KR101565439B1

KR101565439B1 - 시타글립틴의 합성을 위한 전구체인 베타아미노산을 포함한 다양한 광학활성 베타아미노산의 효소적 생산 방법

Info

Publication number: KR101565439B1
Application number: KR1020140098351A
Authority: KR
Inventors: 윤형돈; 이상협
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2015-11-18

Abstract

본 발명은 리파아제와 오메가트랜스아미나제를 이용하여 시타글립틴의 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]을 에스터 화합물에서부터 합성하는 방법, 및 상기 방법을 이용하여 다양한 베타아미노산을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정을 이용하여 시타글립틴 합성의 전구체인 베타아미노산 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산 및 다양한 베타아미노산을 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

시타글립틴의 합성을 위한 전구체인 베타아미노산을 포함한 다양한 광학활성 베타아미노산의 효소적 생산 방법{Enzymatic production method of optically active beta-amino acids including intermediate for the synthesis of sitagliptin}

본 발명은 새로운 광학활성 베타아미노산의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에스터 화합물에서부터 리파아제와 ω-트랜스아미나아제를 이용하여 시타글립틴 합성의 전구체 베타아미노산을 포함한 다양한 베타아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.

시타글립틴(Sitagliptin)(MK-0431)은 인산염 형태로 '자누비아정'이란 상품명으로 판매되고 있고 제2형 당뇨병 환자의 혈당조절 향상을 위해 개발된 효소억제이다(비특허문헌 1 및 2 참조). 시타글립틴의 중요성으로 인해서 다양한 합성경로가 개발되었다(도 1 참조). [도 1]의 합성경로 1은 베타케토에스터(화합물 1)에서 출발하여 루테늄(ruthenium) 역합성을 통해서 베타-하이드록시에스터(화합물 2)로 전환한 뒤 최종적으로 시타글립틴을 얻는다(비특허문헌 3 참조). [도 1]의 합성경로 2는 트리플로로페닐 아세트산에서 출발하여 다단계 반응을 통하여 화합물 4를 합성하고, 다시 화합물 5를 합성한 뒤, 로듐(rhodium) 촉매를 이용하여 최종적으로 시타글립틴을 얻는 방법이다(비특허문헌 4 참조).

오메가트랜스아미나제는 아민화합물(또는 비천연아미노산)의 아민기를 케톤화합물(또는 케토산)에 광학 선택적으로 전이할 수 있는 효소로써 1) 기질특이성이 넓어 타 효소에 비해 다양한 기질에 대해 반응성이 있는 점, 2) 광학선택성이 뛰어나 광학적으로 순수한 화합물을 얻을 수 있다는 점, 3) 반응 기질 및 생성물의 물에 대한 높은 용해도로 인해 유기용매를 사용할 필요가 없다는 점, 4) 조효소를 필요로 하지 않다는 점, 5) 효소의 안정성이 뛰어나 반응기 운전이 쉽다는 장점들이 있다(비특허문헌 5-8 참조).

최근에 화합물 4를 개량된 오메가트랜스아미나제와 아이소프로필아민을 아민 제공기로 사용하여 시타글립틴을 합성하는 방법이 개발되었다(도 1의 합성경로 3, 비특허문헌 9 참조). 한편, 먼저 오메가트랜스아미나제를 이용하여 다양한 베타아미노산의 광학분할 반응이 가능함이 보고되었다. 특히, 특허출원번호 제 10-2006-0078204호에서는 오메가트랜스아미나제를 이용한 베타아미노산에 대한 합성법을 제시하였다(도 2 참조). 하지만 베타케토산에서부터 역합성을 통하여 광학활성 베타 아미노산의 생산을 위한 반응 기질 중에는 시타글립틴의 전구체가 포함되지 않았고, 알파 또는 베타아미노산을 아미노 공여체(amino donor)를 사용하였다. 또한 해당 트랜스아미나제는 메조리조비움 유래의 트랜스아미나제 또는 그와 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질로 제안이 되어있다. 최근에 폴라로모나스(Polaromonas sp. JS666) 유래의 오메가트랜스아미나제가 다양한 베타아미노산에 높은 활성과 광학 선택성을 보이며 광학분할 반응에 의해서 (R)-광학활성 베타아미노산을 생성할 수 있음이 보고되었다(비특허문헌 10 참조). 오메가트랜스아미나제 반응에서 광학분할 반응은 라세믹(racemic) 기질과 아미노 수용체(amino acceptor)를 반응하여 라세믹 기질에서 광학적으로 특정 형태 즉 (R) 또는 (S)-기질에서 아민기가 오메가트랜스아미나제에 의해 아미노 수용체에 전이되면서 카보닐(carbonyl) 화합물로 전환되고, 반응하지 않고 남아있는 기질을 광학적으로 순수하게 얻을 수 있는 반응이며, 이론 수율이 50%이다(비특허문헌 8 참조). 한편 역합성 반응은 목적기질을 카보닐(carbonyl) 화화물의 형태로 반응에 넣어주고, 아미노 공여체를 넣어주어, 오메가트랜스아미나제 반응에 의해 카보닐화합물이 아미노 공여체로부터 아민기를 전이 받는 반응으로 이론 수율 100%로 광학적으로 순수한 아민 또는 비천연아미노산을 생산하는 방법이다(비특허문헌 8 참조). 베타아미노산의 역합성이 3-아미노-페닐프로피온산(3-amino-3-phenylpropionic acid)의 에스터를 출발기질로 하여 3-아미노뷰티르산(3-aminobutyric acid)을 아미노 제공기로 사용하면 베타-페닐알라닌(beta-phenylalanine)이 생성될 수 있음을 보였다(비특허문헌 11 참조). 하지만 이 논문에서는 메조리조비움(Mesorhizobium sp)에서 유래된 트랜스아미나제이며, 이 효소는 특허출원번호 제 10-2006-0078204호에 보고한 동종의 효소이다. 또한 반응 수율이 낮으며 아미노제공기를 아미노산의 형태를 이용하였다. 무엇보다도 시타글립틴의 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]에 대한 연구는 진행되지 않았다. (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산은 베타페닐알라닌과 비교하여 베타아미노산이라는 특징은 갖지만 전체 구조가 전혀 다르고 복잡하다.

본 발명자들은 시타글립틴을 생산을 위한 반응공정을 연구한 결과, 시타글립틴 생산을 위해서는 그 전구체인 베타아미노산인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산(화합물 8)을 효과적으로 생산하는 것이 핵심기술이라는 것을 알게 되었고, 그에 대한 특허 및 논문으로 보고도지 않은 신규한 공정임을 알게 되었다. 이에, 본 발명자들은 리파아제와 오메가트랜스아미나제 반응을 조합하여 베타아미노에스터(화합물 6)에서부터 시타글립틴 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산(화합물 8)을 효과적으로 생산하는 공정을 디자인하고, 그 효율을 증대시켰으며, 해당반응 공정은 다양한 베타아미노산의 생산에도 적용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다(도 3 참조).

특허출원번호 제 10-2006-0078204호

Desai AA. Angew Chem Int Ed Engl. 2011 50(9):1974-6 Kim D, Wang L, Beconi M, Eiermann GJ, Fisher MH, He H, Hickey GJ, Kowalchick JE, Leiting B, Lyons K, Marsilio F, McCann ME, Patel RA, Petrov A, Scapin G, Patel SB, Roy RS, Wu JK, Wyvratt MJ, Zhang BB, Zhu L, Thornberry NA, Weber AE. J. Med. Chem. 2005, 48, 141-151. K. B. Hansen, J. Balsells, S. Dreher, Y. Hsiao, M. Kubryk, M. Palucki, N. Rivera, D. Steinhuebel, J. D. Armstrong III, D. Askin, E. J. J. Grabowski, Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 634-639. K. B. Hansen, Y. Hsiao, F. Xu, N. Rivera, A. Clausen, M. Kubryk, S. Krska, T. Rosner, B. Simmons, J. Balsells, N. Ikemoto, Y. Sun, F. Spindler, C. Malan, E. J. J. Grabowski, J. D. Armstrong III, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 8798-8804. Koszelewski, D. Tauber, K. Faber, K. Kroutil, W. Trends Biotechnol. 2010, 28, 324 Hohne, M.; Bornscheuer, U. T. Chemcatchem. 2009, 1, 42. Malik, M. S.; Park, E. S.; Shin, J. S., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 94 (5), 1163-71. Mathew, S.; Yun, H. ACS Catal. 2012, 2,993-1001. C. K. Savile, J. M. Janey, E. C. Mundorff, J. C. Moore, S. Tam, W. R. Jarvis, J. C. Colbeck, A. Krebber, F. J. Fleitz, J. Brands, P. N. Devine, G. W. Huisman, G. J. Hughes, Science 2010, 329, 305-309. Bea, H.S., Park, H.J., Lee, S.H., Yun, H. Chem. Commun. 2011, 47, 5894. Kim J, Kyung D, Yun H, Cho BK, Seo JH, Cha M, Kim BG.Appl Environ Microbiol. 2007 73(6):1772-82.

본 발명의 목적은 리파아제와 오메가트랜스아미나제를 이용하여 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]에서부터 시타글립틴 생산의 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]을 합성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 에스터 가수분해 효소와 트랜스아미나제를 이용하여 에스터 화합물에서부터 다양한 베타아미노산을 합성하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]를 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제(transaminase) 및 아미노 공여체와 반응시킴으로써, 시타글립틴의 합성을 위한 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]을 생산시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제 및 아미노 공여체를 포함하는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트로부터 시타글립틴의 합성을 위한 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 반응 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 다양한 에스터 화합물, 즉 하기 화학식 1의 화합물:

[화학식 1]

,

[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이며, R₂는 수소, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 또는 그 이상의 탄소를 갖는 알킬기, 및 페닐기 및 벤질기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다];

을 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제(transaminase) 및 아미노 공여체와 반응시킴으로써, 다양한 베타아미노산, 즉 하기 화학식 2의 화합물:

[화학식 2]

,

[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다];

을 생산하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제 및 아미노 공여체를 포함하는, 다양한 에스터 화합물, 즉 상기 화학식 1의 화합물로부터 다양한 베타아미노산, 즉 상기 화학식 2의 화합물의 생산을 위한 반응 조성물을 제공한다.

본 발명은 리파아제와 오메가트랜스아미나제(ω-TA)를 이용하여 시타글립틴 합성의 전구체인 베타아미노산 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid](화합물 8)을 효과적으로 생산할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산방법은 시타글립틴을 합성할 수 있는 기존에 보고되지 않은 새로운 합성 경로이다. 또한, 본 발명에 따른 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 반응조건 최적화는 다른 광학활성 베타아미노산의 효율적인 생산을 가능하게 한다.

도 1은 기존에 시타글립틴의 합성경로를 보여주는 개요도이다.
도 2는 특허출원번호 제 10-2006-0078204호에 나와 있는 베타아미노산 합성경로를 보여주는 개요도이다.
도 3은 본 발명에 따른 리파아제와 오메가트랜스아미나제(ω-TA)를 이용한 시타글립틴의 전구체인 베타아미노산의 합성경로를 보여주는 그림이다.
도 4는 오메가트랜스아미나제(ω-TA)의 정제를 보여주는 그림이다:
레인 1: 정제된 ω-TA(47 kDa); 및
레인 2: 분자량 마커.
도 5는 L-알라닌을 오메가트랜스아미나제(ω-TA)의 아미노 제공기로 사용할 경우 생성되는 피르빅산(pyruvate)에 의한 생성물 저해를 극복하기 위해서 락테이트탈수소효소와 NADH 재생산 시스템을 통해서 생산수율 증대를 유도하는 반응경로를 보여주는 그림이다.
도 6은 반응에서 여러 종류의 아미노 공여체에 따른 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid](화합물 8)의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 효소반응의 최종 수율과 기질을 녹이기 위한 유기용매의 상관관계를 나타내는 그림이다.
도 8은 리파아제의 농도가 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid](화합물 8)의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 리파아제와 오메가트랜스아미나제(ω-TA)를 이용한 화합물 9a, 9b, 9c, 9d 및 9d로부터 베타아미노산의 합성경로를 보여주는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate](화합물 6)를 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제(transaminase) 및 아미노 공여체와 반응시킴으로써, 시타글립틴의 합성을 위한 전구체인 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid](화합물 8)을 생산시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 에스터 가수분해효소는 리파아제(lipase)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 에스터레이즈(esterase) 또는 단백질 분해효소(protease)와 같은 에스터를 가수분해할 수 있는 효소는 모두 사용가능하다.

상기 반응에서 에스터 가수분해효소의 농도는 10 내지 50 mg/mL인 것이 바람직하고, 12 내지 36 mg/mL인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 트랜스아미나제는 오메가트랜스아미나제(ω-TA)인 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반 트랜스아미나제도 사용가능하다.

상기 반응에서 트랜스아미나제는 트랜스아미나제 발현 전세포를 사용하는 것이 바람직하고, 트랜스아미나제 과발현 대장균 전세포를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 아미노 공여체는 L-알라닌 또는 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 베타-알라닌, 3-아미노프로판오익산(3-aminopropionic acid; 3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2) 또는 벤질아민(benzylamine; BnNH2)이 모두 사용가능하다.

상기 방법에 있어서, 아미노 공여체로서 L-알라닌을 사용하는 경우, 락테이트탈수소효소, NADH 및 글루코스 탈수소효소 등을 이용한 NADH 재생산 시스템을 도입하여 부산물인 피루빅산 생성을 저해시키는 공정을 더 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 추가적으로 PLP(pyridoxal-5'-phosphate) 및/또는 유기용매를 함께 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유기용매로는 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 에탄올, 메탄올 또는 아세톤인 것이 바람직하고 디메틸설폭시드인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 효소공정 법은 도 3에 기재된 개요도와 같이 반응이 일어난다. 구체적으로, 리파아제 등의 에스터 가수분해효소는 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트(화합물 6)을 가수분해하여 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid](화합물 7)을 생산하며, ω-TA 등의 트랜스아미나제는 아미노 공여체를 이용하여 화합물 7을 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산으로 전환시킨다(도 3 참조).

상기 방법에 있어서 출발 기질로 에틸에스터(화합물 6)이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 리파아제는 에스터를 가수분해하여 케토산이 되게 할 수 있는 한편, ω-TA는 케토산을 광학적으로 순수한 베타아미노산으로 전환하는데 사용된다.

상기 에스터 가수분해효소는 리파아제(lipase)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 에스터레이즈(esterase) 또는 단백질 분해효소(protease)와 같은 에스터를 가수분해할 수 있는 효소는 모두 사용가능하다. 상기 에스터 가수분해효소의 농도는 10 내지 50 mg/mL인 것이 바람직하고, 12 내지 36 mg/mL인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 트랜스아미나제는 오메가트랜스아미나제(ω-TA)인 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반 트랜스아미나제도 사용가능하다.

상기 아미노 공여체는 L-알라닌 또는 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 베타-알라닌, 3-아미노프로판오익산(3-aminopropionic acid; 3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2) 또는 벤질아민(benzylamine; BnNH2)이 모두 사용가능하다.

상기 유기용매는 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 에탄올, 메탄올 또는 아세톤이 모두 사용가능하다.

본 발명에서는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]에 리파아제, ω-TA, L-알라닌를 처리한 결과, 가수분해 효소인 리파아제가 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트를 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid]으로 전환시켰고, 그런 다음, 아미노 공여체인 L-알라닌을 이용하여 ω-TA에 의해 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]로 전환시켰다. 이때 부산물로 피루빅산이 생성되었다.

본 발명에서는, 알라닌에 부산물인 피루빅산을 제거하기 위해 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트에 리파아제, ω-TA, L-알라닌, 락테이트탈수소효소, NADH, NADH 재생산 시스템을 도입한 결과, (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산수율을 증대시킬 수 있었다.

본 발명에서는, w-TA의 다양한 아미노 공여체를 테스트하여 생산 수율을 증대시킬 수 있었다. 특히 기존에 w-TA 주로 사용되는 아미노제공기인 L-알라닌 대신에 (S)-알파벤질아민을 제공기로 사용하여 그 생산 수율을 증대시킬 수 있었다.

본 발명에서는, 기질인 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트의 용해도를 증가시키기 위해서 물에 잘 녹는 유기용매를 첨가하여 고농도 반응을 수행할 수 있었다. 대표적인 예로 DMSO를 15% 첨가하여 고농도 반응인 50 mM 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트를 성공적으로 목적 생성물로 전환시킬 수 있었다.

본 발명에서는 생산수율을 증대시키기 위해서 리파아제의 농도를 최적화하여 그 생산 수율을 증대시킬 수 있었다.

본 발명에서는 이렇게 확립된 조건으로 다양한 에스터 화합물에서 광학적으로 순수한 다양한 종류의 베타아미노산을 생산할 수 있었다.

[화학식 1]

,

[화학식 2]

,

을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 당업자에게 명백한 사실이다. 따라서 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

오메가트랜스아미나제의 발현, 분리 및 전세포의 제조

폴라로모나스(Polaromonas sp. JS666) 유래 오메가트랜스아미나제 (protein_id = "ABE43415.1")를 P1(5'-CGCCATATGAACAAGCCGTCCACGTCTTCCATG-3')(서열번호: 1) 및 P2(5'-CCCAAGCTTGACCTGCAACGGGCAACAGCG3')(서열번호: 2) 프라이머를 이용하여 폴라로모나스(Polaromonas sp. JS666)의 제노믹(genomic) DNA로부터 유전자를 증폭시킨 후, IPTG 유도 발현벡터 pET24ma 벡터에 클로닝시켰다. pET24ma 벡터 내로 클론 시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD₆₀₀이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 w-TA의 발현을 유도하였다. 6시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포 침전물을 20 uM 피리독살 50 인산염(pyridoxal 5-phosphate, PLP), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 포함하는 20 mL의 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 재현탁하였다. 초음파 분해를 이용한 세포파괴를 통해 세포추출물을 획득하였다. His-태그된(tagged) ω-TA를 포함하는 재조합 E. coli 세포의 조추출물을 Ni-NTA 아가로즈 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 적용시켜 w-TA 효소를 정제하였다(도 4). 그런 다음, 정제된 ω-TA 효소를 20 uM PLP를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.0)에 투석한 후 한외여과 장치(Amicon, Millipore, USA)로 농축시켰다. 정제된 ω-TA 효소 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -20℃에서 저장하였다. ω-TA의 전세포 제조를 위해서, 세포 침전물을 얻은 뒤, 100 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 전세포 용액에 글리세롤을 첨가한 후(25% 글리세롤), 추가적인 연구를 위해 -70℃에서 저장하였다.

오메가트랜스아미나제의 베타아미노산에 대한 활성 측정

분리된 오메가트랜스아미나제의 라세믹 형태의 베타아미노산(3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid, 화합물 8)에 대한 활성을 측정하였다. 이때 비교를 위해서 표준기질인 베타페닐알라닌과 비교하였다.

구체적으로, 효소 반응은 10 mM 화합물 8, 20 mM 피루빅산(아미노 수용체)(Sigma-Aldrich), 0.1 mM PLP 및 오메가트랜스아미나제(0.01 mg mL^-1)를 포함하는 200 mM Tris/HCl 버퍼(pH 7.5)의 0.2 mL에서 37℃에서 30분 동안 수행하였다. 초기속도(즉, <15% 전환)은 생산된 아세토페논(acetophenone)을 분석하여 측정하였으며, 아미노 수용체 초기속도의 경우 피루빅산의 환원으로 측정하였다.

베타아미노산의 전환 분석은 Crownpak CR (Daicel Co., Japan) column을 갖춘 HPLC를 이용하여 pH 1.5 과염소산 용액(perchloric acid solution)(0.6 mL min-1)의 용리로 210 nm에서 측정하였다. 각 광확이성질체는 분석 조건에서 분리되지 않고 정확한 전환이 산출되었다. 베타아미노산의 정량적인 카이랄(chiral) 분석은 Waters HPLC system을 갖춘 C18 Symmetry column (Waters, MA)를 이용하여 GITC로 시료의 유도체화한 후 254 nm에서 수행하였다. 각 광확이성질체의 분리는 0.6 mL min^-1의 흐름율에서 50% 메탄올 및 50% 물 (0.1% TFA)의 혼합물로 등용매용리를 통해 성취하였다. 피루빅산은 Aminex HPX-87H HPLC column (Bio-Rad, CA)을 이용하여 5 mM 황산의 용리로 UV 210 nm에서 분석하였다. 아세토페논은 C18 Symmetry column (Agilent)을 이용하여 0.6 mL min^-1의 흐름율에서 50% 메탄올 및 50% 물 (0.1% TFA)의 혼합물로 등용매용리를 통해 분석하였다.

그 결과, 화합물 8과 베타페닐알라닌에 대해서 각각 1.4 U/mg, 그리고 5.1 U/mg으로 높은 비활성을 보였다. 이는 효소가 화합물 8에 활성이 높음을 의미하고 역반응을 수행하면 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid(화합물 7)에서 화합물 8로 전환할 수 있음을 의미한다.

L-알라닌을 아미노 제공기로 사용하여 오메가트랜스아미나제와 리파아제를 통한 화합물 8의 생산

4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid(화합물 7)의 불안정성으로 인해서 에스터인 ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6)으로부터 반응을 수행하였다.

효소 반응은 w-TA가 과발현된 대장균 전세포(10 mg/mL), 리파아제(Candida rugosa (no. L1754)에서 유래)(10 mg/mL), 100 mM L-알라닌, 10 mM ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 7)를 포함하는 100 mM Tris/HCl 버퍼(pH 7.5)로 이루어진 반응 수용액에서 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다. 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 화합물 6을 가수분해 효소인 리파아제가 가수분해하여 화합물 7로 전환하고, 다시 w-TA에 의해 전형적인 w-TA의 아미 공여체인 L-알라닌을 사용하여 화합물 8을 생산하였다. 0.8 mM (R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid(화합물 8)을 얻을 수 있었다. 광학순도는 99% 이상이었다.

L-알라닌을 아미노 제공기를 사용하는 경우 생기는 피루빅산의 생성물의 저해

아미노제공기인 L-알라닌의 반응생성물인 피루빅산이 w-TA 효소 반응을 저해할 수 있기 때문에 반응의 생산수율을 증대시키기 위해서, 반응수용액에서 피루빅산을 제거하는 시스템을 도입하였다(도 5). 피루빅산을 w-TA의 활성에 영향을 주지 않은 락테이트(lactate)로 전환하는 락테이트탈수소효소(lactate dehydrogenase)와 락테이트 탈수소효소가 조효소로 사용하는 NADH의 원활한 사용을 위해, 글루코스탈수소효소(glucose dehydrogenase)를 이용한 NADH 재사용 시스템을 함께 도입하여 실시하였다.

효소 반응은 w-TA가 과발현된 대장균 전세포(10 mg/mL), 리파아제(10 mg/mL), 100 mM L-알라닌, 10 mM ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6), 100 mM 글루코스, 1 mM NADH, 락테이트탈수소효소(112 U/mL), 글루코스 탈수소효소(5 U/mL)를 포함하는 100 mM Tris/HCl 버퍼(pH 7.5)로 이루어진 효소반응액을 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다. 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 1.5 mM의 (R)-화합물 8을 얻을 수 있었다. 피루빅산 제거 시스템을 사용하지 않은 상기 [실시예 3]의 경우보다 약 2배 정도 생산 수율이 증대되었다.

다양한 아미노 제공기를 사용한 생산수율 증대

w-TA의 반응 효율은 그 아미노 공여체의 종류에 따라 달라진다. L-알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판오익산(3-aminopropionic acid; 3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2), 벤질아민(benzylamine; BnNH2), 그리고 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)(Sigma-Aldrich)의 아미노 제공기에 따른 생산수율 변화를 조사하였다.

효소 반응은 리파아제(10 mg/mL), 0.5 mM PLP, w-TA가 과발현된 대장균(10 mg/mL), 10 mM ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6), 50 mM 아미노제공기가 포함된 100 mM Tris/HCl(pH7.5)에서 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다(도 6). 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 모든 경우에 (R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid(화합물 8)이 생성되었으며, 그 중에서 (S)-알파메틸벤질아민을 아미노 제공기로 사용하였을 경우 화합물 6에서부터 화합물 8의 전환률이 95%였고, (R)-화합물 8의 광학 순도는 99% 이상이었다.

기질의 용해도 문제를 극복하기 위하여 유기용매의 사용 및 최적 용매의 선정

ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6)의 물에 대한 낮은 용해도 문제를 극복하기 위해서, 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 에탄올, 메탄올, 아세톤 등 물과 잘 혼합되는 유기용매를 첨가하여 화합물 6의 용해도를 증가시켜 순수한 수용액 반응보다 고농도 반응을 수행하였다(도 7).

효소 반응은 50 mM ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6), 150 mM의 (S)-알파메틸벤질아민, w-TA가 과발현된 대장균 전세포(20 mg/mL), 리파아제(30 mg/mL), 0.5 mM PLP, 그리고 15% 유기용매를 넣고 100 mM Tris/HCl 버퍼(pH8.0) 조건에서 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다. 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 모든 경우에 50% 이상의 높은 전환률을 얻을 수 있었고, 그 중에서 DMSO를 첨가하였을 경우 전활률 90%으로 가장 뛰어났고 광학순도는 99% 이상이었다.

반응의 효율성 증대를 위한 리파아제 효소 농도의 최적화

ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6)은 리파아제에 의해서 가수분해되어 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid(화합물 7)로 전환된 뒤 최종적으로 w-TA에 의해서 (R)-3-amino-4-(2,4,5- trifluorophenyl)butanoic acid(화합물 8)로 전환된다. 효소반응의 경우, 특히 w-TA의 경우 기질에 의해서 기질 저해를 받는다. 따라서 리파아제의 농도가 너무 높아서 반응액에 화합물 7이 농축되고, 농축되면 생성물 저해가 생겨 화합물 8의 생성속도가 감소한다. 한편 리파아제를 너무 적게 넣어주면 화합물6의 가수분해 속도가 감소하고, 따라서 전체적으로 반응속도가 느려지기 때문에, w-TA가 과발현된 대장균 전세포를 20 mg/mL로 그 양을 고정하고 리파아제 농도의 최적화를 수행하였다.

효소 반응은 50 mM ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate(화합물 6), 150 mM의 (S)-알파메틸벤질아민, w-TA가 과발현된 대장균 전세포(20 mg/mL), 리파아제 (0 ~ 36 mg/mL), 0.5 mM PLP, DMSO (15%)를 포함하는 100 mM Tris/HCl 버퍼(pH8.0) 반응 조건에서 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다(도 8). 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 30 mg/mL 까지 리파아제의 농도를 증가시킴에 따라 화합물 8의 생성수율은 증가되었다. 리파아제의 농도가 30 mg/mL일 때 반응수율은 89%이었다. 하지만 36 mg/mL에서는 반응수율이 81.7%로 감소하였다. 모든 경우에 광학순도 ee 값은 99% 이상이었다.

다른 다양한 베타아미노산의 생산에 본 발명에 따른 반응 시스템의 적용

본 발명에 따라 확립된 반응조건으로 다양한 광학활성 아민화합물을 생산하였다(도 9).

효소 반응은 50 mM 에스터(화합물 9a, 9b, 9c, 9d, 9d), 150 mM의 (S)-알파메틸벤질아민, w-TA가 과발현된 대장균 전세포(20 mg/mL), 리파아제(30 mg/mL), 0.5 mM PLP 그리고 DMSO (15%)를 포함하는 100 mM Tris/HCl 버퍼 (pH 8.0) 효소 반응액을 37℃에서 24시간 반응을 수행하였다. 분석은 상기 [실시예 2]와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 모든 화합물의 높은 전환률로 광학활성 베타아미노산으로 전환되었다(표 1).

반응기질	전환률(%)	광확순도 (ee; %)
9a	96.2	>99
9b	75.1	>99
9c	73.1	>99
9d	>99	>99
9e	60.6	>99

Claims

에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]를 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제(transaminase) 및 아미노 공여체(amino donor)와 반응시켜 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산[(R)-3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid]을 생산시키는 단계를 포함하는, (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 효소적 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 에스터 가수분해효소는 리파아제(lipase), 에스터레이즈(esterase) 및 단백질 분해효소(protease)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 효소적 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 트랜스아미나제는 오메가트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 반응에서 트랜스아미나제는 트랜스아미나제 발현 전세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 아미노 공여체는 L-알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판오익산(3-aminopropionic acid; 3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2), 벤질아민(benzylamine; BnNH2) 및 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 반응에서 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 에탄올, 메탄올 및 아세톤로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유기용매를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 에스터 가수분해효소의 농도는 10 내지 50 mg/mL인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트는 에스터 가수분해효소에 의해서 가수분해되어 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid]으로 전환된 뒤 최종적으로 트랜스아미나제에 의해서 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산으로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제 발현 전세포, 아미노 공여체 및 유기용매를 포함하는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트로부터 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 조성물.
하기 화학식 1의 화합물:

,
[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이며, R₂는 수소, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 또는 그 이상의 탄소를 갖는 알킬기, 및 페닐기 및 벤질기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다]
을 에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제(transaminase) 및 아미노 공여체와 반응시켜,
하기 화학식 2의 화합물:

,
[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다]
을 생산시키는 단계를 포함하는,
베타아미노산의 효소적 생산 방법.
에스터 가수분해효소, 트랜스아미나제 발현 전세포, 아미노 공여체 및 유기용매를 포함하는,
하기 화학식 1의 화합물:

,
[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이며, R₂는 수소, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 그 이상의 탄소를 갖는 알킬기 및 페닐기 및 벤질기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다]
로부터 하기 화학식 2의 화합물:

,
[여기서, 상기 R₁은 페닐기 또는 벤질기이고, 여기서 페닐기 또는 벤질기는 비치환되거나 1개 내지 3개의 C₁ _-4의 알킬기, 아릴기, 티오기, 니트릴기, 플루오르기, 브롬기, 알콕시기, 비닐기, 아크릴기 및 아민기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 종이다]
의 생산을 위한 조성물.