CN104685061B - L-赖氨酸羟化酶和利用了该l-赖氨酸羟化酶的羟基-l-赖氨酸的制造法及羟基-l-2-哌啶酸的制造法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种能够有效地制造羟基‑L‑赖氨酸的方法。本发明提供一种羟基‑L‑赖氨酸的制造方法,其特征在于,使2‑酮戊二酸依赖型L‑赖氨酸羟化酶或包含该2‑酮戊二酸依赖型L‑赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液与L‑赖氨酸作用,生成下述通式(I)(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)所表示的羟基‑L‑赖氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及利用了新型的赖氨酸羟化酶的羟基-L-赖氨酸的制造法、以及利用了所得到的羟基-L-赖氨酸的羟基-L-2-哌啶酸的制造法。
背景技术
羟基-L-赖氨酸是作为药物的中间体等有用的中间体。例如,已知(3R)-羟基-L-赖氨酸可以用作蛋白激酶C抑制剂(-)-balanol的前体(非专利文献1),(5R)-羟基-L-赖氨酸可以用作具有抗肿瘤活性的Bengamide B的前体(非专利文献2)。另外,还报道了羟基-L-赖氨酸可以用作羟基-L-2-哌啶酸的原料(非专利文献3、4)。例如,(4R)-羟基-L-2-哌啶酸可以用作HIV蛋白酶抑制剂palinavir的前体(非专利文献5),(5S)-羟基-L-2-哌啶酸和(5R)-羟基-L-2-哌啶酸可以用作抗菌剂的前体(专利文献1)。
作为羟基-L-赖氨酸的合成法,例如,报道了(3R)-羟基-L-赖氨酸活用了基于Ru催化剂的不对称氢化的方法(非专利文献1)。
需要说明的是,氨基酸羟化酶是对药物的中间体等的制造有用的酶,据报道存在脯氨酸4位羟化酶(非专利文献6)、L-异亮氨酸双加氧酶(非专利文献7)等。但是,迄今为止尚未报道有作用于L-赖氨酸的酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2004-505088号公报
非专利文献
非专利文献1:Coulon等、Tetrahedron Lett.,1998,39,6467
非专利文献2:Kinder等、J.Org.Chem.,2001,66,2118
非专利文献3:Yasuda等、Tetrahedron Asymm.,2006,17,1775
非专利文献4:Tsotsou等、Biochemie,2007,89,591
非专利文献5:Gillard等、J.Org.Chem.,1996,61,2226
非专利文献6:Shibasaki等、Appl.Environ.Microbiol.,1999,65,4028
非专利文献7:Hibi等、Appl.Environ.Microbiol.,2011,77,6926
发明内容
发明要解决的课题
非专利文献1中记载的羟基-L-赖氨酸的合成法中,原料的制备繁杂,而且用于催化剂的制备和再循环的成本负荷大,需要更高效的合成法。
本发明的课题在于提供一种廉价且简便地制造光学纯度更高的羟基-L-赖氨酸的新方法。
用于解决课题的方案
本发明人为了解决上述课题对光学活性羟基-L-赖氨酸的制造方法进行了深入研究,结果发现L-精氨酸β羟化酶VioC的同源蛋白具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性,而L-精氨酸β羟化酶VioC的同源蛋白迄今为止作为蛋白质没有被分离的报道,功能也不明确。并且发现,利用编码这些蛋白质的DNA制作转化体,使该转化体细胞、其制备物和/或培养液与L-赖氨酸作用,由此能够以高光学纯度且高浓度得到羟基-L-赖氨酸。此外发现,利用所得到的羟基-L-赖氨酸可以制造羟基-L-2-哌啶酸。本发明是基于这些见解而完成的。
即,本发明的要点如下所述。
(1)一种羟基-L-赖氨酸的制造方法,其特征在于,使2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液与L-赖氨酸作用,生成下述通式(I)
(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)所表示的羟基-L-赖氨酸。
(2)如(1)所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶包含以下的(A)、(B)或(C)所示的多肽:
(A)具有序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列的多肽;
(B)具有在序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生了缺失、取代和/或添加的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽;或
(C)具有与序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列有60%以上的同源性的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽。
(3)如(1)或(2)所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,包含所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞是用编码所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA进行了转化的细胞。
(4)如(3)所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,编码所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA包含以下的(D)、(E)或(F)所示的DNA:
(D)具有序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列的DNA;
(E)包含在序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生了取代、缺失和/或添加的碱基序列且编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽的DNA;或
(F)包含与序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列的互补链在严格条件下杂交的碱基序列且编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽的DNA。
(5)如(1)~(4)中任一项所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,使所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液在2-酮戊二酸和二价铁离子的存在下与所述L-赖氨酸作用。
(6)一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用(1)~(5)中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶;或者选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶和氨基酸消旋酶与所得到的羟基-L-赖氨酸发生反应,生成下述通式(II)
(式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同)所表示的化合物,之后使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶与所得到的化合物作用,生成下述通式(III)
(式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
(7)一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用(1)~(5)中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶、L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶与所得到的羟基-L-赖氨酸发生反应,生成下述通式(IV)
(式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同)所表示的化合物,之后使吡咯啉-5-羧酸还原酶与所的得到的化合物作用,生成下述通式(III)
(式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
(8)一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用(1)~(5)中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使赖氨酸环化脱氨酶与所得到的羟基-L-赖氨酸作用,生成下述通式(III)
(式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
(9)一种2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶蛋白,其具有与L-赖氨酸作用而生成羟基-L-赖氨酸的活性,且包含以下的(A)、(B)或(C)所示的多肽:
(A)具有序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列的多肽;
(B)具有在序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生了缺失、取代和/或添加的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽;或
(C)具有与序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列有60%以上的同源性的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽。
发明的效果
根据本发明,能够高效地制造羟基-L-赖氨酸,进而,能够得到光学纯度高的羟基-L-赖氨酸。另外,能够由所得到的羟基-L-赖氨酸高效地制造光学纯度高的羟基-L-2-哌啶酸。
附图说明
图1是示出基于Hyl-1、3、4、5的L-赖氨酸向4-羟基赖氨酸转换的图。
图2是示出基于Hyl-2、6的L-赖氨酸向3-羟基赖氨酸转换的图。
具体实施方式
下面,详细说明本发明。
<使用了2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的羟基-L-赖氨酸的制造方法>
本发明的羟基-L-赖氨酸的制造方法的特征在于,使2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液与L-赖氨酸作用。如后所述,本发明的制造方法优选在2-酮戊二酸和2价铁离子的存在下进行。
本发明中使用的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶(下文中有时称为“本发明的L-赖氨酸羟化酶”)由于将L-赖氨酸羟化时的位置选择性和立体选择性高,因而,通过使用该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶,可以高效地得到光学纯度高的羟基-L-赖氨酸。
本发明的L-赖氨酸羟化酶只要是具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的酶就没有特别限制,优选具有序列号2、4、6、8、10或12中记载的氨基酸序列;或者为该氨基酸序列的同源物且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性。即,本发明的L-赖氨酸羟化酶优选包含以下的(A)、(B)或(C)所示的多肽。
(A)具有序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列的多肽;
(B)具有在序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生了缺失、取代和/或添加的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽;或
(C)具有与序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列有60%以上的同源性的氨基酸序列且具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽。
作为能够在本发明中使用的具有序列号2、4、6、8、10或12中记载的氨基酸序列的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的同源物,如所述(B)中记载的那样,只要保持2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性,则可以举出具有在序列号2、4、6、8、10或12中记载的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生了缺失、取代或添加的氨基酸序列的物质。此处,“一个或多个氨基酸”是指,例如,1个~100个、优选为1个~50个、更优选为1个~20个、进一步优选为1个~10个、特别优选为1个~5个氨基酸。
另外,如上述(C)中记载的那样,上述同源物只要保持2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性,则也可以为与序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列全长至少具有60%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为95%以上的序列同源性的蛋白质。
本说明书中,2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性是指依赖于2-酮戊二酸而在L-赖氨酸的3位、4位和/或5位的碳原子添加羟基的活性。这样的活性可以通过下述方式确认:在含有L-赖氨酸作为底物、进而含有2-酮戊二酸作为辅酶的反应体系中,作为酶,使目标蛋白质、表达该蛋白质的细胞或其制备物作用,如后述实施例那样测定羟基-L-赖氨酸的生成,由此进行确认。
序列号2、4、6、8、10或12中记载的氨基酸序列分别基于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)UW101株、耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)SRS30216株、松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)DSM2588株、粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)ATCC35910株、朝鲜农研所丝杆菌(Niastella koreensis)GR20-10株、海洋放线菌(marineactinobacterium)PHSC20C1的基因组信息。
另外,序列号2、4、6、8、10或12中记载的氨基酸序列分别与预测编码蛋白质的DNA序列的翻译氨基酸序列基因库登录号ABQ06186、ABS05421、ACU60313、EFK34737、AEV99100和EAR24255相同。这些均不存在作为蛋白质被分离等等、实际上确认了存在的报道例,作为蛋白质的功能完全不清楚。
包含序列号2、6、8和10的氨基酸序列的本发明的L-赖氨酸羟化酶可将L-赖氨酸的4位羟化,因而可以生成(2S,4R)羟基‐L-赖氨酸。这些之中,由于收率高而优选序列号8。
另一方面,包含序列号4和12的氨基酸序列的本发明的L-赖氨酸羟化酶可将L-赖氨酸的3位羟化,因而可以生成(2S,3S)羟基‐L-赖氨酸。这些之中,由于收率高而优选序列号12。
需要说明的是,在本发明的制造方法中,可以合用两种以上的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶。
能够在本发明中使用的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶分别也可以由约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)、耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)、松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)、粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)、朝鲜农研所丝杆菌(Niastella koreensis)、或海洋放线菌(marine actinobacterium)纯化得到,但也可以利用PCR或杂交等公知的方法将编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA克隆化,使其在适当的宿主中表达,从而得到。
作为编码具有序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA,分别可以举出包含序列号1、3、5、7、9或11的碱基序列的DNA,只要编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的蛋白质,则也可以为包含序列号1、3、5、7、9或11的碱基序列的DNA的同源物。即,作为编码本发明的L-赖氨酸羟化酶的DNA,可以举出以下的(D)、(E)或(F)所示的碱基序列。
(D)具有序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列的DNA;
(E)包含在序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生了取代、缺失和/或添加的碱基序列且编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽的DNA;或
(F)包含与序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列的互补链在严格条件下杂交的碱基序列且编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的多肽的DNA。
作为同源物,例如,如上述(E)中记载的那样,可以举出包含在序列号1、3、5、7、9或11的碱基序列中一个或多个碱基发生了取代、缺失或者添加的碱基序列的物质。此处所说的一个或多个碱基是指,例如,1个~300个、优选为1个~150个、更优选为1个~60个、进一步优选为1个~30个、特别优选为1个~15个碱基。
此外,如上述(F)中记载的那样,上述DNA的同源物只要编码具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的蛋白质,则也可以为与序列号1、3、5、7、9或11的碱基序列的互补链在严格条件下杂交的DNA。此处,作为“严格条件”,例如可以举出包括在0.1×SSC、0.1%SDS、60℃的条件下进行清洗的步骤的条件。
本领域技术人员通过利用部位特異的突变导入法(Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR APractical Approach IRL Press pp.200(1991))等在序列号1、3、5、7、9或11的DNA中适当导入取代、缺失、插入和/或添加突变,从而可以得到上述那样的DNA同源物。
另外,也可以基于序列号2、4、6、8、10或12的氨基酸序列或其一部分、序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列或其一部分,对例如日本核酸数据库(DNA Databank ofJAPAN)(DDBJ)等数据库进行同源性检索,从而得到2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶活性的氨基酸信息或编码其的DNA的碱基序列信息。
在本发明的羟基-L-赖氨酸的制造方法中,也可以将2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶直接用于反应中,但优选使用包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞或其制备物或者对该细胞进行培养而得到的培养液。
作为包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞,可以使用原本具有2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的微生物等的细胞,优选使用以编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的基因进行了转化的微生物等的细胞。此处,作为细胞,无论其生死,例如,可以适宜地使用静止细胞等。
另外,作为包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞的制备物,例如可以使用:通过丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯等有机溶剂或表面活性剂对该细胞进行了处理的物质、进行冷冻干燥处理而得到的物质、通过物理方式或酶方式破碎而得到的物质等细胞制备物、将细胞中的酶组分作为粗产物或纯化物取出而得到的物质、以及将它们固定化于以聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等为代表的载体而得到的物质等。
作为对包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞进行培养而得到的培养液,例如可以使用该细胞与液体培养基的悬浮液,在该细胞为分泌表达型细胞的情况下,可以使用通过离心分离等除去该细胞而得到的上清或其浓缩物。
通过以能够表达的方式将如上分离的编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA插入公知的表达载体中,可提供2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶表达载体。并且,通过用该表达载体转化宿主细胞,可以得到导入有编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA的转化体。转化体也可以通过利用同源重组等方法以能够表达的方式将编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA插入宿主的染色体DNA中而得到。
作为转化体的制作方法,具体来说,可例示出下述方法:向在微生物等宿主细胞中稳定存在的质粒载体、噬菌体载体或病毒载体中导入编码2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA,将所构筑的表达载体导入该宿主细胞中,或者直接向宿主基因组中导入该DNA,使其遗传信息转录·翻译。此时,优选在宿主中将适当的启动子连结至DNA的5'-侧上游,进而,更优选将终止子连结至3'-侧下游。作为这样的启动子和终止子,只要是已知在用作宿主的细胞中发挥功能的启动子和终止子就没有特别限定,例如,在“微生物学基础讲座8基因工学·共立出版”等中详细记载了能够在宿主微生物中利用的载体、启动子和终止子。
作为成为用于表达2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的转化的对象的宿主微生物,只要宿主自身不对L-赖氨酸的反应产生不良影响就没有特别限定,具体来说,可以举出以下所示的微生物。
属于埃希氏杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属等的宿主载体系统确立的细菌。
属于红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等的宿主载体系统确立的放线菌。
属于酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等的宿主载体系统确立的酵母。
属于脉孢菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、木霉(Trichoderma)属等的宿主载体系统确立的霉。
用于制作转化体的步骤、适合于宿主的重组载体的构筑和宿主的培养方法可以根据分子生物学、生物工程学、基因工程学的领域中惯用的技术进行(例如,分子克隆(Molecular Cloning)中记载的方法)。
下面,具体举出优选的宿主微生物、各微生物中的优选的转化方法、载体、启动子、终止子等的示例,但本发明不限定于这些示例。
在埃希氏杆菌属、特别是大肠杆菌(Escherichia coli)中,作为质粒载体,可以举出pBR、pUC系质粒等,可以举出lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR等来源的启动子等。另外,作为终止子,可以举出trpA来源、噬菌体来源、rrnB核蛋白体RNA来源的终止子等。
在芽孢杆菌属中,作为载体,可以举出pUB110系质粒、pC194系质粒等,另外还可以对染色体进行整合。作为启动子和终止子,可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等的酶基因的启动子和终止子等。
在假单胞菌属中,作为载体,可以举出在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等中确立的通常的宿主载体系统、或与甲苯化合物的分解有关的质粒、以TOL质粒为基本的宽宿主范围载体(包含RSF1010等来源的、自主性复制所需要的基因)pKT240(Gene,26,273-82(1983))等。
在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中,作为载体,可以举出pAJ43(Gene 39,281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子,可以利用在大肠杆菌中使用的各种启动子和终止子。
在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中,作为载体,可以举出pCS11(日本特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等质粒载体。
在酵母菌(Saccharomyces)属、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,作为载体,可以举出YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒等。另外,可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸激酶、烯醇酶之类的各种酶基因的启动子、终止子。
在裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属中,作为载体,可以举出Mol.Cell.Biol.6,80(1986)中记载的粟酒裂殖酵母来源的质粒载体等。特别是,pAUR224由宝酒造销售,可以容易地利用。
在曲霉菌(Aspergillus)属中,黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等在霉中被最充分地进行了研究,可以利用向质粒或染色体的整合,可以利用菌体外蛋白酶或淀粉酶来源的启动子(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。
另外,除了上述以外,还确立了与各种微生物对应的宿主载体系统,可以适宜使用这些宿主载体系统。
另外,除了微生物以外,在植物、动物中还确立了各种的宿主·载体系统,特别是确立了在昆虫(例如蚕)等动物中(Nature 315,592-594(1985))、或菜籽、玉米、土豆等植物中大量表达异种蛋白的系统、以及利用了大肠杆菌无细胞提取液或小麦胚芽等无细胞蛋白质合成系统的系统,可以适宜地利用。
本发明的制造方法中,使2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶、包含所述酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液在2-酮戊二酸的存在下与作为反应底物的L-赖氨酸作用,从而可以制造下述通式(I)
(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)所表示的羟基-L-赖氨酸。
上述通式(I)的R1、R2、R3分别考虑最终希望得到的化合物来选择即可,其中,优选R1、R2和R3中的一个或两个为羟基,更优选R1、R2和R3中的一个为羟基。
对于本发明的制造方法,只要可以使2-酮戊二酸、和2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液与L-赖氨酸作用就没有特别限制,通常,优选在水性介质中、或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。本发明的制造方法进而优选在二价铁离子的存在下进行。
作为所述水性介质,例如,可以举出水或缓冲液。
另外,作为所述有机溶剂,可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等反应底物的溶解度高的有机溶剂。作为所述有机溶剂,另外,也可以使用对反应副产物的除去等有效果的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、三氯甲烷、正己烷等。
关于成为反应底物的L-赖氨酸,通常,在底物浓度为0.01%w/v~90%w/v、优选为0.1%w/v~30%w/v的范围使用。反应底物可以在反应开始时一并添加,但从减少存在酶的底物抑制时的影响的方面、提高产物的蓄积浓度的方面出发,优选连续或间歇地添加。
关于反应所需要的2-酮戊二酸,通常,在与底物等摩尔或其以上、优选为等摩尔~1.2倍摩尔的范围添加。2-酮戊二酸可以在反应开始时一并添加,但从减少存在对酶的抑制作用时的影响的方面、提高产物的蓄积浓度的方面出发,优选连续或间歇地添加。或者,也可以代替2-酮戊二酸而添加葡萄糖等宿主能够代谢的廉价的化合物,使宿主代谢,将该过程中产生的2-酮戊二酸用于反应。
本发明的制造方法优选在二价铁离子的存在下进行。二价铁离子通常优选在0.01mM~100mM、优选在0.1mM~10mM的范围使用。二价铁离子可以以硫酸亚铁等的形式在反应开始时一并添加,在反应中,所添加的二价铁离子被氧化成3价、或者形成沉淀而减少时,追加也是有效的。另外,在本发明的L-赖氨酸羟化酶、包含该酶的细胞、该细胞的制备物或对该细胞进行培养而得到的培养液中已经包含足够量的二价铁离子的情况下,不添加也可。
反应通常在4℃~60℃、优选在10℃~45℃的反应温度下、通常以pH3~11、优选以pH5~8进行。反应时间通常为1小时~72小时左右。
关于添加至反应液中的细胞和/或该细胞制备物的量,在添加细胞的情况下,通常,以湿菌体重计,按照该细胞的浓度为0.1%w/v~50%w/v左右、优选为1%w/v~20%w/v的方式添加至反应液中,在使用酶之类的制备物的情况下,求出酶的比活性,在添加时添加达到上述细胞浓度的量。
对于利用本发明的制造方法生成的羟基-L-赖氨酸,在反应结束后,通过离心分离、膜处理等分离反应液中的菌体或蛋白质等后,可以适当组合利用1-丁醇、叔丁醇等有机溶剂的提取、蒸馏、利用了离子交换树脂或硅胶等的柱色谱、等电点下的晶析或利用一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的晶析等,从而进行纯化。
<羟基-L-2-哌啶酸的制造方法>
利用本发明的方法所制造的羟基-L-赖氨酸可以用于羟基-L-2-哌啶酸的制造。
作为由本发明的羟基-L-赖氨酸制造羟基-L-2-哌啶酸的方法,可以举出以下的3种方法。
由本发明的羟基-L-赖氨酸制造羟基-L-2-哌啶酸的第1方法如下所示。
<I>一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,使<I-1>选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶与羟基-L-赖氨酸反应,或者使<I-2>选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶、和氨基酸消旋酶与羟基-L-赖氨酸反应,生成通式(II)所表示的在1位具有双键的环状氨基酸,之后使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶与所得到的1位具有双键的环状氨基酸作用,生成下述通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)
下面,例示出路线进行说明。
路线1-1
路线1-1为使用选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶与N-甲基-L-氨基酸脱氢酶的情况(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)。
首先,利用选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的酶将化合物(a)(羟基-L-赖氨酸)转换为化合物(b),化合物(b)自发地转换为化合物(c)。并且,化合物(c)被N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)转换为化合物(d)(羟基-L-2-哌啶酸)。
此处,作为L-氨基酸氧化酶,只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含序列号26的氨基酸序列的蛋白质;或具有与序列号26有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
作为L-氨基酸脱氢酶,只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出Nature,1966,211,854中记载的蛋白质。
作为L-氨基酸转移酶(L-氨基酸氨基转移酶),只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含Eur.J.Biochem.,1998,254,347中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与其氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
作为N-甲基-L-氨基酸脱氢酶,只要是能够对将上述通式(II)的化合物转换为羟基-L-2-哌啶酸的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含序列号24的氨基酸序列的蛋白质;或具有与序列号24有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
路线1-2
路线1-2是使用选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶和氨基酸消旋酶、与N-甲基-L-氨基酸脱氢酶的情况(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)。
首先,通过氨基酸消旋酶将化合物(a)(羟基-L-赖氨酸)转换为D体的化合物(a’)(羟基-D-赖氨酸),通过选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的酶将其转换为化合物(b),化合物(b)自发地转换为化合物(c)。然后,化合物(c)被N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)转换为化合物(d)(羟基-L-2-哌啶酸)。
氨基酸消旋酶只要是能够对将羟基-L-赖氨酸转换为羟基-D-赖氨酸的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含序列号30的氨基酸序列的蛋白质;或具有与序列号30有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
D-氨基酸氧化酶只要是能够对将羟基-D-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含Biochemistry,2005,70,40中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与该氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
D-氨基酸脱氢酶只要是能够对将羟基-D-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出Microbiology,2010,156(Pt 1),60和Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2009,106,906中记载的DauA;或具有与DauA有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
D-氨基酸转移酶(D-氨基酸氨基转移酶)只要是能够对将羟基-D-赖氨酸的2位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出Protein Eng,1998,11,53中记载的D-AAT;或具有与D-AAT有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
作为N-甲基-L-氨基酸脱氢酶,只要是能够对将上述通式(II)的化合物转换为羟基-L-2-哌啶酸的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含序列号24的氨基酸序列的蛋白质;或具有与序列号24有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
路线1-1和1-2的反应可以分别进行各酶反应,但优选在同一反应体系中连续地进行。
更优选通过使包含催化各反应的酶的细胞与羟基-L-赖氨酸反应来进行。包含催化各反应的酶的细胞可以使用本来具有这些酶的微生物,但优选使用以编码各酶的DNA进行了转化的细胞,在路线1-1的情况下,优选使用以分别编码选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶与N-甲基-L-氨基酸脱氢酶的DNA进行了转化的细胞,在路线1-2的情况下,优选使用以分别编码选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶、氨基酸消旋酶与N-甲基-L-氨基酸脱氢酶的DNA进行了转化的细胞。
另外,这些DNA可以分别插入染色体中,也可以将这些DNA导入单一的载体中并对宿主进行转化,还可以在将这些DNA分别个别地导入载体中后对宿主进行转化。
需要说明的是,微生物等宿主细胞的转化方法、宿主的种类等与在2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的项目中说明过的情况相同。
需要说明的是,N-甲基-L-氨基酸脱氢酶由于辅酶需要NAD(P)H,因此优选还共存NAD(P)H的再生系统。即,在添加上述NAD(P)H的情况下,使由NAD(P)H生成的NAD(P)+再生为NAD(P)H可提高生产效率,因而优选,作为再生方法,可以举出:1)利用宿主微生物自身的NAD(P)+还原能力的方法;2)将具有由NAD(P)+生成NAD(P)H的能力的微生物或其制备物、或者葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等能够用于NAD(P)H的再生的酶(再生酶)添加至反应体系内的方法;3)在制造转化体时,将能够用于NAD(P)H的再生的酶即上述再生酶类的基因与本发明的DNA同时导入宿主中的方法。
其中,在上述1)的方法中,优选向反应体系中添加葡萄糖或乙醇、甲酸等。
另外,在上述2)的方法中,可以使用:包含上述再生酶类的微生物、对该微生物菌体进行了丙酮处理而得到的物质、进行冷冻干燥处理而得到的物质、通过物理方式或酶方式破碎而得到的物质等菌体制备物、将酶组分作为粗产物或纯化物取出而得到的物质、以及将它们固定化于以聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等为代表的载体而得到的物质等;或者也可以使用市售的酶。该情况下,需要添加成为再生酶的底物的化合物,例如,在利用葡萄糖脱氢酶时需要添加葡萄糖,在利用甲酸脱氢酶时需要添加甲酸,在利用醇脱氢酶时需要添加乙醇或异丙醇等。
在同一反应体系中连续进行路线1-1或1-2的反应时,优选在含有羟基-L-赖氨酸、利用编码各酶的基因群进行了转化的细胞、该转化后的细胞的制备物和/或对该转化后的细胞进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
作为所述水性介质,可以举出水或缓冲液。另外,作为所述有机溶剂,可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等反应底物的溶解度高的有机溶剂。作为有机溶剂,另外,也可以使用对反应副产物的除去等有效果的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、三氯甲烷、正己烷等。
关于成为反应底物的羟基-L-赖氨酸,通常,在底物浓度为0.01%w/v~90%w/v、优选为0.1%w/v~30%w/v的范围使用。反应底物可以在反应开始时一并添加,但从减少存在酶的底物抑制时的影响的方面、提高产物的蓄积浓度的方面出发,优选连续或间歇地添加。
根据需要,通常添加0.001mM~100mM、优选为0.01mM~10mM的NAD(P)H等辅酶。
反应通常在4℃~60℃、优选在10℃~45℃的反应温度下、通常以pH3~11、优选以pH5~8进行。反应时间通常为1小时~72小时左右。
对于利用本发明的方法生成的羟基-L-2-哌啶酸,在反应结束后,通过离心分离、膜处理等分离反应液中的菌体或蛋白质等后,可以适当组合利用1-丁醇、叔丁醇等有机溶剂的提取、蒸馏、利用了离子交换树脂或硅胶等的柱色谱、等电点下的晶析或利用一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的晶析等,从而进行纯化。
由本发明的羟基-L-赖氨酸制造羟基-L-2-哌啶酸的第2方法如下所示。
<II>一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶、L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶与羟基-L-赖氨酸发生反应,生成通式(IV)所表示的在6位具有双键的环状氨基酸,之后使吡咯啉-5-羧酸还原酶与所得到的6位具有双键的环状氨基酸作用,生成通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)
下面,例示出路线进行说明(式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或者羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基)。
路线2
首先,利用选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶、L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶将化合物(a)(羟基-L-赖氨酸)转换为化合物(b’),化合物(b’)自发地转换为化合物(c’)。然后,化合物(c’)被吡咯啉-5-羧酸(P5C)还原酶转换为化合物(d)(羟基-L-2-哌啶酸)。
L-赖氨酸6-氧化酶只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的6位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出Biochim.Biophys.Acta.,2006,17641577中记载的lodA;或具有与lodA有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
L-赖氨酸6-脱氢酶只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的6位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含J.Biochem.,105,1002-1008(1989)中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与该氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
L-赖氨酸6-转移酶(赖氨酸-6-氨基转移酶)只要是能够对将羟基-L-赖氨酸的6位的氨基转换为氧基的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含国际公开公报WO2001/048216号中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与该氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
吡咯啉-5-羧酸(P5C)还原酶只要是能够对将通式(IV)所表示的化合物转换为通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含国际公开公报WO2001/048216号中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与该氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
路线2的反应可以分别进行各酶反应,但优选在同一反应体系中连续进行。
更优选通过使包含催化各反应的酶的细胞与羟基-L-赖氨酸反应来进行。包含催化各反应的酶的细胞可以使用本来具有这些酶的细胞,但优选使用以编码各酶的DNA进行了转化的细胞,具体来说,优选使用以分别编码选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶、L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶和吡咯啉-5-羧酸(P5C)还原酶的DNA进行了转化的细胞。
需要说明的是,微生物等宿主细胞的转化方法、宿主的种类等与在2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的项目中说明过的情况相同。
在同一反应体系中连续进行路线2的反应的情况下,优选在含有羟基-L-赖氨酸、利用编码各酶的基因群进行了转化的细胞、该转化体的制备物和/或对该转化体进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
反应条件、辅酶的添加和再生、羟基-L-2-哌啶酸的回收方法与在上述<I>的项中说明的情况相同。
由本发明的羟基-L-赖氨酸制造羟基-L-2-哌啶酸的第3方法如下所示。
<III>一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,使赖氨酸环化脱氨酶与羟基-L-赖氨酸作用,生成通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸。
赖氨酸环化脱氨酶只要是能够对将羟基-L-赖氨酸转换为羟基-L-2-哌啶酸的反应进行催化的酶就没有特别限制,例如,可以举出包含Biochimie 2007,89,591中记载的氨基酸序列的蛋白质;或具有与该氨基酸序列有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的同源性的氨基酸序列且可保持该活性的蛋白质。
基于赖氨酸环化脱氨酶的反应优选通过使包含赖氨酸环化脱氨酶的细胞与羟基-L-赖氨酸反应而进行。包含赖氨酸环化脱氨酶的微生物可以使用本来具有这些酶的细胞,但优选使用以编码赖氨酸环化脱氨酶的DNA进行了转化的细胞。
需要说明的是,微生物等宿主细胞的转化方法、宿主的种类等与在2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的项目中说明过的情况相同。
利用赖氨酸环化脱氨酶进行羟基-L-赖氨酸向羟基-L-2-哌啶酸转换的反应的情况下,优选在含有羟基-L-赖氨酸、利用编码赖氨酸环化脱氨酶的DNA进行了转化的细胞、该转化体的制备物和/或对该转化体进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
反应条件、辅酶的添加和再生、羟基-L-2-哌啶酸的回收方法与在上述<I>的项中说明过的情况相同。
需要说明的是,还可以同时使用2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶、和进行羟基-L-赖氨酸向羟基-L-2-哌啶酸转换的反应的酶或酶群,由L-赖氨酸直接制造羟基-L-2-哌啶酸,但是由于在2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶作用于L-赖氨酸之前,进行羟基-L-赖氨酸向羟基-L-2-哌啶酸转换的反应的酶或酶群有可能作用于L-赖氨酸而副产生L-2-哌啶酸,因此,关于进行羟基-L-赖氨酸向羟基-L-2-哌啶酸转换的反应的酶或酶群,需要选择与L-赖氨酸相比优先作用于羟基-L-赖氨酸的物质。该情况下,也可以利用2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶、和进行羟基-L-赖氨酸向羟基-L-2-哌啶酸转换的反应的酶或酶群的DNA同时转化宿主细胞而使用。
另外,在将通过本发明的方法所制造的羟基-L-赖氨酸用于羟基-L-2-哌啶酸的制造时,也可以省略羟基-L-赖氨酸的纯化,仅在转换为羟基-L-2-哌啶酸后进行纯化。
[实施例]
下面,通过实施例来更详细地说明本发明,但本发明不限定于此。
实施例1
2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶基因的克隆
基于编码约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)NBRC14942株来源的L-精氨酸β羟化酶VioC同源物Hyl-1(基因库登录号ABQ06186、序列号2)的基因序列(hyl-1、序列号1),设计、合成了用于扩增hyl-1基因的全长的引物hyl1_F(序列号13)和hyl1_R(序列号14)。以约氏黄杆菌的染色体DNA为模板,根据常规方法进行PCR反应,得到约1.0kbp的DNA片段。
同样地,对于耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)NBRC101839株、松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC15968株、粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)NBRC15054株、朝鲜农研所丝杆菌(Niastella koreensis)NBRC106392株来源的VioC同源物,分别为Hyl-2(基因库登录号ABS05421、序列号4)、Hyl-3(基因库登录号ACU60313、序列号6)、Hyl-4(基因库登录号EFK34737、序列号8)、Hyl-5(基因库登录号AEV99100、序列号10)。基于编码各酶的基因序列(hyl-2(序列号3)、hyl-3(序列号5)、hyl-4(序列号7)、hyl-5(序列号9)),设计、合成了用于扩增各基因的全长的引物。对于hyl-2,合成引物hyl2_f(序列号15)和hyl2_r(序列号16),对于hyl-3,合成引物hyl3_f(序列号17)和hyl3_r(序列号18),对于hyl-4,合成引物hyl4_f(序列号19)和hyl4_r(序列号20),对于hyl-5,合成引物hyl5_f(序列号21)和hyl5_r(序列号22),以各株的染色体DNA为模板并根据常规方法进行了PCR反应。分别得到约1.0kbp的DNA片段。
分别利用限制酶NdeI、XhoI对所得到的5种DNA片段进行消化,根据常规方法连接至利用NdeI、XhoI进行了消化的pET21a(Novagen),从而分别得到pEHYL1、pEHYL2、pEHYL3、pEHYL4、pEHYL5。
另外,由DNA2.0社人工合成编码海洋放线菌marine actinobacterium PHSC20C1来源的Hyl-6(基因库登录号EAR24255、序列号12)的基因序列(hyl-6、序列号11),制作插入于pJExpress401(DNA2.0)的质粒pJHYL6。
接着,使用所得到的各质粒,根据常规方法对大肠杆菌(Eschelichia coli)BL21(DE3)(Invitrogen制造)进行转化,得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pEHYL1、BL21(DE3)/pEHYL2、BL21(DE3)/pEHYL3、BL21(DE3)/pEHYL4、BL21(DE3)/pEHYL5、BL21(DE3)/pJHYL6。为了得到表达所导入的基因的菌体,对于各重组大肠杆菌,利用含有氨苄青霉素和lac启动子诱导物质的液体LB培养基在30℃进行培养,培养约第20小时收集菌体。
实施例2
基于静止细胞反应的2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的活性确认
在塑料管内混合5mM L-赖氨酸、10mM 2-酮戊二酸、1mM L-抗坏血酸、0.1mM硫酸亚铁、以及利用根据实施例1的方法得到的重组大肠杆菌,按照浊度OD600=10的方式来混合反应液。使所制备的混合液0.5ml在30℃、pH7.0的条件下反应3小时。利用1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(FDAA)使反应产物衍生物化,之后通过HPLC进行分析。其结果,如图1、图2所示,确认到BL21(DE3)/pEHYL2、BL21(DE3)/pJHYL6在3-羟基赖氨酸标准物品的保持时间为8.04分钟时生成一致的化合物。另外,确认到BL21(DE3)/pEHYL1、BL21(DE3)/pEHYL3、BL21(DE3)/pEHYL4、BL21(DE3)/pEHYL5在4-羟基赖氨酸标准物品的保持时间为8.16分钟时生成一致的化合物。
需要说明的是,基于HPLC的羟基赖氨酸分析条件如下所述。
柱:Nacalai Tesque社制造COSMOSIL 5C18-AR-II(4.6mm×150mm)、流动相:50mM磷酸缓冲液(pH2.7)、流速:1.0mL/分钟、柱温:40℃、UV:340nm
实施例3
(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的合成
在1L发酵罐中混合1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)35mL、脱盐水304mL、L-赖氨酸盐酸盐1.28g、2-酮戊二酸2.05g、L-抗坏血酸钠0.14g、硫酸亚铁0.02g、Adekanol LG109 0.35g、和利用根据实施例1的方法得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pEHYL2的湿菌体8g,在30℃、pH7.0、搅拌数500rpm、空气的通气量2.0vvm的条件下反应17小时。通过基于HPLC的分析来确认L-赖氨酸的峰消失,由此判断反应结束。通过离心分离和微滤,从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣,得到390g的滤液。
需要说明的是,基于HPLC的L-赖氨酸分析条件如下所述。
柱:住化分析中心社制造SUMICHIRAL OA-6100(4.6mm×250mm)、流动相:1mM硫酸铜、流速:1.0mL/分钟、柱温:30℃、UV:254nm
使滤液390g通过离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)60.0g),用水清洗后,用含有150mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液,得到(2S,3S)-3-羟基赖氨酸1.0g(6.17mmol、收率88%)。
下面示出所得到的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ,1.45-1.58(2H,m),1.63-1.73(1H,m),1.74-1.88(1H,m),2.93-3.04(2H,m),3.47(1H,d,J=4.3Hz),3.89(1H,dt,J=8.4,4.5Hz)
实施例4
(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的立体化学确定
向烧瓶中添加利用根据实施例3的方法得到的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸8.3mg(0.051mmol)、1mol/L氢氧化钠水溶液0.26ml、苄氧基碳酰氯18μl(0.13mmol),在室温搅拌1小时。进而添加1mol/L氢氧化钠水溶液0.26ml、苄氧基碳酰氯18μl(0.13mmol),在室温反应一晩后,添加四氢呋喃0.5ml,在60℃进而反应2小时。冷却至室温后,添加氢氧化钠95mg,在室温反应一晚。将反应液用甲苯-四氢呋喃(1:1)清洗2次后,添加浓盐酸250μl使其为强酸性,进而用乙酸乙酯清洗3次后,用1-丁醇对水层进行4次提取。用无水硫酸镁将1-丁醇层干燥后,进行浓缩,以白色固体的形式得到(4S,5S)-5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸14.6mg(0.045mmol、收率89%)。
将NOESY测定的结果示于下式。在3位氢原子(H4)与4位氢原子(H5)之间观测到交叉峰,在4位与1’位间未观测到交叉峰,因而可以确定4位和5位的取代基为顺式构型。由于酶反应中使用的赖氨酸的绝对构型为S,因而可以确定:本实施例中得到的5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸具有(4S,5S)的立体化学,作为其原料的3-羟基赖氨酸具有(2S,3S)的立体化学。
下面示出所得到的(4S,5S)-5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)δ,1.39-1.53(3H,m,H1',H2'x2),1.59-1.68(1H,m,H1'),3.02-3.08(2H,m,H3'),3.60-3.64(1H,m,H4),3.93-4.00(1H,m,H5),4.90-5.02(2H,m,Bn),7.18-7.28(5H,m,Bn).
[参考例1]
共表达[N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(下文中称为DpkA)、L-氨基酸氧化酶(下文中称为AIP)、葡萄糖-1-脱氢酶(下文中称为GDH)和氨基酸消旋酶(下文中称为KR)的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的制备例]
(1)基因的克隆
基于编码恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的DpkA(基因库登录号BAD89743、序列号24)的基因序列(下文中称为dpkA、序列号23),设计、合成了用于扩增dpkA基因的全长的引物dpkA_F(序列号31)和dpkA_R(序列号32)。以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的染色体DNA为模板,根据常规方法进行PCR,得到约1.0kbp的DNA片段。
设计并人工合成了编码蛋白质AIP(序列号26)的基因序列(下文中称为aip、序列号25),该蛋白质AIP在从日本鲭(Scomber japonicus)来源的L-氨基酸氧化酶(基因库登录号CAC00499)除去信号肽而得到的序列中添加了蛋氨酸。进而设计、合成了用于扩增aip基因的全长的引物aip_F(序列号33)和aip_R(序列号34)。根据常规方法进行PCR,得到约1.5kbp的DNA片段。
基于编码在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的GDH(基因库登录号NP_388275)中将96位的氨基酸残基谷氨酸取代为丙氨酸的蛋白质(序列号28)的基因序列(下文中称为gdh、序列号27),设计、合成了用于扩增gdh的基因的全长的引物gdh_F(序列号35)和gdh_R(序列号36)。
根据常规方法进行PCR,得到约0.8kbp的DNA片段。
基于编码恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的KR(基因库登录号NP_745855、序列号30)的基因序列(下文中称为kr、序列号29),设计、合成了用于扩增rk基因的全长的引物kr_F(序列号37)和kr_R(序列号38)。以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的染色体DNA为模板,根据常规方法进行PCR,得到约1.2kbp的DNA片段。
(2)表达用质粒的制备
分别利用限制酶EcoRI和XbaI对上述(1)中得到的DNA片段进行消化,在利用MunI和XbaI进行了消化的国际公开公报WO2012/029819号中记载的质粒pKW32中,利用Ligation-Convenience Kit(Nippon Gene社制造)导入至trc启动子的下游,分别得到pKW32dpkA、pKW32aip、pKW32gdh、pKW32kr。
接下来,利用SpeI和NdeI消化pKW32aip,将包含aip的约2.4kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32dpkA所得到的开环质粒约4.2kbp的dpkA的下游,得到pKW32(dpkA,aip)。
此外,利用SpeI和NdeI消化pKW32gdh,将包含gdh的约1.7kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32(dpkA、aip)所得到的开环质粒约5.7kbp的aip的下游,得到pKW32(dpkA,aip,gdh)。
最后,利用SpeI和NdeI消化pKW32kr,将包含kr的约2.1kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32(dpkA,aip,gdh)所得到的开环质粒约6.5kbp的gdh的下游,得到pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)。
(3)表达株的制备
利用上述(2)中得到的质粒pKW32(dpkA,aip,gdh,kr),根据常规方法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(宝生物株式会社制造),得到重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)。
实施例5
(2S,3S)-3-羟基2-哌啶酸的制造
在塑料管中混合1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)0.75mL、脱盐水9.21mL、实施例3中得到的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸86mg、50mM NADPH 0.083ml、1.0M葡萄糖0.7ml、和参考例1中得到的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的100g/L悬浮液1.25ml,在30℃、pH8.0、搅拌数1000rpm的条件下反应20小时。通过基于HPLC的分析来确认(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的峰消失,由此判断反应结束。通过离心分离从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣,得到10.5g的上清。
基于HPLC的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸分析条件如下所述。
柱:SUPELCO社制造CLC-D(4.6mm×150mm)、流动相:2mM硫酸铜、流速:1.0mL/分钟、柱温:30℃、UV:254nm
使上清10.5g通过离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)4.0g),用水清洗后,用含有16.4mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液,得到了褐色固态物质255mg。NMR分析的结果,该固态物质是含有(2S,3R)-3-羟基2-哌啶酸20重量%(0.35mmol、收率66.3%)、三羟甲基氨基甲烷80重量%的混合物。
下面示出所得到的固态物质的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ,1.38-1.56(2H,m),1.73-1.85(2H,m),2.71-2.79(1H,m),3.04-3.11(1H,m),3.23(1H,d,J=7.6Hz),3.79-3.86(1H,m).
实施例6
(2S,4R)-4-羟基赖氨酸的合成
在1L发酵罐中混合脱盐水335mL、L-赖氨酸盐酸盐1.28g、2-酮戊二酸2.05g、L-抗坏血酸钠0.14g、硫酸亚铁0.02g、Adekanol LG109 0.35g、和利用根据实施例1的方法得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pEHYL1的湿菌体8g,在30℃、pH6.8、搅拌数500rpm、空气的通气量2.0vvm的条件下反应19小时。通过基于HPLC的分析来确认L-赖氨酸的峰消失,由此判断反应结束。通过离心分离和微滤,从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣。其结果,得到345g的滤液。
需要说明的是,基于HPLC的L-赖氨酸分析条件如下所述。
柱:住化分析中心社制造SUMICHIRAL OA-6100(4.6mm×250mm)、流动相:1mM硫酸铜、流速:1.0mL/分钟、柱温:30℃、UV:254nm
使所得到的滤液345g通过用NH3进行了置换的离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)40.0g),用水清洗后,用含有64mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液,得到(2S,4R)-4-羟基赖氨酸1.1g(6.79mmol、收率97%)。
下面示出所得到的(2S,4R)-4-羟基赖氨酸的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ,1.50-1.65(3H,m),1.71(1H,ddd,J=14.4,9.1,4.3Hz),2.62-2.75(2H,m),3.32(1H,dd,J=8.6,4.8Hz),3.72-3.80(1H,m).
实施例7
(2S,4R)-4-羟基赖氨酸的立体化学确定
在烧瓶中添加实施例6中得到的(2S,4R)-4-羟基赖氨酸47mg(0.30mmol)、水0.2ml、6N盐酸0.2ml,在室温下反应1小时。浓缩反应液,以白色结晶的形式得到粗(3S,5R)-3-氨基-5-(2-氨基乙基)-2(3H)-二氢呋喃酮二盐酸盐67mg。
将所得到的粗(3S,5R)-3-氨基-5-(2-氨基乙基)-2(3H)-二氢呋喃酮二盐酸盐42mg(0.19mmol)、三乙胺0.56ml(4.0mmol)、二氯甲烷1ml投入烧瓶,在冰冷条件下添加三氟乙酸酐0.14ml(1.0mmol)。搅拌2小时后浓缩反应液,用硅胶柱色谱进行纯化。将所得到的油状物质溶解于乙酸乙酯中,用碳酸钾水溶液、饱和盐水进行清洗。用乙酸乙酯对水层进行再提取,将所得到的有机层用硫酸镁干燥,浓缩有机层,得到了褐色油状物质43mg。NMR分析的结果,该油状物质是含有(3S,5R)-3-三氟乙酰氨基-5-(2-三氟乙酰氨基乙基)-2(3H)-二氢呋喃酮34重量%(0.044mmol、收率23%)、三乙胺·三氟乙酸盐66重量%的混合物。
将NOESY测定的结果示于下式。在3位氢原子(H3)与5位氢原子(H5)之间、以及4位氢原子的一者(H4a)与3位和5位的氢原子之间观测到交叉峰,因而可以确定3位和5位的取代基为顺式构型。由于酶反应中使用的赖氨酸的绝对构型为S,因而可以确定:3-三氟乙酰氨基-5-(2-三氟乙酰氨基乙基)-2(3H)-二氢呋喃酮具有(3S,5R)的立体化学,作为其原料的4-羟基赖氨酸具有(2S,4R)的立体化学。
下面示出所得到的(3S,5R)-3-三氟乙酰氨基-5-(2-三氟乙酰氨基乙基)-2(3H)-二氢呋喃酮的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ1.93-2.22(3H,m,H4b,H1'x2),2.76(1H,ddd,J=12.6,8.8,5.6Hz,H4a),3.51-3.56(2H,m,H2'),4.52-4.60(1H,m,H5),4.75(1H,dd,J=11.9,9.1Hz,H3),7.86(1H,brs,NH),8.87(1H,brs,NH).
实施例8
(2S,4R)-4-羟基2-哌啶酸的制造
在塑料管中混合1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)0.75mL、脱盐水9.21mL、实施例6中得到的(2S,4R)-4-羟基赖氨酸86mg、50mM NADPH 0.083ml、1.0M葡萄糖0.7ml、和参考例1中得到的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的100g/L悬浮液1.25ml,在30℃、pH8.0、搅拌数1000rpm的条件下反应20小时。通过基于HPLC的分析来确认(2S,4R)-4-羟基赖氨酸的峰消失,由此判断反应结束。通过离心分离从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣,得到上清10.5g。
基于HPLC的(2S,4R)-4-羟基赖氨酸分析条件如下所述。
柱:SUPELCO社制造CLC-D(4.6mm×150mm)、流动相:2mM硫酸铜、流速:1.0mL/分钟、柱温:30℃、UV:254nm
使上清10.5g通过离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)4.0g),用水清洗后,用含有16.4mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液,得到了褐色固态物质219mg。NMR分析的结果,该固态物质是含有(2S,4R)-4-羟基2-哌啶酸22重量%(0.33mmol、收率62.6%)、三羟甲基氨基甲烷78重量%的混合物。
下面示出所得到的(2S,4R)-4-羟基2-哌啶酸的物性的测定结果。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ,1.28-1.45(2H,m),1.91-1.99(1H,m),2.26-2.33(1H,m),2.77(1H,td,J=13.2,3.1Hz),3.25(1H,ddd,J=13.2,4.4,2.6Hz),3.36-3.41(1H,m),3.78(1H,tt,J=11.1,4.5Hz).
工业实用性
本发明能够用作作为药物的中间体等有用的羟基-L-赖氨酸的制造法、和利用了所得到的羟基-L-赖氨酸的羟基-L-2-哌啶酸的制造法。
Claims (8)
1.一种羟基-L-赖氨酸的制造方法,其特征在于,使2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的包含2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的培养液与作为反应底物的L-赖氨酸作用,生成下述通式(I)所表示的羟基-L-赖氨酸,
式中,R1、R2和R3分别表示氢原子或羟基,R1、R2和R3中的至少一个表示羟基,
所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶为序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,包含所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞是用编码所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA进行了转化的细胞。
3.如权利要求2所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,编码所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的DNA为序列号1、3、5、7、9或11所表示的碱基序列的DNA。
4.如权利要求1~3中任一项所述的羟基-L-赖氨酸的制造方法,其中,使所述2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶或包含该2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶的细胞、所述细胞的制备物或者对所述细胞进行培养而得到的培养液在2-酮戊二酸和二价铁离子的存在下与所述L-赖氨酸作用。
5.一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用权利要求1~4中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶、或者选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶和氨基酸消旋酶与所得到的羟基-L-赖氨酸发生反应,生成下述通式(II)所表示的化合物,之后使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶与所得到的化合物作用,生成下述通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸,
式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同,
式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同。
6.一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用权利要求1~4中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶、L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶与所得到的羟基-L-赖氨酸发生反应,生成下述通式(IV)所表示的化合物,之后使吡咯啉-5-羧酸还原酶与所的得到的化合物作用,生成下述通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸,
式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同,
式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同。
7.一种羟基-L-2-哌啶酸的制造方法,其特征在于,利用权利要求1~4中任一项所述的制造方法制造羟基-L-赖氨酸,使赖氨酸环化脱氨酶与所得到的羟基-L-赖氨酸作用,生成下述通式(III)所表示的羟基-L-2-哌啶酸,
式中,R1、R2和R3与通式(I)含义相同。
8.一种2-酮戊二酸依赖型L-赖氨酸羟化酶蛋白,其具有与L-赖氨酸作用而生成羟基-L-赖氨酸的活性,其是序列号2、4、6、8、10或12所表示的氨基酸序列的多肽。
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