KR20210073375A

KR20210073375A - 신규 에스터 가수분해효소를 이용한 베타 아미노산의 효소적 생산방법

Info

Publication number: KR20210073375A
Application number: KR1020190164157A
Authority: KR
Inventors: 윤형돈; 최인석; 전현우
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 주식회사 종근당바이오
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2021-06-18
Also published as: WO2021118137A1; KR102357426B1

Abstract

본 발명은 신규 에스터 가수분해효소를 이용한 베타 아미노산의 효소적 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 베타 아미노산의 합성 과정 중 베타-케토 에스테르로부터 베타-케토산을 합성하는데 있어서 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 적용함으로써 베타 아미노산의 생산성을 증대시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 에스터 가수분해효소를 이용한 베타 아미노산의 효소적 생산방법{METHOD FOR ENZYMATICALLY PRODUCING BETA AMINO ACID USING NOVEL ESTER HYDROLASES}

소분자 제약, 농약 및 기타 산업에 있어서 중요한 화합물의 제조를 위해 필수 구성요소인 베타 아미노산의 중요성이 부각되고 있다. 특히 베타 아미노산은 독특한 약리 활성으로 인하여 약리화합물로 중요하게 인식되어 있으며, 생리조건에서 단백질 분해 효소 대하여 저항성이 있어 각종 펩티드 신약 연구에도 중요하게 사용되어져 왔다.

한편, 리파아제와 같은 에스터 가수분해효소는 베타 아미노산을 효소 공학적으로 합성하는 과정에 필수적인 효소이다. 기존 보고된 리파아제(특허출원 제10-2014-0098351호 참조)는 상업적으로 이용 가능한 반면 곰팡이 유래의 리파아제이기 때문에 대장균에서의 발현이 용이하지 않다는 문제점과 비용적인 문제가 있었고, 또한 낮은 활성도로 인해 베타 아미노산의 합성 공정 상 문제가 있었다.

본 발명에서는 상기의 문제점을 해결하기 위하여, 종래의 상업적 리파아제(Candida rugose)보다 활성이 뛰어난 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 적용함으로써 베타 아미노산의 생산성을 증대시킬 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

대한민국 등록특허 제10-1565439호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 신규의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 이용한 베타 아미노산의 생산 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 베타 케토 에스터로부터 베타 아미노산의 생산을 위한 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]를 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소와 반응시켜, 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid] 을 합성한 후, 상기 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid] 을 트랜스 아미나아제 및 아미노기 공여체와 반응시켜, (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나아제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트로부터 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 조성물을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 베타 케토 에스터를 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소와 반응시켜, 하기 화학식 2로 표시되는 베타 케토산을 합성한 후, 상기 베타 케토산을 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와 반응시켜, 하기 화학식 3으로 표시되는 베타 아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3에서 R은

,

및

로 이루어진 군에서 선택됨.

상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae) 또는 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri) 둘 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 트랜스 아미나제는 오메가 트랜스 아미나제일 수 있다.

상기 베타 케토 에스터와 에스터 가수분해효소의 반응은 20 ~ 45 ℃에서 20 ~ 180 분 동안 수행될 수 있다.

상기 베타 케토산과, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와의 반응은 20 ~ 45 ℃에서 12 ~ 60시간 동안 수행될 수 있다.

상기 베타 케토 에스터와 에스터 가수분해효소의 반응 및/또는 상기 베타 케토산과, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와의 반응에서 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 에탄올, 메탄올 및 아세톤로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유기용매를 더 포함할 수 있다.

상기 아미노기 공여체는 L-알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로피오닉산(3-aminopropionic acid;3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2), 벤질아민(benzylamine; BnNH2) 및 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 에스터 가수분해효소와 트랜스 아미나제의 농도비는 1: 1 ~ 12일 수 있다.

상기 에스터 가수분해효소와 트랜스 아미나제는 대장균에서 발현된 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 동일한 대장균에서 공동 발현된 것일 수 있다.

또한 본 발명은, 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 상기 화학식 1로 표시되는 베타 케토 에스터로부터 상기 화학식 3으로 표시되는 베타 아미노산의 생산을 위한 조성물을 제공할 수 있다. 상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

또한 본 발명은, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]를 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소와 반응시켜, 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid] 을 합성한 후, 상기 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid]을 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와 반응시켜, (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산은 시타글립틴의 전구체일 수 있다.

또한 본 발명은, 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트로부터 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 조성물을 제공한다. 상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 베타-아미노산의 효소적 생산 과정에 있어서, 종래의 상업적 리파아제(Candida rugose)보다 활성이 뛰어난 신규의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 적용함으로써, 높은 수율로 베타 아미노산을 생산할 수 있다.

도 1은 BLAST를 통해 선별된 후보 중 상대적으로 서열의 길이를 비교하여 선별된 42개의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)의 후보군을 나타내는 것이다.
도 2는 선별된 E.Coli 유래의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)의 SDS-PAGE 사진이다.
도 3은 선별된 8개의 리파아제/에스테라아제의 활성측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 Lip PA (서열번호 1) 와 Lip PS (서열번호 2)의 최적 pH를 나타내는 그래프이다.
도 5는 Lip PA 와 Lip PS의 최적온도와 시간에 따른 활성감소량을 분석한 그래프이다.
도 6은 DMSO의 농도에 따른 Lip PA 와 Lip PS의 활성 차이를 분석한 그래프이다.
도 7은 Pseudomonas avellanae 유래의 리파아제(Lip PA)와 pseudomonas stutzeri 유래의 리파아제(Lip PS), candida rugose 유래의 상업적 리파아제(Lipase)의 특이적 활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 각각 발현된 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 및 트랜스 아미나제 OD 100의 연쇄반응을 통한 베타-아미노산의 생성률을 분석한 그래프이다. 반응조건: 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트(100 mM), 오메가-트랜스 아미나제(100 OD), 리파아제/에스테라아제(10-90 OD), DMSO(15%), (S)-α-MBA (200 mM), PLP (Pyridoxal 5′-phosphate) (0.5 mM), 완충용액 (200 mM Tris-HCl pH 7.0), 온도 (37 ℃), 반응시간 (48 시간).
도 9는 각각 발현된 신규 리파아제/에스테라아제 및 트랜스 아미나제 OD 120의 연쇄반응을 통한 베타-아미노산의 생성률을 분석한 그래프이다. 반응조건: 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트(100 mM), 오메가-트랜스 아미나제(120 OD), 리파아제/에스테라아제(10-90 OD), DMSO(15%), (S)-α-MBA(200 mM), PLP(0.5 mM), 완충용액(200 mM Tris-HCl pH 7.0), 온도 (37 ℃), 반응시간 (48 시간).
도 10은 pET24ma의 오메가-트랜스 아미나제(TAIC) 와 pQE-80L의 Lip PA/Lip PS를 단일 세포(대장균 BL21)에서 공동 발현시킨 시스템을 이용하여 생산한 베타-아미노산의 생성률을 분석한 그래프이다. 반응조건: 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트(100 mM), 공동 발현된 오메가-트렌스 아미나제/리파아제(30-150 OD) DMSO(15%), (S)-α-MBA(200 mM), PLP(0.5 mM), 완충용액(200 mM Tris-HCl pH 7.0), 온도 (37 ℃), 반응시간 (48 시간).
도 11는 pCDF-Duet의 오메가-트랜스 아미나제(TAIC)와 pQE-80L의 Lip PA/Lip PS를 단일 세포(대장균)에 공동 발현시킨 시스템을 이용하여 생산한 베타-아미노산의 생성률을 분석한 그래프이다. 반응조건: 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트(100 mM), 공동 발현된 오메가-트랜스 아미나제/리파아제(30-150 OD) DMSO(15%), (S)-α-MBA(200 mM), PLP(0.5 mM), 완충용액(200 mM Tris-HCl pH 7.0), 온도 (37 ℃), 반응시간 (48 시간).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.

본 발명의 선행특허 (출원번호 10-2014-0098351)에서 사용되었던 리파아제는 상업적으로 구입 가능한 것으로, 활성이 낮아서 베타 아미노산의 합성 시 많은 양의 효소가 필요한 제약이 있었다. 무엇보다도 상기 상업적 리파아제는 곰팡이 유래의 효소로 대장균에서 발현이 용이하지 않은 문제점이 있었다. 본 발명에서는 기존의 리파아제 보다 활성이 높은 신규 리파아제를 스크리닝하였고, 이를 이용하여 기존에 리파아제를 대체하여 대장균에서의 오메가-트렌스 아메나제와 리파아제를 발현하시켜 시타글립틴 전구체 및 각종 베타-아미노산의 공정법을 개선하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기와 같은 반응식에 따라 시타글립틴 전구체인 베타 아미노산을 효율적으로 합성할 수 있다.

[반응식 1] 출발물질인 베타-케토 에스테르로부터 리파아제 및 트랜스 아미나제를 이용하여 베타 아미노산을 생산하는 반응 스킴.

베타 아미노산의 효소반응공정 과정에서 베타-케토 에스테르로부터 베타-케토산을 합성할 때, 기존에 알려진 상업적 리파아제 대신 본 발명에서 새롭게 스크리닝한 리파아제를 이용하는 경우 빠른 베타-케토산의 전환으로 높은 수준의 수득률을 얻을 수 있다.

실시예 : 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 스크리닝 및 베타-아미노산의 효소적 생산

1. 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 스크리닝

이전 연구에서 사용된 산업적 Candida rugosa 리파아제(시그마 알드리치 카탈로그 번호 L1754)는 베타-케토에스테르를 베타-케토산으로 가수분해 한 다음 오메가-트랜스 아미나제를 이용해 아민화하여 3-ATfBA (3-amino-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanoic acid)를 포함한 다양한 베타-아미노산을 형성하는데 성공적으로 활용되었다. 본 실시예에서는 베타-케토에스테르에 해당하는 [에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트로부터 베타-케토산인 3-ATfBA 합성에 필요한 에스터 가수분해효소(리파아제/에스테라아제)를 확보하기 위하여, 오메가-트랜스 아미나제의 연쇄반응 및 기존 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)보다 적합한 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)의 동정을 위한 연구를 수행하였다. 대장균이 가지고 있는 BioH라는 리파아제 단백질이 베타-케토에스테르를 가수분해할 수 있음을 확인하고, 대장균이 보유한 42개의 리파아제 중에서, Candida rugosa 리파아제의 아미노산 서열을 이 기준으로 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 검색을 수행하였다 (도 1). 그 중 계통 발생학적 분석에 기초하여 활성을 보일 것으로 예측되는 6종류의 대장균 유래의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 선정하였다 (도 1).

대장균 유래 리파아제 단백질 외 추가적으로 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)에 대하여 BLAST를 통하여 비교를 진행하였다. 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래의 일부 리파아제/에스테라아제의 경우 사용하고자 하는 기질인 베타-케토 에스테르와 크기 및 구조가 비슷한 케토 프로펜 에틸 에스테르의 에스테르 구조를 잘라낸다고 보고되었다. 이를 통하여 베타-케토 에스테르를 분해할 수 있을 것으로 예상하고 보고된 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 이용하여 BLAST를 진행하였고, 이를 통하여 Pseudomonas avellanae 유래의 Lip PA (서열번호 1) 및 Pseudomonas stutzeri 유래의 Lip PS (서열번호 2) 2종류의 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 선정하였다.

선택된 총 8개의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)에 대한 유전자은행 고유 식별 번호를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

선별된 42개의 후보군 중 E.coli 유래의 6개의 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래의 2개 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)

E.coli 유래의 6개의 유전자를 프라이머 (Sequences (5'→3'), entry 1: F1 primer - atta ggatcc Atgaccaatataccg (서열번호 3) R1 primer - gccg gagctc ttatttctgcttcgt (서열번호 4), entry 2: F2 primer - atta ggatcc atgaaacatgaccat (서열번호 5) R2 primer - gccg gagctc ttacatcatttcaat (서열번호 6), entry 3: F3 primer - gccg ggatcc atgatgaataataaa (서열번호 7) R3 primer - cggc gagctc ttacagagtttcctc (서열번호 8), entry 4: F4 primer - atta ggatcc atgattgaaatagaatcacgcga (서열번호 9) R4 primer - gccg gagctc ttaaagatgctggcggaaaaatgtcac (서열번호 10), entry 5: F5 primer - atta ggatcc atggaaaattcacgcatccctggg (서열번호 11) R5 primer - agat ggatcc tcagttatcacgacgcaccgccatcg (서열번호 12), entry 8: F8 primer - atta ggatcc atgaacttcaaca (서열번호 13) R8 primer - gccg gagctc ttatgagtcatga (서열번호 14))를 이용하여 pQE-80L 벡터에 클로닝하였고, 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래의 2개 유전자는 코돈 최적화 후 합성(bionics) 및 pQE-80L 벡터 내에 클로닝하고 대장균 BL21(DE3) 내로 도입하였다. 총 8개의 리파아제/에스테라아제는 하기와 같이 Ni-NTA 친화성 컬럼을 사용하여 발현 및 정제하였다 (도 2). E. coli BL21의 형질전환체는 37 ℃에서 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD 600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 리파아제/에스테라아제의 발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포 침전물을 20 uM 피리독살 50 인산염(pyridoxal 5-phosphate, PLP), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 포함하는 20 mL 의 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 재현탁하였다. 초음파 분해를 이용한 세포파괴를 통해 세포추출물을 획득 하였다. His-태그된(tagged) 리파아제/에스테라아제를 포함하는 재조합 E. coli 세포의 조추출물을 Ni-NTA 아가로즈 컬럼 (Qiagen, Hilden, Germany)에 적용시켜 효소를 정제하였다(도 2).

정제된 효소를 사용하여 pH 7.0의 조건에서 반응기질[에틸에스테르(에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트)] 및 DMSO를 사용하여 베타-케토 에스테르에 대한 활성을 시험하였다 (도 3). 반응조건은 다음과 같다: 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트 (10mM), 리파아제/에스테라아제 (0.1mg/mL), DMSO (15%), 완충용액 (200 mM Tris-HCl pH 7.0), 온도 (37 ℃), 반응시간 (30분).

8개의 리파아제/에스테라아제 중에서 슈도모나스 (Pseudomonas)에서 유래한 Lip PA와 Lip PS가 각각 6.2U/mg, 10.3U/mg의 높은 활성을 보여주었다. 반면에, E.coli에서 유래한 6종류의 리파아제의 경우 1U/mg미만의 활성으로 큰 차이로 낮게 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 기질로 사용되는 베타-케토 에스테르에 반응성이 높게 형성되는 Lip PA와 Lip PS를 선택하여 추가적인 실험을 진행하였다

2. Lip PA 와 Lip PS 세부 활성도 측정

2-1) Lip PA 와 Lip PS의 최적 pH와 온도 확인

Lip PA와 Lip PS는 pH 6 - 9의 범위에서 활성을 나타내었고, 반응은 ρ-니트로 페닐 아세테이트를 함유하는 50 mM 포스페이트(Phosphate) 완충액(pH 6.0-7.0), 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0-9.0)에서 수행되었다. 이 반응에서, ρ-니트로 페닐 아세테이트를 Lip PA 및 Lip PS를 사용하여 ρ-니트로 페놀로 전환시키고, UV-분광광도계를 사용하여 405 nm 파장에서 관찰한 결과 황색 물질이 확인되었다 (반응식 2).

[반응식 2] Lip PA 및 Lip PS의 활성 측정을 위한 스킴.

슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae) 유래의 Lip PA (서열번호 1)는 pH 8.5에서 14.5U/mg으로 최대 활성을 나타내었고 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri)유래의 Lip PS는 pH 8.0에서 55U/mg으로 최적 활성을 보였다(도 4). 오메가-트랜스 아미나제의 반응조건인 pH 7.0에서도 Lip PA의 경우 약 2U/mg, Lip PS의 경우 20U/mg으로 반응성이 높게 나타나는 것으로 확인되었다.

도 5는 Lip PA 와 Lip PS의 최적온도와 시간에 따른 활성감소량을 분석한 결과를 나타내는 것이다. 도 5의 반응은 상기 pH 7.0에서의 반응과 유사한 방식으로 수행되었고, 정제된 효소를 사용하여 30-60℃에서 0-15시간 동안 배양 및 반응하고 샘플을 특정시간 간격 동안 추출하고 405 nm에서 UV-분광 광도계를 사용하여 분석 하였고 분석 결과, Lip PA 및 Lip PS의 최적 온도는 30 ℃로 확인하였다 (도 5).

2-2) DMSO의 농도에 따른 Lip PA 와 Lip PS의 활성

위 실험의 반응조건을 동일하고 서로 다른 농도의 DMSO (5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %)의 조건 하에 Lip PA 및 Lip PS의 효소 활성을 측정하였다. DMSO의 농도를 5 %에서 30 %로 증가시키면 Lip PA 및 PS의 효소 활성이 감소하는 것으로 관찰되었다.

2-3) Lip PA 및 Lip PS와 오메가-트랜스 아미나제 연쇄반응을 통한 리파아제의 농도 최적화

이전 연구에서 본 발명자들은 두 세포 시스템인 상업용 리파아제와 오메가-트랜스 아미나제를 사용하여 베타-아미노산을 합성하였다. 본 연구에서는 기존 리파아제 보다 활성이 좋은 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)를 사용하여 베타 아미노산을 합성하려고 시도하였다. 이를 위해, 본 연구는 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제)의 활성이 있는지에 대한 여부를 확인하였다. 이전 연구에서 사용된 오메가-트랜스 아미나제 (TAIC:(Ilumatobacter coccineus) 유래 오메가트랜스 아미나제 (protein_id =WP_015443725.1")와 신규 리파아제인 Lip PA, Lip PS가 각각 거의 동일한 분자량인 45, 43, 43 kDa으로 SDS-PAGE로는 공동 발현된 세포 시스템의 경우에 효소의 발현량을 밴드로 구별할 수 없다. 따라서 다음의 방법으로 리파아제의 특이적 활성을 확인하였다. Lip PA, PS 및 상업용 리파아제 칸디다 루고사 (candida rugosa)의 특이적 활성의 확인은, 기질인 (에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트 0.5 ml 반응 부피에서 수행되었고 상업용 리파아제 칸디다 루고사 (candida rugosa) 1mg/ml, 신규 리파아제 Lip PA, Lip PS는 각각 0.5 OD를 사용하여 200mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)에서 37 ℃ 180 rpm으로 20분 동안 반응을 진행하고, 반응 후 1 : 1 (v/v)의 비율로 10 % 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 혼합물을 17000 g에서 30분 동안 원심 분리하고, 투명한 상등액을 분석하였다. 기질인 에틸3-옥소-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부타노에이트의 감소량으로 C18 대칭 컬럼을 사용하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과 Lip PS (12U/mg)에 이어 Lip PA (9.8U/mg)가 특이적 활성을 나타내었으며 상업적인 리파아제 칸디다 루고사 (candida rugosa) (0.324U/mg) 보다 훨씬 좋은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 7).

상기와 같은 결과에 기초하여 우리는 각각 대장균에 발현된 신규 리파아제/에스테라아제를 오메가-트랜스 아미나제와 연쇄반응을 통해 베타-아미노산을 생합성 하였다. 트랜스 아미나제는 다음과 같이 최적화된 Ilumatobacter coccineus 유래의 오메가-트랜스 아미나제를 pET-24ma 백터를 통해 대장균에 과발현 후 정제하여 사용하였다. 구체적으로 TAIC:(Ilumatobacter coccineus) 유래 오메가트랜스 아미나제 (protein_id =WP_015443725.1")를 바이오닉스 회사에 의뢰하여 유전자 합성 후, IPTG 유도 발현벡터 pET24ma 벡터에 클로닝시켰다. pET24ma 벡터 내로 클론 시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 w-TA의 발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 한 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포를 반응에 사용하였다.

100 OD, 120 OD의 오메가-트랜스 아미나제에서의 신규 에스터 가수분해효소 (리파아제/에스테라아제) 농도에 따른 베타아미노산의 생성률을 확인하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 오메가-트랜스 아미나제의 100 OD의 조건 하에서 Lip PA OD 50, Lip PS OD 10일 때 각각 각각 49 mM, 61 mM의 베타-아미노산 생성률을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 8). 오메가-트랜스 아미나제의 120 OD 조건하에서는 Lip PA OD 50, Lip PS OD 10일 때 각각 39mM, 56.6mM로 베타-아미노산 생성률이 감소하는 결과를 나타내었다 (도 9). 이러한 결과를 바탕으로 오메가-트랜스 아미나제와 신규 리파아제/에스테라아제의 비율이 Lip PA는 2:1, Lip PS는 10:1이 최적임을 확인할 수 있었다.

2-4) 벡터시스템 확립 및 동시발현을 통한 최적화

두 세포 시스템을 사용하여 비율을 최적화 한 후 단일 세포에서 두 벡터를 공동 발현함으로써 단일 세포 시스템으로 베타-아미노산 합성을 수행하였다. 오메가-트랜스 아미나제(TAIC)는 pET24ma에서 클로닝되었고 Lip PA 및 Lip PS는 pQE-80L에서 클로닝되었으며, 이들을 단일 세포에서 공동 발현시켰다. 구체적으로 오메가-트랜스 아미나제(TAIC)는 pET24ma 벡터 내로 클론 시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 50 mg/L의 카나마이신을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 w-TA의 발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 한 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포를 반응에 사용하였다. 그리고 에스터 가수분해효소 Lip PA 및 Lip PS는 pQE80L 벡터 내로 클론 시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 100 mg/L의 엠피실린을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD 600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 에스터 가수분해 효소의 발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 한 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포를 반응에 사용하였다.

그 후 단일 세포에서 공동 발현된 대장균을 30-150 OD의 농도로 반응을 수행하였다 (도 11). 오메가-트랜스 아미나제(TAIC) 및 Lip PA 공동 발현 시스템에서 최대 전환율은 28.30 mM (120 OD) 인 반면, 오메가-트랜스 아미나제(TAIC) 및 Lip PS 공동 발현된 셀 시스템의 경우 약 48.22 mM (150 OD) 전환에 이르는 것으로 확인되었다.

또 다른 공동 발현된 세포 시스템은 다음과 같다. 오메가-트랜스 아미나제(TAIC)는 pCDF-Duet 벡터에서 클로닝되는 반면, Lip PA 및 Lip PS는 pQE-80L 벡터에서 클로닝되었으며, 이들을 단일 세포에서 공동 발현시켜 상기와 같은 반응을 수행하였다. 구체적으로 오메가-트랜스 아미나제(TAIC)는 pCDF-Duet 벡터 내로 클론 에스터 가수분해효소 Lip PA 및 Lip PS는 pQE80L 벡터 내로 클론 시킨 이 두 개의 벡터를 동시에, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 25 mg/L의 클로람페니칼과 100mg/L 엠피실린을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 w-TA와 에스터 가스분해효소의 공동발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 한 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포를 반응에 사용하였다. 그리고 에스터 가수분해효소 Lip PA 및 Lip PS는 pQE80L 벡터 내로 클론 시킨 다음, E. coli BL21 내로 도입하였다. E. coli BL21의 형질전환체는 37℃에서 100 mg/L의 엠피실린을 포함하는 1 L의 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체의 OD600이 0.4 ~ 0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Carbosynth)를 첨가하여 에스터 가수분해 효소의 발현을 유도하였다. 12시간 후, 상기 세포를 채취한 후 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 한 번 세척하였다. 원심분리 후, 세포를 이용하여 반응에 사용되었다.

오메가-트렌스 아미나제(TAIC) 및 Lip PA 공동 발현 세포 시스템을 이용한 경우, 최대 전환율(베타-아미노산 생성률)은 35.58 mM (150 OD) 인 것으로 나타났으며, 오메가-트랜스 아미나제(TAIC) 및 Lip PS 공동발현된 세포 시스템을 이용한 경우 약 42.34 mM (150 OD) 전환율 (베타-아미노산 생성률)이 관찰되었다 (도 11).

서열정보

서열번호 1 (Lip PA : 진뱅크 접근번호 WP_005619979.1)

mqiqghyelqfeavreafaalfddpqergaalciqvggqtvvdlwagtadkdgaeawhtdtianlfsctktftsvavlqlveegklkldepvarlwpefavagkasitlrqllchqaglpalreplpaealyqwdtmtaalaaeepwwtpgqghgyaaitygwlvgemlrradgrgpgesiaarisrplgldfhvgladeqfyrvahiargkgnagdaaaqrvlqatmrepasitakaftnppsimtstnkpewrrmqqpaanghgnarslagfynglldgslleadmlneltrehslgdktlltstrlglgcmldqpaepnatfglgpkafghpgaggsvgfadpdydvafgfvtntlgpyilmdpraqklvgvlreclq

서열번호 2 (Lip PS : 진뱅크 접근번호 WP_020308675.1)

mqvqgyfdlrfeavrdafaalfdgtqqrgaalcvqiggetvidlwagvadnqgeqawhsdtlvnlfsctktftavaalqlveegkleldapvarvwpefaangkesitlrqllchraglpairrplapealydwtcmtdalaaeqpwwapgtdqgyaamtygwlvgellrrvdgcgagesivrrtaaplgldfhvglddsqadrvayltrtkndfgdacaqrllkalmsdpasisacafnnppsimssgnkpewrrmaqpaanghgnarslaglytgllqgrlldeavlremthehsagedrtllastrfglgcwldqpdvanatfamgprafghpgaggcigfadperelgfgfvtntlgpyvlmdpraqslarcvaaclh

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP., CHONG KUN DANG PHARMACEUTICAL CORP. <120> METHOD FOR ENZYMATICALLY PRODUCING BETA AMINO ACID USING NOVEL ESTER HYDROLASE <130> 1066479 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 382 <212> PRT <213> Pseudomonas avellanae <400> 1 Met Gln Ile Gln Gly His Tyr Glu Leu Gln Phe Glu Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Cys Ile Gln Val Gly Gly Gln Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Thr 35 40 45 Ala Asp Lys Asp Gly Ala Glu Ala Trp His Thr Asp Thr Ile Ala Asn 50 55 60 Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ser Val Ala Val Leu Gln Leu 65 70 75 80 Val Glu Glu Gly Lys Leu Lys Leu Asp Glu Pro Val Ala Arg Leu Trp 85 90 95 Pro Glu Phe Ala Val Ala Gly Lys Ala Ser Ile Thr Leu Arg Gln Leu 100 105 110 Leu Cys His Gln Ala Gly Leu Pro Ala Leu Arg Glu Pro Leu Pro Ala 115 120 125 Glu Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Thr Met Thr Ala Ala Leu Ala Ala Glu 130 135 140 Glu Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Ala Ala Ile Thr 145 150 155 160 Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Met Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly 165 170 175 Pro Gly Glu Ser Ile Ala Ala Arg Ile Ser Arg Pro Leu Gly Leu Asp 180 185 190 Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu Gln Phe Tyr Arg Val Ala His Ile 195 200 205 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Ala Gly Asp Ala Ala Ala Gln Arg Val Leu 210 215 220 Gln Ala Thr Met Arg Glu Pro Ala Ser Ile Thr Ala Lys Ala Phe Thr 225 230 235 240 Asn Pro Pro Ser Ile Met Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg 245 250 255 Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ala Asp Met 275 280 285 Leu Asn Glu Leu Thr Arg Glu His Ser Leu Gly Gln Asp Lys Thr Leu 290 295 300 Leu Thr Ser Thr Arg Leu Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Pro Ala 305 310 315 320 Glu Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Lys Ala Phe Gly His Pro 325 330 335 Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Asp Tyr Asp Val Ala 340 345 350 Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Leu Met Asp Pro 355 360 365 Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Val Leu Arg Glu Cys Leu Gln 370 375 380 <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Pseudomonas stutzeri <400> 2 Met Gln Val Gln Gly Tyr Phe Asp Leu Arg Phe Glu Ala Val Arg Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Gly Thr Gln Gln Arg Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Cys Val Gln Ile Gly Gly Glu Thr Val Ile Asp Leu Trp Ala Gly Val 35 40 45 Ala Asp Asn Gln Gly Glu Gln Ala Trp His Ser Asp Thr Leu Val Asn 50 55 60 Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Ala Ala Leu Gln Leu 65 70 75 80 Val Glu Glu Gly Lys Leu Glu Leu Asp Ala Pro Val Ala Arg Val Trp 85 90 95 Pro Glu Phe Ala Ala Asn Gly Lys Glu Ser Ile Thr Leu Arg Gln Leu 100 105 110 Leu Cys His Arg Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Arg Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Thr Cys Met Thr Asp Ala Leu Ala Ala Glu 130 135 140 Gln Pro Trp Trp Ala Pro Gly Thr Asp Gln Gly Tyr Ala Ala Met Thr 145 150 155 160 Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Val Asp Gly Cys Gly 165 170 175 Ala Gly Glu Ser Ile Val Arg Arg Thr Ala Ala Pro Leu Gly Leu Asp 180 185 190 Phe His Val Gly Leu Asp Asp Ser Gln Ala Asp Arg Val Ala Tyr Leu 195 200 205 Thr Arg Thr Lys Asn Asp Phe Gly Asp Ala Cys Ala Gln Arg Leu Leu 210 215 220 Lys Ala Leu Met Ser Asp Pro Ala Ser Ile Ser Ala Cys Ala Phe Asn 225 230 235 240 Asn Pro Pro Ser Ile Met Ser Ser Gly Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg 245 250 255 Met Ala Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala 260 265 270 Gly Leu Tyr Thr Gly Leu Leu Gln Gly Arg Leu Leu Asp Glu Ala Val 275 280 285 Leu Arg Glu Met Thr His Glu His Ser Ala Gly Glu Asp Arg Thr Leu 290 295 300 Leu Ala Ser Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Trp Leu Asp Gln Pro Asp 305 310 315 320 Val Ala Asn Ala Thr Phe Ala Met Gly Pro Arg Ala Phe Gly His Pro 325 330 335 Gly Ala Gly Gly Cys Ile Gly Phe Ala Asp Pro Glu Arg Glu Leu Gly 340 345 350 Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp Pro 355 360 365 Arg Ala Gln Ser Leu Ala Arg Cys Val Ala Ala Cys Leu His 370 375 380 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 prmier <400> 3 attaggatcc atgaccaata taccg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 prmier <400> 4 gccggagctc ttatttctgc ttcgt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 prmier <400> 5 attaggatcc atgaaacatg accat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 prmier <400> 6 gccggagctc ttacatcatt tcaat 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 prmier <400> 7 gccgggatcc atgatgaata ataaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 prmier <400> 8 cggcgagctc ttacagagtt tcctc 25 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4 prmier <400> 9 attaggatcc atgattgaaa tagaatcacg cga 33 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R4 prmier <400> 10 gccggagctc ttaaagatgc tggcggaaaa atgtcac 37 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5 prmier <400> 11 attaggatcc atggaaaatt cacgcatccc tggg 34 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R5 prmier <400> 12 agatggatcc tcagttatca cgacgcaccg ccatcg 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 prmier <400> 13 attaggatcc atgaataaca tctggtggca gaccaa 36 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R8 prmier <400> 14 agatggatcc ctacaccctc tgcttc 26

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 베타 케토 에스터를 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소와 반응시켜, 하기 화학식 2로 표시되는 베타 케토산을 합성한 후, 상기 베타 케토산을 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와 반응시켜, 하기 화학식 3으로 표시되는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3에서 R은
,
,
,
,
,
,
및
로 이루어진 군에서 선택됨.
청구항 1에 있어서,
상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae) 또는 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri) 둘 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 트랜스 아미나제는 오메가 트랜스 아미나제인 것을 특징을 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 아미노기 공여체는 L-알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로피오닉산(3-aminopropionic acid;3-APA), 아이소프로필아민(isopropyl amine; iPrNH2), 벤질아민(benzylamine; BnNH2) 및 (S)-알파메틸벤질아민(α-methylbenzylamine; MBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 에스터 가수분해효소와 트랜스 아미나제의 농도비는 1: 1 ~ 12인 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 에스터 가수분해효소와 트랜스 아미나제는 대장균에서 발현된 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 에스터 가수분해효소와 트랜스 아미나제는 동일한 대장균에서 공동 발현된 것을 특징으로 하는 베타 아미노산을 생산하는 방법.
슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 베타 케토 에스터로부터 하기 화학식 3으로 표시되는 베타 아미노산의 생산을 위한 조성물.
[화학식 1]

[화학식 3]

상기 화학식 1, 화학식 3에서 R은
,
,
,
,
,
,
및
로 이루어진 군에서 선택됨.
청구항 9에 있어서,
상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoate]를 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소와 반응시켜, 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid] 을 합성한 후, 상기 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부탄산[4-(2,4,5-trifluorophenyl)-3-oxobutanoic acid] 을 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체와 반응시켜, (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산을 생산하는 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유래의 에스터 가수분해효소, 트랜스 아미나제 및 아미노기 공여체를 포함하는, 에틸 4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-3-옥소부타노에이트로부터 (R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)부탄산의 생산을 위한 조성물.
청구항 13에 있어서,
상기 가수분해효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.