CN106520743A - 重组羟腈裂解酶及其用于制备光学纯手性氰醇的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于巴达木(Prunus communis L.var.dulcis Borkh)的羟腈裂解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及应用该重组羟腈裂解酶作为催化剂在催化潜手性芳香醛类化合物不对称羟氰化以制备医药前体手性氰醇中的应用。本发明的羟腈裂解酶具有催化效率高、立体选择性好的优点，与脱脂制备的野生巴达木种仁粉催化剂相比，本发明的羟腈裂解酶催化剂催化效果更佳，底物适应性更广。本发明的酶促反应可以在室温下进行，克服了常规羟氰化反应必须在低温操作的缺陷，操作简单，具有很好的工业应用前景。

Description

重组羟腈裂解酶及其用于制备光学纯手性氰醇的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羟腈裂解酶及其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组羟腈裂解酶的制备，以及该重组羟腈裂解酶作为催化剂在催化芳香醛不对称羟氰化以制备光学纯手性α-氰醇中的应用。

背景技术

光学纯α-氰醇的α-碳是一个手性碳原子，连接一个羟基和一个腈基，这些基团可以在保持手性的情况下转化成其他各种基团，再加上氰醇分子中其他官能基团参与的转化，可以生成多种手性化合物分子，其中许多化合物都具有生物活性。因此，光学纯的α-氰醇在药物和精细化学品的不对称合成中占有重要地位。目前，光学纯α-氰醇的立体选择性制备已成为有机合成的重要研究领域。

生物催化法是制备光学纯氰醇的重要方法，一般使用羟腈裂解酶(Hydroxynitrile lyase,HNL)，催化氢氰酸与醛类或酮类化合物的不对称加成反应，获得高光学纯度的氰醇。目前，羟腈裂解酶的研究历史已经超过一个世纪，通过羟腈裂解酶催化，合成了许多具有重大经济价值的手性α-氰醇，不乏工业规模制备的案例。例如：来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的(S)-羟腈裂解酶(HbHNL)能催化3-苯氧基苯甲醛与氢氰酸不对称加成制备(S)-3-苯氧基扁桃腈，后者是具有巨大市场前景的拟除虫菊酯类杀虫剂化合物的前体，目前其产率高达1000g L^-1d^-1，产物的ee值高于98.5％(Chim.Oggi.1998,16,15-19)。使用分子改造的苦杏仁(Prunus amygdalus)羟腈裂解酶5号同工酶作为催化剂，催化2-氯苯甲醛的不对称羟氰化反应合成抗凝血剂氯吡格雷合成前体(R)-2-氯扁桃腈，6h时转化率达到98％以上，产物的ee值高于98％，反应时空产率达到250g L^-1d^-1(ChemBioChem.2008,9,58–61)。类似的，使用理性设计改造的苦杏仁(Prunus amygdalus)羟腈裂解酶5号同工酶作为催化剂，催化苯丙醛与氢氰酸进行不对称加成，合成非巯基血管紧张素转化酶抑制剂的前体(R)-2-羟基-4-苯基丁腈，反应10h，转化率高于97％，产物的ee值大于99％(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,4700–4704)。然而，尽管在羟腈裂解酶的研究领域已取得突出成果，并有产业化的实例，该酶催化的反应仍然存在一些共性的问题。由于底物醛的活性较高，容易发生自发的化学羟氰化反应，而自发的化学反应是没有立体选择性的；同时产物α-氰醇自身不稳定，在高温、高pH环境中容易发生自发消旋，因此酶促羟氰化反应通常在低温(4-10℃)、低pH(<4.5)的条件下进行；或者引入水-有机两相体系或微水相体系，以避免自发的化学反应，提高酶促反应产物的光学纯度。但是在低pH的环境中，绝大多数羟腈裂解酶不稳定，反应过程中活力迅速下降甚至直接失活。针对苦杏仁羟腈裂解酶催化的2-氯苯甲醛与氢氰酸加成合成(R)-2-氯扁桃腈的反应过程中对映选择性低的问题，将苦杏仁核仁粉碎脱脂后的种仁粉作为催化剂，在异丙醚微水相体系内催化反应，采用逐步流加底物的方法，可获得ee值为82-91％的产物(Org.Process Res.Dev.,2003,7,828–831)。对纯化后的苦杏仁羟腈裂解酶进行交联，制备交联酶聚集体，在异丙醚微水相体系中催化2-氯苯甲醛的羟氰化反应，底物浓度达到0.5M，2h转化率为98％，产物(R)-2-氯扁桃腈的ee值达到95％(Org.Lett.,2005,7,327–329)。

(R)-4-甲硫基扁桃腈是广谱抗生素氟苯尼考和甲砜霉素的合成前体，羟腈裂解酶可以催化4-甲硫基苯甲醛不对称羟氰化合成(R)-4-甲硫基扁桃腈，但是目前已知的具有较广底物谱的苹果、枇杷、苦杏仁等植物种籽的脱脂种仁粉催化剂，对4-甲硫基苯甲醛的活性低，立体选择性差，仅有巴达木(Prunus communis)脱脂种仁粉所含的羟腈裂解酶能催化4-甲硫基苯甲醛转化，在异丙醚的微水相反应体系中，12–24h内催化0.5M的4-甲硫基苯甲醛完全转化，产物得率为96％，ee值为90-96％(Tetrahedron,2008,64,7822–7827)。由于巴达木脱脂种仁粉中羟腈裂解酶有效成分低，酶促反应体系中催化剂使用量大；种仁中羟腈裂解酶的含量严重受季节因素以及产地的影响，不同来源的巴达木种籽中的羟腈裂解酶含量存在差异，此外不同批次酶促反应的重复性较差，操作条件以及操作人员的水平严重影响产物光学纯度的稳定性。采用微水相反应体系操作时，所有溶剂必须现场新鲜重蒸，严格控制体系中的水含量，如果反应条件控制不好，产品光学纯度低，需要进行重结晶后才能达到高于99％的ee值。巴达木所含羟腈裂解酶的分子特性及催化性能，至今尚无报道。而且与苦杏仁类似的是，巴达木羟腈裂解酶是以同工酶的形式存在，不同的同工酶在催化特性上可能具有很大的差异。因此有必要利用分子克隆技术将巴达木羟腈裂解酶基因克隆到微生物内进行重组表达，不仅可以在短时间内获取大量的活性羟腈裂解酶，而且更关键的是获得的重组羟腈裂解酶催化剂性能稳定，使用重组酶催化反应，反应的可重复性好，易于操作，有利于获得高光学纯度的产品。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对天然巴达木种籽中活性羟腈裂解酶含量低，进行微水相不对称羟氰化反应时产物的ee值不稳定的严重缺陷，提供一种重组羟腈裂解酶及其制备方法，以该重组羟腈裂解酶作为催化剂在两相反应体系中催化潜手性芳香醛与氢氰酸不对称羟氰化制备光学纯α-氰醇的应用。该应用可在室温下进行操作，生产效率高，产物光学纯度高，工艺稳定，操作简便，易于放大。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供的重组羟腈裂解酶PcHNL来源于产自中国新疆省的厚皮巴达木(Prunus communis)，在市场上易于获得；其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；或者是在保持由该羟腈裂解酶催化活力的前提下，插入、缺失，或替换如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

本发明还涉及一种羟腈裂解酶基因，所述的核酸是编码上述重组羟腈裂解酶PcHNL的核酸分子。

其碱基序列优选如序列表中SEQ ID No.1所示。

如本领域技术人员众所周知，本发明的羟腈裂解酶基因的碱基序列也可以是编码如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的其他任何碱基序列。

本发明还涉及包含本发明羟腈裂解酶基因的核苷酸序列的重组表达载体，其可通过本领域常规方法将本发明的羟腈裂解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以是本领域常规的各种载体，如商业化的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pPICZαA。较佳的，可根据下述方式制得本发明的重组表达载体：将羟腈裂解酶PcHNL基因通过PCR扩增，所得的DNA产物片段与质粒pMD-19T连接，形成的克隆载体pMD-19T-PcHNL与表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的羟腈裂解酶基因的重组表达质粒pPICZαA-PcHNL。

本发明还涉及包含本发明所述羟腈裂解酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体，其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中，获得本发明所述的基因工程菌株。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且所携带的本发明的重组羟腈裂解酶基因可以有效表达即可。本发明优选的宿主微生物是重组毕赤酵母，更优选毕赤酵母X33。本发明的基因工程菌株可按照本领域的常规方法制备而得，将含有本发明重组羟腈裂解酶的重组表达质粒转化到原核宿主微生物，比如大肠杆菌中进行扩增，提取扩增的重组表达质粒，用限制性内切酶Sac I单酶切消化后转化到目标毕赤酵母宿主细胞，即得到本发明优选的基因工程菌株，即重组毕赤酵母菌P.pastoris pPICZαA-PcHNL。

本发明还涉及一种重组羟腈裂解酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组表达的羟腈裂解酶。其中，所述重组表达转化体培养所用的培养基可以是本领域任何可以使所述重组表达转化体生长并产生本发明的羟腈裂解酶的培养基，对于重组毕赤酵母菌，优选BMGY培养基：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，无氨基酸酵母氮源13.4g/L以及终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组表达转化体能够生长并产生本发明的羟腈裂解酶即可。其他培养重组表达转化体的具体操作均可按照本领域常规操作进行。对于重组毕赤酵母菌株，优选下述方法：将表达本发明重组羟腈裂解酶的重组酵母菌(优选本发明的毕赤酵母(Pichia pastoris)X33构建的重组表达转化体)接种至含氨苄青霉素的BMGY培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到1.3-2(优选1.5)时，将培养基替换为BMMY(甲醇20ml/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，无氨基酸酵母氮源13.4g/L以及终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)，每隔24h添加相当于培养液体积1％的纯甲醇进行诱导，持续诱导96h，可高效诱导重组毕赤酵母菌分泌表达本发明的重组羟腈裂解酶。

本发明还涉及一种利用分光光度计检测280nm处吸光值的变化计算羟腈裂解酶的活力的方法，其重组羟腈裂解酶活力测定方法如下：在保温于25℃的1ml反应体系(100mM柠檬酸钠缓冲液，pH 5.0)，加入2mM外消旋扁桃腈，加入适量酶液，迅速摇匀，检测280nm处吸光值的变化。

羟腈裂解酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10³/(1376×l)，式中，EW为1min内280nm吸光值的变化；V为反应液的体积，单位mL；1376为摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。

重组羟腈裂解酶活力定义为：上述酶活力测定条件下，每分钟催化裂解1μmol外消旋扁桃腈所需要的酶量。

本发明还涉及一种重组羟腈裂解酶催化剂及其制备方法。本发明所述的重组羟腈裂解酶以分泌表达的形式存在于发酵培养液中，可直接使用分离除去菌体细胞的发酵培养液作为酶促反应的催化剂；或者将发酵培养液经脱盐处理，然后对低盐的培养液进行冷冻干燥，制得重组羟腈裂解酶冻干酶粉。较佳的，对发酵培养液高速离心，分离去除菌体细胞，离心上清液通过0.22μm孔径的微滤膜过滤后，于4℃用截留分子量为30kDa的超滤膜超滤浓缩，并用柠檬酸钠缓冲液(20mM,pH 5.5)反复洗涤，获得浓度大约为1mg/ml的羟腈裂解酶溶液，最后对酶液进行冷冻干燥，制得重组羟腈裂解酶冻干酶粉。

本发明还涉及一种使用本发明的羟腈裂解酶作为催化剂催化芳香醛不对称羟氰化以制备手性α-氰醇的应用。较佳的，所述的应用按下述方法进行：在pH 4-5的缓冲溶液中，在有机溶剂的存在下，以含有重组巴达木羟腈裂解酶的培养清液或冻干酶粉作为催化剂，以潜手性芳香醛和氢氰酸作为底物，进行生物转化反应。其中，优选的缓冲溶液为柠檬酸钠缓冲液，优选的有机溶剂是甲基叔丁基醚。

所述潜手性芳香醛为结构如式1-5所示的潜手性芳香醛类化合物：

式1中，R为-H；

或者R为-Cl，其取代的位置在苯基的邻位或间位；

或者R为-OMe，其取代的位置在苯基的邻位、间位或对位；

或者R为-OPh，其取代的位置在苯基的间位；

或者R为-SMe，其取代的位置在苯基的对位；

或者R为-Me，其取代的位置在苯基的对位；

或者R为-F，其取代的位置在苯基的对位；

式2中，取代基在1-位，或者2-位；

式4中，n为1或2；

式5中，X为O或者S。

较佳的，所述的潜手性芳香醛类化合物为结构如式1-17所示的潜手性芳香醛类化合物：

所述的潜手性芳香醛类化合物在反应液中的浓度为100-500mM，较佳的是400mM。本发明的重组巴达木羟腈裂解酶的添加量为催化有效量，较佳的为100-630U/mmol醛，氢氰酸的浓度较佳的为1-2M，其中氢氰酸的获得是通过氰化钠或氰化钾与强酸反应后，用甲基叔丁基醚萃取的方法获得含有氢氰酸的甲基叔丁基醚溶液。所述的柠檬酸盐缓冲液可以是本领域常规柠檬酸盐缓冲液，如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的浓度较佳的为50-100mM，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称羟氰化反应在反应液充分搅拌混合的条件下进行，比如在圆底烧瓶中以磁力搅拌的方式进行。所述的不对称羟氰化反应的温度较佳的为15-25℃。所述的不对称羟氰化反应通过TLC薄层层析的方法监控反应进程，反应时间以目标产物量不再增加时为准，一般为4-12h。不对称羟氰化反应结束后可按本领域常规方法从反应液中提取反应产物(R)-或(S)-型手性α-氰醇。优选的，反应液用等体积乙酸乙酯萃取三次，分离有机相，然后用饱和FeCl3水溶液洗涤至水溶液不变色，之后依次以水、饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，真空旋转蒸发浓缩后，快速柱层析分离获得高纯度的目标手性α-氰醇产物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即可获得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：本发明的重组羟腈裂解酶可作为催化剂应用于不对称羟氰化前手性芳香醛类化合物以制备多种光学活性手性α-氰醇，其催化效率高，立体选择性强，反应可以在室温环境中进行，能耗低。与天然巴达木脱脂种仁粉相比，本发明的羟腈裂解酶催化效果更佳，底物适应性更广，具备很高的工业开发前景。

附图说明

图1为巴达木羟腈裂解酶基因的获取策略图；

图2为重组质粒pPICZαA-PcHNL的构建流程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步阐述本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

质粒pMD-19T，聚合酶PrimeStar HS premix，dATP购自大连TaKaRa公司。

表达质粒pPICZαA购自美国Invitrogen公司。

Escherichia coli Top10和Pichia pastoris X33感受态细胞购自美国Invitrogen公司，聚合酶Easy Taq Master Mix购自江苏康维生物有限公司，琼脂糖凝胶试剂盒及DNA纯化回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。

实施例1巴达木羟腈裂解酶基因的克隆

将新鲜巴达木种籽果核在80℃热水中浸泡0.5h，取出以冰水冷却，反复3次，取出后埋在沙土中，表层沙土的厚度约0.5cm，间歇浇水，保持沙土湿润，待种籽发芽后以酚氯仿法提取幼嫩叶片的基因组DNA。由于巴达木羟腈裂解酶的基因序列未见文献报道，根据已知蔷薇科羟腈裂解酶的基因序列(Genbank，Accession AF412329.1、AF040079.1、U51562.1、AY321296.1、GU126428.1、U78814.1)分析可能存在于整个蔷薇科家族HNL中的保守碱基区段，据此设计简并引物，以巴达木基因组为模板，采取文献报道类似的方法(JBiosci.Bioeng.,2011,112,321-325)在其染色体上步移获取基因碎片片段，通过比对后根据获取的碎片信息设计N端上游引物Primer 1-F，C末端根据Genbank上报道序列最为类似的苦杏仁羟腈裂解酶5号同工酶的基因(Genbank，Accession AF412329)设计下游引物Primer 1-R。

巴达木羟腈裂解酶基因的获取策略如图1所述。

具体的，本发明羟腈裂解酶基因的克隆包括以下步骤：

步骤1，使用Easy Taq Master Mix进行PCR扩增，PCR体系为：2×Easy Taq MasterMix 15μl，上游引物Primer 1-F和下游引物Primer 1-R各1.5μl，巴达木基因组模板1μl(100ng)，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR反应程序为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性1min；(3)50℃退火1min；(4)72℃延伸0.5min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物连接到质粒pMD-19T上，转化到大肠杆菌E.coli DH 5α中，并进行蓝白斑筛选获得阳性克隆子，对PCR扩增产物进行测序，依据测序结果，设计第二步扩增引物Primer S-F1和Primer 2-R。

步骤2，使用Easy Taq Master Mix进行PCR扩增，PCR体系为：2×Easy Taq MasterMix 15μl，上游引物Primer S-F1和下游引物Primer 2-R各1.5μl，巴达木基因组模板1μl(100ng)，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR反应程序为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火1min；(4)72℃延伸1.8min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物连接到质粒pMD-19T上，转化至大肠杆菌E.coli DH 5α中，并进行蓝白斑筛选获得阳性克隆子，对PCR扩增产物进行测序，依据测序结果，设计第二步扩增引物Primer HNL-F和Primer HNL-R。

步骤3，使用PrimeStar HS premix进行PCR扩增，PCR体系为：2×PrimeStar HSpremix 15μl，上游引物Primer HNL-F和下游引物Primer HNL-R各1.5μl，巴达木基因组模板1μl(100ng)，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR反应程序为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性1min；(3)53℃退火1min；(4)72℃延伸2min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物加入Easy Taq polymerase 1μl，dATP 3μl，72℃保温30min，直接连接至质粒pMD-19T，转化至大肠杆菌E.coli DH 5α中，并进行蓝白斑筛选获得阳性克隆子，对PCR扩增产物进行测序，获取巴达木羟腈裂解酶完整基因。

其中，所涉及的引物的具体序列如表1所示：

表1所涉及的引物的具体序列

名称	序列
		Primer 1-F	5’-ATGGNGAAATCAACAATGTCAG-3’
Primer 1-R	5’-TGCCAATGGACACCCT-3’
		Primer S-F1	5’-GCAAATAGAACAGATGCATGTGCTAAA-3’
Primer 2-R	5’-CTNCCTAACATCAGATA-3’
		Primer HNL-F	5’-CTTGCCAATACTTCTGCTCATGATTTTAG-3’
Primer HNL-R	5’-TCACATGGACTCTTGAATATT-3’

实施例2重组质粒pPICZαA-PcHNL的制备

重组质粒pPICZαA-PcHNL的构建流程如图2所示。

实施例1中克隆获得的巴达木羟腈裂解酶完整基因中含有内含子，通过与Genbank中已报道的蔷薇科羟腈裂解酶特有的保守内含子进行比对，识别出巴达木羟腈裂解酶中包含的3个内含子。随后，以实施例1制备获得的质粒pMD-19T-HNL为模板，采用引物连接重叠延伸PCR技术删除原基因序列中包含的3个内含子。具体操作步骤如下：

步骤1，使用PrimeStar HS premix进行PCR扩增，采用三组引物，分别扩增获得羟腈裂解酶PcHNL的三段外显子。PCR体系为：2×PrimeStar HS premix 15μl，上下游引物各1.5μl，pMD-19T-HNL模板1μl(100ng)，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR程序为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性1min；(3)54℃退火1min；(4)72℃延伸0.5–1.0min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收相应大小的电泳条带，作为下一个步骤的模板。所用的各组引物名称、序列以及电泳条带大小见表2：

表2所用的各组引物名称、序列以及电泳条带大小

步骤2，使用PrimeStar HS premix进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×PrimeStarHS premix 15μl，上游引物Primer F1-F和下游引物Primer F2-R各1.5μl，步骤1获取的条带1和条带2模板各50ng，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR程序为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性1min；(3)57℃退火1min；(4)72℃延伸1min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收1000-1500bp处的条带4；

步骤3，使用PrimeStar HS premix进行PCR扩增，PCR体系为：2×PrimeStar HSpremix 15μl，上游引物Primer EcoRI F和下游引物Primer Not I R各1.5μl，步骤1、2获取的条带3和条带4各50ng，DMSO 0.5μl，ddH₂O补足至30μl。PCR程序为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性1min；(3)57℃退火1min；(4)72℃延伸1min；程序(2)-(4)重复共30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收1500-2000bp处的条带，获得目标羟腈裂解酶的成熟基因。其中，引物Primer EcoRI F和Primer Not I R的序列如表3所示：

表3引物Primer EcoRI F和Primer Not I R的序列

名称	序列
		Primer EcoRI F	5’-GGAATTCCATCACCATCACCATCACCTTGCCAATACTTCTGCTCATG-3’
Primer Not I R	5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCACATGGACTCTTGAATATT-3’

步骤4，将步骤3获得的PCR产物在37℃经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切4h，经PCR纯化回收试剂盒回收，将回收产物与同样经EcoR I和Not I双酶切消化的质粒pPICZαA，在16℃连接过夜得到重组质粒pPICZαA-PcHNL。

实施例3重组毕赤酵母P.pastoris/pPICZαA-PcHNL的制备

将实施例2中获得的重组质粒pPICZαA-PcHNL在37℃经限制性内切酶Sac I双酶切4h，电泳验证重组质粒完全线性化后，利用PCR纯化回收试剂盒回收目标DNA片段(浓度>100ng/μl)。

将80μl毕赤酵母X33的感受态细胞和1μg线性化质粒DNA样品混匀，转移至预冷的电转杯(电极间距0.2cm)中，冰浴5min；然后在2kV、5ms的条件下脉冲电击一次；之后向电转杯中迅速加入0.5ml冰上预冷的山梨醇溶液(1M)，并将电转杯中的菌液转移到装有0.5mlYPD液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，pH 6.0)的1.5mlEppendorf管中，于30℃、200rpm培养2-3h；用移液枪吸取200μl电转复苏后的菌液，涂布于YPDZ固体培养基平板(琼脂粉：20g/L，蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，博莱霉素100-2000μg/mL，pH 6.0)，倒置于30℃培养箱中培养2天左右，至有肉眼可见的转化子长出，获得重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZαA-PcHNL。挑取单个转化子菌落，抽提基因组，使用AOX通用引物扩增整合至基因组上的目的羟腈裂解酶基因片段，经DNA测序，基因全长1599bp，碱基序列如序列表中SED ID No.2所示。

实施例4重组毕赤酵母菌的培养以及重组羟腈裂解酶催化剂的制备

将实施例3中的重组毕赤酵母Pichia pastoris X33/pPICZαA-PcHNL接种至YPDZ液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，博莱霉素100μg/mL，pH6.0)中，于30℃，250rpm震荡培养24h，按1％的接种量接种至100ml含有100μg/mL氨苄青霉素的BMGY液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，甘油：10g/L，无氨基酸酵母氮源：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)中，置于30℃，250rpm摇床中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到1.5时，停止培养，静置2-3h使酵母细胞沉降，小心倾倒出BMGY培养基上清，然后将收集的菌体用100ml的BMMY培养基(甲醇10ml/L，蛋白胨：20g/L，酵母提取物10g/L，生物素0.4mg/L，无氨基酸酵母氮源13.6g/L，终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)重新悬浮，置于30℃，250rpm摇床中继续培养，每24h添加2ml的纯甲醇进行诱导，持续培养、诱导96h，培养过程中定期吸取培养液，离心后取上清，进行羟腈腈裂解活力测定，监控重组羟腈裂解酶的表达。培养结束后，将培养液于4℃、8000×g离心后去除菌体，上清以0.22μm孔径的微滤膜微滤，于4℃以截留分子量为30KDa的超滤膜超滤浓缩，并用柠檬酸钠缓冲液(20mM,pH 5.5)反复洗涤，最终浓缩至重组羟腈腈裂解的浓度大约为100U/ml。

对浓缩的酶液冷冻干燥后制得含有重组羟腈裂解酶的冻干粗酶粉，比活力为12U/mg。

实施例5氢氰酸-甲基叔丁基醚溶液的制备

称取9.8g NaCN，加入250ml的圆底烧瓶中，冰浴冷却，加入20ml蒸馏水与25ml甲基叔丁基醚，翻口塞密封后于冰浴上磁力搅拌15min，然后在搅拌条件下以注射器缓慢滴加25ml浓度为4M的硫酸溶液，滴加结束后继续搅拌4min，以分液漏斗快速分液，分离有机相，剩余的水相中加入25ml甲基叔丁基醚再萃取一次，合并有机相置于氮气保护的棕色瓶内，加入10ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH 5.0)作为稳定剂，保存于-80℃备用。

实施例6重组羟腈裂解酶液催化4-甲硫基苯甲醛不对称羟氰化反应

取2.5ml实施例4制备的浓缩后的羟腈裂解酶液，加入2.5ml如实施例5制备的氢氰酸-甲基叔丁基醚溶液，加入终浓度200mM的4-甲硫基苯甲醛，于15℃，磁力搅拌反应，间歇取样50μl，以1ml乙酸乙酯萃取，通过液相色谱分析测定反应转化率和α-氰醇的ee值，反应24h，转化率97％，产物ee值高于99％。

液相色谱分析，使用的色谱柱为OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大赛璐公司，日本)，流动相为正己烷/异丙醇，流动相比例为正己烷/异丙醇：85/15，检测柱温25℃，流动相流速0.7ml/min，检测波长为254nm。其中α-氰醇的ee值测定需要预先对α-氰醇进行乙酰化处理，乙酰化反应的条件为：乙酸乙酯的萃取样品加入80μl乙酸酐，40μl吡啶，1mg对二甲氨基吡啶，室温搅拌反应2h，反应产物以1ml饱和硫酸铜水溶液洗涤至水相不变色，1ml水洗两次，1ml饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，蒸发去除溶剂，以300μl异丙醇复溶后进行液相色谱分析。

实施例7重组羟腈裂解酶催化4-甲硫基苯甲醛不对称羟氰化反应条件考察

按表4条件配置反应体系，称取5-125mg如实施例4获得的重组羟腈裂解酶冻干粗酶粉，溶解于2.37ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH 4-6)中，加入2.5ml如实施例5制备的氢氰酸-甲基叔丁基醚溶液，加入终浓度100-500mM的4-甲硫基苯甲醛，于4-25℃，磁力搅拌反应，间歇取样，薄层层析检测反应转化率。当反应转化率停止增长时，反应液用2倍反应体积乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有机相，用饱和FeCl₃洗涤至水相溶液不变色，再分别以等体积水，饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，真空减压蒸发除去溶剂，200-300目硅胶填装层析柱，快速柱层析分离获得目标产物。柱层析条件为石油醚/乙酸乙酯：15/1分离出未转化的4-甲硫基苯甲醛，石油醚/乙酸乙酯：4/1分离得(R)-4-甲硫基扁桃腈。反应转化率和α-氰醇的ee值通过液相色谱分析测定，使用的色谱柱为OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大赛璐公司，日本)，流动相为正己烷/异丙醇，流动相比例为正己烷/异丙醇：85/15，检测柱温25℃，流动相流速0.7ml/min，检测波长为254nm。其中α-氰醇的ee值测定需要预先对α-氰醇进行乙酰化处理，乙酰化反应的条件为：1mmol氰醇溶解于2ml二氯甲烷，加入400μl乙酸酐，200μl吡啶，5mg对二甲氨基吡啶，室温搅拌反应2h，反应产物以2倍体积饱和硫酸铜水溶液洗涤至水相不变色，等体积水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，真空减压蒸发去除溶剂，取少量以异丙醇复溶后进行液相色谱分析，分析结果见表4。

表4.不同条件重组羟腈裂解酶催化4-甲硫基苯甲醛不对称羟氰化反应结果

实施例8-23重组羟腈裂解酶催化潜手性芳香醛的不对称羟氰化反应

称取50mg如实施例4获得的重组羟腈裂解酶冻干粗酶粉，溶解于2.5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH 5.0)中，加入2.5ml如实施例5制备的氢氰酸-甲基叔丁基醚溶液，分别加入终浓度400mM的前手性芳香醛(实施例8-23)，于25℃，磁力搅拌反应，间歇取样TLC检测反应转化率。当反应转化率停止增长时，反应液用2倍体积乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有机相，用饱和FeCl₃洗涤至水相溶液不变色，再分别以等体积水和饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，真空减压蒸发除去溶剂，200-300目硅胶填装层析柱，快速柱层析分离，使用的流动相为石油醚/乙酸乙酯，首先分离除去未反应醛，随后适当调整流动相比例，洗脱获得目标产物。柱层析的流动相比例列于表5中。

反应转化率和α-氰醇的ee值通过液相色谱分析测定，使用的色谱柱为OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大赛璐公司，日本)，流动相为正己烷/异丙醇，流动相比例列于表5中。检测柱温25℃，流动相流速0.7ml/min，检测波长为254nm。其中实施例9-12、14-16、19-20的反应产物进行乙酰化处理后进行ee值分析。乙酰化反应的条件为：1mmol氰醇溶解于2ml二氯甲烷，加入400μl乙酸酐，200μl吡啶，5mg对二甲氨基吡啶，室温搅拌反应2h，反应产物以2倍体积饱和硫酸铜水溶液洗涤至水相不变色，等体积水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，真空减压蒸发去除溶剂，取少量以异丙醇复溶后进行液相色谱分析，分析结果见表6。

表5液相色谱分析以及产品柱层析分离的流动相比例

表6.重组巴达木羟腈裂解酶催化潜手性芳香醛不对称羟氰化反应

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110> 华东理工大学

<120> 重组羟腈裂解酶及其用于制备光学纯手性氰醇的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2058

<212> DNA

<213> Prunus communis

<400> 1

cttgccaata cttctgctca tggtaaattt ccatcttcag tattcattta acaaaaaagt 60

gtagatttat aattaagaaa actgaaacaa gtagtgcaag aaacaagcta atttagatgc 120

atgttgaaaa aaatctttca tctcttcaca tatattttgc agattttagc tacttgaagt 180

ttgtgtacaa cgccactgat acaagcttgg aaggatcata tgactacatt gtaatcggtg 240

gaggaacatc agggtgtcca ttggcagcaa ctttatcaga aaaatacaag gtgcttcttc 300

tagaaagagg cactattgct acagaatacc cgaacacgtt gactgcagat gggtttgcat 360

ataatctgca gcaacaagat gatggaaaga cgccagttga aaggttcgtg tccgaagatg 420

gcattgataa tgtgcgagcc aggatcctcg gtggcacgac cataatcaat gcaggcgtct 480

acgccagagc taacatttca ttctatagtc aaacaggaat tgaatgggac ctggatttgg 540

tcaataagac atatgagtgg gttgaagacg ccattgtggt caagccaaat aatcaatctt 600

ggcaatctgt tataggagag ggattcttgg aggcgggtat tcttccagac aatggattta 660

gtttggatca cgaagcagga actagactca ccggctcaac ttttgacaat aatggaacgc 720

gacatgcggc tgatgaactg cttaataaag gagaccctaa taacttgcta gttgcagttc 780

aggcctcagt agagaagatc ctcttctctt ccaatacatc aagtatgttg catcagtgat 840

atttaatggt agctcctagt ttgtcatgct gcactcgaaa attattattt tatcatttta 900

aaatactaac agaatagtgt gaagtctcat atttcccttc catatttccc aaatttccat 960

aaacaaaact tcccaattct ccttcgttta gtttgacaat aattataagc tattctctaa 1020

tgcagatttg tcagctattg gagtcatata tacggattct gatggaaact ctcatcaggc 1080

atttgtacgc ggtaacggag aagttattgt tagtgcaggg acaatcggaa cgcctcagct 1140

tctactactt agtggcgttg gaccagagtc ttacctatct tctctcaaca tcacagttgt 1200

tcagccgaat ccttatgttg ggcagtttgt gtatgacaat ccttgtaatt tcattaatat 1260

tttgccccca aatccaattg aagcctctgt tgtaactgtt ttaggcatta gaagtgatta 1320

ttatcaagtt tctctgtcaa gcttgccatt ttccactcca ccctttagtc tttttcctac 1380

aacatcttac cccctcccaa attcgacttt tgctcatatt gttagccaag ttccaggacc 1440

attgtctcat ggttctgtca cgctaaattc atcctctgac gtgagaatcg ctccaaatat 1500

taaattcaat tactattcaa attccacaga ccttgctaat tgtgttagcg gcatgaagaa 1560

gcttggtgac ttattaagga caaaggcatt agaaccatat aaagctcgag atgtgctggg 1620

aattgacggt ttcaattatt tgggagtacc tttgccagag aaccaaacag atgatgcatc 1680

cttcgagaca ttttgtctag ataatgtagc ttcatactgg cattaccacg gtggaagcct 1740

tgttgggaaa gtgcttgatg atagtttccg tgttatgggg atcaaagcat tacgcgttgt 1800

tgatgcctcc actttccctt acgaaccaaa cagccatcct cagggcttct atctgatgtt 1860

aggaaggtat gtgatgcaca cttccaacca ctagagattc tcaatatttt gttgttgttg 1920

taatgaactc tgtgccgcat tgctcttttt tattaatcct taaaattttg tgttttgcgc 1980

aggtatgtgg gccttcaaat cctgcaagaa aggtcaatcc ggttggaggc tattcataat 2040

attcaagagt ccatgtga 2058

<210> 2

<211> 532

<212> DNA

<213> Prunus communis

<400> 2

Leu Ala Asn Thr Ser Ala His Asp Phe Ser Tyr Leu Lys Phe Val

5 10 15

Tyr Asn Ala Thr Asp Thr Ser Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Tyr Ile

20 25 30

Val Ile Gly Gly Gly Thr Ser Gly Cys Pro Leu Ala Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Glu Lys Tyr Lys Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly Thr Ile Ala

50 55 60

Thr Glu Tyr Pro Asn Thr Leu Thr Ala Asp Gly Phe Ala Tyr Asn

65 70 75

Leu Gln Gln Gln Asp Asp Gly Lys Thr Pro Val Glu Arg Phe Val

80 85 90

Ser Glu Asp Gly Ile Asp Asn Val Arg Ala Arg Ile Leu Gly Gly

95 100 105

Thr Thr Ile Ile Asn Ala Gly Val Tyr Ala Arg Ala Asn Ile Ser

110 115 120

Phe Tyr Ser Gln Thr Gly Ile Glu Trp Asp Leu Asp Leu Val Asn

125 130 135

Lys Thr Tyr Glu Trp Val Glu Asp Ala Ile Val Val Lys Pro Asn

140 145 150

Asn Gln Ser Trp Gln Ser Val Ile Gly Glu Gly Phe Leu Glu Ala

155 160 165

Gly Ile Leu Pro Asp Asn Gly Phe Ser Leu Asp His Glu Ala Gly

170 175 180

Thr Arg Leu Thr Gly Ser Thr Phe Asp Asn Asn Gly Thr Arg His

185 190 195

Ala Ala Asp Glu Leu Leu Asn Lys Gly Asp Pro Asn Asn Leu Leu

200 205 210

Val Ala Val Gln Ala Ser Val Glu Lys Ile Leu Phe Ser Ser Asn

215 220 225

Thr Ser Asn Leu Ser Ala Ile Gly Val Ile Tyr Thr Asp Ser Asp

230 235 240

Gly Asn Ser His Gln Ala Phe Val Arg Gly Asn Gly Glu Val Ile

245 250 255

Val Ser Ala Gly Thr Ile Gly Thr Pro Gln Leu Leu Leu Leu Ser

260 265 270

Gly Val Gly Pro Glu Ser Tyr Leu Ser Ser Leu Asn Ile Thr Val

275 280 285

Val Gln Pro Asn Pro Tyr Val Gly Gln Phe Val Tyr Asp Asn Pro

290 295 300

Arg Asn Phe Ile Asn Ile Leu Pro Pro Asn Pro Ile Glu Ala Ser

305 310 315

Val Val Thr Val Leu Gly Ile Arg Ser Asp Tyr Tyr Gln Val Ser

320 325 330

Leu Ser Ser Leu Pro Phe Ser Thr Pro Pro Phe Ser Leu Phe Pro

335 340 345

Thr Thr Ser Tyr Pro Leu Pro Asn Ser Thr Phe Ala His Ile Val

350 355 360

Ser Gln Val Pro Gly Pro Leu Ser His Gly Ser Val Thr Leu Asn

365 370 375

Ser Ser Ser Asp Val Arg Ile Ala Pro Asn Ile Lys Phe Asn Tyr

380 385 390

Tyr Ser Asn Ser Thr Asp Leu Ala Asn Cys Val Ser Gly MET Lys

395 400 405

Lys Leu Gly Asp Leu Leu Arg Thr Lys Ala Leu Glu Pro Tyr Lys

410 415 420

Ala Arg Asp Val Leu Gly Ile Asp Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Val

425 430 435

Pro Leu Pro Glu Asn Gln Thr Asp Asp Ala Ser Phe Glu Thr Phe

440 445 450

Cys Leu Asp Asn Val Ala Ser Tyr Trp His Tyr His Gly Gly Ser

455 460 465

Leu Val Gly Lys Val Leu Asp Asp Ser Phe Arg Val MET Gly Ile

470 475 480

Lys Ala Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Thr Phe Pro Tyr Glu Pro

485 490 495

Asn Ser His Pro Gln Gly Phe Tyr Leu MET Leu Gly Arg Tyr Val

500 505 510

Gly Leu Gln Ile Leu Gln Glu Arg Ser Ile Arg Leu Glu Ala Ile

515 520 525

His Asn Ile Gln Glu Ser MET

530

Claims (10)

1.一种重组羟腈裂解酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)：氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)：在保持该羟腈裂解酶催化活力的前提下，插入、缺失，或替换如序列表中SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述的重组羟腈裂解酶的核酸分子。

3.一种重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求2所述的核酸。

4.一种重组表达转化体，其特征在于：包含如权利要求3所述重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于：其为将如权利要求3所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌株，所述的宿主微生物为毕赤酵母。

6.一种如权利要求1所述重组羟腈裂解酶的制备方法，其特征在于：包括以下形式：

(a)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离培养清液，浓缩后获得酶液；

(b)将(a)中的酶液冷冻干燥后制备得到的冻干粗酶粉。

7.一种如权利要求1所述重组羟腈裂解酶的应用，其特征在于，所述重组羟腈裂解酶作为催化剂催化潜手性芳香醛与氢氰酸加成的不对称羟氰化反应，制备光学纯手性氰醇。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的不对称羟氰化反应在水-有机溶剂两相体系中进行。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述潜手性芳香醛为结构如式1-5所示的潜手性芳香醛类化合物：

式1中，R为-H；

或者R为-Cl，其取代的位置在苯基的邻位或间位；

或者R为-OMe，其取代的位置在苯基的邻位、间位或对位；

或者R为-OPh，其取代的位置在苯基的间位；

或者R为-SMe，其取代的位置在苯基的对位；

或者R为-Me，其取代的位置在苯基的对位；

或者R为-F，其取代的位置在苯基的对位；

式2中，取代基在1-位，或者2-位；

式4中，n为1或2；

式5中，X为O或者S。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述不对称羟氰化反应条件为：重组羟腈裂解酶的浓度为12～300U/mL，潜手性芳香醛浓度为0.1～0.5M，反应温度为4～25℃，氢氰酸的浓度为1～2M，反应液水相pH为4–6；所述的不对称羟氰化反应的时间以反应转化率停止增长的时间为准。