JP2019062927A - Ｌ−リジン水酸化酵素およびそれを利用したヒドロキシ−ｌ−リジンの製造法およびヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造法 - Google Patents

Ｌ−リジン水酸化酵素およびそれを利用したヒドロキシ−ｌ−リジンの製造法およびヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造法 Download PDF

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Abstract

【課題】効率よくヒドロキシ-L-リジンを製造できる方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、L-リジンに2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式(I)(式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す)で表されるヒドロキシ-L-リジンを生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-リジンの製造方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、新規なリジン水酸化酵素を利用したヒドロキシ-L-リジンの製造法、および得られたヒドロキシ-L-リジンを利用したヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造法に関するものである。
ヒドロキシ-L-リジンは、医薬品の中間体等として有用な中間体である。例えば、(3R)-ヒドロキシ-L-リジンはプロテインキナーゼC阻害剤 (-)-balanolの前駆体として利用可能であり（非特許文献１）、(5R)-ヒドロキシ-L-リジンは抗腫瘍活性のあるBengamide Bの前駆体として利用可能である（非特許文献２）ことが知られている。また、ヒドロキシ-L-リジンはヒドロキシ-L-ピペコリン酸の原料として利用可能なことも報告されている（非特許文献３，４）。例えば、(4R)-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸はHIVプロテアーゼ阻害剤palinavirの前駆体として利用可能であり（非特許文献５）、(5S)-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸および(5R)-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸は抗菌剤の前駆体として利用可能である（特許文献１）。
ヒドロキシ-L-リジンの合成法としては、たとえば、(3R)-ヒドロキシ-L-リジンはRu触媒による不斉水素化を活用した方法が報告されている（非特許文献１）。
なお、アミノ酸水酸化酵素は、医薬品の中間体等の製造に有用な酵素であり、プロリン4位水酸化酵素（非特許文献６）やL-イソロイシンジオキシゲナーゼ（非特許文献７）などの存在が報告されている。しかしながら、L-リジンに作用する酵素はこれまでに報告されていない。
特表2004-505088号公報
Coulonら、Tetrahedron Lett., 1998, 39, 6467 Kinderら、J. Org. Chem., 2001, 66, 2118 Yasudaら、Tetrahedron Asymm., 2006, 17, 1775 Tsotsouら、Biochemie, 2007, 89, 591 Gillardら、J. Org. Chem., 1996, 61, 2226 Shibasakiら、Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65, 4028 Hibiら、Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77, 6926
非特許文献１に記載のヒドロキシ-L-リジンの合成法は、原料の調製が煩雑であり、また、触媒の調製やリサイクルのためのコスト負荷が大きく、より効率的な合成法が求められていた。
本発明は、より光学純度の高いヒドロキシ-L-リジンを、安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、光学活性ヒドロキシ-L-リジンの製造方法について鋭意検討した結果、これまでタンパク質として単離された報告が無く、機能が不
明であったＬ−アルギニンβヒドロキシラーゼＶｉｏＣのホモログタンパク質が2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有することを見出した。そしてこれらのタンパク質をコードするDNAを用いて形質転換体を作製し、該形質転換体細胞、その調製物および／または培養液をL-リジンに作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度でヒドロキシ-L-リジンを得ることができることを見出した。さらに、得られたヒドロキシ-L-リジンを用いてヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１） L-リジンに2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式(I)
(式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す)で表されるヒドロキシ-L-リジンを生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-リジンの製造方法。
（２） 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素が、以下の(A)、(B)または(C)に示すポリペプチドを含む、（１）に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法：
(A) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列を有し、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド；または
(C) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
（３） 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞が、前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするDNAで形質転換された細胞である、（１）または（２）に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法。
（４） 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするDNAが以下の(D)、(E)または（F）に示すDNAを含む、（３）に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法：
(D) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列を有するDNA；
(E) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失及び／または付加された塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA；または
(F) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リ
ジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
（５） 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を、2-オキソグルタル酸、および２価の鉄イオンの存在下、前記L-リジンに作用させる、（１）〜（４）のいずれかに記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法。
（６） （１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、L-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、もしくはD-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素およびアミノ酸ラセマーゼを反応させ、下記一般式(II)
(式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表される化合物を生成させた後、得られた化合物に、N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させて、下記一般式(III)
(式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
（７） （１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、L-リジン 6-オキシダーゼ、L-リジン 6-デヒドロゲナーゼ、L-リジン 6-トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素を反応させ、下記一般式(IV)
(式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表される化合物を生成させた後、得られた化合物に、ピロリン-5-カルボン酸レダクターゼを作用させて、下記一般式(III)
(式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
（８） （１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させて、下記一般式(III)
(式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
（９） L-リジンに作用してヒドロキシ-L-リジンを生成する活性を有し、かつ、以下の(A)、(B)または(C)に示すポリペプチドを含む、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素タンパク質：
(A) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド；
(B) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列を有し、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド；または
(C) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
本発明によれば、効率よくヒドロキシ-L-リジンを製造することができ、さらに、光学純度の高いヒドロキシ-L-リジンを得ることができる。また、得られたヒドロキシ-L-リジンから効率よく、光学純度の高いヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造することができる。
Hyl-1,3,4,5によるL-リジンの4-ヒドロキシリジンへの変換を示す図。 Hyl-2,6によるL-リジンの3-ヒドロキシリジンへの変換を示す図。
以下に、本発明を詳細に説明する。
＜2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を用いたヒドロキシ-L-リジンの製造方法＞
本発明のヒドロキシ-L-リジンの製造方法は、L-リジンに、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を作用させることを特徴とする。本発明の製造方法は、後述するように、2-オキソグルタル酸および2価鉄イオンの存在下、行なうことが好ましい。
本発明で使用される2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素（以下、「本発明のL-リジン水酸化酵素」と称することがある。）はL-リジンを水酸化する際の位置選択性および立体選択性が高いため、これを用いることにより、効率よく、光学純度の高いヒドロキシ-L-リジンを得ることができる。
本発明のL-リジン水酸化酵素は、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有する酵素であれば特に制限はないが、配列番号２，４，６，８，１０または１２に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであって2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するものであることが好ましい。即ち、本発明のL-リジン水酸化酵素は、以下の(A)、(B)または(C)に示すポリペプチドを含むものであることが好ましい。
(A) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列を有し、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド；または
(C) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
本発明において使用しうる、配列番号２，４，６，８，１０または１２に記載のアミノ酸配列を有する2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素のホモログとしては、前記(B)に記載の通り、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を保持する限り、配列番号２，４，６，８，１０または１２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ここで「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１個〜１００個、好ましくは１個〜５
０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個、のアミノ酸である。
また、上記ホモログは、前記(C)に記載の通り、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を保持する限り、配列番号２，４，６，８，１０または１２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
本明細書において、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性とは、2-オキソグルタル酸依存的にL-リジンの３位、４位および／または５位の炭素原子に水酸基を付加する活性をいう。このような活性は、L-リジンを基質として含有し、さらに2-オキソグルタル酸を補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する細胞またはその調製物を作用させて、後述の実施例のようにヒドロキシ-L-リジンの生成を測定することにより確認することができる。
配列番号２，４，６，８，１０または１２に記載のアミノ酸配列はそれぞれ、フラボバクテリウム・ジョンソネ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ） ＵＷ１０１株、キネオコッカス・ラジオトレランス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ） ＳＲＳ３０２１６株、キチノファーガ・ピネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ） ＤＳＭ２５８８株、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ） ＡＴＣＣ３５９１０株、ニアステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ） ＧＲ２０−１０株、海洋性放線菌（ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ＰＨＳＣ２０Ｃ１のゲノム情報に基づくものである。
また、配列番号２，４，６，８，１０または１２に記載のアミノ酸配列はそれぞれ、タンパク質をコードすると予測されたDNA配列の翻訳アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＢＱ０６１８６、ＡＢＳ０５４２１、ＡＣＵ６０３１３、ＥＦＫ３４７３７、ＡＥＶ９９１００およびＥＡＲ２４２５５と同一である。いずれも、タンパク質として単離するなどして、実際に存在を確認した報告例は無く、タンパク質としての機能についても全く不明であったものである。
配列番号２、６、８、および１０のアミノ酸配列を含む本発明のL-リジン水酸化酵素は、L-リジンの４位を水酸化するので、（２Ｓ,４Ｒ）ヒドロキシ‐Ｌ−リジンを生成することができる。これらの中では、収率が高いことから、配列番号８が好ましい。
一方、配列番号４、および１２のアミノ酸配列を含む本発明のL-リジン水酸化酵素は、L-リジンの３位を水酸化するので、（２Ｓ,３Ｓ）ヒドロキシ‐Ｌ−リジンを生成することができる。これらの中では、収率が高いことから、配列番号１２が好ましい。
なお、本発明の製造方法において、複数の2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を併用してもよい。
本発明に使用しうる2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素は、それぞれ、フラボバクテリウム・ジョンソネ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）、キネオコッカス・ラジオトレランス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、キチノファーガ・ピネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ）、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）、ニアステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、または、海洋性放線菌（ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から精製して得ることもできるが、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするDNAをＰＣＲやハイブリダイゼーションなどの公知の方法でクローン化し、それを適当な宿主で発現させることによって得ることもできる。
配列番号２，４，６，８，１０または１２に示されるアミノ酸配列を有する2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号１，３，５，７，９または１１の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１，３，５，７，９または１１の塩基配列を含むＤＮＡのホモログでもよい。即ち、本発明のL-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡとしては、以下の(D)、(E)または(F)に示す塩基配列が挙げられる。
(D) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列を有するDNA；
(E) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失及び／または付加された塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA；または
(F) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
ホモログとしては、例えば、前記(E)に記載の通り、配列番号１、３、５、７、９または１１の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含むものが挙げられる。ここでいう１または数個の塩基とは、例えば、１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、特に好ましくは１個〜１５個、の塩基である。
さらに、上記ＤＮＡのホモログは、前記(F)に記載の通り、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１，３，５，７，９または１１の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
当業者であれば、配列番号１，３，５，７，９または１１のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、上記のようなＤＮＡホモログを得ることが可能である。
また、配列番号２，４，６，８，１０または１２のアミノ酸配列またはその一部や、配列番号１，３，５，７，９または１１で表される塩基配またはその一部をもとに、例えばＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性のアミノ酸情報またはそれをコードするＤＮＡの塩基配列情報を手に入れることも可能である。
本発明のヒドロキシ-L-リジンの製造方法においては、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を直接反応に使用してもよいが、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞やその調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を用いることが好ましい。
2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞としては、もともと2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を有する微生物などの細胞を用いてもよいが、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードする遺伝子で形質転換された微生物などの細胞を用いることが好ましい。ここで、細胞としては、その生死は問わず、例えば、休止菌体等を好適に用いることができる。
また、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞の調製物としては、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞調製物、細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。
2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞を培養して得られた培養液としては、例えば、該細胞と液体培地の懸濁液や、該細胞が分泌発現型細胞である場合は該細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物を用いることができる。
上記のようにして単離された、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素発現ベクターが提供される。そして、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を得ることができる。形質転換体は、宿主の染色体ＤＮＡに2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡを相同組み換えなどの手法によって発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物などの宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に該ＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。このとき、宿主において適当なプロモーターをＤＮＡの５'−側上流に連結させることは好ましく、さらに、ターミネーターを３'−側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに宿主微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターが詳細に記述されている。
2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体がL-リジンの反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクタ
ー系の確立されている酵母。
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）。
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））などを挙げることができる。
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドなどが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターなどを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（例えば、蚕）などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
本発明の製造方法では、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素、前記酵素を含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を、2-オキソグルタル酸の存在下、反応基質であるL-リジンに作用させることにより、下記一般式（Ｉ）
(式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す)
で表されるヒドロキシ-L-リジンを製造することができる。
上記一般式（Ｉ）のR1、R2、R3は、それぞれ、最終的に得たい化合物を考慮して選択すればよいが、中でも、R1、R2およびR3の一つまたは二つがヒドロキシル基であることが好ましく、R1、R2およびR3の一つがヒドロキシル基であることがより好ましい。
本発明の製造方法は、L-リジンに、2-オキソグルタル酸、及び2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を作用させることができれば特に制限はないが、通常、水性媒体中、もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われることが好ましい。本発明の製造方法は、さらに、２価の鉄イオンの存在下で行なうことが好ましい。
前記水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。
また、前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等
、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。前記有機溶媒としてはまた、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等を使用することもできる。
反応基質となるL-リジンは、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応に必要な2-オキソグルタル酸は、通常、基質と等モルまたはそれ以上、好ましくは等モル〜１．２倍モルの範囲で添加する。2-オキソグルタル酸は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素への阻害作用があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。または2-オキソグルタル酸の代わりにグルコース等の宿主が代謝可能な安価な化合物を添加し、宿主に代謝させ、その過程で生じる2-オキソグルタル酸を反応に使用させることも可能である。
本発明の製造方法は、２価の鉄イオンの存在下で行なうことが好ましい。２価の鉄イオンは、通常０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で用いることが好ましい。２価の鉄イオンは、硫酸鉄などとして、反応開始時に一括して添加することができるが、反応中に、添加した２価の鉄イオンが３価に酸化されたり、沈殿を形成して減少してしまった場合には追添加することも効果的である。また、本発明のL-リジン水酸化酵素、該酵素を含む細胞、該細胞の調製物または該細胞を培養して得られる培養液に既に充分な量の２価の鉄イオンが含まれている場合は必ずしも添加しなくてもよい。
反応は、通常４℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は通常、１時間〜７２時間程度である。
反応液に添加する細胞及び／又は該細胞調製物の量は、細胞を添加する場合は反応液にその細胞の濃度が通常、湿菌体重で０．１％ｗ／ｖ〜５０％ｗ／ｖ程度、好ましくは１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖとなるように添加し、酵素のような調製物を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
本発明の製造方法により生成するヒドロキシ-L-リジンは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質などを遠心分離、膜処理などにより分離した後に、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
＜ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法＞
本発明の方法により製造されたヒドロキシ-L-リジンはヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造に使用できる。
本発明のヒドロキシ-L-リジンからヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造する方法としては、以下の３種類の方法が挙げられる。
本発明のヒドロキシ-L-リジンからヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造する第１の方法は以下に示すとおりである。
＜I＞ヒドロキシ-L-リジンに、＜I−1＞L-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素を反応させるか、もしくは＜I−２＞D-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、およびアミノ酸ラセマーゼを反応させることにより、一般式(II)で表される1位に二重結合を
もつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた1位に二重結合をもつ環状アミノ酸に、N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させて、下記一般式(III)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
(式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す)
以下、スキームを例示して説明する。
スキーム１−１はL-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを使用する場合である（式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す）。
まず、L-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素により化合物（ａ）（ヒドロキシ-L-リジン）を化合物（ｂ）に変換し、化合物（ｂ）は自発的に化合物（ｃ）に変換される。そして、化合物（ｃ）はN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）により化合物（ｄ）（ヒドロキシ-L-ピペコリン酸）に変換される。
ここで、L-アミノ酸オキシダーゼとしては、ヒドロキシ-L-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号２６と８０％以上、好ましくは
９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
L-アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、ヒドロキシ-L-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Nature, 1966, 211, 854に記載のタンパク質が挙げられる。
L-アミノ酸トランスフェラーゼ（L-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）としては、ヒドロキシ-L-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Eur. J. Biochem., 1998, 254, 347に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、上記一般式(II)の化合物をヒドロキシ-L-ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質または、配列番号２４と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
スキーム１−２はD-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、およびアミノ酸ラセマーゼと、N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを使用する場合である（式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す）。
まず、アミノ酸ラセマーゼにより化合物（ａ）（ヒドロキシ-L-リジン）をD体の化合物（ａ’）（ヒドロキシ-D-リジン）に変換し、これをD-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素により化合物（ｂ）に変換し、化合物（ｂ）は自発的に化合物（ｃ）に変換される。そして、化合物（ｃ）はN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）により化合物（ｄ）（ヒドロキシ-L-ピペコリン酸）に変換される。
アミノ酸ラセマーゼは、ヒドロキシ-L-リジンをヒドロキシ-D-リジンに変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質または、配列番号３０と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
D-アミノ酸オキシダーゼは、ヒドロキシ-D-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochemistry, 2005, 70, 40に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
D-アミノ酸デヒドロゲナーゼは、ヒドロキシ-D-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Microbiology, 2010, 156(Pt 1), 60およびProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, 106, 906に記載のDauAまたは、DauAと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
D-アミノ酸トランスフェラーゼ（D-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）は、ヒドロキシ-D-リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Protein Eng, 1998, 11, 53に記載のD-AATまたは、D-AATと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、上記一般式(II)の化合物をヒドロキシ-L-ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質または、配列番号２４と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
スキーム１−１および１−２の反応は各酵素反応を別々に行ってもよいが、同一反応系で連続的に行うことが好ましい。
より好ましくは、各反応を触媒する酵素を含む細胞をヒドロキシ-L-リジンと反応させることにより行うことが好ましい。各反応を触媒する酵素を含む細胞は本来的にこれらの酵素を有する微生物を用いてもよいが、各酵素をコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましく、スキーム１−１の場合は、L-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼをそれぞれコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましく、スキーム１−２の場合は、D-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とアミノ酸ラセマーゼとN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼをそれぞれコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
また、これらのDNAはそれぞれ染色体に組み込まれてもよいし、単一のベクター中にこれらのＤＮＡを導入し、宿主を形質転換してもよいし、これらのＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換してもよい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素の項目で述べたのと同様である。
なお、N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼは補酵素にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とするため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生系も共存させることが好ましい。すなわち、上記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加する場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤ（Ｐ）+還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。この場合、再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを利用する場合のグルコース、ギ酸デヒドロゲナーゼを利用する場合のギ酸、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となる。
スキーム１−１、または１−２の反応を同一反応系で連続的に行う場合は、ヒドロキシ-L-リジン、各酵素をコードする遺伝子群で形質転換された細胞、該形質転換体された細胞の調製物および／または該形質転換体された細胞を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
前記水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられる。また、前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。有機溶媒としてはまた、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等を使用することもできる。
反応基質となるヒドロキシ-L-リジンは、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
必要に応じて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補酵素を、通常、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ添加する。
反応は、通常４℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は通常、１時間〜７２時間程度である。
本発明の方法により生成するヒドロキシ-L-ピペコリン酸は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質などを遠心分離、膜処理などにより分離した後に、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
本発明のヒドロキシ-L-リジンからヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造する第２の方法は以下に示すとおりである。
＜II＞ヒドロキシ-L-リジンに、L-リジン 6-オキシダーゼ、L-リジン 6-デヒドロゲナーゼ、L-リジン 6-トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素を反応させ、一般式(IV)で表される6位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた6位に二重結合をもつ環状アミノ酸に、ピロリン-5-カルボン酸レダクターゼを作用させて、一般式（III）で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
(式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す)
以下、スキームを例示して説明する（式中、R1、R2およびR3はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1、R2およびR3の少なくとも一つはヒドロキシル基を示す）。
まず、L-リジン 6-オキシダーゼ、L-リジン 6-デヒドロゲナーゼ、L-リジン 6-トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素により化合物（ａ）（ヒドロキシ-L-リジン）を化合物（ｂ’）に変換し、化合物（ｂ’）は自発的に化合物（ｃ’）に変換される。そして、化合物（ｃ’）はピロリン-5-カルボン酸（P5C）レダクターゼにより化合物（ｄ）（ヒドロキシ-L-ピペコリン酸）に変換される。
L-リジン 6-オキシダーゼは、ヒドロキシ-L-リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochim. Biophys. Acta., 2006, 1764 1577に記載のlodAまたは、lodAと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタ
ンパク質が挙げられる。
L-リジン 6-デヒドロゲナーゼは、ヒドロキシ-L-リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、J. Biochem., 105, 1002-1008 (1989)に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
L-リジン 6-トランスフェラーゼ（リジン− ６ − アミノトランスフェラーゼ）は、ヒドロキシ-L-リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開公報ＷＯ２００１／０４８２１６号に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
ピロリン-5-カルボン酸（P5C）レダクターゼは、一般式（IV）で表される化合物を一般式（III）で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開公報ＷＯ２００１／０４８２１６号に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
スキーム２の反応は各酵素反応を別々に行ってもよいが、同一反応系で連続的に行うことが好ましい。
より好ましくは、各反応を触媒する酵素を含む細胞をヒドロキシ-L-リジンと反応させることにより行うことが好ましい。各反応を触媒する酵素を含む細胞は本来的にこれらの酵素を有する細胞を用いてもよいが、各酵素をコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましく、具体的には、L-リジン 6-オキシダーゼ、L-リジン 6-デヒドロゲナーゼ、L-リジン 6-トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とピロリン-5-カルボン酸（P5C）レダクターゼをそれぞれコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素の項目で述べたのと同様である。
スキーム２の反応を同一反応系で連続的に行う場合は、ヒドロキシ-L-リジン、各酵素をコードする遺伝子群で形質転換された細胞、該形質転換体の調製物および／または該形質転換体を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
反応条件、補酵素の添加および再生、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の回収方法は上記＜I＞の項で述べたのと同様である。
本発明のヒドロキシ-L-リジンからヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造する第３の方法は以下に示すとおりである。
＜III＞ヒドロキシ-L-リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させて、一般式(III)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
リジンシクロデアミナーゼは、ヒドロキシ-L-リジンをヒドロキシ-L-ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochimie 2007, 89
, 591に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質または、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
リジンシクロデアミナーゼによる反応は、リジンシクロデアミナーゼを含む細胞をヒドロキシ-L-リジンと反応させることにより行うことが好ましい。リジンシクロデアミナーゼを含む微生物は本来的にこれらの酵素を有する細胞を用いてもよいが、リジンシクロデアミナーゼをコードするDNAで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素の項目で述べたのと同様である。
リジンシクロデアミナーゼによるヒドロキシ-L-リジンのヒドロキシ-L-ピペコリン酸への変換反応を行う場合は、ヒドロキシ-L-リジン、リジンシクロデアミナーゼをコードするDNAで形質転換された細胞、該形質転換体の調製物および／または該形質転換体を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
反応条件、補酵素の添加および再生、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の回収方法は上記＜I＞の項で述べたのと同様である。
なお、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素と、ヒドロキシ-L-リジンのヒドロキシ-L-ピペコリン酸への変換反応を行う酵素または酵素群を同時に用いてL-リジンから直接ヒドロキシ-L-ピペコリン酸を製造することもできるが、L-リジンに2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素が作用する前に、ヒドロキシ-L-リジンのヒドロキシ-L-ピペコリン酸への変換反応を行う酵素または酵素群がL-リジンに作用し、L-ピペコリン酸が副生する可能性もあるため、ヒドロキシ-L-リジンのヒドロキシ-L-ピペコリン酸への変換反応を行う酵素または酵素群についてはL-リジンにくらべてヒドロキシ-L-リジンに優先的に作用するものを選択する必要がある。この場合、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素と、ヒドロキシ-L-リジンのヒドロキシ-L-ピペコリン酸への変換反応を行う酵素または酵素群のDNAで同時に宿主細胞を形質転換して用いてもよい。
また、本発明の方法により製造されたヒドロキシ-L-リジンをヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造に使用する場合、ヒドロキシ-L-リジンの精製は省略し、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸に変換した後のみに精製を行うことも可能である。
［実施例］
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素遺伝子のクローニング
フラボバクテリウム・ジョンソネ（ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）ＮＢＲＣ１４９４２株由来Ｌ−アルギニンβヒドロキシラーゼＶｉｏＣホモログＨｙｌ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＢＱ０６１８６、配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−１、配列番号１）を元に、ｈｙｌ−１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｈｙｌ１＿Ｆ（配列番号１３）とｈｙｌ１＿Ｒ（配列番号１４）を設計、合成した。フラボバクテリウム・ジョンソネの染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
同様に、キネオコッカス・ラジオトレランス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０１８３９ 株、キチノファーガ・ピネンシス（Ｃｈｉｔｉ
ｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ１５９６８株、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）ＮＢＲＣ１５０５４株、ニアステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ１０６３９２株由来のＶｉｏＣホモログについて、それぞれＨｙｌ−２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢＳ０５４２１、配列番号４）、Ｈｙｌ−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣＵ６０３１３、配列番号６）、Ｈｙｌ−４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＦＫ３４７３７、配列番号８）、Ｈｙｌ−５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥＶ９９１００、配列番号１０）とした。各酵素をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−２（配列番号３）、ｈｙｌ−３（配列番号５）、ｈｙｌ−４（配列番号７）、ｈｙｌ−５（配列番号９））を元に、各遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーを設計、合成した。ｈｙｌ−２に対してはプライマーｈｙｌ２＿ｆ（配列番号１５）とｈｙｌ２＿ｒ（配列番号１６）、ｈｙｌ−３に対してはプライマーｈｙｌ３＿ｆ（配列番号１７）とｈｙｌ３＿ｒ（配列番号１８）、ｈｙｌ−４に対してはプライマーｈｙｌ４＿ｆ（配列番号１９）とｈｙｌ４＿ｒ（配列番号２０）、ｈｙｌ−５に対してはプライマーｈｙｌ５＿ｆ（配列番号２１）とｈｙｌ５＿ｒ（配列番号２２）を合成し、各株の染色体ＤＮＡを鋳型とし常法に従ってＰＣＲ反応を行った。それぞれ約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
得られた５種のＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩにより消化し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩにより消化したｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に定法に従ってライゲーションすることで、それぞれｐＥＨＹＬ１、ｐＥＨＹＬ２、ｐＥＨＹＬ３、ｐＥＨＹＬ４、ｐＥＨＹＬ５を得た。
また、海洋性放線菌ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＨＳＣ２０Ｃ１由来Ｈｙｌ−６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＡＲ２４２５５、配列番号１２）をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−６、配列番号１１）をＤＮＡ２．０社にて人工合成し、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４０１（ＤＮＡ２．０）に挿入されたプラスミドｐＪＨＹＬ６を作製した。
次に得られた各プラスミドを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン製）を定法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＨＹＬ６を得た。導入した遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてアンピシリン、およびｌａｃプロモーター誘導物質を含む液体ＬＢ培地を用いて３０℃で培養し、培養約２０時間目に集菌した。
休止菌体反応による2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素の活性確認
プラスチックチューブ内で５ｍＭ Ｌ−リジン、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、０．１ｍＭ硫酸鉄、そして、実施例１に準ずる方法で得られた組換え大腸菌を濁度ＯＤ600＝１０となるように反応液を混合した。調製された混合液０．５ｍｌを３０℃、ｐＨ７．０で３時間反応させた。反応産物を１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）により誘導体化し、その後ＨＰＬＣにより分析した。その結果、図１，図２に示す通り、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＨＹＬ６が３−ヒドロキシリジン標準品の保持時間８．０４分に一致する化合物を生成することが確認された。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ５が４−ヒドロキシリジン標準品の保持時間８．１６分に一致する化合物を生成することが確認された。
なお、ＨＰＬＣによるヒドロキシリジン分析条件は以下の通りである。
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ18−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ)、移動相：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）、流速：１．０ｍＬ／分、カ
ラム温度：４０℃、ＵＶ：３４０ｎｍ
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンの合成
１Ｌジャーファーメンターに、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３５ｍＬ、脱塩水３０４ｍＬ、Ｌ−リジン塩酸塩１．２８ｇ、２−オキソグルタル酸２．０５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１４ｇ、硫酸鉄０．０２ｇ、アデカノールＬＧ１０９ ０．３５ｇ、及び実施例１に準ずる方法で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２の湿菌体８ｇを混合し、３０℃、ｐＨ７．０、撹拌数５００ｒｐｍ、空気の通気量２．０ｖｖｍで１７時間反応させた。反応終了はＨＰＬＣによる分析によりＬ−リジンのピーク消失を確認することで判断した。反応終了後の液から遠心分離および精密ろ過により菌体及び菌体残渣を取り除き、３９０ｇの濾液が得られた。
なお、ＨＰＬＣによるＬ−リジン分析条件は以下の通りである。
カラム：住化分析センター社製ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−６１００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)、移動相：１ｍＭ硫酸銅、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、ＵＶ：２５４ｎｍ
濾液３９０ｇをイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）６０．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、１５０ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン１．０ｇ（６．１７ｍｍｏｌ、収率８８％）を得た。
得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンの物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ，１．４５−１．５８（２Ｈ，ｍ），１．６３−１．７３（１Ｈ，ｍ），１．７４−１．８８（１Ｈ，ｍ），２．９３−３．０４（２Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），３．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．４, ４．５Ｈｚ）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンの立体化学決定
フラスコに、実施例３に準ずる方法で得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン８．３ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．２６ｍｌ、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８μｌ（０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。さらに１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．２６ｍｌ、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８μｌ（０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩反応させた後、テトラヒドロフラン０．５ｍｌを添加して、６０℃でさらに２時間反応させた。室温に冷却後、水酸化ナトリウム９５ｍｇを添加し、室温で一晩反応させた。反応液をトルエン−テトラヒドロフラン（１：１）で２回洗浄した後、濃塩酸２５０μｌを添加して強酸性にし、さらに酢酸エチルで３回洗浄した後、水層を１−ブタノールで４回抽出した。１−ブタノール層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後に濃縮し、白色固体として（４Ｓ，５Ｓ）−５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸１４．６ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ、収率８９％）を得た。
ＮＯＥＳＹ測定の結果を下式に示す。３位水素原子（Ｈ4）と４位水素原子（Ｈ5）の間にクロスピークが観測され、４位と１’位間には観測されなかったことから、４位と５位の置換基はシス配置であることが確かめられた。酵素反応に用いたリジンの絶対配置はＳであることから、本実施例で得られた５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸は（４Ｓ，５Ｓ）の立体化学を持ち、その原料である３−ヒドロキシリジンは（２Ｓ，３Ｓ）の立体化学を有することが確かめられた。
得られた（４Ｓ，５Ｓ）−５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸の物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ4）δ，１．３９−１．５３（３Ｈ，ｍ，Ｈ1'
，Ｈ2'ｘ２），１．５９−１．６８（１Ｈ，ｍ，Ｈ1'），３．０２−３．０８（２Ｈ，ｍ，Ｈ3'），３．６０−３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｈ4），３．９３−４．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ5），４．９０−５．０２（２Ｈ，ｍ，Ｂｎ），７．１８−７．２８（５Ｈ，ｍ，Ｂｎ）．
[参考例１]
［Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＤｐｋＡ）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＡＩＰ）、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）、及びアミノ酸ラセマーゼ（以下、ＫＲ）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の調製例］
（１）遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来ＤｐｋＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＤ８９７４３、配列番号２４）をコードする遺伝子配列（以下ｄｐｋＡ、配列番号２３）を元に、ｄｐｋＡ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｄｐｋＡ＿Ｆ（配列番号３１）とｄｐｋＡ＿Ｒ（配列番号３２）を設計、合成した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
マサバ（Ｓｃｏｍｂｅｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＣ００４９９）からシグナルペプチドを除いた配列にメチオニンを付加したタンパク質ＡＩＰ（配列番号２６）をコードする遺伝子配列（以下ａｉｐ、配列番号２５）を設計し、人工合成した。さらにａｉｐ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーａｉｐ＿Ｆ（配列番号３３）とａｉｐ＿Ｒ（配列番号３４）を設計、合成した。常法に従ってＰＣＲを行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＧＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿３８８２７５）において９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したタンパク質（配列番号２８）をコードする遺伝子配列（以下ｇｄｈ、配列番号２７）を元に、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ（配列番号３５）とｇｄｈ＿Ｒ（配列番号３６）を設計、合成した。
常法に従ってＰＣＲを行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のＫＲ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿７４５８５５、配列番号３０）をコードする遺伝子配列（以下ｋｒ、配列番号２９）を元に、ｒｋ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｋｒ＿Ｆ（配列番号３７）とｋｒ＿Ｒ（配列番号３８）を設計、合成した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消
化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化した国際公開公報ＷＯ２０１２／０２９８１９号に記載のプラスミドｐＫＷ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、それぞれｐＫＷ３２ｄｐｋＡ，ｐＫＷ３２ａｉｐ，ｐＫＷ３２ｇｄｈ，ｐＫＷ３２ｋｒを得た。
続いて、ｐＫＷ３２ａｉｐをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してａｉｐを含む約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２ｄｐｋＡをＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約４．２ｋｂｐのｄｐｋＡの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ）を得た。
さらに、ｐＫＷ３２ｇｄｈをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してｇｄｈを含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ、ａｉｐ）をＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約５．７ｋｂｐのａｉｐの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）を得た。
最後に、ｐＫＷ３２ｋｒをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してｋｒを含む約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）をＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約６．５ｋｂｐのｇｄｈの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を得た。
（３）発現株の調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を得た。
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシピペコリン酸の製造
プラスチックチューブに、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．０）０．７５ｍＬ、脱塩水９．２１ｍＬ、実施例３で得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン８６ｍｇ、５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．０８３ｍｌ、１．０Ｍグルコース０．７ｍｌ、及び参考例１で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の１００ｇ／Ｌけん濁液１．２５ｍｌを混合し、３０℃、ｐＨ８．０、撹拌数１０００ｒｐｍで２０時間反応させた。反応終了はＨＰＬＣによる分析により（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンのピーク消失を確認することで判断した。反応終了後の液から、遠心分離により菌体及び菌体残渣を取り除いた１０．５ｇの上清を得た。
ＨＰＬＣによる（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン分析条件は以下の通りである。
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ社製ＣＬＣ−Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ)、移動相：２ｍＭ硫酸銅、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、ＵＶ：２５４ｎｍ
上清１０．５ｇをイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）４．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、１６．４ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、褐色固形物質２５５ｍｇを取得した。ＮＭＲ解析の結果、この固形物質は、（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシピペコリン酸を２０重量％（０．３５ｍｍｏｌ、収率６６．３％）、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを８０重量％含有する混合物であった。
得られた固形物質の物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ）δ，１．３８−１．５６（２Ｈ, ｍ），１．７３−１．８５（２Ｈ, ｍ），２．７１−２．７９（１Ｈ, ｍ），３．０４−３．１１（１Ｈ, ｍ），３．２３（１Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．７９−３．８６（１Ｈ, ｍ）．
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジンの合成
１Ｌジャーファーメンターに、脱塩水３３５ｍＬ、Ｌ−リジン塩酸塩１．２８ｇ、２-
オキソグルタル酸２．０５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１４ｇ、硫酸鉄０．０２ｇ、アデカノールＬＧ１０９ ０．３５ｇ、及び実施例１に準ずる方法で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ１の湿菌体８ｇを混合し、３０℃、ｐＨ６．８、撹拌数５００ｒｐｍ、空気の通気量２．０ｖｖｍで１９時間反応させた。反応終了はＨＰＬＣによる分析によりＬ−リジンのピーク消失を確認することで判断した。反応終了後の液から、遠心分離および精密ろ過により菌体及び菌体残渣を取り除いた。その結果３４５ｇの濾液が得られた。
なお、ＨＰＬＣによるＬ−リジン分析条件は以下の通りである。
カラム：住化分析センター社製ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−６１００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、移動相：１ｍＭ硫酸銅、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、ＵＶ：２５４ｎｍ
得られた濾液３４５ｇをＮＨ3で置換したイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）４０．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、６４ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジン１．１ｇ（６．７９ｍｍｏｌ、収率９７％）を得た。
得られた（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジンの物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ，１．５０−１．６５（３Ｈ，ｍ），１．７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，９．１，４．３Ｈｚ），２．６２−２．７５（２Ｈ，ｍ），３．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，４．８Ｈｚ），３．７２−３．８０（１Ｈ，ｍ）．
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジンの立体化学決定
フラスコに、実施例６で得られた（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジン４７ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）、水０．２ｍｌ、６Ｎ塩酸０．２ｍｌを添加し、室温で１時間反応させた。反応液を濃縮し、白色結晶として粗（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノ−５−（２−アミノエチル）−２（３Ｈ）−ジヒドロフラノン二塩酸塩６７ｍｇを得た。
得られた粗（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノ−５−（２−アミノエチル）−２（３Ｈ）−ジヒドロフラノン二塩酸塩４２ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５６ｍｌ（４．０ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン１ｍｌをフラスコ仕込み、氷冷下トリフルオロ酢酸無水物０．１４ｍｌ（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。２時間撹拌した後反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた油状物質を酢酸エチルに溶解し、炭酸カリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。水層を酢酸エチルで再抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、有機層を濃縮し、褐色油状物質４３ｍｇを取得した。ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（３Ｓ，５Ｒ）−３−トリフルオロアセチルアミノ−５−（２−トリフルオロアセチルアミノエチル）−２（３Ｈ）−ジヒドロフラノンを３４重量％（０．０４４ｍｍｏｌ、収率２３％）、トリエチルアミン・トリフルオロ酢酸塩を６６重量％含有する混合物であった。
ＮＯＥＳＹ測定の結果を下式に示す。３位水素原子（Ｈ3）と５位水素原子（Ｈ5）の間、及び４位水素原子の一方（Ｈ4a）と、３位及び５位の水素原子の間にクロスピークが観測されたことから、３位と５位の置換基はシス配置であることが確かめられた。酵素反応に用いたリジンの絶対配置はＳであることから、３−トリフルオロアセチルアミノ−５−（２−トリフルオロアセチルアミノエチル）−２（３Ｈ）−ジヒドロフラノンは（３Ｓ，５Ｒ）の立体化学を持ち、その原料である４−ヒドロキシリジンは（２Ｓ，４Ｒ）の立体化学を有することが確かめられた。
得られた（３Ｓ，５Ｒ）−３−トリフルオロアセチルアミノ−５−（２−トリフルオロアセチルアミノエチル）−２（３Ｈ）−ジヒドロフラノンの物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．９３−２．２２（３Ｈ，ｍ，Ｈ4b，Ｈ1'ｘ２），２．７６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，８．８，５．６Ｈｚ，Ｈ4a），３．５
１−３．５６（２Ｈ，ｍ，Ｈ2'），４．５２−４．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ5），４．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，９．１Ｈｚ，Ｈ3），７．８６（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），８．８７（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ）．
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピペコリン酸の製造
プラスチックチューブに、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．０）０．７５ｍＬ、脱塩水９．２１ｍＬ、実施例６で得られた（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジン８６ｍｇ、５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．０８３ｍｌ、１．０Ｍグルコース０．７ｍｌ、及び参考例１で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の１００ｇ／Ｌけん濁液１．２５ｍｌを混合し、３０℃、ｐＨ８．０、撹拌数１０００ｒｐｍで２０時間反応させた。反応終了はＨＰＬＣによる分析により（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジンのピーク消失を確認することで判断した。反応終了後の液から、遠心分離により菌体及び菌体残渣を取り除いた上清１０．５ｇを得た。
ＨＰＬＣによる（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシリジン分析条件は以下の通りである。
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ社製ＣＬＣ−Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、移動相：２ｍＭ硫酸銅、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、ＵＶ：２５４ｎｍ
上清１０．５ｇをイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）４．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、１６．４ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、褐色固形物質２１９ｍｇを取得した。ＮＭＲ解析の結果、この固形物質は、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピペコリン酸を２２重量％（０．３３ｍｍｏｌ、収率６２．６％）、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを７８重量％含有する混合物であった。
得られた（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピペコリン酸の物性の測定結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ）δ，１．２８−１．４５（２Ｈ, ｍ），１．９１−１．９９（１Ｈ, ｍ），２．２６−２．３３（１Ｈ, ｍ），２．７７（１Ｈ, ｔｄ, Ｊ＝１３．２, ３．１Ｈｚ），３．２５（１Ｈ, ｄｄｄ, Ｊ＝１３．２, ４．４, ２．６Ｈｚ），３．３６−３．４１（１Ｈ, ｍ），３．７８（１Ｈ, ｔｔ, Ｊ＝１１．１, ４．５Ｈｚ）．
医薬品の中間体等として有用なヒドロキシ-L-リジンの製造法、および得られたヒドロキシ-L-リジンを利用したヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造法として、使用できる。

Claims (8)

  1. L-リジンに、以下の（A)に示すポリペプチドを含む2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式(I)
    (式中、R1およびR2はそれぞれ水素原子もしくはヒドロキシル基を示し、R1およびR2の少なくとも一つはヒドロキシル基を示し、R3は水素原子を示す)で表されるヒドロキシ-L-リジンを生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-リジンの製造方法：
    (A) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ヒスチジン、トレオニン及びグルタミン酸をこの順に有する３個のアミノ酸からなる配列部分を有するとともに当該グルタミン酸から１３１個〜１３４番目のいずれかの位置にヒスチジンを有し、かつ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
  2. 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素を含む細胞が、前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするDNAで形質転換された細胞である、請求項１に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法。
  3. 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素をコードするDNAが以下の(B)または（C）に示すDNAを含む、請求項２に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法：
    (B) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失及び／または付加された塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA；または
    (C) 配列番号１、３、５、７、９または１１で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
  4. 前記2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素またはそれを含む細胞、前記細胞の調製物もしくは前記細胞を培養して得られた培養液を、2-オキソグルタル酸、および２価の鉄イオンの存在下、前記L-リジンに作用させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒドロキシ-L-リジンの製造方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、L-アミノ酸オキシダーゼ、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、L-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、もしくはD-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、D-アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素およびアミノ酸ラセマーゼを反応させ、下記一般式(II)
    (式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表される化合物を生成させた後、得られた化合物に、N-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させて、下記一般式(III)
    (式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
  6. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、L-リジン 6-オキシダーゼ、L-リジン 6-デヒドロゲナーゼ、L-リジン 6-トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素を反応させ、下記一般式(IV)
    (式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表される化合物を生成させた後、得られた化合物に、ピロリン-5-カルボン酸レダクターゼを作用させて、下記一般式(III)
    (式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
  7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法によりヒドロキシ-L-リジンを製造し、得られたヒドロキシ-L-リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させて、下記一般式(III)
    (式中、R1、R2およびR3は一般式（I）と同義である)で表されるヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
  8. L-リジンに作用してヒドロキシ-L-リジンを生成する活性を有し、かつ、以下の(A)に示すポリペプチドを含む、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素タンパク質を有するヒドロキシ-L-リジン生成用触媒：
    (A) 配列番号２，４，６，８，１０または１２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ヒスチジン、トレオニン及びグルタミン酸をこの順に有する３個のアミノ酸からなる配列部分を有するとともに当該グルタミン酸から１３１個〜１３４番目のいずれかの位置にヒスチジンを有し、かつ、2-オキソグルタル酸依存型L-リジン水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
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