CN103998618A - 光学活性的α-取代-β-氨基酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种式(2)所示的光学活性的α-取代-β-氨基酸的制造方法,其包括使用具有将式(1)所示的α-取代-β-氨基酸酯的旋光异构体混合物的酯部位不对称水解的能力的酶等对所述旋光异构体混合物进行不对称水解的步骤(式中,R1表示酰基、羧基或酰胺基;R2表示烷基、芳基、芳烷基、环状醚基等;R3表示可以具有取代基的碳原子数1~20的烃基;R4表示烷基;X表示氧原子或硫原子;*表示不对称中心)。
Description
技术领域
本发明涉及光学活性的α-取代-β-氨基酸的制造方法。
背景技术
式(2)所示的光学活性的α-取代-β-氨基酸作为用于制造原料药化合物的制造用原料或中间体化合物是有用的,
(式中,R1表示氢原子、碳原子数1~10的酰基、羧基或酰胺基。R2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基、可以具有取代基的碳原子数6~20的芳基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳烷基、碳原子数2~20的酰基、可以具有取代基的碳原子数2~15的烷氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数8~20的芳烷氧基羰基或可以具有取代基的碳原子数4~10的环状醚基。R3表示可以具有取代基的碳原子数1~20的烃基。X表示氧原子或硫原子。*表示不对称中心。)。
例如,WO 00/61134中记载了作为抗菌剂的制造用原料的光学活性的α-环戊基甲基-β-(N-甲酰基-N-羟基)氨基酸的制造方法。
发明内容
本发明提供上述式(2)所示的光学活性的α-取代-β-氨基酸的新制造方法。
即,本发明包括以下的[1]~[12]的发明。
[1]一种式(2)所示的光学活性的α-取代-β-氨基酸(以下根据情况称为“光学活性α-取代-β-氨基酸(2)”)的制造方法,其包括使用具有将式(1)所示的α-取代-β-氨基酸酯(以下根据情况称为“α-取代-β-氨基酸酯(1)”)的旋光异构体混合物的-CO2R4基(以下根据情况称为“酯部位”)不对称水解的能力的酶、或者具有产生该酶的能力的微生物的培养物或其处理物对所述旋光异构体混合物进行不对称水解的步骤,
(式中,R4表示可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基。R1、R2、R3和X为与上述相同的含义。)。
[2]如[1]所述的方法,其中,R3为可以具有取代基的碳原子数1~10的烃基。
[3]如[1]所述的方法,其中,R3为环戊基甲基。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,R1为碳原子数1~10的酰基。
[5]如[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基或苯甲酰基。
[6]如[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,R1为氢原子。
[7]如[1]~[6]中任一项所述的方法,其中,R2为碳原子数7~20的芳烷基。
[8]如[1]~[6]中任一项所述的方法,其中,R2为苄基。
[9]如[1]~[8]中任一项所述的方法,其中,R4为甲基或乙基。
[10]如[1]~[9]中任一项所述的方法,其中,酶为来源于色杆菌(Chromobacterium)属或毛霉(Mucor)属的微生物的水解酶、或者构成该水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
[11]如[1]~[9]中任一项所述的方法,其中,酶为来源于巧克力色色杆菌(Chromobacterium chocolatum)或米黑毛霉(Mucor miehei)的微生物的水解酶、或者构成该水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
[12]如[1]~[9]中任一项所述的方法,其中,酶为来源于色杆菌SC-YM-1株(日本工业技术院生命工学技术研究所保藏号:FERMBP-6703)的酯酶或脂肪酶、或者构成该酯酶或脂肪酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
具体实施方式
以下详细说明本发明的制造方法。
首先,本制造方法使用上述α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物。
式(1)中的R1表示氢原子、碳原子数1~10的酰基、羧基(-COOH)或酰胺基(-CONH2)。作为该酰基,例如可举出:甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、特戊酰基和苯甲酰基,它们可以为直链、支链和环状中的任意一种。其中,优选氢原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基和苯甲酰基,特别优选甲酰基、乙酰基和丙酰基。另外,这些酰基可以为具有取代基的烷羰基或具有取代基的芳羰基,作为该取代基,可举出:碳原子数1~5的烷基、碳原子数1~5的烷氧基、碳原子数7~9的芳烷氧基、卤素原子、氰基、硝基等。作为具有该取代基的酰基,例如可举出:氯乙酰基、二氯乙酰基、甲氧基乙酰基、3-氯丙酰基、甲苯酰基、三氟甲基苯甲酰基、氯苯甲酰基、氟苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氰基苯甲酰基、硝基苯甲酰基等。从R1为氢原子或甲酰基的α-取代-β-氨基酸酯衍生物能够容易地得到如WO00/61134中记载的光学活性的α-环戊基甲基-β-(N-甲酰基-N-羟基)氨基酸这样的原料药化合物的制造用原料或中间体化合物。
式(1)中的R2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基、可以具有取代基的碳原子数6~20的芳基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳烷基、碳原子数2~20的酰基、可以具有取代基的碳原子数2~15的烷氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数8~20的芳烷氧基羰基或可以具有取代基的碳原子数4~10的环状醚基。
作为该烷基,例如可举出:甲基、乙基、丙基、丁基、己基、辛基和癸基等,它们可以为直链、支链或环状中的任意一种。其中,该烷基优选甲基、叔丁基。
作为该芳基,例如可举出:苯基、萘基、蒽基和联苯基等,其中,优选苯基。
作为该芳烷基,例如可举出:苄基、对甲氧基苄基和萘甲基等,其中,优选苄基。
作为该酰基,例如可举出:乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、特戊酰基和苯甲酰基等,其中,优选乙酰基和特戊酰基。
作为该烷氧基羰基,例如可举出:甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、己氧基羰基、辛氧基羰基和癸氧基羰基等,它们可以为直链、支链或环状中的任意一种。其中,优选叔丁氧基羰基。
作为该芳氧基羰基,例如可举出:苯氧基羰基、萘氧基羰基、蒽氧基羰基和联苯基氧基羰基等,其中,优选苯氧基羰基。
作为该芳烷氧基羰基,例如可举出:苄氧基羰基、萘基甲氧基羰基等,其中,优选苄氧基羰基。
该环状醚基为从环状醚化合物中去掉1个氢原子而形成的基团,从环状醚化合物中去掉的氢原子特别优选位于环状醚化合物的2位的氢原子。上述环状醚基的具体例为四氢-2H-吡喃-2-基、四氢呋喃-2-基和1,4-二氧杂环己烷-2-基,其中,优选四氢-2H-吡喃-2-基。
另外,这些烷基、芳基、芳烷基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基和环状醚基可以具有取代基,作为该取代基,可举出:碳原子数1~5的烷氧基、碳原子数7~11的芳烷氧基、卤素原子等。另外,芳基、芳烷基、芳氧基羰基和芳烷氧基羰基等具有芳香环的基团有时在其芳香环上具有碳原子数1~5的烷基、碳原子数1~5的烷氧基、卤素原子作为取代基。
以上举出具体例对R2进行了说明,其中,R2优选为碳原子数7~20的芳烷基,进一步优选为苄基或对甲氧基苄基,特别优选为苄基。
上述式(1)中的R3为碳原子数1~20的烃基,该烃基可以为脂肪族烃基、脂环式烃基、芳香族烃基或它们的组合中的任意一种。R3的烃基的碳原子数优选为1~7、更优选为3~6。该脂肪族烃基典型地为烷基,例如可举出:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基等,它们可以为直链也可以为支链。作为该脂环式烃基,可举出:环丁基、环戊基、环己基、环辛基、环癸基、降冰片基和金刚烷基等。作为该芳香族烃基,典型地为芳基,该芳基的具体例与R2的芳基中例示的基团相同。另外,R3的烃基也可以具有取代基,作为该取代基,与作为R2的烷基、芳基等取代基例示的基团相同。可以具有取代基的烃基的碳原子数优选为1~10、更优选为3~7。
如上所述,式(1)中的R3可以为脂肪族烃基与脂环式烃基的组合、脂肪族烃基与芳香族烃基的组合、或脂环式烃基与芳香族烃基的组合。作为脂肪族烃基与脂环式烃基的组合,典型地可举出环烷基与烷烃二基的组合。具体而言,可举出:环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环戊基丁基、环己基甲基、环己基乙基、环己基丙基、环己基丁基、环辛基甲基、环辛基乙基、环辛基丙基和环辛基丁基等。作为脂肪族烃基与芳香族烃基的组合,典型地为芳烷基,可举出苄基和萘甲基等。作为脂环式烃基与芳香族烃基的组合,为苯基环戊基、苯基环己基、萘基环戊基和萘基环己基等。
以上举出具体例对R3进行了说明,其中,R3优选为脂肪族烃基与脂环式烃基的组合,进一步优选为环戊基甲基、环己基甲基,特别优选为环戊基甲基。
式(1)中的R4为可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基,该烷基可以为直链也可以为支链。另外,该烷基的具体例为其碳原子数在1~10的范围且与在R3的烷基中说明的基团相同的基团。上述R4的烷基进一步优选其碳原子数为1~4,特别优选为甲基、乙基。需要说明的是,R4所任意具有的取代基与作为R3所任意具有的取代基而例示的基团相同。
式(1)中的X表示氧原子或硫原子,优选为氧原子。
在此,将优选的α-取代-β-氨基酸酯(1)的具体例以式(1)中的R1~R4的组合示出在表1中。
表1
表1所举出的α-取代-β-氨基酸酯中,优选(1-1)、(1-2)、(1-9)、(1-10)、(1-17)、(1-18)、(1-25)、(1-26)、(1-33)、(1-34),特别优选(1-9)、(1-10)、(1-17)、(1-18)、(1-25)、(1-26),进一步优选X为氧原子。
α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物可以通过公知的制造方法得到。例如,本制造方法记载于ARKICOV 2010(iX)196~205页等。
本制造方法中使用的α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物可以为外消旋体,也可以为过量含有一种旋光异构体的异构体混合物。这些外消旋体、异构体混合物可以是新制备的,也可以为通过将该外消旋体进行光学拆分而制备的、过量含有任意一种旋光异构体的异构体混合物。
作为具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的酯部位(-CO2R4基)不对称水解的能力的酶,可举出来源于色杆菌(Chromobacterium)属或毛霉(Mucor)属的微生物的水解酶,进一步优选举出来源于巧克力色色杆菌(Chromobacterium chocolatum)或米黑毛霉(Mucor miehei)的微生物的水解酶。
作为具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的酯部位不对称水解的能力的酶,更具体而言,可举出:来源于色杆菌SC-YM-1株(日本工业技术院生命工学技术研究所保藏号FERM BP-6703)的酯酶或脂肪酶、或者作为市售酶的キラザイムL-9[来源于米黑毛霉、CHIRAZYME L-9(商品名)]。
作为这些具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的酯部位不对称水解的能力的酶(以下根据情况称为“本酶”),可以为来源于通过诱变剂或紫外线照射等处理从这些微生物诱导而来的突变体的酶,也可以为通过导入这些微生物所具有的编码本酶的基因并进行转化而得到的重组微生物所产生的酶,或者还可以为通过基因工程学的方法使本酶的氨基酸序列中的特定的1个至2个氨基酸缺失、添加或置换而得到的突变型酶,只要具有选择性水解α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的酯部位的能力,则均可以用于本发明制造方法。
作为制作导入编码本酶的基因并进行转化而得到的重组微生物的方法,例如可举出依照J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis著;分子克隆第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)、1989年出版等中记载的通常的基因工程学方法的方法。更具体而言,可以举出依照日本专利第3875283号中记载的方法的方法。作为通过可以如此制作的重组微生物产生的本酶的例子,可举出来源于色杆菌SC-YM-1株(FERM BP-6703)的酯酶(日本专利第3875283号)。
另外,作为利用基因工程学方法的突变型酶的制作方法,例如可举出OlfertLandt等(Gene 96 125-128 1990)的方法。更具体而言,可举出依照日本特开2000-78988号公报或日本专利第3486942号中记载的方法的方法。作为可以如此制作的突变型酶的例子,可举出由来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶制作的突变型酯酶或脂肪酶等。
本制造方法中使用的本酶可以为使构成来源于色杆菌属的微生物的水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。该突变型酶的制备中使用基因学方法,具体而言,使用基因的定点诱变技术。
作为上述来源于色杆菌SC-YM-1株的本酶的特别优选的例子,可举出由下述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一项的DNA所编码的氨基酸序列构成的酶。
(a)序列号1所示的碱基序列。
(b)编码一并记载在序列号1所示的碱基序列的氨基酸序列中第160位的氨基酸被选自下述A组中的氨基酸置换、并且第189位的氨基酸被选自下述B组中的氨基酸置换而形成的氨基酸序列的碱基序列。
(c)在严格的条件下与由上述(b)构成的DNA杂交的DNA的碱基序列,并且是编码与由上述(b)编码的氨基酸序列构成的酶具有同等催化功能的酶的氨基酸序列的碱基序列。
(A组)
丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丝氨酸
(B组)
丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸和精氨酸
(d)序列号1所示的氨基酸序列中,其第325位的氨基酸被异亮氨酸置换的氨基酸序列。
(e)序列号1所示的氨基酸序列中,其第240位的氨基酸被丙氨酸置换并且第288位的氨基酸被丙氨酸置换的氨基酸序列。
(f)序列号1所示的氨基酸序列中,其第43位的氨基酸被丝氨酸置换的氨基酸序列。
作为上述来源于色杆菌SC-YM-1的酶的更优选的例子,可举出:来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶160A189Y363term、来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶160S189F363term、来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶160A189F363term、来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶V325I、来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶T240AV288A、来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶N43SA363term。
对该定点诱变技术进行简单说明。首先,获得编码突变型酶的基因(以下根据情况称为“基因1”)。为了获得该基因1,可以获得编码来源于色杆菌属的微生物的水解酶的野生型基因(以下根据情况称为“野生型基因1”)。野生型基因例如可以依照J.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著分子克隆第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)、1989年出版等中记载的通常的基因工程学方法从色杆菌SC-YM-1株中获得。即,例如使用LB培养基(胰蛋白胨1.0%、酵母提取物0.5%、NaCl 0.5%)对色杆菌SC-YM-1株进行培养,通过超声波裂解等方法将所得到的菌体裂解,进行蛋白酶处理等后,提取基因组DNA。将所得到的基因组DNA用适当的限制酶进行切割,使用连接酶插入到例如作为噬菌体载体的λgt11或作为质粒载体的pUC19等中,由此制作基因组DNA文库。通过例如使用与野生型酶的一部分氨基酸序列对应的合成DNA探针的杂交法、测定野生型酶的活性的方法等筛选法对该基因组DNA文库进行筛选,由此能够获得含有野生型基因1的克隆。
通过向野生型基因1中导入定点突变,能够制备基因1。作为定点诱变法,例如可举出OlfertLandt等(Gene 96 125-128 1990)、Smith等(Genetic Engineering 31 Setlow,J.and Hollaender,APlenum:NewYork)、Vlasuk等(Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Academic Press,NewYork)、Hos.N.Hunt等(Gene 77 51 1989)提出的方法等。例如,使用OlfertLandt等(Gene 96 125-128 1990)的方法来制备编码来源于色杆菌属的微生物的水解酶的氨基酸序列中特定的氨基酸被其他氨基酸置换的氨基酸序列的基因1时,首先,依照例如J.sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著分子克隆第2版(Molecular Cloning2nd edition)、冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)、1989年出版等中记载的方法,制备插入有野生型基因1的质粒DNA。接着,以所得到的质粒DNA作为模板,使用例如包含特定的氨基酸被置换的碱基序列的寡核苷酸作为单侧的引物,通过PCR法进行DNA片段的扩增即可。在此,作为PCR反应的条件,例如,在94℃下保温5分钟后,将在94℃下保温1分钟、接着在50℃下保温2分钟、进而在75℃下保温3分钟的处理进行20次循环,最后在75℃下保温8分钟。将这样扩增得到的DNA片段用例如限制酶BstPI和XbaI消化,并与包含进行了同样的限制酶消化的野生型基因1的质粒DNA进行连接反应,由此能够得到目标基因1。
可以使用这样制备的基因1,依照通常的基因工程方法来制造、获得突变型酶。具体而言,例如,制备能够使基因1在宿主微生物细胞中表达的质粒,将该质粒导入宿主微生物细胞中而对宿主微生物细胞进行转化,并对该转化体微生物进行培养即可。作为上述的质粒,可优选举出:向能够在宿主微生物细胞中进行复制、容易从宿主中分离、纯化且具有启动子和能够检测的标记的表达载体中导入基因1而得到的质粒。该表达载体可以使用市售的各种载体,例如,在大肠杆菌中表达时,可以使用包含lac、trp、tac等启动子的表达载体(可以从Pharmacia Biotech等购入)。
作为宿主微生物细胞,可以使用真核生物或原核生物中的任意一种,例如可举出大肠杆菌等。可以通过通常的基因工程方法将上述质粒导入该宿主微生物细胞中而对宿主微生物细胞进行转化。这样得到的持有含有基因1的质粒的微生物的培养可以通过通常的方法来进行。例如,在宿主微生物细胞为大肠杆菌时,可以在适宜地含有适当的碳源、氮源和维生素等微量营养物的培养基中进行培养。作为培养方法,可以为固体培养、液体培养中的任意一种,可优选举出通气搅拌培养法。对于从该培养菌体中收集突变型酶,可以举出蛋白质的通常的分离、纯化方法,即已经说明过的作为从培养液中纯化酶的方法而例示的方法。
本发明中,按照一并记载在序列号1所示的碱基序列中的氨基酸序列中第160位的氨基酸被选自上述A组中的氨基酸置换、并且第189位的氨基酸被甘氨酸以外的氨基酸置换的方式制备突变引物,通过PCR法进行扩增即可。优选导入第160位的氨基酸被选自上述A组中的氨基酸置换、并且第189位的氨基酸被选自上述B组中的氨基酸置换的特异性突变。
需要说明的是,可以在一并记载在序列号1所示的碱基序列中的氨基酸序列中的第160位和第189位的氨基酸处同时导入定点突变。
另外,制备一并记载在序列号1所示的碱基序列中的氨基酸序列中第325位的氨基酸被异亮氨酸置换的突变引物、序列号1所示的氨基酸序列中其第240位的氨基酸被丙氨酸置换且第288位的氨基酸被丙氨酸置换的突变引物、或者序列号1所示的氨基酸序列中其第43位的氨基酸被丝氨酸置换的突变引物,通过PCR法进行扩增即可。
接着,对来源于毛霉(Mucor)属的微生物的水解酶进行说明。该来源于毛霉属的微生物的水解酶中,优选来源于米黑毛霉(Mucor miehei)的微生物的水解酶。另外,作为来源于米黑毛霉(Mucor miehei)的微生物的水解酶,也可以使用市售的酶。作为上述市售的酶,有キラザイム(CHIRAZYME)L-9[Roche Diagnostics公司制]等。由于市售的酶能够容易地获得,因此从能够更简便地实施本制造方法的观点出发是优选的。需要说明的是,也可以制备在这些来源于毛霉属的微生物的水解酶中使构成该水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶,然后将该突变型酶用于本制造方法。制备这种情况下的突变型酶时,也可以使用作为从来源于色杆菌属的微生物的水解酶制备突变型酶的方法所说明过的定点诱变技术。
产生本酶的微生物均可以通过通常的方法进行液体培养。作为培养基,可以使用适当含有通常的微生物培养中使用的碳源、氮源、无机物等的各种培养基。例如,作为碳源,可以使用葡萄糖、甘油、淀粉、糊精、有机酸、糖蜜等;作为氮源,可以使用油脂类、多聚蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、大豆粉、玉米浆、棉籽粉、干酵母、酪蛋白水解物、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素等;作为无机物,可以使用钾、钠、镁、钙、铁、锰、钴、锌、铜等的盐类、硫酸盐类、乙酸盐类、碳酸盐类和磷酸盐类,具体而言,可以使用氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、碳酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钠等。另外,为了提高上述微生物所具有的α-取代-β-氨基酸酯(1)的不对称水解能力,可以适当地向培养基中添加橄榄油或三丁酸甘油酯等甘油三酯或者α-取代-β-氨基酸酯(1)。
培养通常优选在需氧条件下进行,振荡培养或通气搅拌培养是适合的。培养温度通常为20~40℃、优选为25~35℃,pH优选为6~8。培养时间根据各种条件而不同,优选1~7天。
另外,只要是能够得到具有α-取代-β-氨基酸酯(1)的不对称水解能力的微生物菌体的方法,则也可以根据需要适当采用固体培养法。
为了从通过上述方式培养得到的微生物培养物中纯化本酶,通常按照一般的酶纯化中使用的方法进行即可。例如,首先,通过超声波处理、戴诺磨处理或弗氏压碎器处理等方法将微生物培养物中的菌体进行裂解。通过离心分离等从所得到的裂解液中除去不溶物后,通过使用通常的酶纯化中使用的阳离子交换柱色谱、阴离子交换柱色谱、疏水柱色谱、凝胶过滤柱色谱等中的一种或者将多种适当组合,能够纯化出目标酶。作为这些柱色谱中使用的载体的一例,可举出DEAE-Sepharose fastflow(Amersham Pharmacia Biotech公司制)、Butyl-Toyopearl650S(东洋曹达工业株式会社制)等。
本酶可以以纯化酶、粗酶、微生物培养物、菌体及它们的处理物等各种形态使用。在此,处理物是指例如冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体、菌体磨碎物、菌体的自消化物、菌体的超声波处理物、菌体提取物或菌体的碱处理物等。此外,可以将上述的各种纯度或形态的酶通过例如向硅胶、陶瓷等无机载体、纤维素、离子交换树脂等上吸附的吸附法、聚丙烯酰胺法、含硫多糖凝胶法(例如角叉菜胶凝胶法)、海藻酸凝胶法、琼脂凝胶法等公知方法固定化后使用。
接着,对使用选自由上述水解酶及其突变型酶组成的组中的酶、产生具有该酶的能力的微生物的培养物或其处理物(以下将在此所述的酶、培养液和处理物总称为“本酶等”)的本制造方法进行说明。
上述本酶等的使用量以不引起反应时间的延迟、不对称水解的选择性下降的方式进行适当选择。例如在使用纯化酶、粗酶或市售品酶的情况下,其使用量以本酶等中含有的酶的重量换算计,相对于α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物通常为0.001~2重量倍、优选为0.002~0.5重量倍,在使用微生物培养物、菌体或它们的处理物的情况下,其使用量以本酶等中含有的酶的重量换算计,相对于α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物通常为0.01~200重量倍、优选为0.1~50重量倍。
不对称水解反应中使用的水可以为缓冲水溶液。作为缓冲水溶液,例如可举出:磷酸钠水溶液、磷酸钾水溶液等磷酸碱金属盐水溶液等无机酸盐的缓冲水溶液;乙酸钠水溶液、乙酸钾水溶液等乙酸碱金属盐等有机酸盐的缓冲水溶液等。上述水或缓冲水溶液的使用量相对于α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的重量通常为0.5重量倍以上,可根据情况为溶剂量使用程度的量,但通常为200重量倍以下。
不对称水解反应可以在疏水性有机溶剂、亲水性有机溶剂等有机溶剂中进行。作为疏水性有机溶剂,例如可使用叔丁基甲醚、异丙醚等醚;甲苯、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等烃等;作为亲水性有机溶剂,例如可分别举出:叔丁醇、甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇等醇;四氢呋喃等醚;二甲基亚砜等亚砜;丙酮等酮;乙腈等腈;N,N-二甲基甲酰胺等酰胺等。这些疏水性有机溶剂、亲水性有机溶剂可以分别单独使用或者将两种以上组合使用,也可以将疏水性有机溶剂与亲水性有机溶剂组合使用。另外,本制造方法中可以混合使用水或缓冲水溶液、疏水性有机溶剂和亲水性有机溶剂。
使用上述有机溶剂时,其使用量通常相对于α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的重量在200重量倍以下、优选0.1~100重量倍的范围内。
不对称水解反应例如通过将水、α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物和本酶等混合的方法来进行,在使用有机溶剂的情况下,将该有机溶剂、水、α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物和本酶等混合即可。
反应体系的pH可以适当选择使利用本酶等的不对称水解选择性良好地进行的值,没有特别限定,通常为pH4~10、优选为pH6~8的范围。反应中,可以通过加入酸或碱而将pH调整到适当选择的范围内。作为上述酸,例如可举出:氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸及其盐、乙酸、柠檬酸、甲磺酸等有机酸及其盐,作为上述碱,例如可使用:氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物;碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙等碱金属和碱土金属的碳酸盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属碳酸氢盐;磷酸二氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢钾等磷酸盐、二乙胺、二异丙基乙胺、三乙胺、环己胺、苄胺、苯乙胺、吡啶等有机碱、氨。上述碱可以单独使用或混合使用两种以上。这些酸或碱可以根据本制造方法中使用的本酶等的种类等,按照通过添加的酸或碱的作用不产生α-取代-β-氨基酸酯(1)的水解的方式进行选择。上述酸或碱通常以水溶液的形式使用,但在反应中使用有机溶剂的情况下,也可以以有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶液的形式使用。上述有机溶剂可以使用与在反应中使用的溶剂相同的溶剂。另外,溶解酸或碱的水可以替换为缓冲水溶液。此外,酸或碱可以以固体或悬浮于溶液中的状态使用。
反应温度可以适当选择使利用本酶等的不对称水解选择性良好地进行的温度,没有特别限定,但如果过高,则本酶等中的本酶的稳定性有下降的倾向,另外如果过低,则反应速度有下降的倾向。另一方面,温度越低,则选择性倾向于越高。反应温度通常在-10~65℃的范围内,优选在-5~50℃的范围内。
反应时间通常从1~100小时的范围内选择,优选从1~50小时的范围内选择。也可以对本制造方法的反应体系中的反应液适当采样,通过HPLC、GC等适当的分析手段,求出α-取代-β-氨基酸酯(1)的消失程度或α-取代-β-氨基酸(2)的生成程度,从而确定反应时间。
这样可得到光学活性α-取代-β-氨基酸(2)的溶液,通常为了与反应中使用的酶、缓冲剂或通过水解反应生成的羧酸等分离,进一步进行后处理操作。
作为上述后处理,例如可举出:将反应溶液中的溶剂蒸馏除去后,使用硅胶色谱分离纯化α-取代-β-氨基酸(2)的方法;同样地将溶剂蒸馏除去后,通过蒸馏分离纯化α-取代-β-氨基酸(2)的方法;通过分液操作分离纯化α-取代-β-氨基酸(2)的方法等。
通过分液操作分离纯化α-取代-β-氨基酸(2)时,在反应时使用了溶解于水和疏水性有机溶剂中的任意一种的有机溶剂的情况下,可以通过蒸馏将其除去后使用。另外,在溶液中存在不溶酶、固定化载体等的情况下,可以通过过滤将它们除去。
本制造方法的反应结束后的反应液中含有作为不对称水解反应的产物的α-取代-β-氨基酸(2)和残留的α-取代-β-氨基酸酯(1)。为了将该二者分离,例如可采用如下的方法:利用水/疏水性有机溶剂进行萃取操作,使残留的α-取代-β-氨基酸酯(1)分配于有机层(疏水性有机溶剂层)中,使α-取代-β-氨基酸(2)分配于水层中,并将该有机层和该水层分液。
为了将作为目标物的光学活性α-取代-β-氨基酸(2)与本酶等、缓冲剂、其他水溶性成分分离,使用疏水性有机溶剂将光学活性α-取代-β-氨基酸(2)萃取至有机层中并与水层分液即可。
作为上述疏水性有机溶剂,例如可举出:叔丁基甲醚、异丙醚等醚;甲苯、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等烃;二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、氯苯、邻二氯苯等卤代烃;乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯等酯;等。在反应时使用了这些疏水性有机溶剂的情况下,将反应结束后的反应液分离为有机层和水层时,也可以直接进行分液操作。另外,在反应时未使用疏水性有机溶剂的情况下、由于疏水性有机溶剂或水的使用量少因而反应液不易分液为有机层和水层的情况下、或者由于水的使用量少因而无法容易地进行分液的情况下,适当添加疏水性有机溶剂或水等后进行分液即可。疏水性有机溶剂的使用量没有特别限定,通常以α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体的重量作为基准,为0.1~200重量倍、优选为0.2~100重量倍。
提取上述目标物时的pH通常在2~10的范围内、优选在4~8的范围内。需要说明的是,为了调整pH,也可以适当地使用酸或碱。在此,所使用的酸或碱的具体例与作为本制造方法的反应体系的pH调整用途所例示的酸或碱相同。从水层中萃取目标物不充分时,可以反复进行数次相同的萃取、分液操作。另外,同样地,从有机层中除去水溶性成分不充分时,也可以反复进行数次相同的萃取、分液操作。
通过上述的萃取,与作为不对称水解产物的羧酸分离后的残留酯可以通过将油层中的有机溶剂蒸馏除去而分离。所得到的光学活性α-取代-β-氨基酸酯(1)通过供给外消旋化的处理,能够以α-取代-β-氨基酸酯(1)的旋光异构体混合物的形式再利用。
通过将上述的油层中的有机溶剂蒸馏除去而分离的未反应α-取代-β-氨基酸酯(1)可以通过柱色谱等进一步进行纯化。
通过上述的萃取,作为不对称水解产物的光学活性α-取代-β-氨基酸(2)包含在分液后的水层中,其可以通过将水蒸馏除去或者在中和处理后使用有机溶剂进行萃取等而容易地从水层中取出。分离的光学活性α-取代-β-氨基酸(2)可以通过将油层中的有机溶剂蒸馏除去而单离。
这样得到的光学活性α-取代-β-氨基酸(2)可以进一步通过柱色谱、再结晶、再沉淀等纯化操作进一步纯化。另外,再结晶、再沉淀等纯化操作中,也可以将光学活性α-取代-β-氨基酸(2)进一步用适当的碱制成盐后,将该盐通过再结晶、再沉淀进行纯化,并将纯化后的盐再次通过适当的方法恢复为光学活性α-取代-β-氨基酸(2)。
将这样得到的光学活性α-取代-β-氨基酸(2)的具体例以式(2)中的R1~R3的组合示出在表2中。
表2
本发明中,作为本酶,如果使用具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)中的R构型的酯部位选择性水解的能力的酶,则所得到的光学活性的α-取代-β-氨基酸(2)富含R构型,如果使用具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)中的S构型的酯部位选择性水解的能力的酶,则所得到的光学活性的α-取代-β-氨基酸(2)富含S构型。另外,使用具有将α-取代-β-氨基酸酯(1)中的R构型的酯部位选择性水解的能力的酶来得到R构型的α-取代-β-氨基酸(2)时,可同时得到S构型的α-取代-β-氨基酸酯(1),可以通过上述的萃取、分液操作等将其与R构型的α-取代-β-氨基酸(2)分离、单离。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明,但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1~8
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸(2-5)的制造
将生产表3所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分或酶以表4所示的量分别称取到容器中,在其中加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL、2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸甲酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg和叔丁基甲醚1mL。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,用高效液相色谱[柱:CHIRALPAK AD-H、5μm(大赛璐化学公司制)]分析叔丁基甲醚层的光学纯度,另外,用高效液相色谱[柱:Cadenza CD-18、3μm(Imtakt公司制)]分析叔丁基甲醚层的化学纯度,求出所得到的光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表4中。
表3
表4
实施例9~16
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸(2-5)的制造
将生产表5所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分或酶以表6所示的量分别称取到容器中,加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL和2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸甲酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,与实施例1同样地对叔丁基甲醚层进行分析,求出所得到的光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表6中。
表5
表6
实施例17
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸(2-5)的制造
在容器中称取0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)50.3g,向其中加入2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸甲酯的旋光异构体混合物(外消旋体)400.0mg、叔丁基甲醚7.4g、生产来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶N43SA363term的大肠杆菌重组体的碱处理物2.0g。将该溶液在25℃下搅拌158小时后,通过与实施例1同样的方法进行分析并求出转换率,结果为44.2%((R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的镜像异构体过量率:100.0%ee)。在所得到的反应液中加入3.4%磷酸水溶液10.6g,使pH为5.0。在该溶液中加入叔丁基甲醚8.0g,通过分液分离为油层和水层。将水层用叔丁基甲醚8.0g萃取两次,进行分液操作,除去水层后与之前得到的油层合并。对所得到的混合溶液进行硅藻土过滤,用叔丁基甲醚2.0g洗涤两次后,通过分液分离为油层和水层。在油层中加入二异丙基乙胺250.5mg、水4.0g,通过分液分离为油层和水层。接着,用叔丁基甲醚2.0g洗涤水层,除去油层。在所得到的水层中加入1N盐酸1.9g、叔丁基甲醚8.0g,通过分液分离为油层和水层。将油层用硫酸钠脱水干燥后,在减压下使油层的有机溶剂蒸馏除去,以油状物质的形式得到(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸134.6mg。与实施例1同样地对所得到的油状物质进行分析,求出所得到的(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的收率和镜像异构体过量率,结果收率为37.6%、镜像异构体过量率为100.0%ee。
实施例18
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸(2-5)的制造
在容器中称取0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)50.2g,向其中加入2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)400.0mg、叔丁基甲醚7.4g、生产来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶160A189Y363term的大肠杆菌重组体的碱处理物2.0g。将该溶液在25℃下搅拌122小时后,通过与实施例1同样的方法进行分析并求出转换率,结果为49.4%((R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的镜像异构体过量率:95.6%ee)。在所得到的反应液中加入3.4%磷酸水溶液9.7g,使pH为5.0。在该溶液中加入叔丁基甲醚8.0g,通过分液分离为油层和水层。将水层用叔丁基甲醚8.0g萃取两次,进行分液操作,除去水层后与之前得到的油层合并。对所得到的混合溶液进行硅藻土过滤,用叔丁基甲醚2.0g洗涤两次后,通过分液分离为油层和水层。在油层中加入1N氢氧化钠水溶液4.0g,通过分液分离为油层和水层。接着,用叔丁基甲醚4.0g洗涤水层,除去油层。在所得到的水层中加入1N盐酸3.9g、叔丁基甲醚8.0g,通过分液分离为油层和水层。将油层用15%食盐水0.8g洗涤后,用硫酸钠脱水干燥,在减压下使油层的有机溶剂蒸馏除去,以油状物质的形式得到(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸170.6mg。与实施例1同样地对所得到的油状物质进行分析,求出所得到的(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的收率和镜像异构体过量率,结果收率为35.8%、镜像异构体过量率为95.2%ee。
实施例19
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸(2-5)的制造法
在容器中称取2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)3.0g,向其中加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)14.2g、生产来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶N43SA363term的大肠杆菌重组体的碱处理物0.75g,在25℃下搅拌24小时后,追加0.1M磷酸钾缓冲液7.2g。进一步在25℃下搅拌53小时后,追加0.1M磷酸钾缓冲液24.4g。进一步在25℃下搅拌26小时后,追加0.1M磷酸钾缓冲液45.0g。进一步在25℃下搅拌80小时后,追加0.1M磷酸钾缓冲液120.0g。进一步在25℃下搅拌96小时后,通过与实施例1同样的方法进行分析并求出转换率,结果为46.3%((R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的镜像异构体过量率:99.8%ee)。在所得到的反应液中加入85%磷酸水溶液2.3g,使pH为5.0。在该溶液中加入叔丁基甲醚12.0g,通过分液分离为油层和水层。用叔丁基甲醚12.0g将水层萃取两次,进行分液操作,除去水层后与之前得到的油层合并。对所得到的混合溶液进行硅藻土过滤,用叔丁基甲醚1.5g洗涤两次后,通过分液分离为油层和水层。在油层中加入二异丙基乙胺1.74g、水15.0g,通过分液分离为油层和水层。接着,在油层中加入水6.0g,进行萃取,除去油层后与之前得到的水层合并。在所得到的水层中加入35%盐酸0.4g、叔丁基甲醚9.0g,通过分液分离为油层和水层。在减压下使油层的有机溶剂蒸馏除去,以油状物质的形式得到(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸1.12g。与实施例1同样地对所得到的油状物质进行分析,求出所得到的(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的收率和镜像异构体过量率,结果收率为39.7%、镜像异构体过量率为99.5%ee。
实施例20
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基)氨基]丙酸(2-1)的制造法
在容器中称取0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)21.0g,向其中加入2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)300.0mg、生产来源于色杆菌SC-YM-1株的酯酶N43SA363term的大肠杆菌重组体的碱处理物75.0mg。将该溶液在25℃下搅拌96小时后,加入85%磷酸水溶液0.24g,使pH为5.0。在该溶液中加入叔丁基甲醚6.0g,通过分液分离为油层和水层。用叔丁基甲醚6.0g将水层萃取两次,进行分液操作,除去水层后与之前得到的油层合并。对所得到的混合溶液进行硅藻土过滤,用叔丁基甲醚1.5g洗涤两次后,通过分液分离为油层和水层。在油层中加入二异丙基乙胺189.9mg、水3.0g,通过分液分离为油层和水层。接着,用叔丁基甲醚1.5g洗涤水层,除去油层。在所得到的水层中加入1N盐酸1.6g、叔丁基甲醚6.0g,通过分液分离为油层和水层。将油层用硫酸钠脱水干燥后,在减压下使油层的有机溶剂蒸馏除去,以油状物质的形式得到(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基)氨基]丙酸17.7mg。与实施例1同样地对所得到的油状物质进行分析,求出所得到的(R)-2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基)氨基]丙酸的收率和镜像异构体过量率,结果收率为5.8%、镜像异构体过量率为99.2%ee。
实施例21~27
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-乙酰基)氨基]丙酸(2-9)的制造
将生产表7所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分以表8所示的量分别称取到容器中,加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL和2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-乙酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,与实施例1同样地对叔丁基甲醚层进行分析,求出所得到的光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-乙酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表8中。
表7
表8
实施例28~34
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-丙酰基)氨基]丙酸(2-13)的制造
将生产表9所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分以表10所示的量分别称取到容器中,加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL和2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-丙酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,与实施例1同样地对叔丁基甲醚层进行分析,求出所得到的光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-丙酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表10中。
表9
表10
实施例35~41
光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-苯甲酰基)氨基]丙酸(2-17)的制造
将生产表11所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分以表12所示的量分别称取到容器中,加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL和2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-苯甲酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,与实施例1同样地对叔丁基甲醚层进行分析,求出所得到的光学活性2-环戊基甲基-3-[(N-苄基氧基-N-苯甲酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表12中。
表11
表12
实施例42~43
光学活性2-苄基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的制造
将生产表13所示的各种酶的大肠杆菌重组体可溶性级分以表14所示的量分别称取到容器中,加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)5mL和2-苄基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋体)40.0mg。将该溶液在25℃下搅拌48小时后,添加3.4%磷酸水溶液1mL和叔丁基甲醚10mL并混合。静置后,与实施例1同样地对叔丁基甲醚层进行分析,求出所得到的光学活性2-苄基-3-[(N-苄基氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸的转换率和镜像异构体过量率。将结果示于表14中。
表13
表14
转换率(%)=产物量/(底物量+产物量)×100
镜像异构体过量率(%ee)=(A-B)/(A+B)×100(A和B表示所对应的镜像异构体量,且A>B)。
产业上的可利用性
本发明的制造方法对于原料药化合物的制造用原料或中间体化合物的制造是有用的。
Claims (12)
1.一种式(2)所示的光学活性的α-取代-β-氨基酸的制造方法,其包括使用具有将式(1)所示的α-取代-β-氨基酸酯的旋光异构体混合物的-CO2R4基不对称水解的能力的酶、或者具有产生该酶的能力的微生物的培养物或其处理物对所述旋光异构体混合物进行不对称水解的步骤,
式(2)中,R1表示氢原子、碳原子数1~10的酰基、羧基或酰胺基,
R2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基、可以具有取代基的碳原子数6~20的芳基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳烷基、碳原子数2~20的酰基、可以具有取代基的碳原子数2~15的烷氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数7~20的芳氧基羰基、可以具有取代基的碳原子数8~20的芳烷氧基羰基或可以具有取代基的碳原子数4~10的环状醚基,
R3表示可以具有取代基的碳原子数1~20的烃基,
X表示氧原子或硫原子,
*表示不对称中心,
式(1)中,R4表示可以具有取代基的碳原子数1~10的烷基,
R1、R2、R3和X为与上述相同的含义。
2.如权利要求1所述的方法,其中,R3为可以具有取代基的碳原子数1~10的烃基。
3.如权利要求1所述的方法,其中,R3为环戊基甲基。
4.如权利要求1所述的方法,其中,R1为碳原子数1~10的酰基。
5.如权利要求1所述的方法,其中,R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基或苯甲酰基。
6.如权利要求1所述的制造方法,其中,R1为氢原子。
7.如权利要求1所述的方法,其中,R2为碳原子数7~20的芳烷基。
8.如权利要求1所述的方法,其中,R2为苄基。
9.如权利要求1所述的制造方法,其中,R4为甲基或乙基。
10.如权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,酶为来源于色杆菌(Chromobacterium)属或毛霉(Mucor)属的微生物的水解酶、或者构成该水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
11.如权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,酶为来源于巧克力色色杆菌(Chromobacterium chocolatum)或米黑毛霉(Mucor miehei)的微生物的水解酶、或者构成该水解酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
12.如权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,酶为来源于色杆菌SC-YM-1株(日本工业技术院生命工学技术研究所保藏号:FERMBP-6703)的酯酶或脂肪酶、或者构成该酯酶或脂肪酶的氨基酸中的1个至2个缺失、添加或置换而形成的突变型酶。
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