CN107287255A - Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途 - Google Patents
Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途，属于生物技术领域。具体来说，是指Pseudomonas veronii CIP104663蛋白作为催化剂的用途。通过其催化L‑2‑哌啶甲酸的合成体系，具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途，属于生物技术领域。
背景技术
Pseudomonas veronii CIP104663蛋白是来源于Pseudomonas veronii CIP104663的一种蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列2。用于其编码的基因序列为序列表中序列1。
发明内容
本发明的目的是提供了Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的一种新用途，具体来说，是指其作为催化剂的用途。
更进一步地，是用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。
为了实现Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的催化作用，我们需要获得一种可以高效表达这一蛋白的菌体，从而以全细胞催化剂的形式将其加入到反应体系中。
在本发明中，我们选定的用于高效表达Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的菌体为大肠杆菌。然而，在Pseudomonas veronii CIP104663中用以编码Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的野生型基因序列GC含量接近50％，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。
首先，我们利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
| 2mM dNTP mix(2mM each dNTP) | 5μl |
| 10×Pfu buffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.3。
按照图1的方式构建含有SEQ ID NO.3的表达质粒。
挑取含有SEQ ID NO.3的表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。
将所收集得到的大肠杆菌作为全细胞催化剂加入至L-赖氨酸盐酸盐生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应中，从而获得了一种高效率的生物催化系统。这一系统具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。
附图说明
图1为SEQ ID NO.3的表达质粒图谱
图2为含有SEQ ID NO.3表达质粒的大肠杆菌的SDS-PAGE图谱。
图3为生物转化反应的TLC图谱
图4为L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图
图5为L-2-哌啶甲酸的MS谱图
具体实施方式
为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。
以下实施例中涉及到的TLC检测中：
展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。
硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。
显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。
以下实例中涉及到的LC-MS检测条件为：
Prevail C18色谱柱(250×4.6mm，i.d. 5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4L/min；进样体积：10μL。
实施例1
将Pseudomonas veronii CIP104663置于LB培养基中培养，控制温度为28.0℃，180rpm培养3天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化Pseudomonas veronii基因组DNA。
用Pfu高保真酶对Pseudomonas veronii基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为
Pve-F 5' ATGGTGGCACAGCGAGCAAC 3'
Pve-R 5' TCATGCTAATTTTAAGGTACGGTCG 3'
由于Pseudomonas veronii CIP104663的DNA的GC含量接近50％，故使用Pfu高保真酶直接扩增。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3'端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至南京金斯瑞生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.1，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
| 2mM dNTP mix(2mM each dNTP) | 5μl |
| 10×Pfu buffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.3。
实施例3
挑取含有SEQ ID NO.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
结果见图2，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。SDS-PAGE蛋白胶显示，含有SEQ ID NO.3表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。
实施例4
加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)，65g/L含有SEQ ID NO.3表达质粒的菌体，60g/L L-赖氨酸盐酸盐，0.1mM NAD，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图3，结果显示28小时生成大量产物，无底物残 余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为48.7g/L。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图4，图5所示。
当我们在体系中加入L-赖氨酸的时候，其快速转变为L-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京诺云生物科技有限公司
<120> Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> Pseudomonas veronii
<400> 1
atggtggcac
agcgagcaac tattatcctc tctgaggaaa acattggtga aattgtcgca 60
gcagtcgggc
tcgacacttt aatggatgaa acgattgcaa aactacgtga tgccctcaac 120
gtgtttggtg
atggccaggt tgaaatacaa ccgcgcaccg gctttgtcta tgaaactccg 180
gaaatggggc
tgatagagtt tatgccggct taccgccggg ataaaaatgt cgcgttaaaa 240
gttgttggct
accatccggg aaatccgttt aaccggggca tgccgacggt catcgccact 300
aactccctat
atgacgtaag ggacggccac cttattgcgg tgatcgatgg tgtatttgca 360
acagcagtac
gaacgggcgc agcatccgct gtggcttcga agttgctggc tcatcctgaa 420
agcaaaaccc
ttgggctgat cggagctggc gccatggcag tgacccaggc ccatgccctc 480
agtcgaattt
atgactttga cgcagtcttg atccacgata ttgaccccgc agtggaaaaa 540
actttcgcca
agcgggtatc cgccctggga attacaccga tcatcgcttc caaagacagg 600
gtactggcag
agtccgacat catctgtgtt gctacctcca ttggccttga tgcaggcccg 660
gttctccacg
ctggcgggat gaaaccacat gtacacatca atgctattgg tgccgacacg 720
ccgcgcaaat
atgaattatc aacagagctg ctcaaaagct cgttccttgt cacggattat 780
ctggaacagg
ccattaacga aggtgaatgc cagcaattga gtaaagacga atacggctat 840
atcggccctg
agttgcacaa aatagtgaaa gagccgcaag cctatatcca atatcagatg 900
aaacagacca
tctttgatag caccggtatt tcattggaag atcagataat gaccgaggtc 960
ttgatcgatc
aggcggagag actagggctt ggtcagcgga tcctgattga agcgggatgt 1020
gatgacccca
tgaacccata tcttttctca aattccgcga acgctcttga taccgtcaag 1080
aatacagtgc
acgaccgtac cttaaaatta gcatga 1116
<210> 2
<211> 371
<212> PRT
<213> Pseudomonas veronii
<400> 2
Met Val Ala Gln
Arg Ala Thr Ile Ile Leu Ser Glu Glu Asn Ile Gly
1 5 10 15
Glu Ile Val Ala
Ala Val Gly Leu Asp Thr Leu Met Asp Glu Thr Ile
20 25 30
Ala Lys Leu Arg
Asp Ala Leu Asn Val Phe Gly Asp Gly Gln Val Glu
35 40 45
Ile Gln Pro Arg
Thr Gly Phe Val Tyr Glu Thr Pro Glu Met Gly Leu
50 55 60
Ile Glu Phe Met
Pro Ala Tyr Arg Arg Asp Lys Asn Val Ala Leu Lys
65 70 75 80
Val Val Gly Tyr
His Pro Gly Asn Pro Phe Asn Arg Gly Met Pro Thr
85 90 95
Val Ile Ala Thr
Asn Ser Leu Tyr Asp Val Arg Asp Gly His Leu Ile
100 105 110
Ala Val Ile Asp
Gly Val Phe Ala Thr Ala Val Arg Thr Gly Ala Ala
115 120 125
Ser Ala Val Ala
Ser Lys Leu Leu Ala His Pro Glu Ser Lys Thr Leu
130
135 140
Gly Leu Ile Gly
Ala Gly Ala Met Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu
145 150 155 160
Ser Arg Ile Tyr
Asp Phe Asp Ala Val Leu Ile His Asp Ile Asp Pro
165 170 175
Ala Val Glu Lys
Thr Phe Ala Lys Arg Val Ser Ala Leu Gly Ile Thr
180 185 190
Pro Ile Ile Ala
Ser Lys Asp Arg Val Leu Ala Glu Ser Asp Ile Ile
195 200 205
Cys Val Ala Thr
Ser Ile Gly Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu His Ala
210 215 220
Gly Gly Met Lys
Pro His Val His Ile Asn Ala Ile Gly Ala Asp Thr
225 230 235 240
Pro Arg Lys Tyr
Glu Leu Ser Thr Glu Leu Leu Lys Ser Ser Phe Leu
245 250 255
Val Thr Asp Tyr
Leu Glu Gln Ala Ile Asn Glu Gly Glu Cys Gln Gln
260 265 270
Leu Ser Lys Asp
Glu Tyr Gly Tyr Ile Gly Pro Glu Leu His Lys Ile
275 280 285
Val Lys Glu Pro
Gln Ala Tyr Ile Gln Tyr Gln Met Lys Gln Thr Ile
290 295 300
Phe Asp Ser Thr
Gly Ile Ser Leu Glu Asp Gln Ile Met Thr Glu Val
305 310 315 320
Leu Ile Asp Gln
Ala Glu Arg Leu Gly Leu Gly Gln Arg Ile Leu Ile
325 330 335
Glu Ala Gly Cys
Asp Asp Pro Met Asn Pro Tyr Leu Phe Ser Asn Ser
340 345 350
Ala Asn Ala Leu
Asp Thr Val Lys Asn Thr Val His Asp Arg Thr Leu
355 360 365
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370
<210> 3
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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ctggaacagg
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Claims (2)
1.Pseudomonas veronii CIP104663蛋白作为催化剂的用途，所述的Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述的催化剂用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610196783.4A CN107287255A (zh) | 2016-03-31 | 2016-03-31 | Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途 |
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|---|---|---|---|
| CN201610196783.4A CN107287255A (zh) | 2016-03-31 | 2016-03-31 | Pseudomonas veronii CIP104663蛋白的新用途 |
Publications (1)
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|---|---|
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|---|---|
| CN (1) | CN107287255A (zh) |
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2016
- 2016-03-31 CN CN201610196783.4A patent/CN107287255A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171024 |
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