JP2003219896A - Ｌ−アリールグリシンの製造方法及び分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】Ｌ-アリールグリシンに作用するアミノトラン
スフェラーゼが求められていた。 【解決手段】化学式［１］で示されるアリールグリオキ
シル酸に、天然型アミノ酸の存在下、広域アミノ酸アミ
ノトランスフェラーゼを作用させ、化学式［２］で表さ
れるＬ-アリールグリシンを製造する。また、化学式
［２］で表されるＬ-アリールグリシンに、天然型-ケト
酸の存在下、広域アミノ酸トランスフェラーゼを作用さ
せて、当該Ｌ-アリールグリシンを分解する。 （化学式［１］及び［２］において、Ｒは、（１）無置
換もしくは任意の置換基を有するフェニル基もしくはナ
フチル基、又は（２）酸素原子、窒素原子、もしくは硫
黄原子を一つ含むかもしくはいずれかの原子が組み合わ
さって２つ以上含む、５もしくは６員環性芳香族複素環
基を表す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬や農薬の部分構
造として有用な光学活性アリールグリシンを簡便な方法
でかつ高い光学純度で取得する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アリールグリシンは抗ＨＩＶ薬（Ｕ
Ｓ５８９１８５１）、血液凝固阻害剤（ＵＳ４８４７２
６５）、抗菌剤（ＥＰ２４８７０３）などの合成原料と
して利用され、またグルタミン酸リセプターの活性化
（Ｍａｎｎａｉｏｎｉら、（２００１）Ｊ． Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．、２１巻、５９２５頁、）等の生理活性を有
する光学活性非天然型アミノ酸である。光学活性非天然
型アミノ酸は近年医薬や農薬の合成中間体として需要が
増してきており、種々の不斉合成法や光学分割法が検討
されているが、これらの中で酵素を触媒とする方法は、
酵素の高い光学特異性や位置特異性のため容易に純度の
高い製品が得られるので特に注目されている。

【０００３】例えば、ヒダントイナーゼを触媒として５
−置換ヒダントイン誘導体の光学特異的加水分解するこ
とによりＤ−ヒドロキシフェニルグリシン（ＷＯ９６０
０２９６号公報）を取得する方法や、Ｏ−メチル−Ｌ−
チロシン又は３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン（特
開平５−２３６９７８号公報）を取得する方法、アミノ
酸脱水素酵素によって３−置換−２−オキソプロピオン
酸を還元的アミノ化してＬ−アミノ酸を得る方法（Ｈｕ
ｍｍｅｌ，Ｗ． ＆ Ｋｕｌａ．，Ｍ．Ｒ．，（１９８
９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４巻，１頁）、
或いは同じく３−置換−２−オキソプロピオン酸を原料
とするがアミノ酸アミノトランスフェラーゼ（以下ＡＴ
と略記する）を触媒としてＬ−チエニルアラニン（ＥＰ
０５８１２５０Ａ２号公報）やホスホノスリシン（ＥＰ
０４７７９０２Ａ２号公報）を合成する方法などが開示
されている。

【０００４】これらのうち、ＡＴを用いる方法は近年特
に注目されている。と言うのは、原料の２−オキソ酸の
安価な合成法が考案された（特開昭６２−１１６５４１
号公報）だけでなく、脱水素酵素を用いる場合には高価
なＮＡＤＨが副原料として必要なのに対し、ＡＴを用い
れば調味料や飼料として安価に大量生産されているグル
タミン酸、アラニン、リジン、アスパラギン酸等の天然
型アミノ酸を副原料に利用できるという大きな利点があ
るためである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、Ｌ−フ
ェニルグリシンの様な２位の炭素原子にアリール基が直
接結合したＬ−アリールグリシンに対しては、現在知ら
れている多くのアミノトランスフェラーゼは全く作用し
ないことが知られている。かかるアミノ酸に作用するア
ミノトランスフェラーゼの数少ない例としてシュードモ
ナス・ストゥツェリＳＴ−２０１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＳＴ−２０１）やシュード
モナス・プチダＬＷ−４株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ ＬＷ−４）がベンゾイルギ酸や４−ヒド
ロキシフェニルグリオキシル酸をＤ−フェニルグリシン
やＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンに変換すること
が報告されている（Ｓ．Ｗｉｙａｋｒｕｔｔａ ａｎｄ
Ｖ． Ｍｅｅｖｏｏｔｉｓｏｍ （１９９７） Ｊ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、 ５５巻、１９３頁、Ｗ．
Ｊ．Ｊ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｔｗｅｅｌら（１９８８）
Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．、２９巻 ２２４頁）。しかしながら、Ｌ−ア
リルグリシンを生成するアミノトランスフェラーゼにつ
いては全くしられていなかった。

【０００６】かかるアミノ酸の工業的な合成法として、
５−アリールヒダントインをヒダントイナーゼで加水分
解して得られたＮ−カルバモイル−２−アリールグリシ
ンを有機化学的な方法もしくはカルバモイラーゼを用い
る方法で脱カルバモイル化して得る方法が良く知られて
いる（ＷＯ９６／００２９６号公報）。しかしながら、
ヒダントイナーゼにおいてもＤ−体に作用する酵素の存
在が知られているのみであり、Ｌ−アリールグリシンに
作用する酵素は知られていなかった。またこの方法では
ヒダントイン誘導体の加水分解工程と脱カルバモイル工
程の２工程が必要である。これに対してアミノトランス
フェラーゼを用いる方法では１工程で目的物を得られる
という利点がある。以上の様な背景からＬ−アリールグ
リシンに作用するアミノトランスフェラーゼが求められ
ていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、超好熱性
古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、特開２００１−３２１１８０
号公報）やアエロピルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒ
ｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、日本農芸化学会誌 ２００１．Ｍ
ａｒｃｈ，７５，臨時増刊号、ｐ．５５）が生産する広
域アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｍｕｌｔｉ Ｓ
ｕｂｓｔｒａｔｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ、以下ＭｓＡＴと略記する）が化学式［１］で表され
るアリールグリオキシル酸、そのエノール体またはそれ
らの塩類、及び化学式［２］で表されるＬ−アリールグ
リシンまたはその塩類に顕著な酵素活性を示す一方、化
学式［３］で表されるＤ−アリールグリシンには著しく
低い酵素活性しかしめさないことを見出し、本発明の完
成に至った。

【０００８】

【化５】

【化６】

【化７】 （化学式［１］［２］及び［３］において、Ｒは、
（１）無置換もしくは任意の置換基を有するフェニル基
もしくはナフチル基、又は（２）酸素原子、窒素原子、
もしくは硫黄原子を一つ含むかもしくはいずれかの原子
が組み合わさって２つ以上含む、５もしくは６員環性芳
香族複素環基を表す） 即ち本発明は、化学式［１］で示されるアリールグリオ
キシル酸、そのエノール体、またはそれらの塩に、天然
型アミノ酸の存在下、広域アミノ酸アミノトランスフェ
ラーゼを作用させることを特徴とする、化学式［２］で
表されるＬ−アリールグリシンの製造方法である。また
本発明は、化学式［２］で表されるＬ−アリールグリシ
ンに、天然型−ケト酸の存在下、広域アミノ酸トランス
フェラーゼを作用させることを特徴とするＬ−アリール
グリシンの分解方法である。以下、本発明を更に詳細に
説明する。

【０００９】本発明で原料として用いるアリールグリオ
キシル酸及びＬ−体アリールグリシンは、それぞれ化学
式［１］及び［２］で示される。化学式［１］及び
［２］においてＲは、（１）無置換もしくは任意の置換
基を有するフェニル基もしくはナフチル基、又は（２）
酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子を一つ含むかも
しくはいずれかの原子が組み合わさって２つ以上含む、
５もしくは６員環性芳香族複素環基を表す。なお、上記
（２）において複素環基は、複素環上にさらに任意の置
換基を有していても良い。

【００１０】前記無置換または任意の置換基をもつフェ
ニル基としては、具体的に言えば（ア）フェニル基、ま
たは（イ）低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲ
ン原子、アルキルチオ基、メルカプト基、ニトロ基、シ
アノ基、アミノ基、低級アルコキシカルボニル基、フェ
ニル基およびヒドロキシ基からなる群から選ばれた置換
基により、任意の位置が１〜３個置換されたフェニル基
を例示することができる。これらの中でもこのましくは
フェニル基、又はメチル基、メトキシ基、メチルチオ
基、メルカプト基、ニトロ基、フェニル基、シアノ基も
しくはヒドロキシ基により任意の位置が１〜３個置換さ
れたフェニル基である。

【００１１】なお、本願明細書では「低級」とは炭素数
１〜６のものを示す。

【００１２】前記無置換または任意の置換基をもつナフ
チル基としては、具体的に言えば（ア）１−ナフチル基
もしくは２−ナフチル基、または（イ）低級アルキル
基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、メルカプト基、
アルキルチオ基、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、低級
アルコキシカルボニル基、フェニル基およびヒドロキシ
基からなる群から選ばれた置換基により、任意の位置が
１〜３個置換された１−ナフチル基もしくは２−ナフチ
ル基を例示することができる。

【００１３】酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子を
一つ含むかもしくはいずれかの原子が組み合わさって２
つ以上含む、５もしくは６員環性芳香族複素環基として
は、例えば２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル
基、３−チエニル基、ピリジル基、チアゾリル基等があ
げられる。

【００１４】これらの中でもこのましくは１−ナフチル
基もしくは２−ナフチル基、またはメチル基、メトキシ
基、メチルチオ基、メルカプト基、ニトロ基、フェニル
基、シアノ基もしくはヒドロキシ基により任意の位置が
１〜３個置換された１−ナフチル基もしくは２−ナフチ
ル基である。

【００１５】これらの製造法にも特に限定はなく、グリ
ニャール試薬によりベンゼンと蓚酸クロライドを縮合す
る方法（Ｂｉｇｉら （１９８４） Ｊ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １巻 ２６５
５頁）、１−ブロモナフタレンやヨードベンゼンに一酸
化炭素を二重付加する方法（伊藤ら（１９８８）Ｂｕｌ
ｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｊｐｎ． ６１巻 ４１５１
頁、または特開平６−３１５６７４３）など、公知の方
法を用いて合成することが出来る。これらの方法で合成
した原料は、遊離の酸として用いても良いし、塩として
用いることも出来る。塩として用いる場合にその対イオ
ンにも特に限定はなく、ナトリウムイオン、カリウムイ
オン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの金
属イオン、アンモニウムやアミン類などのを自由に用い
ることが出来る。

【００１６】本発明で用いられるＭｓＡＴは超好熱性古
細菌の一種であるサーモコッカス・プロファンダス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）から分
離・精製され、芳香族アミノ酸のみならずアラニンやロ
イシンなどの脂肪族アミノ酸にも作用する極めて幅広い
基質域を示すアミノトランスフェラーゼとして報告され
た酵素である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，（１９９
７） Ｔｈｅ ５ｔｈＡｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ Ｎｏｖ
ｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ 要旨集２１頁）。現在そのアミノ酸配列は遺伝子や
蛋白質のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋに受入番号
ＡＢ０２７１３１として登録されており、インターネッ
トを通じてＮＣＢＩのホームページより入手可能である
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
Ｅｎｔｒｅｚ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。

【００１７】その後にパイロコッカス・フリオサス（特
開２００１−３２１１８０号公報）やアエロピルム・ペ
ルニクス（日本農芸化学会誌 ２００１．Ｍａｒｃｈ，
７５，臨時増刊号、ｐ．５５）から同様なアミノ酸配列
上の特徴を持つ酵素の遺伝子が取得され、遺伝子組換え
酵素として生産された両酵素が広範な基質に作用するこ
とが確認された。以下、サーモコッカス・プロファンダ
ス由来のＭｓＡＴをＴｐＭｓＡＴ、パイロコッカス・フ
リオサス由来のＭｓＡＴをＰｆＭｓＡＴ、アエロピルム
・ペルニクス由来のＭｓＡＴをＡｐＭｓＡＴと略記す
る。ＰｆＭｓＡＴとＡｐＭｓＡＴはＴｐＭｓＡＴと同様
に広範な基質に作用するだけでなく、ＴｐＭｓＡＴより
高い耐熱性を示すことが確認されており、光学活性アミ
ノ酸の合成触媒としてより有用性が高いものと考えられ
ている。

【００１８】これらのＭｓＡＴはアミノ酸配列上の特徴
よりファミリーＩのアミノトランスフェラーゼに分類さ
れる。即ちアミノ末端より７０番目のチロシン、１３８
番目のプロリン、１９４番目のアスパラギン、１９５番
目のプロリン、１９７番目のグリシン、２２２番目のア
スパラギン酸、２２５番目のチロシン、２５８番目のリ
ジン、２６６番目のアルギニン、２６８番目のグリシ
ン、３８６番目のアルギニンの各残基が共通して保存さ
れている。なお、ここで示すアミノ酸残基番号は、目的
のＭｓＡＴのアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬＷなどの配
列解析プログラムで哺乳類のアスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼのアミノ酸配列に対してアライメントし
た場合の残基番号にしたがっており、実際のＭｓＡＴの
配列に直接基づいたものではない。

【００１９】配列解析プログラム、ＣＬＵＳＴＡＬＷは
インターネット上のホームページＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃ
ｏｍｅ−ｅ．ｈｔｍｌ）などで公開されている。しかし
ながらＭｓＡＴには２５８番目のリジンと２６６番目の
アルギニンの間にアミノ酸１残基が欠失しており、２６
２番目にプロリン残基が存在するという他のファミリー
Ｉのアミノトランスフェラーゼには観察されないアミノ
酸配列上の特徴を有している。この点でＭｓＡＴはファ
ミリーＩのアミノトランスフェラーゼの中でも独立した
酵素群として特徴付けられる。

【００２０】ところで、近年生物の全ゲノム情報の解析
が急速に進められており、その多くのデーターベースが
現在インターネット上に公開されている。そのデーター
ベースよりＢＬＡＳＴ法を用いてＴｐＭｓＡＴと相同性
のある遺伝子を検索したところ、パイロコッカス・ホリ
コシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ
ｉ）のオープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦと略
称する）であるＰＨ０２０７、パイロコカッカス・アビ
ッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）のＯＲ
ＦであるＰＡＢ２２２７、サーモプラズマ・アシドフィ
ラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｍ）のＯＲＦであるＴａ１１９３、サーモプラズマ・
ヴォルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃ
ａｎｉｕｍ）のＯＲＦであるＴＶＧ０３９３５３５、ス
ルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕ
ｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＯＲＦであるＳＳ０
０１０４などの遺伝子群が見出された。

【００２１】なお、ＢＬＡＳＴ法はＫＥＧＧ（ｈｔｔ
ｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）など
のインターネット上のホームページで公に提供されてい
る相同性検索ツールである。これらＯＲＦ群がコードす
るアミノ酸配列を詳細に解析すると上述のＭｓＡＴの特
徴が明らかに認められ、さらにこれらの微生物がパイロ
コッカス・フリオサスやアエロピルム・ペルニクス或い
はサーモコッカス・プロファンダスと同様の古細菌とい
う系統発生学的に近縁な生物群に属することを考慮すれ
ば、これらのＯＲＦがＭｓＡＴの遺伝子であることは明
らかである。従って、これらの微生物からＭｓＡＴを得
て本発明に使用することも原理的に可能である。

【００２２】また、同様の検索によれば、細菌であるサ
ーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒ
ｉｔｉｍａ）のＯＲＦであるＴＭ１１３１、デイノコッ
カス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）のＯＲＦであるＤＲ１５８
８、メソリゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ ｌｏｔｉ）のＯＲＦであるｍｌｌ１８１７など
が非常に相同性の高いＯＲＦとして見出され、またその
塩基配列から解読されるアミノ酸配列は先述のＭｓＡＴ
の特徴を有していることから、これらの微生物もＭｓＡ
Ｔを持つことは明白であり、これらのＭｓＡＴも同様に
使用できる。

【００２３】また、全アミノ酸配列や詳細な基質域は明
らかにされていないが、サーモコッカス属の古細菌であ
るサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃ
ｕｓｌｉｔａｒａｌｉｓ）ＤＳＭ５４７３株が種々の天
然型芳香族アミノ酸を基質とするアミノトランスフェラ
ーゼを生産することが報告されているが（Ａｎｄｒｅｏ
ｔｔｉら（１９９４）． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．， ２２０巻５４３頁）、この酵素のアミノ末端
付近の部分的なアミノ酸配列はサーモコッカス・プロフ
ァンダスのＭｓＡＴなど公知のＭｓＡＴと類似性を示し
ていることからＭｓＡＴの一群に属するアミノトランス
フェラーゼであると考えられ、本発明に利用可能と考え
られる。

【００２４】これらのＭｓＡＴの利用の形態にも特に限
定はなく、上述のＭｓＡＴ生産菌の培養液から遠心分離
等の方法で回収した微生物菌体をそのまま触媒として利
用する事も出来るし、微生物菌体を浸透圧ショックや超
音波処理、フレンチプレス処理、或いはマントン・ゴー
リン・ホモジナイザー処理等の既知の方法で破砕して得
た菌体抽出液を触媒とする事も出来る。さらには硫安塩
析法、溶媒分画法、イオン交換や疎水相互作用を利用し
たカラムクロマトグラフィー法等既存の方法で抽出液か
ら精製したＭｓＡＴを利用する事も出来る。また、Ｍｓ
ＡＴ遺伝子を、大腸菌、枯草菌または酵母等の大量培養
に適した微生物に導入し、組換え体微生物を用いて大量
発現させた物を用いる事も出来る。組換え体を用いる場
合でも、微生物菌体をそのまま触媒として利用すること
も出来、或いは上記の方法で菌体を破砕・抽出したも
の、さらには抽出液より通常の方法で精製した酵素を利
用する事も出来る事は同様である。

【００２５】本発明で用いる副原料の天然型アミノ酸や
天然型２−ケト酸にも特に限定はないが、天然型アミノ
酸としては食品添加物として世界中で大量に生産されて
いるグルタミン酸又はその一ナトリウム塩が、原料の価
格の点のみならず、水溶性が高い点でも好ましく、さら
にその一ナトリウム塩は緩衝液としての作用を有する点
で好ましい。グルタミン酸一ナトリウムを副原料として
利用すれば、特に他の緩衝液を用いたり、アルカリや酸
を添加して調整する事無く、反応の間を通じて反応液の
ｐＨを６−９付近に保つことが出来る。このｐＨ領域
は、酵素の安定性や活性にとって好ましい条件である。
この他に用いる事が出来るアミノ酸としてはアラニンが
ある。これらは水溶性が高く、好ましいものである。な
おフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイ
シン、イソロイシン等の疎水性の高いアミノ酸も利用可
能である。

【００２６】天然型２−ケト酸としては原料の入手しや
すさや溶解性の問題からピルビン酸や２−ケトグルタル
酸が特に好適に用いられる。

【００２７】以上に説明した原料のアリールグリオキシ
ル酸、副原料の天然型アミノ酸及びＭｓＡＴを混合して
酵素反応を行う。この時の温度は原料が十分に溶解する
様に常温以上であれば特に限定はなく、水の常圧での沸
点である１００℃を越えた温度で反応を行う場合は加圧
密閉した状態で反応を行えば良いが、原料や酵素の安定
性及び原料の溶解度からは好ましい温度は５０−１００
℃程度である。また反応のｐＨにも特に限定はないが、
原料を十分に溶解させて反応を行う目的からはｐＨ６以
上である事が好ましい。また酵素はこのｐＨ領域で問題
なく使用する事が出来るが、十分な活性を発現させる目
的からより好ましくはｐＨ７−９である。反応液に原
料、副原料及び酵素を投入する順番にも特に制限はな
く、すべてを同時に溶媒である水に添加する事も出来る
し、原料をまず加熱して水に溶解した後に副原料、酵素
を順次投入して反応を開始する事も出来る。

【００２８】原料と副原料の量比にも特に制限はない
が、十分な反応の変換率が得られ、かつ経済的問題や廃
棄物処理の問題の生じない範囲で任意に選定される。

【００２９】アリールグリオキシル酸からＬ−アリール
グリシンへの変換反応において、目的物のＬ−アリール
グリシンは反応の進行に従って沈殿として生成するの
で、ろ過や遠心分離などの通常の固液分離の方法で回収
する事が出来る。沈殿物を回収する時期は、反応が十分
に進行してからでも構わないし、反応の進行中に逐次取
り出す事も出来、さらには原料を添加しながら生成物を
回収する連続反応法を適応する事も出来る。沈殿物の回
収に先立って、反応液を濃縮することによって沈殿生成
を促進することも可能である。この際の濃縮法も、加熱
および／または減圧によって溶媒を留去する方法や限外
ろ過膜による方法など、通常用いられる方法が任意に利
用出来る。また、酸、アルカリ、有機溶媒等を添加して
生成物を溶解して、溶液として生成物を回収する事も可
能である。

【００３０】一方、化学式［２］で表されるＬ−アリー
ルグリシン、副原料の天然型２−ケト酸、及びＭｓＡＴ
を混合して、酵素反応を行うことにより、化学式［２］
で表されるＬ−アリールグリシンを分解することができ
る。この時の温度、ｐＨ、原料，副原料，酵素を反応系
に投入する順番、原料と副原料の量比には特に限定はな
く、前述の反応と同様の条件を適用することができる。
ＭｓＡＴは、化学式［２］で表されるＬ−アリールグリ
シンに顕著な酵素活性を示す一方で、化学式［３］で表
されるＤ−アリールグリシンには著しく低い活性しか示
さない。そのため、反応時に化学式［２］で表されるＬ
−アリールグリシンと共に、化学式［３］で表されるＤ
−アリールグリシンが混在している場合は、化学式
［２］で表されるＬ−アリールグリシンは酵素により分
解されるが、化学式［３］で表されるＤ−アリールグリ
シンは分解されずにそのまま回収することができる。従
って、この方法を用いることにより、Ｄ体とＬ体とが混
在したアリールグリシンから、実質的にＤ体のみを回収
することができる。特にＤ体とＬ体とがラセミ体として
混在している場合であっても、この方法により実質的に
Ｄ体のみを回収することができ、光学活性なものを得る
ことができる。

【００３１】酵素反応で得られた光学活性アリールグリ
シンは、そのまま工業原料や医薬合成原料として利用出
来るが、再結晶化やシリカゲル或いは活性炭を充填した
カラムクロマトグラフィー等の公知の方法でさらに精製
して利用することもできる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を用いてさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定される物ではない。

【００３３】実施例１ ＰｆＭｓＡＴの調製 特開２００１−３２１１８０号公報で得られたＰｆＭｓ
ＡＴ遺伝子で形質転換された組換え大腸菌ＪＭ１０９／
ｐＰＦＡＴ１株を２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラ
スコを用い５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ
培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイースト
エキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌ中で３７
℃、１５時間振とう培養を行った。この培養液３０ｍｌ
を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ４Ｙ培地
（１％バクトトリプトン、２％バクトイーストエキスト
ラクト、０．５％ＮａＣｌ）３リットルに植菌し、５リ
ットル容の発酵槽を用いて３７℃で培養を行った。培養
液のＯＤ６００の吸光度が約１．０になった時点で終濃
度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−チオガラクトピラノシド）を加えさらに約１６時間培
養した。この培養物を常法に従って菌体を集めると３１
ｇであった。

【００３４】集めた菌体の内１．１５ｇを１０ｍｌの５
０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）で洗浄
後、同じ緩衝液１０ｍｌで再度懸濁し、超音波で菌体の
破砕を行った。この菌体破砕物を遠心分離し、上清を取
り出した。この溶液を７０℃で３０分間加熱し、生じた
沈殿物を遠心分離により除去し、次いで氷冷下当量のア
セトンを添加して酵素を沈殿せしめた。この沈殿を遠心
分離により回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ８．０）に溶解し、８０℃、１５分間加熱処理を行な
った。更にＮａＣｌ濃度０Ｍから０．２Ｍのリニアグラ
ジエントによるＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ
（東ソー製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーを
行った。以上の操作によりＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）でほ
ぼ均一な酵素を得た。ＢｉｏＲａｄ社製プロテインアッ
セイキットを用いて蛋白質の定量をおこなったところ、
得られたＰｆＭｓＡＴの濃度は２．０ｍｇ／ｍｌだっ
た。

【００３５】実施例２ Ｌ−フェニルグリシンに対する
ＰｆＭｓＡＴの活性測定 実施例１で調製した酵素液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）で１００倍に希釈した。この酵素液１０μｌ
を、予め７０℃で５分間加熱しておいた０．５ｍｌの基
質溶液、即ち１０ｍＭ Ｌ−フェニルグリシン（シグマ
社製、以下Ｌ−Ｐｈｇと略記する）及び１０ｍＭ ２−
ケトグルタル酸（ナカライテスク社）を含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に加え酵素反応
を行った。正確に７０℃で５分間加温して反応をおこな
ったのち、内部標準として１ｍＭのセリンを含む１Ｎ酢
酸０．５ｍｌを加え、直ちに氷冷して反応を停止させ
た。

【００３６】この反応液の１０μｌを別の試験管に採取
して、３５ｍｌのエタノール、５μｌのトリエチルアミ
ン及び５μｌのフェニルイソチオシアン酸（以下ＰＩＴ
Ｃと略記する）を加えて、室温で２０〜３０分間放置し
て、酵素反応により生成したグルタミン酸（以下Ｇｌｕ
と略記する）をフェニルチオカルバミル（以下ＰＴＣと
略記する）−Ｇｌｕに修飾した後、高速液体クロマトグ
ラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）で定量した。な
お、ＨＰＬＣはカラムとしてＴＳＫ−ｇｅｌＯＤＳ−８
０ＴＭ（東ソー製）を、溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナ
トリウム−０．５％トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）
を用い、ＰＴＣ−Ｇｌｕをアセトニトリルの直線濃度勾
配で溶出させて２５４ｎｍの吸光度で検出した。

【００３７】上記の酵素反応によって生成したＧｌｕは
８９μＭであった。すなわちＰｆＭｓＡＴは酵素１ｍｇ
当り１分間に４４μｍｏｌのＬ−Ｐｈｇから２−ケトグ
ルタル酸へのアミノ基の転移反応を触媒することが確認
された。

【００３８】比較例１ Ｄ−フェニルグリシンに対する
ＰｆＭｓＡＴの活性測定 Ｌ−Ｐｈｇの替わりにＤ−フェニルグリシン（和光純薬
製、以下Ｄ−Ｐｈｇと略記する）を用いたこと、及び酵
素溶液を希釈せずに用いたことをのぞき、実施例２と同
様の実験を行った。本実験では生成したＧｌｕは０．０
８７ｍＭに過ぎず、ＰｆＭｓＡＴはＤ−Ｐｈｇを基質と
した場合は酵素１ｍｇ当り１分間に０．０３６μｍｏｌ
の基質に作用する触媒能しか示さなかった。

【００３９】実施例３ ＰｆＭｓＡＴによるＬ−Ｐｈｇ
の合成 ベンゾイルギ酸（アルドリッチ社製）４００ｍｇ及びＬ
−グルタミン酸ナトリウム１水和物（ナカライテスク
社）２．５ｇを少量の水に溶解し、ＮａＯＨを添加して
ｐＨ８．０としたのち、水を加えて２０ｇとして基質溶
液とした。

【００４０】この基質溶液の４ｇを別の試験管にとり、
実施例１で調製したＰｆＭｓＡＴ溶液１ｍｌを添加して
５０℃で一晩加温して酵素反応を行った。反応中に酵素
反応生成物は針状結晶として析出した。反応終了後、こ
の反応生成物をろ紙（桐山製作所、Ｎｏ．５Ｃ）でろ過
して回収し、純水１０ｍｌ、次いでアセトン５ｍｌで洗
浄し、さらに減圧条件で乾燥させ、１２．５ｇの反応生
成物が回収された。ベンゾイルギ酸当りの収率は１５．
６％だった。

【００４１】回収された生成物の一部を少量の希塩酸に
溶解し、東ソー製ＴＳＫ−ｇｅｌＥｎａｎｔｉｏ Ｌ１
をカラムとしたＨＰＬＣで分析したところ（溶離液１ｍ
ＭＣｕＳＯ４、カラム温度５０℃、検出２５４ｎｍの吸
光度）、Ｌ−Ｐｈｇと一致するピークのみが観察され、
Ｄ−Ｐｈｇに相当するピークは全く認められなかった
（図２）。なお、同様にして市販のＤ−ＰｈｇとＬ−Ｐ
ｈｇの当量混合物をＨＰＬＣで分析した結果を図１に、
市販Ｌ−Ｐｈｇと実施例３における反応生成物の混合物
を分析した結果を図３に示す。図中のＬ，Ｄの矢印はそ
れぞれＬ−Ｐｈｇ及びＤ−Ｐｈｇを示す。

【００４２】さらに、上記反応性生物がＬ−Ｐｈｇであ
ることを確認するため、ＰＴＣ化法によるアミノ酸分析
を行った。即ち、この溶液の１０μｌに５μｌのトリエ
チルアミン、３５μｌのエタノール及び５μｌのＰＩＴ
Ｃを加えて室温で約３０分放置してＰＴＣ誘導体とした
のち、溶媒を減圧除去し、実施例２と同じ条件のＨＰＬ
Ｃで分析した。その結果、目的物は市販のＬ−Ｐｈｇと
完全に一致することが確認された（図７）。なお同様に
して、純水をＰＩＴＣ処理したもの（盲検）を分析した
結果を図６に、市販Ｌ−フェニルグリシンをＰＩＴＣ処
理したものを分析した結果を図８に、市販Ｌ−フェニル
グリシンと実施例３における反応生成物の混合物をＰＩ
ＴＣ処理したものを分析した結果を図９に示す。図中の
矢印はＰＴＣ誘導体のピークを示す。

【００４３】また、得られた結晶のＨ−ＮＭＲを測定結
果は次のとおりだった；¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ−ＤＣｌ） δ（ｐｐｍ） ４．９
７（１Ｈ、ｓ）、７．２１〜７．２９（５Ｈ、ｍ）。

【００４４】以上の分析により、酵素反応で得られた結
晶が光学純度１００％ｅｅのＬ−Ｐｈｇであることが確
認された。

【００４５】実施例４ ＡｐＭｓＡＴの調製 日本農芸化学会誌 ２００１．Ｍａｒｃｈ，７５，臨時
増刊号，ｐ．５５に開示される組換え体大腸菌ＨＢ１０
１／ｐＡＰＡＴ１を用いたことを除き、実施例１と同様
にしてＡｐＭｓＡＴを調製した。この操作により、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ的に均一な０．９ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度
のＡｐＭｓＡＴが調製された。

【００４６】実施例５ Ｌ−Ｐｈｇに対するＡｐＭｓＡ
Ｔの活性測定 実施例４で得られた酵素液の活性を実施例２と同様に測
定した。その結果、ＡｐＭｓＡＴは酵素１ｍｇ当り１分
間に３９μｍｏｌのＬ−Ｐｈｇから２−ケトグルタル酸
へのアミノ基の転移反応を触媒することが確認された。

【００４７】比較例２ Ｄ−Ｐｈｇに対するＡｐＭｓＡ
Ｔの活性測定 比較例１と同様の実験を行った結果、ＡｐＭｓＡＴはＤ
−Ｐｈｇを基質とした場合は酵素１ｍｇ当り１分間に
０．４μｍｏｌの基質に作用する触媒能しか示さないこ
とが確認された。

【００４８】実施例６ ＡｐＭｓＡＴによるＬ−Ｐｈｇ
の合成 実施例４で得たＡｐＭｓＡＴを用いた他、実施例３と同
じ操作で酵素反応を行ったところ、８．５ｍｇの針状結
晶が得られた。この結晶の一部を実施例３と同様にＥｎ
ａｎｔｉｏ Ｌ１カラムを用いたＨＰＬＣ及びＰＴＣ化
法によるアミノ酸分析を行ったところ、生成物は市販の
Ｌ−Ｐｈｇと一致することが確認された。原料のベンゾ
イルギ酸に対する収率は１０．６％であり、光学純度は
１００％ｅｅだった。

【００４９】実施例７ ＰｆＭｓＡＴによるＤ−Ｐｈｇ
の光学分割 １０ｍｇのＤ−Ｐｈｇと１０ｍｇのＬ−Ｐｈｇを混合し
てＤ体とＬ体の当量混合物を調製した。この混合物に２
−ケトグルタル酸（ナカライテスク社製）５８ｍｇ、
０．８ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び
少量の純水を加えて溶解し、ＮａＯＨを加えてｐＨ８．
０とした。この溶液に純水を加えて８ｍｌとし、基質溶
液を調製した。基質溶液２．０ｍｌに実施例１で調整し
たＰｆＭｓＡＴ溶液を２００μｌ加え、５０℃で１８時
間酵素反応を行った。

【００５０】反応終了後、反応液の一部を純水で希釈し
て実施例３と同様にＴＳＫ−ｇｅｌＥｎａｎｔｉｏ Ｌ
１をカラムとしたＨＰＬＣで光学純度を分析したとこ
ろ、混合物中のＬ−Ｐｈｇは痕跡程度にまで分解され、
Ｄ−Ｐｈｇのみが残存していることが確認された（図
４）。図中のＬ，Ｄの矢印は、それぞれＬ−Ｐｈｇ及び
Ｄ−Ｐｈｇを示す。得られたＤ−Ｐｈｇの光学純度は９
６．９％ｅｅだった。

【００５１】比較例３ 実施例７で調製した基質溶液２ｍｌに、ｐｆＭｓＡＴ溶
液の代わりに純水２００μｌを加えたことを除き、実施
例７と同様の操作を行った。保温後の溶液のクロマトグ
ラムを図５に示したが、Ｌ−Ｐｈｇの減少は認められ
ず、Ｄ体とＬ体の当量混合物が回収された。図中のＬ，
Ｄの矢印は、それぞれＬ−Ｐｈｇ及びＤ−Ｐｈｇを示
す。

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば、アリールグリオキシル
酸に天然型のアミノ酸存在下、ＭｓＡＴを作用させるこ
とで、高い効率で医農薬合成原料として有用な光学活性
アリールグリシンを得ることが出来る。本発明で得られ
るＬ−アリールグリシンの光学純度は１００％ｅｅであ
り、実質的にＤ体を全く含まない。また本発明によれ
ば、Ｌ−アリールグリシンと共にＤ−アリールグリシン
が混在していても、天然型ケト酸の存在下、ＭｓＡＴを
作用させることにより、Ｌ−アリールグリシンのみを分
解することができる。即ち本発明は、ＭｓＡＴの利用に
より光学純度の高い光学活性アリールグリシンを製造す
る方法を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３において、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｅｎａｎ
ｔｉｏ Ｌ１をカラムとした高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す図である。

【図２】実施例３において、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｅｎａｎ
ｔｉｏ Ｌ１をカラムとした高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す図である。

【図３】実施例３において、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｅｎａｎ
ｔｉｏ Ｌ１をカラムとした高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す図である。

【図４】実施例７において、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｅｎａｎ
ｔｉｏ Ｌ１をカラムとした高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す図である。

【図５】比較例３において、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｅｎａｎ
ｔｉｏ Ｌ１をカラムとした高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す図である。

【図６】実施例３において、ＰＴＣ化法によるアミノ酸
分析の結果を示す図である。

【図７】実施例３において、ＰＴＣ化法によるアミノ酸
分析の結果を示す図である。

【図８】実施例３において、ＰＴＣ化法によるアミノ酸
分析の結果を示す図である。

【図９】実施例３において、ＰＴＣ化法によるアミノ酸
分析の結果を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】化学式［１］で示されるアリールグリオキ
   シル酸、そのエノール体、またはそれらの塩に、天然型
   アミノ酸の存在下、広域アミノ酸アミノトランスフェラ
   ーゼを作用させることを特徴とする、化学式［２］で表
   されるＬ−アリールグリシンの製造方法。 【化１】 【化２】 （化学式［１］及び［２］において、Ｒは、（１）無置
   換もしくは任意の置換基を有するフェニル基もしくはナ
   フチル基、又は（２）酸素原子、窒素原子、もしくは硫
   黄原子を一つ含むかもしくはいずれかの原子が組み合わ
   さって２つ以上含む、５もしくは６員環性芳香族複素環
   基を表す）
2. 【請求項２】化学式［２］で表されるＬ−アリールグリ
   シンに、天然型−ケト酸の存在下、広域アミノ酸トラン
   スフェラーゼを作用させることを特徴とするＬ−アリー
   ルグリシンの分解方法。 【化３】 （化学式［２］において、Ｒは、（１）無置換もしくは
   任意の置換基を有するフェニル基もしくはナフチル基、
   又は（２）酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子を一
   つ含むかもしくはいずれかの原子が組み合わさって２つ
   以上含む、５もしくは６員環性芳香族複素環基を表す）
3. 【請求項３】請求項２に記載の分解方法において、化学
   式［２］で表されるＬ−アリールグリシンと共に、化学
   式［３］で表されるＤ−アリールグリシンが混在するこ
   とを特徴とする方法。 【化４】 （化学式［３］において、Ｒは、（１）無置換もしくは
   任意の置換基を有するフェニル基もしくはナフチル基、
   又は（２）酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子を一
   つ含むかもしくはいずれかの原子が組み合わさって２つ
   以上含む、５もしくは６員環性芳香族複素環基を表す）
4. 【請求項４】請求項３に記載の分解方法において、化学
   式［２］で表されるＬ−アリールグリシンと、化学式
   ［３］で表されるＤ−アリールグリシンとが、ラセミ体
   で混在することを特徴とする方法。
5. 【請求項５】広域アミノ酸アミノトランスフェラーゼ
   が、パイロコッカス・フリオサスまたはアエロピルム・
   ペルニクスのいずれかに由来するアミノトランスフェラ
   ーゼである請求項１〜４いずれかに記載の方法。