CN116716267B - 乙醛氧化酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙醛氧化酶突变体及其应用。所述突变体是将来源于白腐菌的乙醛氧化酶进行V33F、V122L、E158T、L163I、H164D、T249S、R287T、D289T或G518D中的任何一种单位点突变所获得的突变体；酶活复筛结果显示，突变体G518D酶活最高。本发明利用气相色谱分别对野生型以及突变体G518D在同样条件下对底物乙醛的降解程度和生成物乙酸进行检测，检测结果显示，相比于野生型，突变体G518D催化底物乙醛降解得到产物乙酸生成量明显高于野生型乙醛氧化酶，底物乙醛降解的程度也明显高于野生型乙醛氧化酶。本发明所筛选得到的乙醛氧化酶突变体在降解醛类物质等方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及乙醛氧化酶，尤其涉及乙醛氧化酶突变体及其在降解醛类物质中的应用，属于乙醛氧化酶突变体及其应用领域。
背景技术
醛类物质可以与体内多种蛋白质共价结合，对人体肝脏、呼吸系统和生殖系统等具有很大危害。相比于化学方法，利用生物酶法降解醛类物质，具有绿色、高效和反应条件温和等优点。
乙醛氧化酶能够氧化一系列的醛基、羟基以及羰基化合物生成相应的酸。同时还原O2生成H2O2。PciGLOX1（Accession number KU215437）是来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的乙醛氧化酶，该酶能够在黑曲霉D15#26中成功异源表达，氧化甲基乙二醛的最适反应温度和pH分别为50℃和pH6.0，但是该酶的酶活相对较低，导致其在降解醛类物质的效率方面较低，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供乙醛氧化酶突变体；
本发明的目的之二是将所述的乙醛氧化酶突变体应用于降解醛类物质；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是提供了乙醛氧化酶突变体，所述乙醛氧化酶突变体是将来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的野生型乙醛氧化酶的氨基酸序列进行中V33F、V122L、E158T、 L163I、H164D、T249S、R287T、D289T或G518D 中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的单位点突变体；优选的，将来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的野生型乙醛氧化酶的氨基酸序列进行G518D单位点突变所获得的单位点突变体。
其中，所述的来源于白腐菌Pycnoporus cinnabarinus的野生型乙醛氧化酶（PciGLOX1）（Accession number KU215437）的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明所述氨基酸单位点突变“G518D”表示将SEQ ID No.1所示的来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的乙醛氧化酶的第518位氨基酸由甘氨酸（G）突变成天冬氨酸（D）；本发明中其余的单位点突变的表述也依此类推。
本发明中所述的来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的乙醛氧化酶（PciGLOX1）的单位点突变体的编码基因也属于本发明的保护范畴之内。
本发明还公开了含有所述突变体的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
本发明进一步提供了制备任何一项所述的来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的野生型乙醛氧化酶（PciGLOX1）的单位点突变体的方法，包括：
（1）将所述来源于白腐菌的野生型乙醛氧化酶（PciGLOX1）的单位点突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
本发明的另一方面提供了所述的来源于白腐菌Pycnoporus cinnabarinus的野生型乙醛氧化酶（PciGLOX1）的单位点突变体、其编码基因以及含有编码基因的重组表达载体在降解醛类物质中的用途。
本发明取PSI-Blast检索到100条与PiGLOX1相似的氨基酸序列，并进行系统进化树和物种来源分析，计算了以上100条序列的氨基酸进化概率（PSAP），依此来筛选PiGLOX1的功能结构域以外的保守残基，同时采用PLMC辅助突变体设计，最终筛选获得了可能提高醛氧化酶催化效率的共9个突变体；9个突变体的酶活复筛结果显示，其中PiGLOX1突变体G518D酶活最高，为4.07 U/mL。
为了检测突变体G518D降解乙醛的实际效果，本发明利用气相色谱分别对对野生型PiGLOX1以及PiGLOX1突变体（G518D）在同样的条件下对底物乙醛的降解程度和生成物乙酸进行检测；检测结果显示，相比于野生型PiGLOX1，突变体G518D催化底物乙醛降解得到的产物乙酸生成量明显高于野生型PiGLOX1催化底物乙醛降解的乙酸生成量，突变体G518D催化底物乙醛降解时，底物乙醛降解的程度也明显高于野生型PiGLOX1催化底物乙醛降解程度。本发明所筛选得到的PiGLOX1突变体（G518D）在高效降解醛类物质等方面具有应用前景。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“突变”或“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转化”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1 突变位点的PSAP及COEV分析结果。
图2 野生型PiGLOX1及9个突变体的酵母表达SDS-PAGE验证（A）及酶活检测（B）。
图3 气相色谱检测PiGLOX1突变体（G518D）降解乙醛的乙酸生成量（A）和乙醛减少量（B）。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 PiGLOX1的突变位点的设计与筛选
取PSI-Blast检索到100条与PiGLOX1相似的氨基酸序列，并进行系统进化树和物种来源分析。进化树分析结果显示在自展值均为100%的情况下，进化树分支几乎都小于0.05；物种来源分析结果显示有65.7%的蛋白包括PiGLOX1都属于同一家族。以上结果均表明100条序列亲缘关系相近。然后， 计算了以上100条序列的氨基酸进化概率（PSAP），依此来筛选PiGLOX1的功能结构域以外的保守残基。考虑到氨基酸之间存在共同进化的现象，同时采用PLMC辅助突变体设计。基于以上两种策略，最终筛选获得了可能提高醛氧化酶催化效率的共9个突变位点（图1，表1）。
表1 突变位点
实施例2 PiGLOX1突变体构建、表达和酶活检测
将实施例1所筛选的PiGLOX1的 9个突变体通过两步PCR法构建成功后，分别转入毕赤酵母GS115中进行异源表达，每隔24小时添加1%甲醇诱导目的蛋白表达，共加三次诱导72小时，并在最后一次加甲醇时，同时加入加0.1mM CuSO4激活蛋白。将野生型PiGLOX1及9个突变体分别挑取约44个克隆子进行酶活初步检测，酶活检测体系为（200μL）：40 μL 柠檬酸—柠檬酸钠（pH 6.0，50 mM），40 μL 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS，1 mM），40 μL辣根过氧化物酶（7 U），40 μL 乙醛（20mM）和40 μL 酶液（1mg/mL），在37℃条件下反应5分钟。
实验结果表明各个突变体的阳性率在10%-25%之间，选取活性较高的单克隆依次编号为33-4、164-20、289-11、518-24、122-8、158-33、163-19、249-12和287-22。随后将这9个突变体进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE验证结果如图2中的A所示，所有突变体均能成功表达，大小为70 KDa左右。酶活复筛结果显示，在9个突变体中，突变体G518D酶活最高，为4.07U/mL（图2中的B所示）。
试验例1 PiGLOX1突变体（G518D）动力学参数测定试验
为了进一步验证G518D的催化效率，分别测定了野生型PiGLOX1和PiGLOX1突变体（G518D）的动力学参数，底物乙醛的浓度梯度分别设为：0、0.9、1.3、1.8、2.2、2.6、3.1、3.5、4.0、4.4、5.3、6.2 mg·mL-1。结果显示，突变体G518D的k cat/K m为58.54 mL· mg-1min-1，显著高于野生型。
表2 野生型PiGLOX1和突变体G518D的动力学参数测定结果
试验例2 PiGLOX1突变体（G518D）降解乙醛效果检测试验
为了检测G518D降解乙醛的实际效果，本试验利用气相色谱分别对对PiGLOX1以及PiGLOX1突变体（G518D）在同样的条件下对底物乙醛和生成物乙酸进行检测。
反应体系为：4mM终浓度乙醛、1mM终浓度ATBS、7U辣根过氧化物酶、0.04M pH 6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、0.1mg/ml酶液（PiGLOX1突变体或PiGLOX1突变体（G518D））。
气相条件为：GC自动进样器，碰装室离子淬灭碰撞气体，Agilent1909N-133色谱柱，柱温260℃，分流比为100：1，真空出样。
检测结果显示，相比于野生型PiGLOX1，突变体G518D催化底物乙醛降解得到的乙酸生成量明显高于野生型PiGLOX1催化底物乙醛降解的乙酸生成量(图3中的A所示)，突变体G518D催化底物乙醛的乙酸生成量明显高于野生型PiGLOX1催化底物乙醛的乙酸生成量(图3中的A所示)， 突变体G518D催化底物乙醛降解时，底物乙醛降解的程度明显高于野生型PiGLOX1催化底物乙醛降解程度（图3中的B所示）。
Claims (8)
1.乙醛氧化酶突变体，其特征在于，所述乙醛氧化酶突变体是将来源于白腐菌（Pycnoporus cinnabarinus）的野生型乙醛氧化酶的氨基酸序列进行G518D单位点突变所获得的单位点突变体；所述的来源于白腐菌的野生型乙醛氧化酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的乙醛氧化酶突变体，其特征在于，来源于白腐菌的野生型乙醛氧化酶的信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述的乙醛氧化酶突变体的编码基因。
4.含有权利要求3所述编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求4所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
6.权利要求1所述的乙醛氧化酶突变体在降解醛类物质中的应用。
7.权利要求3所述的乙醛氧化酶突变体的编码基因、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组宿主细胞在降解醛类物质中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的醛类物质是乙醛。
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