JP3370356B2 - Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】ラセミ−エリスロ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸
を特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解
する能力を有する酵素、同酵素を産生する微生物あるい
はその菌体処理物でもって処理することにより、医薬
や、医薬・農薬等の中間体として有用なことが知られて
いるＤ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】従来、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸の合成は、以下の方法により行われていた。即
ち、必要に応じて保護基を導入したアルデヒド誘導体と
グリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラ
セミ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導
体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行
う。得られたラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸誘導体の保護基を除去し、アミノ基部分に置換基を導
入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光
学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する
というものである。 【０００３】 【発明が解決しようとする問題点】アルデヒド誘導体と
グリシンを縮合してβ−ヒドロキシアミノ酸を合成する
と、反応の立体選択性が低いために、スレオ／エリス
ロ，Ｄ／Ｌの組合せで４種類の異性体が不可避的に生成
する。Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成に
当たっては、これらの異性体を分離するための繁雑な工
程を必要とし、工業的製造法を開発する上で大きな問題
となっていた。特に、従来のＤ／Ｌ体の光学分割法は、
使用する光学分割剤が高価であるだけでなく、工程及び
その制御が複雑で収率も低いという問題があった。さら
に、これらの操作で得られる不要の異性体を再度利用す
るためには、別途ラセミ化したり、分解したりする必要
があり、工程をさらに複雑にする原因となっていた。 【０００４】 【問題点を解決するための手段】本発明者らは、Ｄ−エ
リスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成方法に関し鋭意
検討を行った結果、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ
が、意外にもＬ−アロスレオニンのみでなく種々のβ−
ヒドロキシアミノ酸のＬ−エリスロ体に広く作用し、グ
リシンと対応するアルデヒド化合物に分解することを見
出し、本発明を完成した。これにより、ラセミ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸からの効率的なＤ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造が可能になるのみな
らず、分解物は、原料として再度ラセミ体の合成に利用
できる。さらに、遺伝子操作によってＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼの生産性を大幅に向上せしめた組換え体
を用いると、目的とするＤ−エリスロ−β−ヒドロキシ
アミノ酸を分解する酵素が菌体中に含まれる場合でも、
それらの酵素を除去することなく反応に用いることが出
来る。また、このような組換え体を用いると、Ｌ−エリ
スロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の
低いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を
行うことが出来るため、広範囲のＤ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。本発明は、一般
式（Ｉ） 【０００５】 【化２】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｌ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解する酵素である、アルカリゲネス
属、シュードモナス属、アリスロバクター属、キサント
モナス属、バチルス属、エシェリヒア属に属する微生
物、あるいは、これらの微生物より得られたＬ−アロス
レオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめてなる組換え体Ｄ
ＮＡを保有せしめた形質転換体よりなる群より選ばれた
少なくとも１種の微生物が産生するＬ−アロスレオニン
アルドラーゼ、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＤ−エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸の製造法に関する。 【０００６】本発明で用いられる原料ラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸は、上記式（Ｉ）におけるＲ
が、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基又
は複素環式基を表す。具体的には、アルキル基、アルケ
ニル基、アルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化
水素基又は複素環式炭化水素基より選ばれた置換基であ
る化合物であり、置換基に含まれる水素のうち１個又は
複数個が同一又は相異なるアルキル基、アルケニル基、
アルキニル基、アルコキシル基、アルキレン基、脂環式
炭化水素基、芳香族炭化水素基、ヒドロキシル基、ニト
ロ基、又はハロゲン基で置換されていてもよい。置換基
の炭素数が直鎖脂肪族基の場合は好ましくは２０以下、
特に好ましくは１０以下であり、その他の置換基の場合
は好ましくは３０以下、特に好ましくは２０以下である
化合物を用いると良好な結果を得ることができる。 【０００７】本発明においては、Ｄ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸以外の異性体、すなわち、Ｌ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応
するアルデヒドに分解することから、こうして得られた
グリシンと対応するアルデヒドはそれを再度合成に使用
できる。本発明においては、上記酵素又はその同等物
は、スレオ体の存在下で反応せしめ、反応後にスレオ／
エリスロ分離を行い、Ｄ−エリスロ体を得ることも可能
である。 【０００８】本発明においては、前記したように、Ｌ−
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素を用
いることがあげられるが、このような酵素としては、Ｌ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的に分解す
るものであれば、いずれも使用できる。このような酵素
として特に好ましいものとしては、Ｌ−エリスロ−β−
ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアル
デヒドに分解する能力を有するものがあげられる。さら
にまた一般式（Ｉ）に示すような広範囲のβ−ヒドロキ
シアミノ酸に作用するものがあげられる。このような酵
素として特に好ましいものは、Ｌ−アロスレオニンアル
ドラーゼがあげられる。Ｌ−アロスレオニンアルドラー
ゼとしては、特公昭６３−５４３５９号に記載されたも
のの他、その遺伝子を操作して得られたものなどをあげ
ることができる。これらＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−
エリスロ体に特異的に作用しこれをグリシンと対応する
アルデヒドに分解せしめるという優れた特性を有してい
る。 【０００９】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌
あるいはその変異株などから得ることが出来る。Ｌ−ア
ロスレオニンアルドラーゼ生産菌としては、例えば、バ
チルス(Bacillus)ＤＫ−３９（微工研菌寄６２０２
号）、アルカリゲネス・ハエカリス(Alcaligenes faeca
lis)ＩＦＯ１２６６９、シュードモナス(Pseudomonas)
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、アリスロバクター
(Arthrobacter)ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）、
キサントモナス・オリゼー(Xanthomonas oryzae)ＩＡＭ
１６５７などが知られている。これらのＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼ生産菌から得られたＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ
を、遺伝子組換えの手法を用いて導入して作成された組
換え体は、より好適に本発明に用いることが出来る。こ
のような組換え体の作成は、特開平３−１３９２８３号
記載のＤ−スレオニンアルドラーゼ高生産株の作成と同
様の方法で行うことが出来る。すなわち、Ｌ−アロスレ
オニンアルドラーゼ生産菌から染色体ＤＮＡを抽出し、
制限酵素でＤＮＡを部分分解し、精製後、適当なベクタ
ーＤＮＡに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細
胞に移入し、遺伝子ライブラリーを作成する。そこか
ら、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する
遺伝子を保有する株を、培養細胞のＬ−アロスレオニン
アルドラーゼ活性を調べることにより選択し、その細胞
株から組換えＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素でベクタ
ーＤＮＡから目的のＤＮＡを切り出す。得られたＤＮＡ
断片の解析を行い、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの
合成に不必要な部分を欠失させ、小型化し、再度適当な
ベクターＤＮＡに組み込み、宿主細胞に導入することに
より、目的の株を得ることが出来る。このような遺伝子
を導入して利用しうる微生物としては、例えばエシェリ
ヒア(Escherichia) 属細菌、バチルス(Bacillus)属細
菌、キサントモナス(Xanthomonas) 属細菌、アセトバク
ター(Acetobacter) 属細菌、シュードモナス(Pseudomon
as) 属細菌、グルコノバクター(Gluconobacter) 属細
菌、アゾトバクター(Azotobacter) 属細菌、リゾビウム
(Rhizobium) 属細菌、アルカリゲネス(Alcaligenes) 属
細菌、クレブシェラ(Klebsiella)属細菌、サルモネラ(S
almonella)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌などの原
核微生物や酵母などの下等真核生物などを用いることが
できる。 【００１０】このような組換え体のうち、特にＬ−アロ
スレオニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有して
いる組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属
するものがあげられる。キサントモナス・オリゼー(Xan
thomonas oryzae)ＩＡＭ１６５７の染色体ＤＮＡから単
離したＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与す
る遺伝子を担うＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２８を連結
した組換えプラスミドｐＬＡ５５６を、キサントモナス
・シトリー(Xanthomonas citri) ＩＦＯ３３１１に導入
して得られた形質転換体キサントモナス・シトリーＩＦ
Ｏ３３１１（ｐＬＡ５５６）は、Ｌ−アロスレオニンア
ルドラーゼを高度に生産する能力を有しており特に好適
なものである。 【００１１】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することができる。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあげられ、窒
素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イーストエキ
ス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カスなどがあ
げられる。また、塩化ナトリウム、カリウム塩、カルシ
ウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、亜鉛、マグ
ネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用できる。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下でｐＨ４から１０、温度２０から５０℃の任意の
範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。組換え
体を用いる場合、使用する菌株に応じて、アンピシリ
ン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加
してもよい。 【００１２】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できるが、
使用する酵素液あるいは菌体に目的とするＤ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を分解するような活性が含ま
れている場合には、効率的な合成を行うために、その活
性を除去してから反応に用いるのが好ましい。これらの
分解活性を除去する方法としては、酵素液のアセトン分
画・カラムクロマト分画などによる方法が好ましいが、
それに限定されることなく、分解活性を選択的に除去出
来る方法であればいずれも用いることが出来る。また、
遺伝子操作によってＬ−アロスレオニンアルドラーゼの
生産性を大幅に向上せしめた組換え体であれば、これら
の分解活性を除去することなく反応に用いることができ
る。 【００１３】酵素反応を実施する方法は、水性媒体中に
て基質であるラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸を、上に記した微生物の培養液、菌体、菌体処理物、
酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化したものと
接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体としては、
例えば、水、緩衝液、含水有機溶媒等が使用できる。反
応における酵素、微生物菌体あるいは菌体処理物等の濃
度は、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を完全に
分解できるならば特に制限はないが、Ｌ−アロスレオニ
ンアルドラーゼ活性（１ＵはＬ−アロスレオニンから１
分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵
素量を表わす）が、０．１Ｕ／ｍｌ以上であることが望
ましい。特に、１Ｕ／ｍｌ以上であれば反応を速やかに
終了させることが出来る。 【００１４】基質であるラセミ−エリスロ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の濃度は、反応を著しく阻害しない程度で
あればよく１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、基質の供
給は、一括、連続、分割の何れの手段でも実施できる。
反応温度は、１０から５５℃がよく、２０から４０℃が
より好適である。反応時のｐＨは５から１０、好ましく
は６から８である。ピリドキサール−５’−リン酸を反
応系に１０ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１μｍＭ〜１０
０μＭの濃度で添加することにより好ましい結果が得ら
れる。反応形式はバッチ方式、連続方式の何れでもよい
が、かくして、反応は０．５から５０時間程度で終了す
る。反応終了後、反応液は遠心分離や限外濾過等により
除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出等により生成ア
ルデヒドを分離する。抽出には、アルデヒドの溶解性が
高く、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸及びグリ
シンがほとんど不溶である溶媒であれば使用することが
できるが、エーテルを使用すると良好な結果が得られ
る。 【００１５】溶媒相からは減圧濃縮等によりアルデヒド
を回収することが出来る。水相からのＤ−エリスロ−β
−ヒドロキシアミノ酸とグリシンの単離回収は、通常の
イオン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行うこと
が出来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充填し
たカラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により溶出
を行う。 【００１６】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、本発明においてはそれに限定されるこ
となく各種の分離精製法が適用できる。このような方法
の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール
系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶
媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチル
エチルケトン等のケトン溶媒、ジメチルスルホキシド等
のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
等のアミド溶媒、アセトニトリルなどのニトリル系溶
媒、エチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン
等のエーテル系溶媒、メチレンクロライド等のハロゲン
化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶媒あるいはそれらの
水性溶媒などを用いた溶媒抽出などの分離法、カラムク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー、再結晶化法などの方法をあげるこ
とができる。 【００１７】本発明の方法によると、 （１）Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼは、広い範囲の
Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用してこれ
を分解することができるので、様々なラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸からのＤ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。 （２）Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸は合成原
料であるグリシンとアルデヒドに分解されるため、それ
らは反応液から回収して再度ラセミ−スレオ／エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸合成にリサイクル使用するこ
とが出来る。 （３）従って、ラセミ化の必要はなく、目的物が高収率
で得られるので、工程が複雑で高価な光学分割剤を用い
る必要がある従来の光学分割法に比べ、大幅に工程を単
純化出来る。 （４）遺伝子組換えによりＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼの生産性が大幅に向上した菌株を用いれば、目的と
するＤ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する
酵素が菌体中に含まれる場合でもそれらの酵素を除去す
ることなく反応に用いることが出来、また、Ｌ−エリス
ロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の低
いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を行
うことが出来るため、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸類の製造に幅広く利用することができる。 【００１８】 【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。 実施例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にバチルスＤＫ−３
９（微工研菌寄６２０２号）を接種し、ｐＨ７．５に保
ちながら３０℃で２０時間通気及び撹拌をしつつ培養し
た。培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌、水
洗後、０．０１ｍＭピリドキサ−ル−５’−リン酸を含
むｐＨ７．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyeth
ylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)緩衝液５００
ｍｌに懸濁し、この菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間の
超音波破砕処理を４回行い、破砕液の懸濁物質を遠心分
離で除去して粗酵素液を調製した。次に、この粗酵素液
を陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ
Ａ−５００（生化学工業（株）製）を充填したカラム
（２．６ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、上記緩衝液で洗
浄後、塩化ナトリウム直線グラジェントにより溶出・分
画し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を有する画
分（粗精製酵素液）１００ｍｌを得た。得られた粗精製
酵素液のＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（１Ｕは
Ｌ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシ
ンを生成するのに必要な酵素量を表わす）測定したとこ
ろ、０．２６Ｕ／ｍｌであった。得られた粗精製酵素液
にＤ，Ｌ−エリスロ−フェニルセリン（Ｄ体とＬ体の等
量混合物）１００ｍｇを加え、３０℃で１０時間反応さ
せた。反応終了後、反応液のフェニルセリン異性体及び
グリシンを、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ
−システィンにより誘導体化し、ＯＤＳカラムを用いて
ＨＰＬＣにより定量した。また、ベンズアルデヒドは、
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤ
Ｓカラムを用いてＨＰＬＣにより定量した。 Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ２．７０ｍＭ（残存
率９７．８％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ２．７６ｍＭ ベンズアルデヒド ： ２．６９ｍＭ 反応液に１Ｎ塩酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶
物を除去した。この遠心上清に２００ｍｌのエチルエー
テルを加え、撹拌・静置し、エーテル相を分離、減圧乾
固を行い、２７ｍｇのベンズアルデヒドを得た。水相
を、強酸性陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を
充填したカラム（１０ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、脱
イオン水による十分な洗浄後、０．５Ｎのアンモニア水
で吸着物質を溶出させ、フェニルセリン画分とグリシン
画分に分けて採取した。両画分を減圧乾固したところ、
それぞれ４７ｍｇ、１９ｍｇの結晶を得た。フェニルセ
リン画分より得られた結晶の異性体分析（ｏ−フタルア
ルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンによる誘導体
化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬＣ分析）を行ったところ、
残存フェニルセリンは全てＤ−エリスロ体であった。 【００１９】実施例２ 実施例１と同様の方法で、アリスロバクターＤＫ−１９
（微工研菌寄６２０１号）、シュードモナスＤＫ−２
（微工研菌寄６２００号）、アルカリゲネス・ハエカリ
スＩＦＯ１２６６９及びキサントモナス・オリゼーＩＡ
Ｍ１６５７をそれぞれ培養し、その粗精製酵素液を調製
した。得られた粗精製酵素液を用い、実施例１と同様に
反応を行った。反応液の異性体分析により求めた各異性
体の残存率を表１に示す。 【００２０】 【表１】 【００２１】実施例３ キサントモナス・オリゼーからＬ−アロスレオニンアル
ドラーゼ合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡを単離し、
キサントモナス・シトリーに導入して、Ｌ−アロスレオ
ニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有する組換え
体を作製した例を以下に示す。 （１）染色体ＤＮＡの調製及び組換え体ＤＮＡの作成 常法に従い、キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７
の染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡ１２
０μｇをＢａｍＨＩ１４単位／１．２ｍｌ、３７℃、２
時間の条件で部分消化した。反応後、超遠心機を用いた
蔗糖密度勾配により分子量分画し、５〜１０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を含む画分を組換えＤＮＡの作成に供した。プラ
スミドＤＮＡｐＢＲ３２２ １μｇを、ＢａｍＨＩ１２
単位／１４μｌ、３７℃、１８時間の条件で消化した。
アルカリフォスファターゼ処理を行った後、先に作成し
た染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ部分消化物と混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加えラリゲーション反応を行った。得
られた反応混合物を形質転換に供した。 【００２２】（２）形質転換及び遺伝子ライブラリーの
作成 得られた組換え体ＤＮＡを、常法に従い、大腸菌Ｃ６０
０株のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換し、ア
ンピシリン耐性でテトラサイクリン耐性を喪失したコロ
ニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地にピックアップし、５０００クローンからなる遺
伝子ライブラリーを構築した。 【００２３】（３）Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ遺
伝子のクローニング及び小型化 遺伝子ライブラリーに保存した形質転換体を、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地で
３７℃、一晩培養し、集菌、凍結乾燥した。５０ｍＭの
Ｌ−アロスレオニンを含む反応液（０．０１ｍＭＰＬ
Ｐ、０．２Ｍトリス；ｐＨ７．０）を１ｍｌ添加し、均
一に懸濁して１８時間、３０℃で反応させた。反応液の
アミノ酸分析をＴＬＣを用いて行い、グリシン合成活性
が増強されたクローンをＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼ遺伝子を持つ形質転換体として選択した。Ｌ−アロス
レオニンアルドラーゼ活性を獲得した形質転換体からプ
ラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで切断後、アガロース・
ゲル電気泳動で分析し、プラスミドに約１０ｋｂの挿入
断片があることを確認した。種々の欠失解析によって、
Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産に係わる遺伝子が
約５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片に含まれているこ
とが明らかになり、この断片を持つ組換えプラスミドｐ
ＬＡ２２０を作成した。このプラスミドの詳細な解析か
ら、約３ｋｂのＢｇｌII／ＸｈｏＩ断片にＬ−アロスレ
オニンアルドラーゼ生産に係わる遺伝子がコードされて
いた。４μｇのプラスミドｐＬＡ２２０を２４単位のＢ
ｇｌII、ついでＸｈｏＩで完全消化し、アガロース・ゲ
ル電気泳動で分離し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ
生産に係わる遺伝子を含む約３ｋｂの目的のＢｇｌII／
ＸｈｏＩ断片を含むゲルを切り出し、常法に従い、ゲル
内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。プラスミドＤＮ
Ａ ｐＢＲ３２８ １μｇを１２単位のＢａｍＨＩ、次
いでＳａｌＩで順次切断し、フォスファターゼで処理を
した後、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産に係わる
遺伝子断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。
この組換えプラスミドをｐＬＡ５５６と命名し、常法に
従い、大腸菌Ｃ６００株のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌ
ｌに形質転換し、アンピシリンに耐性でテトラサイクリ
ン耐性を喪失したクローンを１株選択し、そのクローン
がＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を獲得している
ことを確認した。 【００２４】（４）キサントモナス属細菌の形質転換 宿主菌、キサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１を５
０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分培養
した。集菌後、直ちに１０ｍｌのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ調
製用緩衝液（５０ｍＭＣａＣｌ2 、１０ｍＭＲｂＣ
ｌ2 、０．１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６．５）に懸濁し、氷
中３０分間静置した。遠心によって上澄みを除去後２．
５ｍｌの同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以上静
置した。１μｇのｐＬＡ５５６を含む微量遠心チューブ
に１００μｌの形質転換用緩衝液（１０％ポリエチレン
グリコール（分子量１０００）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ７．２）、２００μｌのＣｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ ｃｅｌｌを採取し、混合後氷中に３０分間静
置した。３７℃の水浴で２分間加温した後、０．８ｍｌ
のＬＢ培地を添加し、３７℃で１時間培養した。５０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に
０．１ｍｌずつ培養液を塗布し、一昼夜３７℃で培養し
た。得られたクロラムフェニコール耐性株が目的のプラ
スミドを保持し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性
を有していることを確認し、この形質転換体をキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５６）と名
付けた。 【００２５】実施例４ 実施例３で得られた組換え体を、培地にクロラムフェニ
コールを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した以外は実施例
１と同様の方法で培養し、凍結乾燥菌体を得た。菌体重
量当りのＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定
し、遺伝子供与菌、宿主菌、ベクタープラスミドのみを
導入した菌株の活性と比較した結果を表２に示す。 【００２６】 【表２】【００２７】実施例５ キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５
６）を、培地にクロラムフェニコールを５０μｇ／ｍｌ
の濃度で添加して培養し、得られた培養液の６０分の１
量を破砕・粗精製せずにそのまま洗浄・凍結乾燥して１
００ｍｌの懸濁液（０．２０Ｕ／ｍｌ）として反応に用
いる以外は、全て実施例１と同様の方法で行った。反応
終了後、反応液中のフェニルセリン異性体、グリシン、
ベンズアルデヒドを前出の方法で定量し、次の値を得
た。 Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ２．７３ｍＭ（残存
率９８．９％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ２．７５ｍＭ ベンズアルデヒド ： ２．６０ｍＭ 各成分を反応液より分画・精製したところ、ベンズアル
デヒド２５ｍｇ、フェニルセリンの結晶４５ｍｇ、グリ
シンの結晶１８ｍｇを得た。フェニルセリン画分より得
た結晶の異性体分析を行ったところ、残存フェニルセリ
ンは全てＤ−エリスロ体であった。 【００２８】実施例６ 一般式（Ｉ）におけるＲがそれぞれ、エチル基、オクチ
ル基、アリル基、シクロヘキシル基、５−ヒドロキシ−
２−ニトロフェニル基及びイミダゾリル基であるβ−ヒ
ドロキシアミノ酸のＤ，Ｌ−エリスロ体の等量混合物を
基質に用い、実施例１ないし２で得た粗精製酵素液又は
実施例３で得た菌体懸濁液を実施例１と同様の方法で反
応させた。反応液の異性体分析により求めた各異性体の
残存率を表３、表４に示す。 【００２９】 【表３】【表４】【００３０】 【発明の効果】本発明によれば、光学分割のための置換
基の導入や除去が不要であり、高価な光学分割剤を用い
る必要もなく、生成するグリシンとアルデヒド誘導体を
原料合成にリサイクル使用することが可能で、繁雑なラ
セミ化を行う必要がないため、従来の方法に比べて極め
て有利な方法である。特に遺伝子組換えによりＬ−アロ
スレオニンアルドラーゼの生産性が大幅に向上した菌体
を用いることにより、さらに広範囲のラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸から、Ｄ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸を簡単かつ経済的に製造することが出
来るので工業的製造法として適している。
シアミノ酸を、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸
を特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解
する能力を有する酵素、同酵素を産生する微生物あるい
はその菌体処理物でもって処理することにより、医薬
や、医薬・農薬等の中間体として有用なことが知られて
いるＤ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】従来、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸の合成は、以下の方法により行われていた。即
ち、必要に応じて保護基を導入したアルデヒド誘導体と
グリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラ
セミ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導
体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行
う。得られたラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸誘導体の保護基を除去し、アミノ基部分に置換基を導
入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光
学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する
というものである。 【０００３】 【発明が解決しようとする問題点】アルデヒド誘導体と
グリシンを縮合してβ−ヒドロキシアミノ酸を合成する
と、反応の立体選択性が低いために、スレオ／エリス
ロ，Ｄ／Ｌの組合せで４種類の異性体が不可避的に生成
する。Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成に
当たっては、これらの異性体を分離するための繁雑な工
程を必要とし、工業的製造法を開発する上で大きな問題
となっていた。特に、従来のＤ／Ｌ体の光学分割法は、
使用する光学分割剤が高価であるだけでなく、工程及び
その制御が複雑で収率も低いという問題があった。さら
に、これらの操作で得られる不要の異性体を再度利用す
るためには、別途ラセミ化したり、分解したりする必要
があり、工程をさらに複雑にする原因となっていた。 【０００４】 【問題点を解決するための手段】本発明者らは、Ｄ−エ
リスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成方法に関し鋭意
検討を行った結果、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ
が、意外にもＬ−アロスレオニンのみでなく種々のβ−
ヒドロキシアミノ酸のＬ−エリスロ体に広く作用し、グ
リシンと対応するアルデヒド化合物に分解することを見
出し、本発明を完成した。これにより、ラセミ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸からの効率的なＤ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造が可能になるのみな
らず、分解物は、原料として再度ラセミ体の合成に利用
できる。さらに、遺伝子操作によってＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼの生産性を大幅に向上せしめた組換え体
を用いると、目的とするＤ−エリスロ−β−ヒドロキシ
アミノ酸を分解する酵素が菌体中に含まれる場合でも、
それらの酵素を除去することなく反応に用いることが出
来る。また、このような組換え体を用いると、Ｌ−エリ
スロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の
低いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を
行うことが出来るため、広範囲のＤ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。本発明は、一般
式（Ｉ） 【０００５】 【化２】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｌ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解する酵素である、アルカリゲネス
属、シュードモナス属、アリスロバクター属、キサント
モナス属、バチルス属、エシェリヒア属に属する微生
物、あるいは、これらの微生物より得られたＬ−アロス
レオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめてなる組換え体Ｄ
ＮＡを保有せしめた形質転換体よりなる群より選ばれた
少なくとも１種の微生物が産生するＬ−アロスレオニン
アルドラーゼ、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＤ−エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸の製造法に関する。 【０００６】本発明で用いられる原料ラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸は、上記式（Ｉ）におけるＲ
が、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基又
は複素環式基を表す。具体的には、アルキル基、アルケ
ニル基、アルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化
水素基又は複素環式炭化水素基より選ばれた置換基であ
る化合物であり、置換基に含まれる水素のうち１個又は
複数個が同一又は相異なるアルキル基、アルケニル基、
アルキニル基、アルコキシル基、アルキレン基、脂環式
炭化水素基、芳香族炭化水素基、ヒドロキシル基、ニト
ロ基、又はハロゲン基で置換されていてもよい。置換基
の炭素数が直鎖脂肪族基の場合は好ましくは２０以下、
特に好ましくは１０以下であり、その他の置換基の場合
は好ましくは３０以下、特に好ましくは２０以下である
化合物を用いると良好な結果を得ることができる。 【０００７】本発明においては、Ｄ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸以外の異性体、すなわち、Ｌ−エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応
するアルデヒドに分解することから、こうして得られた
グリシンと対応するアルデヒドはそれを再度合成に使用
できる。本発明においては、上記酵素又はその同等物
は、スレオ体の存在下で反応せしめ、反応後にスレオ／
エリスロ分離を行い、Ｄ−エリスロ体を得ることも可能
である。 【０００８】本発明においては、前記したように、Ｌ−
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素を用
いることがあげられるが、このような酵素としては、Ｌ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的に分解す
るものであれば、いずれも使用できる。このような酵素
として特に好ましいものとしては、Ｌ−エリスロ−β−
ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアル
デヒドに分解する能力を有するものがあげられる。さら
にまた一般式（Ｉ）に示すような広範囲のβ−ヒドロキ
シアミノ酸に作用するものがあげられる。このような酵
素として特に好ましいものは、Ｌ−アロスレオニンアル
ドラーゼがあげられる。Ｌ−アロスレオニンアルドラー
ゼとしては、特公昭６３−５４３５９号に記載されたも
のの他、その遺伝子を操作して得られたものなどをあげ
ることができる。これらＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−
エリスロ体に特異的に作用しこれをグリシンと対応する
アルデヒドに分解せしめるという優れた特性を有してい
る。 【０００９】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌
あるいはその変異株などから得ることが出来る。Ｌ−ア
ロスレオニンアルドラーゼ生産菌としては、例えば、バ
チルス(Bacillus)ＤＫ−３９（微工研菌寄６２０２
号）、アルカリゲネス・ハエカリス(Alcaligenes faeca
lis)ＩＦＯ１２６６９、シュードモナス(Pseudomonas)
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、アリスロバクター
(Arthrobacter)ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）、
キサントモナス・オリゼー(Xanthomonas oryzae)ＩＡＭ
１６５７などが知られている。これらのＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼ生産菌から得られたＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡ
を、遺伝子組換えの手法を用いて導入して作成された組
換え体は、より好適に本発明に用いることが出来る。こ
のような組換え体の作成は、特開平３−１３９２８３号
記載のＤ−スレオニンアルドラーゼ高生産株の作成と同
様の方法で行うことが出来る。すなわち、Ｌ−アロスレ
オニンアルドラーゼ生産菌から染色体ＤＮＡを抽出し、
制限酵素でＤＮＡを部分分解し、精製後、適当なベクタ
ーＤＮＡに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細
胞に移入し、遺伝子ライブラリーを作成する。そこか
ら、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する
遺伝子を保有する株を、培養細胞のＬ−アロスレオニン
アルドラーゼ活性を調べることにより選択し、その細胞
株から組換えＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素でベクタ
ーＤＮＡから目的のＤＮＡを切り出す。得られたＤＮＡ
断片の解析を行い、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの
合成に不必要な部分を欠失させ、小型化し、再度適当な
ベクターＤＮＡに組み込み、宿主細胞に導入することに
より、目的の株を得ることが出来る。このような遺伝子
を導入して利用しうる微生物としては、例えばエシェリ
ヒア(Escherichia) 属細菌、バチルス(Bacillus)属細
菌、キサントモナス(Xanthomonas) 属細菌、アセトバク
ター(Acetobacter) 属細菌、シュードモナス(Pseudomon
as) 属細菌、グルコノバクター(Gluconobacter) 属細
菌、アゾトバクター(Azotobacter) 属細菌、リゾビウム
(Rhizobium) 属細菌、アルカリゲネス(Alcaligenes) 属
細菌、クレブシェラ(Klebsiella)属細菌、サルモネラ(S
almonella)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌などの原
核微生物や酵母などの下等真核生物などを用いることが
できる。 【００１０】このような組換え体のうち、特にＬ−アロ
スレオニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有して
いる組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属
するものがあげられる。キサントモナス・オリゼー(Xan
thomonas oryzae)ＩＡＭ１６５７の染色体ＤＮＡから単
離したＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与す
る遺伝子を担うＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２８を連結
した組換えプラスミドｐＬＡ５５６を、キサントモナス
・シトリー(Xanthomonas citri) ＩＦＯ３３１１に導入
して得られた形質転換体キサントモナス・シトリーＩＦ
Ｏ３３１１（ｐＬＡ５５６）は、Ｌ−アロスレオニンア
ルドラーゼを高度に生産する能力を有しており特に好適
なものである。 【００１１】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することができる。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあげられ、窒
素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イーストエキ
ス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カスなどがあ
げられる。また、塩化ナトリウム、カリウム塩、カルシ
ウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、亜鉛、マグ
ネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用できる。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下でｐＨ４から１０、温度２０から５０℃の任意の
範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。組換え
体を用いる場合、使用する菌株に応じて、アンピシリ
ン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加
してもよい。 【００１２】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できるが、
使用する酵素液あるいは菌体に目的とするＤ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を分解するような活性が含ま
れている場合には、効率的な合成を行うために、その活
性を除去してから反応に用いるのが好ましい。これらの
分解活性を除去する方法としては、酵素液のアセトン分
画・カラムクロマト分画などによる方法が好ましいが、
それに限定されることなく、分解活性を選択的に除去出
来る方法であればいずれも用いることが出来る。また、
遺伝子操作によってＬ−アロスレオニンアルドラーゼの
生産性を大幅に向上せしめた組換え体であれば、これら
の分解活性を除去することなく反応に用いることができ
る。 【００１３】酵素反応を実施する方法は、水性媒体中に
て基質であるラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸を、上に記した微生物の培養液、菌体、菌体処理物、
酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化したものと
接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体としては、
例えば、水、緩衝液、含水有機溶媒等が使用できる。反
応における酵素、微生物菌体あるいは菌体処理物等の濃
度は、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を完全に
分解できるならば特に制限はないが、Ｌ−アロスレオニ
ンアルドラーゼ活性（１ＵはＬ−アロスレオニンから１
分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵
素量を表わす）が、０．１Ｕ／ｍｌ以上であることが望
ましい。特に、１Ｕ／ｍｌ以上であれば反応を速やかに
終了させることが出来る。 【００１４】基質であるラセミ−エリスロ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の濃度は、反応を著しく阻害しない程度で
あればよく１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、基質の供
給は、一括、連続、分割の何れの手段でも実施できる。
反応温度は、１０から５５℃がよく、２０から４０℃が
より好適である。反応時のｐＨは５から１０、好ましく
は６から８である。ピリドキサール−５’−リン酸を反
応系に１０ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１μｍＭ〜１０
０μＭの濃度で添加することにより好ましい結果が得ら
れる。反応形式はバッチ方式、連続方式の何れでもよい
が、かくして、反応は０．５から５０時間程度で終了す
る。反応終了後、反応液は遠心分離や限外濾過等により
除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出等により生成ア
ルデヒドを分離する。抽出には、アルデヒドの溶解性が
高く、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸及びグリ
シンがほとんど不溶である溶媒であれば使用することが
できるが、エーテルを使用すると良好な結果が得られ
る。 【００１５】溶媒相からは減圧濃縮等によりアルデヒド
を回収することが出来る。水相からのＤ−エリスロ−β
−ヒドロキシアミノ酸とグリシンの単離回収は、通常の
イオン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行うこと
が出来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充填し
たカラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により溶出
を行う。 【００１６】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、本発明においてはそれに限定されるこ
となく各種の分離精製法が適用できる。このような方法
の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール
系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶
媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチル
エチルケトン等のケトン溶媒、ジメチルスルホキシド等
のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
等のアミド溶媒、アセトニトリルなどのニトリル系溶
媒、エチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン
等のエーテル系溶媒、メチレンクロライド等のハロゲン
化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶媒あるいはそれらの
水性溶媒などを用いた溶媒抽出などの分離法、カラムク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー、再結晶化法などの方法をあげるこ
とができる。 【００１７】本発明の方法によると、 （１）Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼは、広い範囲の
Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に作用してこれ
を分解することができるので、様々なラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸からのＤ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。 （２）Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸は合成原
料であるグリシンとアルデヒドに分解されるため、それ
らは反応液から回収して再度ラセミ−スレオ／エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸合成にリサイクル使用するこ
とが出来る。 （３）従って、ラセミ化の必要はなく、目的物が高収率
で得られるので、工程が複雑で高価な光学分割剤を用い
る必要がある従来の光学分割法に比べ、大幅に工程を単
純化出来る。 （４）遺伝子組換えによりＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼの生産性が大幅に向上した菌株を用いれば、目的と
するＤ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する
酵素が菌体中に含まれる場合でもそれらの酵素を除去す
ることなく反応に用いることが出来、また、Ｌ−エリス
ロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の低
いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を行
うことが出来るため、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸類の製造に幅広く利用することができる。 【００１８】 【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。 実施例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にバチルスＤＫ−３
９（微工研菌寄６２０２号）を接種し、ｐＨ７．５に保
ちながら３０℃で２０時間通気及び撹拌をしつつ培養し
た。培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌、水
洗後、０．０１ｍＭピリドキサ−ル−５’−リン酸を含
むｐＨ７．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyeth
ylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)緩衝液５００
ｍｌに懸濁し、この菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間の
超音波破砕処理を４回行い、破砕液の懸濁物質を遠心分
離で除去して粗酵素液を調製した。次に、この粗酵素液
を陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ
Ａ−５００（生化学工業（株）製）を充填したカラム
（２．６ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、上記緩衝液で洗
浄後、塩化ナトリウム直線グラジェントにより溶出・分
画し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を有する画
分（粗精製酵素液）１００ｍｌを得た。得られた粗精製
酵素液のＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（１Ｕは
Ｌ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシ
ンを生成するのに必要な酵素量を表わす）測定したとこ
ろ、０．２６Ｕ／ｍｌであった。得られた粗精製酵素液
にＤ，Ｌ−エリスロ−フェニルセリン（Ｄ体とＬ体の等
量混合物）１００ｍｇを加え、３０℃で１０時間反応さ
せた。反応終了後、反応液のフェニルセリン異性体及び
グリシンを、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ
−システィンにより誘導体化し、ＯＤＳカラムを用いて
ＨＰＬＣにより定量した。また、ベンズアルデヒドは、
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤ
Ｓカラムを用いてＨＰＬＣにより定量した。 Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ２．７０ｍＭ（残存
率９７．８％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ２．７６ｍＭ ベンズアルデヒド ： ２．６９ｍＭ 反応液に１Ｎ塩酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶
物を除去した。この遠心上清に２００ｍｌのエチルエー
テルを加え、撹拌・静置し、エーテル相を分離、減圧乾
固を行い、２７ｍｇのベンズアルデヒドを得た。水相
を、強酸性陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を
充填したカラム（１０ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、脱
イオン水による十分な洗浄後、０．５Ｎのアンモニア水
で吸着物質を溶出させ、フェニルセリン画分とグリシン
画分に分けて採取した。両画分を減圧乾固したところ、
それぞれ４７ｍｇ、１９ｍｇの結晶を得た。フェニルセ
リン画分より得られた結晶の異性体分析（ｏ−フタルア
ルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンによる誘導体
化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬＣ分析）を行ったところ、
残存フェニルセリンは全てＤ−エリスロ体であった。 【００１９】実施例２ 実施例１と同様の方法で、アリスロバクターＤＫ−１９
（微工研菌寄６２０１号）、シュードモナスＤＫ−２
（微工研菌寄６２００号）、アルカリゲネス・ハエカリ
スＩＦＯ１２６６９及びキサントモナス・オリゼーＩＡ
Ｍ１６５７をそれぞれ培養し、その粗精製酵素液を調製
した。得られた粗精製酵素液を用い、実施例１と同様に
反応を行った。反応液の異性体分析により求めた各異性
体の残存率を表１に示す。 【００２０】 【表１】 【００２１】実施例３ キサントモナス・オリゼーからＬ−アロスレオニンアル
ドラーゼ合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡを単離し、
キサントモナス・シトリーに導入して、Ｌ−アロスレオ
ニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有する組換え
体を作製した例を以下に示す。 （１）染色体ＤＮＡの調製及び組換え体ＤＮＡの作成 常法に従い、キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７
の染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡ１２
０μｇをＢａｍＨＩ１４単位／１．２ｍｌ、３７℃、２
時間の条件で部分消化した。反応後、超遠心機を用いた
蔗糖密度勾配により分子量分画し、５〜１０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を含む画分を組換えＤＮＡの作成に供した。プラ
スミドＤＮＡｐＢＲ３２２ １μｇを、ＢａｍＨＩ１２
単位／１４μｌ、３７℃、１８時間の条件で消化した。
アルカリフォスファターゼ処理を行った後、先に作成し
た染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ部分消化物と混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加えラリゲーション反応を行った。得
られた反応混合物を形質転換に供した。 【００２２】（２）形質転換及び遺伝子ライブラリーの
作成 得られた組換え体ＤＮＡを、常法に従い、大腸菌Ｃ６０
０株のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換し、ア
ンピシリン耐性でテトラサイクリン耐性を喪失したコロ
ニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地にピックアップし、５０００クローンからなる遺
伝子ライブラリーを構築した。 【００２３】（３）Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ遺
伝子のクローニング及び小型化 遺伝子ライブラリーに保存した形質転換体を、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地で
３７℃、一晩培養し、集菌、凍結乾燥した。５０ｍＭの
Ｌ−アロスレオニンを含む反応液（０．０１ｍＭＰＬ
Ｐ、０．２Ｍトリス；ｐＨ７．０）を１ｍｌ添加し、均
一に懸濁して１８時間、３０℃で反応させた。反応液の
アミノ酸分析をＴＬＣを用いて行い、グリシン合成活性
が増強されたクローンをＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼ遺伝子を持つ形質転換体として選択した。Ｌ−アロス
レオニンアルドラーゼ活性を獲得した形質転換体からプ
ラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで切断後、アガロース・
ゲル電気泳動で分析し、プラスミドに約１０ｋｂの挿入
断片があることを確認した。種々の欠失解析によって、
Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産に係わる遺伝子が
約５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片に含まれているこ
とが明らかになり、この断片を持つ組換えプラスミドｐ
ＬＡ２２０を作成した。このプラスミドの詳細な解析か
ら、約３ｋｂのＢｇｌII／ＸｈｏＩ断片にＬ−アロスレ
オニンアルドラーゼ生産に係わる遺伝子がコードされて
いた。４μｇのプラスミドｐＬＡ２２０を２４単位のＢ
ｇｌII、ついでＸｈｏＩで完全消化し、アガロース・ゲ
ル電気泳動で分離し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ
生産に係わる遺伝子を含む約３ｋｂの目的のＢｇｌII／
ＸｈｏＩ断片を含むゲルを切り出し、常法に従い、ゲル
内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。プラスミドＤＮ
Ａ ｐＢＲ３２８ １μｇを１２単位のＢａｍＨＩ、次
いでＳａｌＩで順次切断し、フォスファターゼで処理を
した後、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産に係わる
遺伝子断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。
この組換えプラスミドをｐＬＡ５５６と命名し、常法に
従い、大腸菌Ｃ６００株のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌ
ｌに形質転換し、アンピシリンに耐性でテトラサイクリ
ン耐性を喪失したクローンを１株選択し、そのクローン
がＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を獲得している
ことを確認した。 【００２４】（４）キサントモナス属細菌の形質転換 宿主菌、キサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１を５
０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分培養
した。集菌後、直ちに１０ｍｌのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ調
製用緩衝液（５０ｍＭＣａＣｌ2 、１０ｍＭＲｂＣ
ｌ2 、０．１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６．５）に懸濁し、氷
中３０分間静置した。遠心によって上澄みを除去後２．
５ｍｌの同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以上静
置した。１μｇのｐＬＡ５５６を含む微量遠心チューブ
に１００μｌの形質転換用緩衝液（１０％ポリエチレン
グリコール（分子量１０００）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ７．２）、２００μｌのＣｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ ｃｅｌｌを採取し、混合後氷中に３０分間静
置した。３７℃の水浴で２分間加温した後、０．８ｍｌ
のＬＢ培地を添加し、３７℃で１時間培養した。５０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に
０．１ｍｌずつ培養液を塗布し、一昼夜３７℃で培養し
た。得られたクロラムフェニコール耐性株が目的のプラ
スミドを保持し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性
を有していることを確認し、この形質転換体をキサント
モナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５６）と名
付けた。 【００２５】実施例４ 実施例３で得られた組換え体を、培地にクロラムフェニ
コールを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した以外は実施例
１と同様の方法で培養し、凍結乾燥菌体を得た。菌体重
量当りのＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定
し、遺伝子供与菌、宿主菌、ベクタープラスミドのみを
導入した菌株の活性と比較した結果を表２に示す。 【００２６】 【表２】【００２７】実施例５ キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５
６）を、培地にクロラムフェニコールを５０μｇ／ｍｌ
の濃度で添加して培養し、得られた培養液の６０分の１
量を破砕・粗精製せずにそのまま洗浄・凍結乾燥して１
００ｍｌの懸濁液（０．２０Ｕ／ｍｌ）として反応に用
いる以外は、全て実施例１と同様の方法で行った。反応
終了後、反応液中のフェニルセリン異性体、グリシン、
ベンズアルデヒドを前出の方法で定量し、次の値を得
た。 Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ２．７３ｍＭ（残存
率９８．９％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ２．７５ｍＭ ベンズアルデヒド ： ２．６０ｍＭ 各成分を反応液より分画・精製したところ、ベンズアル
デヒド２５ｍｇ、フェニルセリンの結晶４５ｍｇ、グリ
シンの結晶１８ｍｇを得た。フェニルセリン画分より得
た結晶の異性体分析を行ったところ、残存フェニルセリ
ンは全てＤ−エリスロ体であった。 【００２８】実施例６ 一般式（Ｉ）におけるＲがそれぞれ、エチル基、オクチ
ル基、アリル基、シクロヘキシル基、５−ヒドロキシ−
２−ニトロフェニル基及びイミダゾリル基であるβ−ヒ
ドロキシアミノ酸のＤ，Ｌ−エリスロ体の等量混合物を
基質に用い、実施例１ないし２で得た粗精製酵素液又は
実施例３で得た菌体懸濁液を実施例１と同様の方法で反
応させた。反応液の異性体分析により求めた各異性体の
残存率を表３、表４に示す。 【００２９】 【表３】【表４】【００３０】 【発明の効果】本発明によれば、光学分割のための置換
基の導入や除去が不要であり、高価な光学分割剤を用い
る必要もなく、生成するグリシンとアルデヒド誘導体を
原料合成にリサイクル使用することが可能で、繁雑なラ
セミ化を行う必要がないため、従来の方法に比べて極め
て有利な方法である。特に遺伝子組換えによりＬ−アロ
スレオニンアルドラーゼの生産性が大幅に向上した菌体
を用いることにより、さらに広範囲のラセミ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸から、Ｄ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸を簡単かつ経済的に製造することが出
来るので工業的製造法として適している。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:06
(Ｃ１２Ｐ 41/00 1:38
Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:05
(Ｃ１２Ｐ 41/00 1:64
Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:05）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:64）
(56)参考文献 特開 昭58−116691（ＪＰ，Ａ)
特開 昭58−116681（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開507153（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｌ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解する酵素である、アルカリゲネス
属、シュードモナス属、アリスロバクター属、キサント
モナス属、バチルス属、エシェリヒア属に属する微生
物、あるいは、これらの微生物より得られたＬ−アロス
レオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめてなる組換え体Ｄ
ＮＡを保有せしめた形質転換体よりなる群より選ばれた
少なくとも１種の微生物が産生するＬ−アロスレオニン
アルドラーゼ、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＤ−エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27599692A JP3370356B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27599692A JP3370356B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH06165693A JPH06165693A (ja) | 1994-06-14 |
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ID=17563324
Family Applications (1)
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- 1992-10-14 JP JP27599692A patent/JP3370356B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH06165693A (ja) | 1994-06-14 |
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