CN113943716B

CN113943716B - 一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶及其应用

Info

Publication number: CN113943716B
Application number: CN202111228876.8A
Authority: CN
Inventors: 雷晓光; 高磊
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2041-10-21
Also published as: CN113943716A

Abstract

本发明属于生物酶催化技术领域，具体涉及一种分子间exo选择性Diels‑Alder反应酶及其应用。本发明提供的Diels‑Alder反应酶以查尔酮类似物和含有脱氢异戊烯基化合物为底物，立体专一性合成exo构型天然产物及其类似物。本发明提供的Diels‑Alder反应酶(MaDA)具有较好的底物容忍度，为解决不对称D‑A反应中的热点难点问题提供全新的思路，对于传统化学催化剂的开发具有一定启发性，同时具备工业化生产的应用价值。

Description

一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物酶催化技术领域，涉及一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶及其应用。

背景技术

狄尔斯-阿尔德反应(D-A)反应是有机化学中构建碳-碳键的重要方法之一，D-A反应能一步构建新的六元环和多个手性中心，迅速提高分子的复杂程度，在天然产物全合成、材料化学、化学工业生产等方面扮演着重要的角色。因此，开发新颖催化剂以提高D-A反应的速率和立体选择性一直以来都是合成化学中的研究热点。

传统上，手性Lewis酸、酸和有机催化剂已被成功地用于促进不对称D-A反应的发生，并能够较好实现对映立体选择性，然而这些催化剂并不能有效控制D-A反应中的endo/exo选择性，由于D-A反应endo过渡态中存在着次级轨道相互作用，动力学上有利endo产物通常是主要产物。因此，如何高效实现exo产物的不对称合成依旧是合成化学家们面临的合成难点。

相比于传统化学催化，酶催化是一种绿色、可持续的催化技术，越来越多地应用于在实验室合成以及工业化生产中。自然界中D-A反应酶的发现，解析，改造和设计可为解决D-A反应过程中的难点提供了新的思路，也是生物合成以及酶催化领域中的研究热点。

前期，在桑科植物的研究中，找到了首个单功能分子间D-A反应酶MaDA，该酶仅能催化endo选择性的D-A反应。因此，在桑科植物中发掘分子间exo选择性D-A反应酶的发现和应用将为解决不对称D-A反应中的热点难点问题提供全新的思路，对于传统化学催化剂的开发也具有一定启发性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何通过酶催化的方式高效实现exo构型D-A类型天然产物及其类似物的制备。为解决上述问题，本发明首先提供了一种exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-2及其同源蛋白MaDA-3的核酸序列及其氨基酸序列。本发明的另一目的是提供一种含有上述不含信号肽编码序列的MaDA-2和MaDA-3的表达载体，以及以昆虫细胞作为宿主高效表达MaDA-2和MaDA-3蛋白的技术。本发明还提供上述Diels-Alder反应酶的应用。本发明提供的技术方案如下。

第一方面，本发明提供一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶，所述分子间exo选择性Diels-Alder反应酶具有：1)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的序列与SEQ ID No.2或SEQ ID No.5同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％，且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

所述分子间exo选择性Diels-Alder反应酶包括，MaDA-2和MaDA-3，MaDA-2的氨基酸序列如SEQ ID No.2；MaDA-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

第二方面，本发明提供编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的基因，编码MaDA-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；编码MaDA-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明提供的编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的基因的核苷酸序列中，前1-87个碱基编码信号肽序列。

SEQ ID No.1作为Diels-Alder反应酶MaDA-2基因序列，是一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框是从ATG起始，以TAA结束，共有1632个核苷酸。其中，前87个核苷酸，ATGAAGTACTTTTCCTTCTCTTTGTCGTTTCCCAAAATCACCATTTTTCTTTTTTCATTTGTATTGCTAGCTTCAGCAAATCACGCT为信号肽序列。

成熟的Diels-Alder反应酶MaDA-2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，下划线部分为SEQ ID No.2的氨基酸序列：

MKYFSFSLSFPKITIFLFSFVLLASANHAHESFLECLISTSTPESIIYTKHNPSYFTILNSTSLNSRF FSSPARYPLLIVTPLHASHVQATVHCAKKHGIQIRIRSGGHDYEGLSYMSNVTFAILDLRNLNSINVDVKRKSAWV QSGATLGELHYWIANKSQNLAFPGVVGHTVCMGGMLGAGGYGYSSRKYGLPADNILDAQLIDVRGRILNRKSMGED LFWAIRGGGAGSFGIVLAWKVRLVDVPSKVTVFTAIRDWDNNATKKFIHRYQRRIAKVDKNLTIIIRFVTESTTDE KSNKKIVISTFITALYHGSQDRLLSLMEKDFPELGLLAKECTEETWVQSILYFNFFTNGEPLEVLLNRTMNFELTS FKIKSDYLKKPIPDQVLENLLVMLYEEDIGETFVEFFPYGGKLDEISESEIPCPHRAGNLYNLRYLVSWKEGQNAT AVNKHLSWIRRAYNYMTPYVSKNPRGAFLNFRDLDIGTNPNENEINGAYNYIKQASNWGTKYFKNNFYKLIYVKTI VDPTNFFTYEQSIPSLLPH。

Diels-Alder反应酶MaDA-2含有543个氨基酸，其中前29个氨基酸(MKYFSFSLSFPKITIFLFSFVLLASANHA)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌到细胞外的过程中会被切除。因此成熟的MaDA-2是从His30开始(用下划线表示)，共计514个氨基酸。

与MaDA-2相同，SEQ ID No.4作为Diels-Alder反应酶MaDA-3基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框是从ATG起始，以TAA结束，共有1653个核苷酸。

其中，前87个核苷酸为信号肽序列。

成熟的Diels-Alder反应酶MaDA-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，下划线部分为SEQ ID No.5：

MKYFSFSLSFPKITIFLFSFVLVASANHAHESFLECLTTRISKSNSTSTPESIIYTKDNPSYSTILNS TSLNPRFFPSSARYPLLIVTPLHASHVQATVHCAKKHGIQIRIRSGGHDYEGLSYMSNVTFAIVDLRNLSSIDVDV KRKSAWVQSGATLGELHYWIAKKSQNLAFPGVVGHTVGIGGMLGAGGYGYSSRKYGLSADNILDAQLIDVRGRILN RKSMGEDLFWAIRGGGAGSFGIVLAWKVRLVDVPSKVTVFTAIRDWDNNATKKFIHRYQRRIAKVDKDLTIIVRFL TASITDEKGSKKIQISTFITATYHGSQDRLLSLMEKEFPELGLLAKECAEGAWVQSILYFNLLTNSKSLDVLLNRT LNFEWRAFKIKSDYLKKPIPDQVLENLLVKLYEEDIGETFVEFFPYGGKLDEISESEIPCPHRAGNLYNLRYMVLW KEGQNATAVNKHLSWIRRAYNYMTPYVSKNPRGAFLNFRDLDIGTNPNENEINGAYNYIKQASNWGTKYFKNNFYK LIYVKTIVDPTNFFTYEQSIPSLLPH。

Diels-Alder反应酶MaDA-3含有550个氨基酸，其中前29个氨基酸(MKYFSFSLSFPKITIFLFSFVLVASANHA)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌到细胞外的过程中会被切除。因此成熟的MaDA-3是从His30开始(用下划线表示)，共计521个氨基酸。

第三方面，本发明请求保护，编码上述的分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的DNA片段，编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-2的DNA片段如SEQ ID No.7所示；编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-3的DNA片段如SEQ ID No.8所示。

第四方面，本发明提供扩增上述DNA片段的引物，所述引物如SEQ ID No.13-14所示或SEQ ID No.15-16所示。

第五方面，本发明请求保护含有上述基因或含有上述DNA片段或含有上述引物的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、载体、微生物、昆虫细胞、植物细胞。

作为本发明的具体实施例，本发明构建包含MaDA-2基因序列的表达载体pI-sec-sumostar-tev2，并实现在昆虫细胞(Hi5)的大量表达。利用该载体在昆虫中表达出来的SUMO-MaDA-2蛋白在N端包含了信号肽、6×His标签以及SUMO标签，SUMO-MaDA-2蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

其中，前20个氨基酸(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)为信号肽，HHHHHH为6×His标签。

QDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG为SUMO标签。

ENLYFQG为TEV酶切位点。利用昆虫表达体系表达纯化出来的成熟蛋白不含信号肽，其蛋白理论分子量(MWt)为72753.62Da，酶蛋白的理论等电点(pI)为6.66，利用TEV酶水解后，能得到MaDA-2不带信号肽的成熟蛋白。

本发明还构建了包含MaDA-3基因序列的表达载体pI-sec-sumostar-tev2，并实现在昆虫细胞(Hi5)的大量表达。利用该载体在昆虫中表达出来的SUMO-MaDA-3蛋白在N端包含了信号肽、6×His标签以及SUMO标签，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

其中，前20个氨基酸(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)为信号肽，HHHHHH为6×His标签，QDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG为SUMO标签，ENLYFQG为TEV酶切位点。利用昆虫表达体系表达纯化出来的成熟蛋白不含信号肽，其蛋白理论分子量(MWt)为73225.17Da，酶蛋白的理论等电点(pI)为8.11，利用TEV酶水解后，能得到MaDA-3不带信号肽的成熟蛋白。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述分子间exo选择性Diels-Alder反应酶或其编码基因或上述的生物材料在催化Diels-Alder反应制备含有六元环骨架的桑树天然产物，或合成立体专一性exo构型的产物中的应用。

在本发明提供的应用中，以亲二烯体和二烯体为底物，以分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-3为催化酶进行反应，合成立体专一性exo构型产物。

在本发明提供的应用中，亲二烯体为查尔酮或其衍生物，二烯体为含有脱氢异戊烯基的黄酮、二苯乙烯、查尔酮或苯并呋喃。

在本发明提供的应用中，所述反应的温度为50℃，pH为7.0。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次提供一种来源于桑树的Diels-Alder反应酶，所述Diels-Alder反应酶可以特异性催化合成exo构型产物及其类似物；

(2)本发明提供的Diels-Alder反应酶，具有较好的底物容忍度，为解决不对称D-A反应中的热点难点问题提供全新的思路。

(3)本发明发现来源于桑树的Diels-Alder反应酶能够以查尔酮或其衍生物和含有脱氢异戊烯基化合物为底物，立体专一性合成exo构型天然产物，能够体外制备桑树中D-A类型天然产物及其衍生物。

(4)本发明提供的Diels-Alder反应酶底物适应性良好，可识别不同取代的查尔酮及其衍生物作为亲二烯体生成天然产物。为开发和利用桑科中这类天然产物的药用价值奠定了基础，同时也为其他含有六元环的重要化工前体、天然产物或非天然产物的合成提供了新的可能性。

附图说明

图1为本发明实施例1中川桑基因组中BBE-like家族蛋白的进化树分析。

图2为本发明实施例2中查尔酮体1与二烯体2的酶促反应液相分析结果。

图3为本发明实施例2中查尔酮体5与二烯体2的酶促反应液相分析结果。

图4为本发明实施例2中查尔酮体1与二烯体8的酶促反应液相分析结果。

图5为本发明实施例3中MaDA-3在不同反应温度下的相对活性。

图6为本发明实施例3中MaDA-3在不同pH下的相对活性。

图7为本发明实施例4中酶促产物mongolicin F的手性HPLC分析结果。

图8为本发明实施例4中酶促产物guangsangon J的手性HPLC分析结果图。

图9为本发明实施例4中酶促产物mulberrofuran J的手性HPLC分析结果图。

图10为本发明实施例4中酶促产物exo-kuwanol E的手性HPLC分析结果图。

图11为本发明实施例4中酶促产物exo-artonin I的手性HPLC分析结果图。

图12为本发明实施例4中酶促产物albafuran C的手性HPLC分析结果图。

图13为本发明实施例5中MaDA-3对于不同二烯体的转化率测定结果图。

图14为本发明实施例5中MaDA-3对于不同亲二烯体的转化率测定结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1、菌株

大肠杆菌E.coli DH5α以及DH10Bac的感受态细胞均买自庄盟生物有限公司。表达用昆虫细胞Sf21以及Hi5购买自invitrogen公司。

2、载体

昆虫表达载体pI-secSUMOstar购买自LifeSensors公司，

3、培养基

LB固体培养基：蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,1.5％的琼脂。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L。

4、主要试剂

植物基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均买自天根生化有限公司；同源重组酶买自诺唯赞公司。PCR高保真酶买自全是金公司。PCR引物合成及质粒测序由金唯智生物技术有限公司完成。MS培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

5、反应底物的制备

亲二烯体1、5、37以及43以及二烯体2、8参考已知文献(Nat Chem，2020，12，620)；化合物11参考已知文献(Org.Lett.2016，18，360)；二烯体12参考文献(Biotechnol.J2020，15，2000119)。

6、D-A反应催化酶

MaDA蛋白来源于已知文献Nat Chem，2020，12，620)；

MaDA-1来源于中国专利(CN110951700A)。

7、本申请所用植物材料为广泛种植的白桑。

实施例1

1、川桑基因组中D-A反应酶MaDA同源蛋白的进化树分析

本实施例对川桑(morus notabilis)基因组中FAD依赖蛋白进行分析，共找到41个与endo反应酶MaDA同家族的蛋白(berberine bridge enzyme(BBE)-like家族)。通过将这个41个蛋白与家族中已知功能的D-A反应酶MaDA以及氧化酶MaMO，THCAS，BBE进行进化树分析后，找到了8个跟已知D-A反应酶进化关系最近的蛋白，如图1所示。

2、白桑的基因组DNA的提取

取大约100克白桑新鲜愈伤组织放入研钵中，加入液氮后研末至粉末状，然后依照天根生化公司的植物基因组提取试剂盒说明书提取桑树叶片中基因组DNA。

3、白桑中MaDA-2、MaDA-3基因片段的扩增

(1)根据川桑基因组中的数据，设计引物，以白桑基因组DNA为模板，快速扩增出其基因序列。然而通过5’-RACE扩增分析分析发现，以白桑基因组DNA为模板扩增出的序列，并不能进行蛋白编码，特别是在5’端的序列与NCBI中预测的基因序列存在差异。因此，重新对川桑基因组中的8个跟已知D-A反应酶进化关系最近的蛋白的编码序列进行校准，

根据川桑基因组中XP_024017780.1校准后的基因序列，设计引物MaDA-2-Fw(SEQID No.9：AACCTGTATTTTCAGGGATCCATGAAGTACTTTTCCTTCTCTTTG)和MaDA-2-Rv(SEQ IDNo.10：AACCTGTATTTTCAGGGATCCATGAAGTACTTTTCCTTCTCTTTG)，并根据以下PCR条件：

PCR反应体系(50μL)，32个循环：

PCR循环(50μl体系)

4℃

(2)MaDA-3基因的扩增，根据川桑基因组中XP 024017779.1校准后的基因序列，设计引物MaDA-3-Fw SEQ ID No.11：AACCTGTATTTTCAGGGATCCCATGAAAGCTTTCTTGAGTGCTTG和MaDA-3-Rv(SEQ ID No.12：CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAATGTAGAAGAAGGGA)，PCR扩增反应的条件同MaDA-2基因的PCR扩增反应条件。

4、载体构建与测序

pI-sec-sumostar-tev2空载用BamHI和HindIII双酶切过夜，1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收单一条带，用nanodrop测定回收的DNA浓度。利用Vazyme同源重组酶构建pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-2质粒，10μL连接体系包括：

1μL Exnase II酶

2μL 5×CE buffer

3μL 线性化载体

4μL MaDA-2 PCR产物

上述连接体系中，MaDA-2与线性化pI-sec-sumostar-tev2载体的摩尔数之比大致为2：1。上述反应体系在37℃反应30min后，立即置于冰上，随后将连接产物加入100μL DH5α感受态中,冰浴30min后42℃热激1min,然后立即冰浴3min,加入1mL LB培养基37℃，220rpm培养。大约1小时后，离心弃900μL培养基，将菌体重悬在剩余的100μL培养基中，然后用移液枪全部取出并涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的固体LB平板。37℃过夜培养后，挑取固体培养基上的单克隆于LB液体培养基中培养12-16小时后提取质粒并送测序。根据以上相同的操作，构建pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-3质粒，并测序。

5、MaDA-2和MaDA-3蛋白的外源表达

(1)不带信号肽的MaDA-2基因的扩增

上游引物序列：(SEQ ID No.13)

5’-GAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCCATGAAAGCTTTCTTGAGTGC-3’

下游引物序列:(SEQ ID No.14)

5’-CTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAATGTGGAAGAAGGGACG-3’

(2)不带信号肽的MaDA-3基因的扩增

上游引物序列：(SEQ ID No.15)

5’-GAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCCATGAAAGCTTTCTTGAGTGC-3’

下游引物序列:(SEQ ID No.16)

5’-CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAATGTGGAAGAAGGGACG-3’

根据全长基因载体的构建方法，构建出不带信号肽片段的表达载体pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-2和pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-3,采用Invivogen公司所开发的“Bac-to-bac”方法,根据参考文献(Nat Chem 2020 12,620)的实验方法，表达和纯化含有SUMO标签的MaDA-2以及MaDA-3两个蛋白。

实施例2 MaDA-2和MaDA-3的酶活测试

1、查尔酮morachalcone A(1)与二烯体2之间的酶促反应

向97μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl,pH＝8.0)中加入1μL亲二烯体1(终浓度100μM)以及1μL二烯体2(终浓度200μM)，然后加入1μL MaDA蛋白(终浓度137nM)或MaDA-1(终浓度139nM已知专利)或MaDA-2(终浓度207nM)或MaDA-3(终浓度207nM)，50℃下反应10分钟后，加入100μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,利用UPLC-MS分析。

UPLC分析的条件为：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 column(50mm×2.1mm i.d.,1.7μm,WatersCorporation)；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0～16min，30→70％乙腈，16～18min，70→95％乙腈；18～20min，95→30％乙腈；流速：0.3mL·min-1，柱温：40℃；

UPLC-MS分析结果如图2所示，endo选择性D-A反应酶MaDA以及MaDA-1专一性生成endo类型天然产物chalcomoracin，而新发现的MaDA-2和MaDA-3除了能产生天然产物chalcomoracin外，主要生成exo类型天然产物monglicin F。相较而言，MaDA-3具有更高的exo选择性。此类结果证明，虽然MaDA-2和MaDA-3是一类催化exo选择性D-A反应发生的全新D-A反应酶。

2、查尔酮morachalcone A(5)与二烯体2之间的酶促反应

向97μL反应缓冲液(20mM Tris·HCl,pH＝8.0)中加入1μL亲二烯体5(终浓度100μM)以及1μL二烯体2(终浓度200μM)，然后加入1μL MaDA蛋白(终浓度411nM)或MaDA-1(终浓度416nM已知专利)或MaDA-2(终浓度414nM)或MaDA-3(终浓度411nM)，50℃下反应10分钟后，加入100μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,利用UPLC-MS分析。

UPLC分析的条件为：

UPLC-MS分析结果如图3所示，endo选择性D-A反应酶MaDA-1专一性生成endo类型天然产物mulberrofuran C，而新发现的MaDA-2生成exo类型天然产物mulberrofuran J。

3、查尔酮morachalcone A(1)与二烯体8之间的酶促反应

向97μL反应缓冲液(20mM Tris·HCl,pH＝8.0)中加入1μL亲二烯体1(终浓度100μM)以及1μL二烯体8(终浓度200μM)，然后加入1μL MaDA蛋白(终浓度137nM)或MaDA-1(终浓度139nM已知专利)或MaDA-2(终浓度207nM)或MaDA-3(终浓度207nM)，50℃下反应10分钟后，加入100μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,利用UPLC-MS分析。

UPLC分析的条件为：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 column(50mm×2.1mm i.d.,1.7μm,WatersCorporation)；流动相：甲醇-水梯度洗脱，0～1min，50甲醇；1～8min，50→70％甲醇，8～16min，70→95％甲醇；16～18min，95→100％甲醇；18～20min，100→50％甲醇；流速：0.3mL·min-1，柱温：40℃；

UPLC-MS分析结果如图4所示，endo选择性D-A反应酶MaDA以及MaDA-1专一性生成endo类型天然产物guangsangon E，而新发现的MaDA-2和MaDA-3专一性生成exo类型天然产物guangsangon J。

实施例3 MaDA-3最适温度和pH测试

1、最适温度

以二烯体8和亲二烯体1为底物考察不同反应温度(30、35、40、45、50、55、60、70、75℃)对MaDA-3催化[4+2]环化反应的影响。反应体系(20mM Tris·HCl,pH＝7.5)中含有100μM的二烯体8和亲二烯体1，140nM的MaDA-3，反应体积为100μL，反应时间为5min。反应结束后加入100μL的冷甲醇终止反应，涡旋混匀，高速离心机15000g离心30min，取上清液，利用UPLC进行检测。每组反应三个平行。底物的转化率通过产物的峰面积代入标准曲线计算底物的减少量来计算，最终得到在不同温度下MaDA-3的相对活性，如图5所示。从图5可以看出，MaDA-3最适反应温度在50摄氏度。

2、最适pH

以二烯体8和亲二烯体1为底物考察不同pH缓冲溶液(pH 4.0-6.0，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；6.0-7.0，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；7.0-9.0，Tris-HCl缓冲液；9.0-11.0，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)对MaDA催化[4+2]环化反应的影响。反应体系(20mM Tris-HCl)中含有100μM的二烯体8和亲二烯体1，140nM的MaDA-3，反应体积为100μL，50℃条件下在不同pH缓冲液中反5min。反应结束后加入100μL的冷甲醇终止反应，涡旋混匀，高速离心机15000g离心30min，取上清液，利用UPLC进行检测。每组反应三个平行。底物的转化率通过产物的峰面积代入标准曲线计算底物的减少量来计算，最终得到在不同pH下MaDA-3的相对活性，如图6所示。如图6所示，MaDA-3的最适pH在7.0。

实施例4利用MaDA-3和MaDA-2来合成D-A类型天然产物

1、乙酰基前体S2、亲二烯体1和SUMO-MaDA-3得到mongolicin F。

对应二烯体的乙酰基前体S2(11.3mg,0.0260mmol)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(13.9mg,0.101mmol)，室温搅拌35分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris-HCl,pH＝8.0),再向该反应体系中加入3.3毫克SUMO-MaDA-3和7.4毫克亲二烯体1(0.022mmol，溶解于0.37毫升的DMSO中)，混匀后37℃静置培养12小时，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。

旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物mongolicin F(4.5mg,32％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

[α]D²³＝-213(c＝0.08,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₃₇O₉[M+H]+649.2432,found 649.2436。该酶促产物的ee值大于99％，如图7所示。手性HPLC分析在岛津LC-2030C(DaicelIC,4.6mm×250mm,i.d.5μm)上进行，洗脱条件如下：n-hexane/i-PrOH＝85/15，流速为1.0mL/min，λ＝319nm。

2、乙酰基前体S8、亲二烯体1和SUMO-MaDA-3得到guangsangon J。

对应二烯体的乙酰基前体S8(10.9mg,0.0251mmol)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(17.3mg,0.125mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(50mM Tris-HCl,pH＝7.0),再向该反应体系中加入1.5毫克SUMO-MaDA-3和10.2毫克亲二烯体1(0.03mmol，溶解于0.30毫升的DMSO中)，混匀后37℃静置培养3天，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mmi.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物guangsangon J(5.2mg,32％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

[α]D²⁶＝-298.9(c＝0.20,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₃₇O₉[M+H]+649.2432,found 649.2444。该酶促产物的ee值大于99％，如图8所示。

3、乙酰基前体S2、亲二烯体5和SUMO-MaDA-3得到mulberrofuran J。

对应二烯体的乙酰基前体S2(22.6mg,0.052mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(28.8mg,0.21mmol)，室温搅拌35分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(50mM Tris-HCl,pH＝8.0),再向该反应体系中加入3.8毫克SUMO-MaDA-3和11.4毫克亲二烯体5(0.0419mmol，溶解于0.419毫升的DMSO中)，混匀后37℃静置培养36小时，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物mulberrofuran J(2.5mg,10％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

[α]D²³＝-339.4(c＝0.125,MeOH)

HRMS(ESI)calculated for C₃₄H₂₉O₉[M+H]+581.1806,found 581.1816。该酶促产物的ee值大于99％，如图9所示。

4、乙酰基前体S11、亲二烯体1和SUMO-MaDA-3得到exo-kuwanol E。

对应二烯体的乙酰基前体S11(11.1mg,0.0232mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(19.2mg,0.139mmol)，室温搅拌20分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris-HCl,pH＝7.0),再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3和5.1毫克亲二烯体1(0.015mmol，溶解于0.15毫升的DMSO中)，混匀后37℃静置培养8小时，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mmi.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-kuwanol E(2.6mg,27％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

虽然exo-kuwanol E目前还没有分离报道，但考虑到MaDA-3和MaDA-2存在于桑科植物中，且桑科植物中存在亲二烯体1和二烯体11，因此exo-kuwanol E可能是桑科植物中还未被分离鉴定的一个新天然产物。

[α]D²⁴＝-254.7(c＝0.25,MeOH)

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₃₉O₉[M+H]+651.2589,found 651.2594，该酶促产物的ee值大于99％，如图10所示。

5、乙酰基前体S13、亲二烯体1和SUMO-MaDA-3得到exo-artonin I。

对应二烯体的乙酰基前体S13(6.2mg,0.0130mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：3)，然后加入碳酸钾(7.2mg,0.0519mmol)，室温搅拌35分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3和103微升100mM亲二烯体1(0.0103mmol)的DMSO溶液，混匀后37℃静置培养11小时，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-artonin I(14,6.3mg,89％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

虽然exo-artonin I目前还没有分离报道，但考虑到MaDA-3和MaDA-2存在于桑科植物中，且桑科植物中存在亲二烯体1和二烯体13，因此exo-artonin I(14)可能是桑科植物中还未被分离鉴定的一个新天然产物。

[α]D²⁴＝-163.6(c＝0.20,MeOH)

HRMS(ESI)calculated for C₄₀H₃₇O₁₁[M+H]+693.2330,found 693.2333；该酶促产物的ee值大于99％，如图11所示。

6、乙酰基前体S8、亲二烯体5和SUMO-MaDA-2得到albafuran C。

对应二烯体的乙酰基前体S8(10.8mg,0.0249mmol)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(15.5mg,0.112mmol)，室温搅拌35分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝8.0),再向该反应体系中加入0.45毫克SUMO-MaDA-2和200微升亲二烯体5的DMSO溶液(0.02mmol)，混匀后50℃静置培养7小时后补加100微升亲二烯体5的DMSO溶液(0.01mmol)，继续反应7小时后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物albafuran C(5.8mg,39％)。液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：30％-40％B,0-1min,40％-64％B,1-12min,64％-66％B,12-15min,66％B,15-17min,66％-95％B,17-18min,95％-30％B,18-19min,and 30％B,19-20min。

[α]D²⁶＝-312.6(c＝0.17,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₄H₂₉O₉[M+H]+581.1806,found 581.1806；该酶促产物的ee值大于99％，如图12所示。

实施例5 MaDA-3底物谱拓展

本实施例通过化学合成的方式，得到多种带有脱氢异戊烯基的二烯体(16-36)，随后测定了MaDA-3对不同二烯体与亲二烯体1之间的转化率。

向96微升的反应缓冲液中(20mM Tris-HCl,pH＝7.0)中加入1μL二烯体(终浓度100μM)和1μL亲二烯体1(终浓度100μM)，再向该反应体系中加入1微升SUMO-MaDA-3(9.6μg)和1μL内参化合物4-甲氧基苯乙酮(终浓度100μM)，混匀后在50℃静置反应5分钟，加入100μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,进行UPLC-MS分析。

底物的转化率通过比较加酶和不加酶两种反应体系中二烯体与内参的峰面积来计算得出，结果如图13所示。由上述结果可以看出，MaDA-3除了能够识别桑树中天然存在的二烯体外，还对一系列不同二烯体均具有活性，其中含有底物17骨架结构的二烯体活性更高。

另外，本实施例通过化学合成还获得了一系列不同结构的亲二烯体(37-48)，随后测定了MaDA-3催化的不同亲二烯体(37-48)和二烯体(2和8)之间D-A反应的转化率。

具体操作如下：向96微升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中加入1μL二烯体(2或者8，终浓度200μM)和1μL亲二烯体(终浓度100μM)，再向该反应体系中加入1μL的SUMO-MaDA-3(9.6μg)和1μL内参化合物4-甲氧基苯乙酮(终浓度100μM)，混匀后在50℃静置反应5分钟，加入100μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,进行UPLC-MS分析。底物的转化率通过比较加酶和不加酶两种反应体系中二烯体与内参的峰面积来计算得出，结果如图14所示。

实施例6 MaDA-3在D-A类型天然产物类似物上的合成应用

1、获得D-A类型天然产物类似物exo-50

对应二烯体的乙酰基前体S49(10.2mg,0.0321mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(8.9mg,0.0642mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到由45毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),和3毫升甲醇组成的混合溶液中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后分8次每12个小时加入50微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下共反应5天。随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-50(2.7mg,14％)以及回收2.8毫克的原料49。

[α]D²⁴＝-277.1(c＝0.135,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₃₇O₇[M+H]+617.2534,found 617.2528。

2、获得D-A类型天然产物类似物exo-52

对应二烯体的乙酰基前体S51(7.5mg,0.0237mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(6.5mg,0.04732mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到由45毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),和3毫升甲醇组成的混合溶液中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后分3次加入198微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下共反应20小时。随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-52(7.4mg,61％)。

[α]D²⁴＝-266.9(c＝0.2,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₃₈NO₆[M+H]+616.2694,found 616.2694。

3、获得D-A类型天然产物类似物exo-54

对应二烯体的乙酰基前体S53(11.3mg,0.0292mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(12.1mg,0.0876mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到由45毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),和3毫升甲醇组成的混合溶液中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后分3次加入150微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下共反应10小时。随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-54(7.4mg,77％)。

[α]D²⁵＝-211.8(c＝0.73,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₄₁H₃₉O₇[M+H]+643.2690,found 643.2693。

4、获得D-A类型天然产物类似物exo-56

对应二烯体的乙酰基前体S55(9.5mg,0.0263mmol)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(5.5mg,0.0395mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到由45毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),和3毫升甲醇组成的混合溶液中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后分2次加入100微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下共反应2小时后，补加二烯体55(0.0263mmol)和亲二烯体1(0.0085mmol)，继续反应2小时后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-56(7.3mg,60％)。

[α]D²⁵＝-77.7(c＝0.27,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₈H₃₇FNO₆[M+H]+660.2567,found 660.2574。

5、获得D-A类型天然产物类似物exo-58

对应二烯体的乙酰基前体S57(13.6mg,0.0373mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(7.7mg,0.0559mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后分3次加入150微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下共反应7小时后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-58(8.5mg,86％)。

[α]D²⁵＝-148.6(c＝0.5,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₉H₄₃N₄O₆[M+H]+663.3177,found 663.3176。

6、获得D-A类型天然产物类似物exo-59

对应二烯体的乙酰基前体S22(13.3mg,0.0512mmol)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(21.2mg,0.154mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后每隔一小时分4次加入200微升亲二烯体1的DMSO溶液(100mM储液)，37℃下反应9小时后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mmi.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-59(5.7mg,55％)。

[α]D²⁴＝-141.5(c＝0.57,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₃₁H₃₃O₇[M+H]+517.2221,found 517.2222。

7、获得D-A类型天然产物类似物exo-60

/>

对应二烯体的乙酰基前体S8(12.5mg,0.0288mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(15.6mg,0.115mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后每隔12小时加入50微升亲二烯体38的DMSO溶液(100mM储液)，共加入四次，然后37℃下反应3天后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-60(10.4mg,80％)。

[α]D²⁶＝-333.6(c＝0.52,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₄₁H₃₈NO₇[M+H]+656.2643,found 656.2658。

8、获得D-A类型天然产物类似物exo-61及原料48

对应二烯体的乙酰基前体S8(11.4mg,0.0263mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(16.3mg,0.118mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后每隔12小时加入50微升亲二烯体48的DMSO溶液(100mM储液)，共加入四次，然后37℃下反应2天后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-61(2.1mg,17％)以及原料48(4.8mg)。

[α]D²⁶＝-361.7(c＝0.105,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₄₀H₃₂NO₆[M+H]+622.2224,found 622.2219。

9、获得D-A类型天然产物类似物exo-62及原料38

对应二烯体的乙酰基前体S57(15.5mg,0.0426mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(8.8mg,0.0639mmol)，室温搅拌20分钟后，加入到148毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0)中，再向该反应体系中加入6.8毫克SUMO-MaDA-3和4.9毫克亲二烯体38(溶解在200微升DMSO中)，37℃下反应4小时后，补加4.2毫克亲二烯体38(溶解在200微升DMSO中)，在37℃下继续反应16小时后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-62(4.0mg,23％)以及原料38(3.3mg)。

[α]D²⁶＝-163.0(c＝0.2,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₄₁H₄₄N₅O₄[M+H]+670.3388,found 670.3390。

10、获得D-A类型天然产物类似物exo-63及原料38

对应二烯体的乙酰基前体S53(12.1mg,0.0314mmol)溶解在2毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：9)，然后加入碳酸钾(13.0mg,0.0940mmol)，室温搅拌30分钟后，加入到由45毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝7.0),和3毫升甲醇组成的混合溶液中，再向该反应体系中加入2.0毫克SUMO-MaDA-3，随后每隔6小时加入50微升亲二烯体38的DMSO溶液(100mM储液)，共加入四次，在37℃下继续反应2天后，加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物exo-63(3.7mg,29％)以及原料38(4.2mg)。

[α]D²⁶＝-224.0(c＝0.185,MeOH)；

HRMS(ESI)calculated for C₄₃H₄₀NO₅[M+H]+650.2901,found 650.2906。

本实施例证实，MaDA-3能催化不同反应底物，进行exo选择性D-A反应，生成不同D-A类型天然产物类似物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶及其应用

<130> KHP211120298.6

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagtact tttccttctc tttgtcgttt cccaaaatca ccatttttct tttttcattt 60

gtattgctag cttcagcaaa tcacgctcat gaaagctttc ttgagtgctt gatctcaacc 120

tccactcccg aatccattat ctacactaaa cataatccgt cgtatttcac tatattaaat 180

tcaacgtctc taaattctcg ttttttttct tctccagcca gatatccctt gcttattgtc 240

acgccacttc atgcctccca cgtccaagcc actgttcact gcgccaagaa acacggcata 300

caaatcagaa tccgaagtgg tggccacgat tacgagggcc tctcttacat gtccaacgtt 360

acttttgcca tactcgactt gagaaaccta aattctatta acgttgatgt gaagagaaag 420

tctgcatggg ttcaatccgg agcgacgctt ggtgaacttc attattggat tgctaacaaa 480

agccaaaatc ttgcctttcc tggcgtcgtc ggacacactg tttgcatggg tggaatgcta 540

ggcgcaggtg gctatggcta ttcgtcgcga aaatacgggc tcccagctga taatattctt 600

gacgcgcaac ttatcgacgt gcgaggaaga attctcaatc gaaaatctat gggggaagat 660

ttgttttggg ccatacgtgg tggtggagca ggaagctttg gaatcgttct tgcctggaaa 720

gttcgcctag ttgacgtacc gtcgaaagtg actgtgttta cagccataag ggactgggat 780

aacaatgcaa caaagaagtt tattcaccga tatcagcgcc gtattgccaa ggtcgataag 840

aatctaacta tcattatcag attcgtaaca gaaagtacta ccgatgaaaa aagtaataag 900

aaaattgtaa tatcaacttt catcacggcc ctataccacg gcagccaaga taggctcctt 960

tcgttgatgg aaaaagactt tccagagctg ggtttgcttg caaaagaatg cactgaagag 1020

acatgggtcc aatccattct ctatttcaat tttttcacaa atggagaacc cttggaggtc 1080

ctactcaata gaacgatgaa ttttgaactg acgtctttca aaattaaatc tgactacttg 1140

aaaaagccta ttccggatca ggtgctggaa aatttgttgg ttatgttgta tgaagaagat 1200

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tacaattaca tgactcccta tgtgtcaaaa aatccgagag gtgcatttct taactttaga 1440

gaccttgata ttggaactaa tcctaatgaa aatgagatca acggtgctta taactatatt 1500

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gtaaagacta tagttgatcc aactaatttt tttacgtacg aacaaagcat cccgtccctt 1620

cttccacatt aa 1632

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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50 55 60

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Ala Asn Lys Ser Gln Asn Leu Ala Phe Pro Gly Val Val Gly His Thr

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Asp Val Arg Gly Arg Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu

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195 200 205

Ala Trp Lys Val Arg Leu Val Asp Val Pro Ser Lys Val Thr Val Phe

210 215 220

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225 230 235 240

Arg Tyr Gln Arg Arg Ile Ala Lys Val Asp Lys Asn Leu Thr Ile Ile

245 250 255

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Ile Val Ile Ser Thr Phe Ile Thr Ala Leu Tyr His Gly Ser Gln Asp

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Asn Phe Phe Thr Asn Gly Glu Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Arg Thr

325 330 335

Met Asn Phe Glu Leu Thr Ser Phe Lys Ile Lys Ser Asp Tyr Leu Lys

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Asp Pro Thr Asn Phe Phe Thr Tyr Glu Gln Ser Ile Pro Ser Leu Leu

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Pro His

<210> 3

<211> 659

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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Ser Ala Phe Ala Ala Gly Met Gly His His His His His His Gly Ser

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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180 185 190

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195 200 205

His Cys Ala Lys Lys His Gly Ile Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly

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His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Met Ser Asn Val Thr Phe Ala Ile

225 230 235 240

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275 280 285

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290 295 300

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Ile Asp Val Arg Gly Arg Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp

325 330 335

Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val

340 345 350

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370 375 380

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385 390 395 400

Ile Ile Arg Phe Val Thr Glu Ser Thr Thr Asp Glu Lys Ser Asn Lys

405 410 415

Lys Ile Val Ile Ser Thr Phe Ile Thr Ala Leu Tyr His Gly Ser Gln

420 425 430

Asp Arg Leu Leu Ser Leu Met Glu Lys Asp Phe Pro Glu Leu Gly Leu

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 5

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<211> 666

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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Leu Ser Trp Ile Arg Arg Ala Tyr Asn Tyr Met Thr Pro Tyr Val Ser

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<210> 8

<211> 1566

<212> DNA

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<210> 9

<211> 45

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacctgtatt ttcagggatc catgaagtac ttttccttct ctttg 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacctgtatt ttcagggatc catgaagtac ttttccttct ctttg 45

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacctgtatt ttcagggatc ccatgaaagc tttcttgagt gcttg 45

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctagtacttc tcgacaagct tttaatgtag aagaaggga 39

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaaacctgt attttcaggg atcccatgaa agctttcttg agtgc 45

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctctagtact tctcgacaag cttttaatgt ggaagaaggg acg 43

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaaaacctgt attttcaggg atcccatgaa agctttcttg agtgc 45

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctagtacttc tcgacaagct tttaatgtgg aagaagggac g 41

Claims

1.一种分子间exo选择性Diels-Alder反应酶，其特征在于，分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-2的氨基酸序列如SEQ ID No.2；或分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5。

2.编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的基因，其特征在于，编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.编码权利要求1所述的分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的DNA片段，其特征在于，编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-2的DNA片段如SEQ ID No.7所示；编码分子间exo选择性Diels-Alder反应酶MaDA-3的DNA片段如SEQ ID No.8所示。

4.扩增权利要求3所述DNA片段的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No.13 -14所示或SEQ ID No.15-16所示。

5.含有权利要求2所述基因或含有权利要求3所述DNA片段的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、微生物或昆虫细胞。

6.权利要求1所述分子间exo选择性Diels-Alder反应酶在以亲二烯体和二烯体为底物，催化Diels-Alder反应制备含有六元环骨架的桑树天然产物，或合成立体专一性exo构型产物中的应用；所述亲二烯体为查尔酮或其衍生物，二烯体为含有脱氢异戊烯基的黄酮、二苯乙烯、查尔酮或苯并呋喃。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述分子间exo选择性Diels-Alder反应酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应的温度为50℃，pH为7.0。