JP4636590B2 - D−β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法 - Google Patents

D−β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は医薬や農薬等の合成中間体として有用なD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸もしくはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。
D-エリスロ-3-ヒドロキシアミノ酸は、従来、以下に述べるような化学合成法によって製造されていた。すなわち、アルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ/エリスロ−ヒドロキシアミノ酸誘導体混合物を得た後、スレオ/エリスロ体の相互分離操作を行う。得られたラセミ-エリスロ−ヒドロキシアミノ酸のアミノ基部分に置換基を導入し、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行う。最後に、アミノ基部分の置換基を除去して製造することができる。しかし、上記プロセスは、工程が煩雑であり、収率が悪いばかりでなく、用いる光学分割剤も高価であり生産コストが高くなるという問題があった。
特許文献1、特許文献2では、グリシンまたはグリシン金属錯体とアルデヒド誘導体をD-スレオニンアルドラーゼの存在下、反応させ、D-β-ヒドロキシアミノ酸が製造されている。しかし、上記方法では、α−アミノ基はD体特異的に製造できるが、β−水酸基の立体はスレオ体、エリスロ体が共に生成し、ジアステレオマー選択性が低かった。
更に、特許文献3では、ラセミ-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に、L-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解する酵素であるL-アロスレオニンアルドラーゼを作用させることにより、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法が記載されている。しかしこの方法では、原料であるラセミ-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸が反応を著しく阻害しない濃度として1-100mMが例示されている。更に多量のラセミ体を与えた場合には、基質阻害、あるいは反応に伴って生成する反応生成物による阻害作用が予測された。またラセミ体が溶解性を超えて添加されたときには、酵素反応が起こりにくくなる心配もある。つまり公知の方法は、工業的に耐えうる製造法とは言い難かった。
特開平1-317391 特開平2-207793 特開平6-165693
本発明の課題は、高い基質濃度においても、D-β-ヒドロキシアミノ酸を生成することができる方法の提供である。より具体的には、たとえば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、あるいはD-スレオ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸等の、D-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供することが本発明の課題である。
さて、L-フェニルセリンを資化する微生物に関する検討の中で、土壌より得られたシュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株 (Pseudomonas putida biovar. A) が、L-フェニルセリンアルドラーゼを生産することが明らかにされている。L-フェニルセリンアルドラーゼは、L-フェニルセリンをベンズアルデヒドとグリシンに分解する作用を有する酵素である。この酵素は精製され、その酵素化学的性質が明らかにされた。更に、この酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、その塩基配列とそれによってコードされるアミノ酸配列が決定された(Vitamin (Japan), 75, 51-61, 2001)。
本発明者らは、L-フェニルセリンアルドラーゼをDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸(以下、DL-ACHPと略す)に作用させることによって、原料に含まれる一方のエナンチオマーであるL-ACHPがシクロヘキシルアルデヒドとグリシンに分解され、D-ACHPが残存することを見出した。すなわち光学純度の高いD-ACHPが生成された。L-フェニルセリンアルドラーゼは、工業的な生産においても十分に有用な、高度なD-β-ヒドロキシアミノ酸に対する反応特異性と酵素作用を有していた。たとえば、L-フェニルセリンアルドラーゼは、15%という極めて多量の原料の存在下においても十分な酵素活性を維持した。すなわち本発明は、以下のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、並びにD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法を提供する。
〔1〕 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも1つの酵素活性物質を、式1(式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す)
Figure 0004636590
で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式2で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔2〕 〔1〕におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、〔1〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔3〕 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも1つの酵素活性物質を、式3(式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す)
Figure 0004636590
で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式4で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔4〕 〔3〕におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、〔3〕に記載のD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔5〕 〔1〕または〔3〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度が30g/L以上であることを特徴とする、〔1〕または〔3〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔6〕 〔1〕または〔3〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の濃度が50g/L以上である事を特徴とする、〔1〕または〔3〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔7〕 〔1〕または〔3〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度が50g/L以上であることを特徴とする方法。
〔8〕 〔2〕または〔4〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のpHを10以上にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)反応液のpHを2−9.5に調整することによって析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
〔9〕 〔2〕または〔4〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のpHを1.5以下にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)pHを2−9.5に調整することにより析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
L-フェニルセリンアルドラーゼは、以下に示すような基質特異性を有していることが明らかにされている。まず、以下のような芳香族置換を有する化合物のL体に対しては効率よく作用する。
DL-スレオ-フェニルセリン、
DL-エリスロ−フェニルセリン、および
DL-チエニルセリンなど
しかし、L-スレオニン、L-アロ-スレオニンに対するL-フェニルセリンアルドラーゼの酵素活性は低い。更にL-フェニルセリンアルドラーゼは、L-セリンに対してはほとんど活性を示さない。つまりL-フェニルセリンアルドラーゼには、芳香族アミノ酸にしか高い酵素作用は認められない。したがって、芳香環を有しないL-ACHPに対してL-フェニルセリンアルドラーゼが高い酵素活性を有することは、予想できない結果であった。
また、一般にアルデヒドはアルドラーゼ反応を阻害する。つまりD-ACHPの酵素的な分解によって生成するシクロヘキシルアルデヒドは、L-フェニルセリンアルドラーゼの酵素作用を阻害する恐れがあった。阻害の程度は基質濃度が高いほど大きいと予測される。しかし実際には、15%以上という極めて高い基質濃度においても極めて効率よくL-ACHPが分解されることも意外な結果であった。また本酵素は、カリウムイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオンなどの一価もしくは二価のカチオンにより活性化されない。この特徴も、一般的なスレオニンアルドラーゼとは異なっている。
加えて構造的な特徴から見ても、L-フェニルセリンアルドラーゼのL-ACHPに対する高い酵素活性を予想することは難しい。たとえば前記特許文献3(特開平6-165693)において、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造に利用されているL-アロスレオニンアルドラーゼのうち、アルカリゲネス・ジャディニィ由来のL-アロスレオニンアルドラーゼの塩基配列、およびアミノ酸配列が明らかにされている。そのアミノ酸配列情報をL-フェニルセリンアルドラーゼのそれと比較すると、ホモロジーは20.4%であった。このように両者の構造には大きな隔たりがある。
また、本発明に用いるL-フェニルセリンアルドラーゼは、3-フェニルセリンのL−スレオ体とL−エリスロ体を良好な基質とするEC 4.1.2.26に分類される酵素である。一方、L-アロスレオニンアルドラーゼは、EC 2.1.2.1に分類され、L-アロスレオニンに最も強く作用する。したがって両者は生化学的にも酵素分類上も全く異なる酵素である。
本発明により、DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸あるいはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を原料として、光学活性なD-β-ヒドロキシアミノ酸を酵素的に製造するための方法が提供された。本発明の方法によって製造されるD-β-ヒドロキシアミノ酸は、エリスロ体、およびスレオ体のいずれにおいても、高い光学純度を与える。すなわち、光学分割剤を利用する従来の方法に対して、高度な光学純度を安価に、かつ容易に達成することができる。
また本発明によれば、多量の原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることができる。より具体的には、本発明に基づいて、たとえばD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を、実用的な添加量のラセミ体から、簡便、かつ経済的に、工業的に製造することが可能となった。すなわち、本発明における酵素活性物質は、多量の基質、並びに基質から生成する反応生成物による阻害作用を受けにくい。そのため、より多くの原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることが可能となった。
本発明は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質(enzymatic active materials)を前記式1で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する前記式2で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法である。あるいは本発明は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質(enzymatic active materials)を前記式3で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する前記式4で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法である。
本発明によるD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法において、原料となるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、および、DL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、下記式1および式3に示される構造を有する。なお本発明において、エリスロ体とスレオ体を特に区別しない場合には、エリスロ体およびスレオ体のいずれか、または両方を意味している。たとえば「D-β-ヒドロキシアミノ酸」は、「D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸およびD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれか、または両方」であることを意味する。
Figure 0004636590
式1もしくは式3におけるR基としては、低級アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、アルコキシ基、水酸基などで置換されてもよいシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基などが挙げられる。より具体的には、例えば、シクロヘキシル基、フェニル基、チエニル基などが挙げられる。
式1に示されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、例えば、式5に示すように、トランス−2,3−エポキシカルボン酸にアンモニア、ベンジルアミンなどのアミンを作用させることにより開環し、必要により脱保護することにより合成することができる。
Figure 0004636590
また、式3に示されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、例えば、式6に示すように、アルデヒドとグリシンをアルドール縮合することによりスレオ体選択的に合成することができる。また、シス−2,3−エポキシカルボン酸にアンモニア、ベンジルアミンなどのアミンを作用させることにより開環し、必要により脱保護することにより合成することもできる。
Figure 0004636590
式1もしくは式3に示されるR基がシクロヘキシル基である場合には、R基がフェニル基である式1もしくは式3に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を合成後、還元(水素付加)によってフェニル基をシクロヘキシル基とすることにより合成することも可能である。
本発明の好ましい態様においては、酵素活性物質を原料であるDL-エリスロ-2-アミノ-3-ヒドロキシプロピオン酸に作用させることによって、D-エリスロ-2-アミノ-3-ヒドロキシプロピオン酸が製造される。酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させる条件として、その酵素作用の維持に好ましい条件を選択することができる。
まず、反応の原料であるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度は制限されない。通常0.1〜30%程度、好ましくは0.5〜20%、より好ましくは1〜15%の濃度が用いられる。本発明において、原料として用いられているDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL−エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物である。混合物中のD体とL体の比率は、D体:L体=10〜90:90〜10であり、好ましくは、D体:L体=25〜75:75〜25、より好ましくはD体:L体=50:50(ラセミ体)である。同様に、原料として用いられるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物であり、その混合物中のD体とL体の比率は、D体:L体=10〜90:90〜10であり、好ましくは、D体:L体=25〜75:75〜25、より好ましくはD体:L体=50:50(ラセミ体)である。
具体的には、原料となるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度を、たとえば30g/L以上、あるいは50g/Lとすることができる。より具体的には、30〜200g/L、あるいは30〜150g/L、たとえば60〜100g/Lの原料を添加することができる。原料は反応開始時に一括して添加することもできるし、あるいは反応液中に連続的、もしくは間欠的に添加することもできる。
本発明において、原料の濃度は、反応液中に存在する原料の割合を言う。原料は必ずしも完全に溶解していなくてもよい。つまり本発明においては、原料の溶解状態に関わらず、反応液の体積と、その反応液中に存在する原料の重量(添加量)によって決定される。原料の全量が溶解しない場合には、反応液の液相においては原料が飽和した状態にあると言える。
本発明においては、原料の少なくとも一部が反応液中に溶解していれば、必要な反応は進行する。溶解した原料中のD体とL体のうち、L体は酵素活性物質によって対応するアルデヒドとグリシンに分解される。その結果、反応液に溶解した原料の濃度は低下し、新たに原料が溶解し、そのうちのL体が順次分解されてゆく。一方で飽和状態に達したD体は結晶化してゆく。結果として反応系内のL体が順次消費されるため、溶解度が低い原料であっても、目的とするD体を効率的に得ることができる。たとえば、本発明において原料として用いられるDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、あるいはDL-スレオ−2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸は、通常の条件では、反応液を構成する溶媒中にはわずかしか溶解しない。しかし上記のようなメカニズムにより、本発明によって、目的とするD体を効率的に回収することができる。
なお、本発明における「%」は、いずれも「重量/容量(w/v)」を意味する。またe.e.は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合、次の式で求められる数値を意味する。
(([D-エリスロ体の濃度]-[L-エリスロ体の濃度])
/([D-エリスロ体の濃度]+[L-エリスロ体の濃度])) x 100
同様に、D−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合、e.e.は次の式で求められる数値を意味する。
(([D-スレオ体の濃度]-[L-スレオ体の濃度])
/([D-スレオ体の濃度]+[L-スレオ体の濃度])) x 100
使用するL-フェニルセリンアルドラーゼの量は、通常は0.01〜10000 U/mL、好ましくは0.1〜1000 U/mL、より好ましくは1〜500 U/mL程度とすることができる。反応温度は酵素活性物質がその酵素作用を維持できる温度を選択することができる。具体的には、通常5〜60℃、好ましくは10〜50℃、より好ましくは20〜40℃を示すことができる。また反応pHも、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる範囲を選択することができる。通常はpH6〜11、好ましくは、pH7〜10、より好ましくはpH8〜9.5を示すことができる。反応は、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応液に、任意の添加物を添加することができる。添加物は、酵素活性の増強、酵素活性の安定化、あるいは反応液の流動性の増加などを目的として添加される。本発明において使用するL-フェニルセリンアルドラーゼは、補酵素としてピリドキサール-5'-リン酸(PLP)を利用する。したがって反応液中にPLPを添加することによって、その酵素活性を増強し、そして安定化すことができる。PLPの反応液中の濃度は、通常0.0001〜10mM、好ましくは0.001〜1mM、より好ましくは0.005〜0.1mMである。更に、反応液中にトリス-塩酸緩衝液やリン酸カリウム緩衝液などを添加することにより反応液の流動性を改善できる場合がある。
本発明のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造は、水系溶媒中、水に溶解しにくい有機溶媒中、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水系溶媒の2相系中で実施することができる。本発明に利用することができる水に溶解しにくい有機溶媒として、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどを示すことができる。一方、本発明における水系溶媒としては、水、あるいは酵素活性物質の酵素活性を維持する緩衝液などを示すことができる。
更に、水に溶解する有機溶媒中、あるいは水系溶媒と水に溶解する有機溶媒との混合系中で、原料と酵素活性物質を接触させることもできる。水に溶解する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどを示すことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明においては、原料に酵素活性物質を作用させることによって、原料中のL-β-ヒドロキシアミノ酸が消費され、反応系には目的の化合物であるD-β-ヒドロキシアミノ酸が残される。本発明においては、立体特異的に目的とする化合物が残されることを、生成と言うことがある。本発明においては、D体とL体を含む原料のL体を酵素的に除去し、残存するD体が目的物として回収される。D体そのものは、もともと原料に含まれていた物質である。しかし、L体と混在するD体を、光学純度の高い状態とすることは、「D体の生成」に他ならない。
反応後に残存するD-β-ヒドロキシアミノ酸は、可溶化、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより精製することができる。D-β-ヒドロキシアミノ酸は、アルカリ性化、もしくは、酸性化により可溶化することができる。
例えば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の場合、本化合物の水に対する溶解度が低いために、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼが作用しうるpHでは大部分が沈殿として析出している。反応終了後、塩酸、硫酸、硝酸などの酸を反応液のpHが1.5以下になるまで下げることにより反応液中に残存しているD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させることができる。あるいは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを加えることによって、反応液のpHを10以上にすることにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させることができる。
反応後の原料を溶解させた後、必要により凝集剤を添加した後に、遠心分離や膜濾過等により除菌、除タンパクを行うことができる。反応により生じたアルデヒドは、アルデヒドの溶解性が高く、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の溶解性が低い有機溶媒を用いて抽出すること等により除去することができる。本発明において、アルデヒドの除去のための有機溶媒として、キシレン、ヘキサン、トルエン、t-メチルブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、および酢酸ブチルなどを、示すことができる。有機溶媒抽出したアルデヒドは回収して再利用することもできる。有機溶媒抽出後の水相からは、濃縮、等電点沈殿などによる晶析法やイオン交換樹脂処理、膜分離等の公知の方法によりD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を回収することができる。
一方、本発明における酵素活性物質は、例えば、シュードモナス・プチダ属に属し、下記(1)−(3)の性状により特徴づけられるL-フェニルセリンアルドラーゼ産生能を有する微生物より調製することができる。シュードモナス・プチダ属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株を好適に挙げることができる。すなわちシュードモナス・プチダ属から単離され、以下の性状によって特徴付けられるL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明における酵素活性物質として利用することができる。あるいは、当該酵素を産生するシュードモナス・プチダ属微生物そのもの、あるいはその処理物を本発明の酵素活性物質として利用することができる。
(1) 作用
L-フェニルセリンに作用し、ベンズアルデヒドとグリシンを生成する。
(2) 基質特異性
(a) L-スレオ-フェニルセリン、およびL-エリスロ-フェニルセリンに共に作用するが、D-スレオ-フェニルセリン、およびD-エリスロ−フェニルセリンには実質的に作用しない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体には作用するが、D-エリスロ体には実質的に作用しない。
(3) 分子量
ゲル濾過における分子量が190,000-210,000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が35,000。
本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性は、例えば次のように確認することができる。
活性測定法:
20 mM DL-スレオ-フェニルセリン、200 mM TAPS-NaOH緩衝液(pH8.5)、20μM ピリドキサール-5'-リン酸(以下、PLPと省略する)および酵素を含む0.5 mLの反応液中で、30℃、10分間反応を行い、1 N HClを0.5 mL添加することによって反応を停止する。生成したベンズアルデヒドを次の方法によって定量する。1.0 mLの反応終了液に0.15 mLの0.1% 2,4−ジニトロフェニルヒドラジンを含む2N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、30℃、20分静置する。更に、3 mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、0.85 mLの3 N NaOHを加え、10分間静置する。その溶液の475 nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、30℃において1分間に1 μmolのベンズアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。
また本発明において、酵素が実質的に作用しないとは、上記の活性測定法において、基質として各化合物を与えたときに、同じ条件で測定された良基質に対する活性を100としたときに、当該化合物に対する活性がたとえば10%以下、好ましくは5%以下の場合に、実質的に作用しないと言う。具体的には、シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株由来のL-フェニルセリンアルドラーゼの、以下の化合物に対する活性は、それぞれ対応する良基質に対して以下のとおりである。
(a) L-スレオ-フェニルセリンまたはL-エリスロ-フェニルセリンに対する活性を100とするとき、D-スレオ-フェニルセリンおよびD-エリスロ−フェニルセリンに対する活性は確認できない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体に対する活性を100とするとき、D-エリスロ体に対する作用は確認できない。
シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本酵素は、DL-スレオ-フェニルセリンなどにより誘導されるため、培地に誘導物質を添加することが好ましい。例えば、1.0%ペプトン、0.2%リン酸1水素2カリウム、0.2%リン酸2水素1カリウム、0.2%塩化ナトリウム、0.01%硫酸マグネシウム・7水和物、0.01%酵母エキスを含むpH7.2のペプトン培地に0.2%DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地が好適に利用される。
L-フェニルセリンアルドラーゼは、微生物の培養物から、例えば、以下のようにして精製することができる。シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株を上記0.2%DL-スレオ-フェニルセリンを含むペプトン培地中で十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護するのが望ましい。
還元剤:2-メルカプトエタノール等
プロテアーゼ阻害剤:フェニルメタンフルホニルフルオリド、ペプスタチンA、ロイペプチン、および金属キレーター等
PLP
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、たとえば以下のような各種の蛋白質の分画方法、およびクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。
蛋白質の溶解度による分画(有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など)
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー
より具体的には、たとえば、以下の各工程にしたがって、無細胞抽出液から目的とする酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。各工程の詳細な条件は、たとえば実施例に記載したとおりとすることができる。
40−60%硫安分割;
DEAE−セルロースイオン交換クロマトグラフィー;
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー;
DEAE−セルロース陰イオン交換クロマトグラフィー(2回目)
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー;(2回目)
MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー;
シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株に由来するL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明に利用する酵素活性物質として好ましい。この酵素は、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる。本発明に利用する酵素活性物質はまた、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログを含む。すなわち本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質とは、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも1つの酵素活性物質を含む。
(a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
あるいは配列番号:2に記載のアミノ酸配列に、更に付加的なアミノ酸配列を有する蛋白質も、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の活性を有する限り、本発明における酵素活性物質として利用することができる。たとえば、配列番号:2に記載のアミノ酸配列にHisタグなどを付加した蛋白質は、本発明における酵素活性物質に含まれる。更に、これらの蛋白質を発現する形質転換体、およびそれが産生する組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
本発明に利用するL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号:2に記載のアミノ酸配列に1もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等とは、当該蛋白質が前記(1)−(3)に示した物理化学的、酵素化学的性状を有することを意味する。
当業者であれば、配列番号:1記載のDNAに部位特異的変異導入法(Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) )などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および/または付加変異を導入することによりL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号:2に記載のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを得ることが可能である。
配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号:1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性状(1)および(2)を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号:1に記載中の任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40、60または100個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。具体的な「ストリンジェントな条件」とは、65℃、0.1×SSCおよび0.1%SDSの条件である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い相同性を示したのは、ラルストニア・ソラナシアラム(Ralstonia solanacearum)由来の予想低基質特異性アルドラーゼ(68%)であった。機能が同定されている蛋白質の中では、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) PAO1株由来の低基質特異性L-スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列は、配列番号:2に対する相同性が41%であった。
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドをプローブとして、土壌等の環境サンプルから直接得られたDNAからスクリーニングすることによっても目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、環境サンプルから得られたDNAの物理的消化物、酵素的消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。上記方法で、ハイブリダイズするDNAを得た後、得られたDNA塩基配列を解析した結果、コードするアミノ酸配列がL-フェニルセリンアルドラーゼと70%以上の相同性を有するものは、同様の機能を有することが期待できる。こうして得られたDNAをもつプラスミドによって形質転換された大腸菌も、本発明に利用することができる。
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。たとえば配列番号:1に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより目的のDNAを得ることができる。
あるいは、PCRによって得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株のライブラリーをスクリーニングすることによって目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列情報に基づいて、その5'側あるいは3'側の塩基配列を取得することもできる。このような方法として、RACE法(Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局)を利用することができる。あるいは、既知の断片配列情報に基づいて未知の領域を取得するための方法として、逆PCR(Inverse PCR;Genetics 120, 621-623 ,1988)も公知である。逆PCRにおいては、自己環化によって環状化されたDNAライブラリーが用いられる。このようなライブラリーは、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させることにより得ることができる。一方、逆PCR用のプライマーは、既知のcDNAの塩基配列に対して、その外側(未知の領域)に向かって相補鎖合成反応が進むようにデザインされる。鋳型となるDNAは環状化されているので、逆PCRによって未知の領域を増幅産物として得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
このようにして単離された、ホモログをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログの発現ベクターを得ることができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを組換え体として得ることができる。こうして得られた形質転換体、およびそれが産生するホモログの組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
本発明においてL-フェニルセリンアルドラーゼまたはそのホモログを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属等宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属等宿主ベクター系の開発されているカビ
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる(例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。
微生物菌体内などにおいて、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、等に詳細に記載されている。
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PR等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、 npr(中性プロテアーゼ)、またはamy(α−アミラーゼ)等が利用できる。
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ(特開平5-284973)遺伝子等が利用できる。
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175, 1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1(Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985))等がプラスミドベクターとして利用可能である。
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614,1979)等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003,1992)。
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99,1991)、pUWL-KS (Gene 165,149-150, 1995)等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる(Actinomycetol. 11, 46-53, 1997)。
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター(EP 537456など)は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド(J. Bacteriol. 145, 382-390, 1981)、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド(EP 537456など)などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である(Mol. Cell. Biol. 6, 80,1986)。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J. 6, 729, 1987)。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3(Nucleic Acids Res. 13, 4267, 1985)などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素)のプロモーター(Agri. Biol. Chem. 54, 2521, 1990)等が利用可能である。
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ(Pichia angusta、旧名:ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha))において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子(HARS1、HARS2)も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である(Yeast 7, 431-443, 1991)。また、メタノールなどで誘導されるAOX(アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)等を利用した宿主ベクター系が開発されており(Mol. Cell. Biol. 5, 3376, 1985)、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる(Nucleic Acids Res. 15, 3859, 1987)。
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587,1987)、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている(特開平08-173170)。
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である(Trends in Biotechnology 7, 283-287,1989)。
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる(Biotechnology 7, 596-603, 1989)。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されている。具体的には、蚕などの昆虫(Nature 315, 592-594,1985)、あるいは菜種、トウモロコシ、およびジャガイモ等の植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されている。これらの宿主・ベクター系も、本発明に利用できる。
本発明の方法においては、前記L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質を原料に作用させ、反応液中に残存する目的化合物を回収する工程を含む。すなわち酵素活性物質は、原料であるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用し、基質であるL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を立体選択的に分解することによって、目的化合物であるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸が残存する。あるいは酵素活性物質は、原料であるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用し、基質であるL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を立体選択的に分解することによって、目的化合物であるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸が残存する。
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応溶液の接触形態は任意である。たとえば原料を含む溶媒に、酵素活性物質を混合することによって、両者を接触させることができる。酵素活性物質が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素活性物質が分散され、必要に応じて両者を分離することができる。あるいは原料を含む溶媒と、酵素活性物質を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形態は、酵素活性物質の回収と再利用を容易にする。本発明において、両者の接触形態は、これらの具体例に限定されない。
本発明において、酵素活性物質としては、配列番号:2に記載の蛋白質、またはそのホモログを機能的に発現する形質転換体並びにその処理物を用いることができる。例えば、pKK-PSA1、またはpSE-PSA1により形質転換された大腸菌は、本発明における形質転換体として好ましい。
更に、本発明における配列番号:2に記載の蛋白質、またはそのホモログを発現する形質転換体の処理物には、具体的には以下に示す酵素活性物質が含まれる。
界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物;
凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体;
ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液;
無細胞抽出液を部分精製したもの;
精製された酵素;
形質転換体あるいは酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物;
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔参考例1〕 シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株 (Pseudomonas putida biovar. A)の培養
シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株を1.0%ペプトン、0.2%リン酸1水素2カリウム、0.2%リン酸2水素1カリウム、0.2%塩化ナトリウム、0.01%硫酸マグネシウム・7水和物、0.01%酵母エキスを含むpH7.2のペプトン培地に植菌し、30℃、12時間振盪培養した。同ペプトン培地に0.2%DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地に植菌し、更に30℃、24時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
〔参考例2〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの精製
参考例1により調製した菌289gを、0.1M TES−NaOH緩衝液(pH7.2)、2mM エチレンジアミン4酢酸(EDTA)、0.02% 2−メルカプトエタノールを含む菌体破砕液に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を10mM TES−NaOH緩衝液(pH7.2)、1mM EDTA、0.01%2−メルカプトエタノール、50μM PLPを含む緩衝液1に透析し、無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液に40%飽和まで硫安を添加し、遠心分離により沈殿を除去した。その上清に60%飽和まで硫安を添加し、遠心分離の沈殿画分として本酵素を回収した。
沈殿画分を緩衝液1に溶解し、同緩衝液に透析後、緩衝液1で平衡化したDEAE−セルロースカラム(4.8 x 38cm)に本酵素を吸着させた。緩衝液1、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M塩化カリウムを含む緩衝液1で段階溶出した結果、本酵素は、0.15M及び0.2M塩化カリウムを含む緩衝液1で溶出した。活性画分を集め、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.2)、0.01%2−メルカプトエタノールを含む緩衝液2に対して透析した。
次に、緩衝液2で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム(1.7 x 18cm)に酵素を吸着させ、0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.1Mリン酸カリウム緩衝液で段階溶出した。0.01M、0.02M及び0.03Mリン酸緩衝液で溶出した活性画分を回収し、濃縮後、緩衝液1に透析した。
緩衝液1で平衡化したDEAE−セルロース(1.7 x 19cm)に透析した酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M塩化カリウムを含む緩衝液1で段階溶出を行った。本酵素は、0.15M塩化カリウムを含む緩衝液1で溶出した。活性画分を濃縮後、緩衝液2に透析した。
緩衝液2で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム(1.7 x 18cm)に酵素を吸着し、緩衝液2で洗浄後、0.01M、0.03M、0.05Mリン酸カリウム緩衝液で溶出した。本酵素は、0.03Mリン酸カリウムで溶出した。活性画分を回収、濃縮後、緩衝液1に対して透析した。
緩衝液1で平衡化したMonoQカラム(0.5 x 5cm)に酵素を吸着し、同緩衝液で洗浄後、0から0.5M塩化カリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、精製酵素とした。
精製酵素をゲル電気泳動に供した結果、Native−ポリアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドいずれの条件においても単一バンドを示した。
精製の要約を表1に示した。
〔表1〕
L-フェニルセリンアルドラーゼの精製
==================================================================
ステップ 総蛋白質 総活性 比活性 収率
(mg) (U) (U/mg) (倍)
==================================================================
無細胞抽出液 38100 25500 0.669 1
40-60%硫安画分 24200 25400 1.05 1.57
DEAE-セルロース(1回目) 8670 21300 2.46 3.67
ハイドロキシアパタイト(1回目) 803 8190 10.2 15.2
DEAE-セルロース(2回目) 98.7 4690 47.5 71.0
ハイドロキシアパタイト(2回目) 29.2 2180 74.7 112
MonoQ 8.8 2730 310 464
==================================================================
〔参考例3〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの分子量
精製酵素を、TSKゲルG3000SWカラム(東ソー製)を用い、10mM TES−NaOH緩衝液(pH7.2)、0.01% 2−メルカプトエタノール及び0.1M塩化カリウムを含む溶離液でゲル濾過を行った結果、分子量は約210,000であった。同緩衝液を用い、セファデックスG−200を用いてゲル濾過を行った結果、分子量は約190,000であった。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニットの分子量を測定した結果、約35,000であった。これらの結果より、本酵素は、同一サブユニットの6量体と予想された。
〔参考例4〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの至適pH
L-フェニルセリンアルドラーゼを、酢酸ナトリウム緩衝液、TES−NaOH緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、TAPS−NaOH緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液を用いて活性測定を行い、DL-スレオ-フェニルセリンに対する分解活性を測定し、図1に示した。
最適pHは、TAPS−NaOH緩衝液(pH8.5)で得られた。
〔参考例5〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの基質特異性
参考例2により精製したL-フェニルセリンアルドラーゼを用い、標準活性測定条件において基質を変えて活性を測定した。
DL-スレオ-β-フェニルセリンに対する活性を100とした相対活性で表し、表2に示した。
〔表2〕
L-フェニルセリンアルドラーゼの基質特異性
==============================================
基質 相対活性
==============================================
DL-スレオ-β-フェニルセリン 100
DL-エリスロ-β-フェニルセリン 130
L-スレオニン 2.1
D-スレオニン 0
L-アロ-スレオニン 8
D-アロ-スレオニン 0
L-セリン 0
D-セリン 0
DL-β-チエニルセリン 170
DL-β-ヒドロキシノルバリン 0
L-フェニル乳酸 0
DL-β-ヒドロキシフェニルエチルアミン 0
==============================================
〔参考例6〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの活性に及ぼすカチオンの影響
標準活性測定条件において、基質DL-スレオ-β-フェニルセリン及びPLPを除く反応液に酵素とカチオンを添加し、30℃、10分間インキュベート後、DL-スレオ-β-フェニルセリン及びPLPを添加して活性を測定した。カチオンを添加しない条件で活性測定した場合の活性値を100とした相対活性で表し、表3に示した。
〔表3〕
L-フェニルセリンアルドラーゼ活性に及ぼすカチオンの影響
===================================
化合物 濃度 相対活性
(mM) (%)
===================================
無添加 - 100
塩化カリウム 50 94
塩化アンモニウム 50 92
塩化ナトリウム 50 88
硫酸アルミニウム 0.1 92
塩化バリウム 0.1 90
塩化マンガン 0.1 92
硫酸銅 0.1 89
硫酸ニッケル 0.1 91
塩化コバルト 0.1 98
塩化マグネシウム 0.1 98
硫酸鉄(II) 0.1 91
塩化亜鉛 0.1 92
===================================
〔実施例1〕 シュードモナス プチダからの染色体DNAの精製
シュードモナス・プチダ・バイオバーA 24−1株を1.5%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウムを含む培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)に記載の方法により行った。
〔実施例2〕 L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のコア配列のクローニング
参考例2で得られた精製酵素をトリプシン消化して得られたペプチドのアミノ酸配列(配列番号:3及び4)を元に、プライマー12及びPrimerCを合成した。
配列番号:3
Gln-Ala-Gly-Pro-Tyr-Gly-Thr-Asp-Glu-Leu
配列番号:4
Phe-Gly-Phe-Tyr-His-Asp-Arg-Trp
配列番号:5 プライマー12
GGGAATTCAGGCGGGCCCGTATGGCACCGACCGACGA
配列番号:6 プライマーC
AAGCCGAAGATAGTGCTGGGCGACCCCTAGGGG
各50 pmolのプライマーセット、10 nmolのdNTP、50 ngの染色体DNA、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、3 mMのMgCl2、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、1分)、アニ−ル(50℃、2分)、伸張(65℃、3分)を30サイクル、DNA Thermal Cycler(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行った。
増幅したDNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行い、DNAシーケンサーABI PRISMTM 310(パーキンエルマー社製)により行った。得られた配列を配列番号:7に示した。
〔実施例3〕 L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子の全領域のクローニング
コア配列の塩基配列を元に、プローブU2及びプローブCの3つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらの合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
配列番号8: プローブU2
TGATGACCGTCGACGGCCCG
配列番号9: プローブC
CGGCCTTCAGCAGCGCATCGA
すなわち、制限酵素SphIで消化した染色体DNAを泳動したアガロースゲルをナイロンメンブレンフィルター(デュポン社製)ブロッティングした。ブロッティングしたメンブレンを2×SSC溶液で洗浄後、0.4 M NaOHで1分間アルカリ処理し固定した。続いて0.2 M トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)-2×SSC溶液で中和処理後、風乾した。このメンブレンをハイブリダイゼーション液(0.1% 牛血清アルブミン、0.1% フィコール、0.1% ポリビニルピロリドン、0.75 mM NaCl、75 mM クエン酸ナトリウム、1% SDS)に浸し、45〜55℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った。次に、250 μgの熱変性サケ精子DNAと32Pでラベルしたプローブを加えたハイブリダイゼーション液で更に45〜55℃で一晩ハイブリダイゼーション処理した。ハイブリダイズしたメンブレンを6×SSC-0.5% SDS溶液で洗浄した。続いて同溶液で55℃、2分間洗浄し、2×SSC溶液で軽くすすいだ後、風乾し、オートラジオグラフィーを行った。
その結果、染色体DNAをSphIで消化して得られた約6.7 kbのDNA断片が、どちらのプローブとも強くハイブリダイズすることが確認されたため、該DNA断片部分をゲルから切り出し、同制限酵素SphIで消化したpUC19とTaKaRa DNA Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いて、ライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、約700個のクローン株を得た。
得られた約700個のクローン株について、合成DNAプローブU2用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、放射活性が強い41個のコロニーを選択した。これらのクローン株から目的とする約6.7 kbの挿入DNA断片を含むプラスミドを選択し、pPSA2とした。
pPSA2の挿入DNA断片の塩基配列を解析した結果、コア配列を含む1074 bpのオープンリーディングフレーム(ORF)を確認できた。得られた塩基配列及びこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号:1及び2に示した。
〔実施例4〕 L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子高発現プラスミドpKK-PSA1の構築
該L-フェニルセリンアルドラーゼの高発現株を構築した。まず、pPSA2の挿入DNA断片の塩基配列をもとに、該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のORFの上流部位及び下流部位に対応するそれぞれのオリゴヌクレオチドPrimer PSA-ECO及びPrimer PSA-HINを合成した。
配列番号:10 プライマー PSA−ECO
GGGAATTCGACCATCAGGCGAGCGTCAA
配列番号:11 プライマー PSA−HIN
GGAAGCTTCCAGAGCGAGCACAGCCGCCAC
プラスミドpPSA2を鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、DNA Thermal Cycler(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpKK223-3にライゲーションしてpKK-PSA1を得た。該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKK-PSA1は次のとおりFERM P-20054として寄託された。以下に、寄託物を特定するための情報を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号中央第6(郵便番号305-8566)
(b)寄託日:平成16年4月13日
(c)受託番号:FERM P-20054
〔実施例5〕 L-フェニルセリンアルドラーゼの活性確認
実施例4で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を、アンピシリン(50 mg/L)を含む液体LB培地(バクト−トリプトン10/L、バクト−酵母エキス5g/L、塩化ナトリウム10g/L、pH7.2)に植菌し、30℃で終夜培養した後、アンピシリン(50 mg/L)を含む2×YT培地(バクト−トリプトン20g/L、バクト−酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム10g/L、pH7.2)に植菌し、30℃で培養した後、0.1 mM IPTGにより誘導を4時間行い、遠心分離により集菌体を得た。集菌後、0.02% 2-メルカプトエタノール、2 mM EDTA、20 μM ピリドキサール-5'-リン酸を含む100 mM TES−NaOH緩衝液(pH7.2)に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM(コスモバイオ製)を用いて3分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を無細胞抽出液としてL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を測定した結果、20.0U/mgの比活性を有することが確認できた。
〔実施例6〕 該L-フェニルセリンアルドラーゼのDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸に対する活性
実施例5で得られた無細胞抽出液を用いて、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸に対する活性を測定した結果、6.26U/mgの活性を有し、DL-スレオ-フェニルセリンに対する活性を100%として31.3%の相対活性を有することを見出した。
〔実施例7〕 大腸菌JM109 (pKK-PSA1)を用いたD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成
実施例6により得られたプラスミドpKK-PSA1を有する大腸菌JM109株を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
400 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)、50 μM ピリドキサール-5’-リン酸、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸および菌体を含む10 mLの反応液を、攪拌下、30℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の定量、及び光学純度を次のようにして分析した。
反応終了液を1 N HClで希釈し、遠心分離上清をCROWNPAK CR(+)(0.46 x 15cm、ダイセル化学工業株式会社製)を用いて分析した。D-エリスロ体は24.2分に、L-エリスロ体は28.0分に溶出した。
結果を表4に示した。DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の濃度を1%、5%、10%、15%とした何れの場合においても、不要な異性体の分解は完全に進行し、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸が99%e.e.以上の光学純度で得られることが確認できた。
〔表4〕
=========================================================
基質 D-エリスロ体
DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル- 光学純度
3-ヒドロキシプロピオン酸
=========================================================
1% 99%e.e
5% 99%e.e
10% 99%e.e
15% 99%e.e
=========================================================
〔実施例8〕 D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の精製−1
実施例7において基質15%で反応した反応終了液に硫酸を添加し、反応終了液のpHを0.5まで低下させることにより反応液中に残存するD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させた。遠心分離により菌体等の不要物を分離し、得られた上清に水酸化ナトリウムを添加して約pH6に中和することにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を結晶化させ、濾過により結晶を得た。結晶の純度は約96%、光学純度は>99%eeであった。
〔実施例9〕 D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の精製−2
実施例7において基質15%で反応した反応終了液に水酸化ナトリウムを添加し、反応終了液のpHを12まで上げることにより反応液中に残存するD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させた。遠心分離により菌体等の不要物を分離し、得られた上清に硫酸を添加して約pH6に中和することにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を結晶化させ、濾過により結晶を得た。結晶の光学純度は>99%eeであった。
〔参考例7〕 3−シクロヘキシル−2−プロペン酸の製造方法
マロン酸23.9gにトルエン58.1g加え、65℃まで昇温し、ピリジン27.1g、ピペリジン0.54gを滴下した。さらにシクロヘキシルアルデヒド30.0gを滴下後、10時間反応させた。反応終了後冷却し、3M水酸化ナトリウム水溶液93.3gを加え攪拌後、上層のトルエン相を除去した。下層にt-ブチルメチルエーテル55.5g、濃塩酸55.8gを加え、攪拌後下層を除去した。上層のt-ブチルメチルエーテル相に水24.8g及び濃塩酸0.29gを加え、攪拌後下層を除去した。上層のt-ブチルメチルエーテル相を減圧濃縮し、3−シクロヘキシル−2−プロペン酸33.0gを得た。
〔参考例8〕 3−シクロヘキシル−2,3−エポキシプロピオン酸の製造
タングステン酸ナトリウム2水和物4.3gに水64.4gを加え溶解させ、40℃に加温した。これに3−シクロヘキシル−2−プロペン酸20g及びメタノール15.8gを加え、さらに30%過酸化水素水29.4gを滴下した。25%水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のpHを4.5〜5.0の範囲にコントロールしながら40℃にて20時間反応させた。反応終了後10℃以下まで冷却し、35%重亜硫酸ナトリウム及び25%水酸化ナトリウム水溶液をpH4.0〜6.0に保ちながら滴下し、過酸化水素を分解した。減圧条件下にてメタノールを留去した後、濃塩酸を用いてpHを2.0〜3.0に調整した。t−ブチルメチルエーテル676gを加え30分以上攪拌した後、30分以上静置した。下層を分液した後、上層をろ過した。このろ液を減圧下で濃縮することで淡黄色油状の3−シクロヘキシル−2,3−エポキシプロピオン酸16.2gを得た。
〔参考例9〕 2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造
3−シクロヘキシル−2,3−エポキシプロピオン酸10.0gに水21.0g及び25%水酸化ナトリウム水溶液9.4gを加え溶解させ、40−55℃に昇温した。ベンジルアミン18.9gを滴下し、90℃で10時間反応させた。反応後30℃以下まで冷却した後、濃塩酸17.1g、水61.1g、t−ブチルメチルエーテル9.9gの混合液に反応液を滴下した。滴化後25%水酸化ナトリウム水溶液にてpHを3.5に調整し、30分攪拌した。析出した結晶をろ過し、結晶をアセトン、水で洗浄し、50℃で減圧下乾燥することで2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸13.9gを得た。
〔参考例10〕 2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法
2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸13.0gにメタノール62.8g、水39.4g、25%水酸化ナトリウム水溶液7.5g及び触媒として50%含水水酸化パラジウム(活性炭担持物)0.7gを加え、水素ガスで500KPaまで加圧し、50℃で4時間反応を行った。反応後12%水酸化ナトリウム水溶液7.7gを加えて30分攪拌後、濾過することで触媒を除去した。ろ液を減圧濃縮し、メタノール、トルエンを除去し、濃塩酸にてpHを5.8に調整した。析出した結晶を濾過し、水で洗浄後、減圧下乾燥することで2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸7.9gを得た。
本発明によって製造されるD-β-ヒドロキシアミノ酸は、医薬品あるいは農薬などの合成中間体として有用である。より具体的には、本発明によって、たとえば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を、工業的な規模で効率的に合成することができる。

Claims (9)

  1. 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるL−フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する蛋白質を高発現する形質転換株および/またはその処理物を、式1(式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す)
    Figure 0004636590

    で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式2で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
    (a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド;
    (b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
    (c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
    (d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
    (e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
  2. 請求項1におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、請求項1に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
  3. 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるL−フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する蛋白質を高発現する形質転換株および/またはその処理物を、式3(式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す)
    Figure 0004636590


    で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式4で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
    (a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド;
    (b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
    (c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド;
    (d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
    (e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
  4. 請求項3におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、請求項3に記載のD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
  5. 請求項1または請求項3に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度が30g/L以上であることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
  6. 請求項1または請求項3に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の濃度が50g/L以上である事を特徴とする、請求項1または請求項3に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
  7. 請求項1または請求項3に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度が50g/L以上であることを特徴とする方法。
  8. 請求項2または請求項4に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
    (1)反応終了後に反応液のpHを10以上にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
    (2)不溶物を分離する工程、および
    (3)反応液のpHを2−9.5に調整することによって析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
  9. 請求項2または請求項4に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
    (1)反応終了後に反応液のpHを1.5以下にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
    (2)不溶物を分離する工程、および
    (3)pHを2−9.5に調整することにより析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
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