JP2006121985A - リン酸の添加による光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【解決手段】 原料と酵素活性物質をリン酸イオンの存在下でインキュベートする工程を含む、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法が提供された。リン酸イオンの添加によって、水溶性の低いβ-ヒドロキシアミノ酸を含む反応液の流動性が改善される。本発明の流動性の改善効果は反応の間も継続する。本発明は、酵素活性物質の反応効率の改善に貢献する。

Description

本発明は光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。

D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸、特にD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸等のD-β-ヒドロキシアミノ酸は医薬や農薬等の合成中間体として有用な物質であり、安価な製造方法が望まれている。以下、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸と記載するときは、特に断らない限り、「D-β-ヒドロキシアミノ酸またはL-β-ヒドロキシアミノ酸」を意味する。

光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の合成法として、従来、次のような方法が知られていた。
（１）アルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させた後、スレオ／エリスロ体の相互分離操作を行い、光学分割剤を用いて光学分割を行う化学合成法
（２）グリシンまたはグリシン金属錯体とアルデヒド誘導体をD-スレオニンアルドラーゼの存在下で反応させる酵素的合成法（特許文献１、２）
（３）DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に、L-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解するL-アロスレオニンアルドラーゼを作用させる酵素的合成法（特許文献３）

しかし、上記プロセスは、たとえば次のような問題点を有している。そのため工業的レベルで実用的な製造方法とは言い難い。
−工程が煩雑、
−収率が悪い、
−生産コストが高い、
−ジアステレオマー選択性が低い、
−高濃度の原料により反応が阻害される、

一般に、工業的に物質を生産するとき、製造コストを削減するためには、反応槽あたりの生産量の向上、つまり生産物の蓄積量の増大が、極めて効果的である。微生物や酵素などの酵素活性物質を利用する方法は、その条件を満たすための有力な方法の一つである。

さて、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を微生物や酵素の作用によって製造するとき、DL-β-ヒドロキシアミノ酸が原料として用いられる。DL-β-ヒドロキシアミノ酸は、その構造によっては、水に対する溶解性が非常に低い場合がある。原料の溶解性が低い場合、反応槽あたりのDL-β-ヒドロキシアミノ酸の添加量を増やすと、反応開始時の反応液の流動性が著しく低下する。あるいは、極端な場合には、反応液の固化を招く。

その結果、反応液の混合効率が低下し、酵素活性物質と原料の接触頻度の低下につながる。反応液が固化した場合には、両者の接触そのものが著しく阻害される。このような状態では、反応効率は著しく低下する。すなわち、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造においては、その溶解性の低さに起因する反応効率の低下が、工業的製造方法を開発する上で大きな障害となっていた。
特開平１−３１７３９１ 特開平２−２０７７９３ 特開平６−１６５６９３

本発明の課題は、水溶性の低いDL-β-ヒドロキシアミノ酸を原料とする、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法の提供を課題とする。より具体的には、反応液の流動性が改善された光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法の提供が本発明の課題である。

光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法においては、水溶性の低いDL-β-ヒドロキシアミノ酸が原料として利用される。そして、原料に酵素活性物質を作用させることによって、目的とする光学活性β−ヒドロキシアミノ酸が反応液中に蓄積する。蓄積する光学活性β−ヒドロキシアミノ酸自身も、やはり水溶性の低い化合物である。これらの化合物は、いずれも酸やアルカリを利用して溶解することは可能である。しかし酵素活性物質の作用を利用するときには、反応液は酵素反応の至適ｐＨである中性付近のｐＨに調整される。つまり酵素活性物質による反応は、原料が析出した状態で進行する。つまり、原料を含む反応液、そして光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を蓄積した反応液には、いずれも析出したβ−ヒドロキシアミノ酸が存在することになる。

酵素反応そのものは、部分的に溶解した原料を対象に進行する。原料の一部が析出していること自体は、酵素反応を妨げない。しかし反応液中に、不溶性のβ−ヒドロキシアミノ酸が存在すると、反応液の流動性の低下をもたらす。反応液の流動性の低下は、酵素活性物質と原料との接触を制限し、反応効率の低下、あるいは反応そのものの阻害につながりかねない。

本発明者らは、原料、あるいは目的とする光学活性β−ヒドロキシアミノ酸が不溶性の状態で反応液中に存在していても、反応液の流動性の低下を抑制しうる方法について研究を重ねた。その結果、リン酸イオンの存在下で、酵素活性物質を原料に作用させることによって、反応液の流動性を改善できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。

〔１〕５０mM以上の濃度のリン酸イオンを含む反応液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に接触させ、反応液に蓄積する一方の光学異性体であるDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔２〕反応液におけるリン酸イオンの濃度が、５０mM〜５００mMである上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕DL-β-ヒドロキシアミノ酸が下式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）

で表されるβ−ヒドロキシアミノ酸である、上記〔１〕または上記〔２〕記載の製造方法。
〔４〕 Ｒが置換されていてもよいシクロヘキシル基である上記〔３〕記載の製造方法。
〔５〕 酵素活性物質がL-フェニルセリンアルドラーゼ、L-フェニルセリンアルドラーゼを発現する微生物、またはそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである上記〔１〕乃至上記〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕 酵素活性物質が下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである、上記〔５〕記載の製造方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド

本発明によって、酵素活性物質の作用を利用した光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法における、反応液の流動性が改善された。原料、生成物共に水溶性の低いβ−ヒドロキシアミノ酸を含む反応液においては、通常の条件では、しばしばその流動性が低下する。本発明によれば反応液の流動性が改善され、しかも反応を終了するまでその効果は持続する。反応液の流動性の低下は、酵素活性物質と原料との接触を制限するため、反応効率を著しく低下させる。本発明によれば、流動性の低下による酵素活性物質の触媒作用の阻害を効果的に抑制することができる。このように本発明は、酵素活性物質による光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法の反応効率を改善する。

本発明は、５０mM以上の濃度のリン酸イオンを含む反応液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に接触させ、反応液に蓄積する一方の光学異性体であるDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供する。

本発明において、反応液とは、前記酵素活性物質がD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれかに作用して他の物質に変換する反応を維持することができる液体を言う。具体的には、反応液は、反応に必要な成分で構成され、当該反応に好適な環境を与える。たとえば、酵素反応に必要な補酵素、酵素活性の安定剤、あるいは促進剤などを含むことができる。

本発明においては、５０mM以上の濃度のリン酸イオンを含む反応液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させる。反応液におけるリン酸イオンの濃度は、反応条件において、反応液の流動性を許容できる範囲に維持できるように調節することができる。反応液が十分な流動性を維持していることは、たとえば反応の完結を指標として知ることができる。反応液のリン酸イオン濃度は、通常５０mM以上、好ましくは７０mM以上、より好ましくは１００mM以上を例示することができる。５０mM以下のリン酸イオン濃度では、場合によって反応液の流動性を維持できない可能性がある。

一方、本発明の反応液におけるリン酸イオン濃度の上限は、反応後の操作性や流動性改善の目的を損なわない範囲で適宜設定することができる。一般的な条件においては、通常１M以下で反応させることができる。好ましいリン酸イオン濃度は、たとえば０．５M以下である。したがって、本発明における好ましいリン酸イオン濃度は、通常５０mM〜５００mM、好ましくは７０mM〜４００mM、より好ましくは、１００mM〜３００mMである。

なお、リン酸イオンの濃度は、反応液に供給されたリン酸の総量を言い、イオン以外の化学種が混合した状態でもよい。したがって、たとえばリン酸塩が溶解しているかどうかとは無関係に、添加されたリン酸塩の総量（モル濃度）が、本発明で言うリン酸イオン濃度に相当する。リン酸は、イオンあるいは遊離のリン酸のいずれの状態にあってもよい。しかし、リン酸イオンによる流動性の維持効果は、反応液に溶解したリン酸によってもたらされる。したがって、必要濃度のリン酸またはリン酸塩が、反応液に溶解できることが本発明における好ましい条件である。

本発明において、反応液に添加されるリン酸イオンは、任意の方法によって反応液に供給することができる。反応液に添加するタイミングも任意である。たとえば、反応液のｐＨの調整のために添加される酸として、リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）を添加して、反応液にリン酸イオンを供給することができる。あるいは、反応液のｐＨを硫酸あるいは塩酸などで調節した後に、リン酸塩(phosphate)として添加することもできる。本発明に利用可能なリン酸塩として、たとえば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどを示すことができる。

本発明において原料となるDL-β-ヒドロキシアミノ酸は、DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸およびDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれかであることを意味する。高濃度条件下で析出するものであれば特に限定されない。たとえば下式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）

で表される構造を有するβ-ヒドロキシアミノ酸は原料として有用である。
本発明によるDL-β-ヒドロキシアミノ酸は、DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸およびDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれかであることを意味する。

式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す。具体的には、炭素数１０以下の低級アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１０以下のアルコキシ基、水酸基などで置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基または複素環式炭化水素基より選ばれた置換基である化合物である。より具体的には、シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、炭素数２０以下、好ましくは１０以下のアルキル基、アリル基、チエニル基等が挙げられる。

特に、Ｒがシクロヘキシル基である化合物は、本発明における好ましい化合物である。すなわち、たとえばDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を原料としてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法において、本発明は有用である。

反応の原料であるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度は制限されない。通常１〜６０％、好ましくは２〜３０％、より好ましくは５〜１５％、より好ましくは２．５〜７．５％の濃度の原料を使用することができる。ここで例示した原料の濃度は、反応液を構成する溶媒の重量に対する原料の重量％である。本発明においては、反応液に対する原料の濃度は、原料の溶解状態とは無関係である。したがって、原料の溶解状態に関わらず、添加された原料が同じときには濃度は一定である。つまり原料は、完全に溶解している溶液状態であってもよく、本発明において好適に扱える範囲で、完全には溶解していない懸濁状態でも良い。

本発明において、原料として好ましいDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物である。混合物中のＤ体とＬ体の比率は、Ｄ体：Ｌ体＝１０：９０〜９０：１０であり、好ましくは、Ｄ体：Ｌ体＝２５：７５〜７５：２５、より好ましくはＤ体：Ｌ体＝５０：５０（ラセミ体）である。

同様に、原料として好ましいDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物であり、その混合物中のＤ体とＬ体の比率は、Ｄ体：Ｌ体＝１０：９０〜９０：１０であり、好ましくは、Ｄ体：Ｌ体＝２５：７５〜７５：２５、より好ましくはＤ体：Ｌ体＝５０：５０（ラセミ体）である。

なお、本発明における「％」は、いずれも「原料または生産物の重量／反応液の重量(w/w)」を意味する。またe.e.は、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸の場合、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-エリスロ体の濃度］−［L-エリスロ体の濃度］）
／（［D-エリスロ体の濃度］＋［L-エリスロ体の濃度］）） ｘ １００

同様に、Ｄ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸においては、e.e.は、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-スレオ体の濃度］−［L-スレオ体の濃度］）
／（［D-スレオ体の濃度］＋［L-スレオ体の濃度］）） ｘ １００

本発明において、原料であるDL-β-ヒドロキシアミノ酸は中性付近での溶解性が低い場合が多い。特に中性付近で溶解性が低いDL-β-ヒドロキシアミノ酸は、通常、酸性またはアルカリ性の溶液として溶液を調製することができる。必要量のDL-β-ヒドロキシアミノ酸を、必要な体積の溶媒に対して溶解できれば、そのｐＨは限定されない。先に述べたような原料濃度の反応液を構成するためには、アルカリ性では、通常ｐＨ１０〜１５、好ましくはｐＨ１１〜１４、より好ましくはｐＨ１２〜１４で原料を溶解することができる。ＮａＯＨ、ＫＯＨなどによって、目的とするｐＨに調整することができる。

また酸性条件で原料を溶解するには、通常ｐＨ０〜２．０、好ましくはｐＨ０〜１．０以下、より好ましくはｐＨ０〜０．５の条件を示すことができる。塩酸、硫酸、あるいは硝酸などで必要なｐＨに調整することができる。

得られた原料溶液の必要な原料を含む量は、反応容器の中で酵素活性物質による反応に必要な成分とともにインキュベートされる。酵素活性物質の反応に好適なｐＨは中性付近である。したがって反応時には原料溶液のｐＨは維持されず、原料の一部が析出してくる。しかし本発明においては、反応液中にリン酸イオンを共存させたことによって、原料の析出にも関わらず、反応液の流動性を維持することができる。

本発明の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造においては、DL-β-ヒドロキシアミノ酸のD-体またはL-体のいずれかの化合物に対して、立体特異的に作用する酵素活性物質(enzyme active materials)が利用される。本発明において、酵素活性物質とは、DL-β-ヒドロキシアミノ酸のD-体またはL-体のいずれかの化合物に対して立体特異的に作用し、他の物質に変換する反応を触媒することができる物質と定義される。立体特異的な作用とは、いずれかの光学異性体に対して、他方の異性体に対する作用よりも高い触媒作用を有することを言う。たとえば、以下の酵素、該酵素活性を有する微生物または微生物処理物を、酵素活性物質として利用することができる。

（１）アルドラーゼ類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する活性を有するL-アミノ酸アルドラーゼ類、あるいはグリシンと対応するアルデヒドからD-β-ヒドロキシアミノ酸を合成する活性を有するD-アミノ酸アルドラーゼ類
（２）脱炭酸酵素類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的に脱炭酸し分解する活性を有するL-アミノ酸脱炭酸酵素類
（３）アシラーゼ類：N-アシル−DL-β-ヒドロキシアミノ酸を原料として、D体特異的に、あるいはL体特異的に加水分解する活性を有するアミノ酸アシラーゼ類

好ましい酵素としては、具体的には、次のような酵素を示すことができる。
L-フェニルセリンアルドラーゼ、
L-スレオニンアルドラーゼ、
L-アロ−スレオニンアルドラーゼ、
D-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、
L-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、
D-スレオニンアルドラーゼ、
D-アロ−スレオニンアルドラーゼ等

中でも、L-フェニルセリンアルドラーゼは本発明における好ましい酵素である。これらの酵素は公知であり、例えば以下に記載された手法により取得することができる。
特開平9-238680
ビタミン, 75, 2, 51-61, 2001
バイオサイエンスとインダストリー, Vol. 56, No. 11, 23-26, 1998
Nature, 181, 1533-1534, 1958
Biochim. Biophys. Acta, 258, 779-790 (1972)
FEMS Microbiology Letters, 151, 245-248, 1997
Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 702-708, 1998
Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 44-51, 2000
Eur. J. Biochem., 248, 385-393, 1997
使用する酵素活性物質の量は、通常は０．０１〜１００００ U/mL、好ましくは０．１〜１０００ U/mL、より好ましくは１〜５００ U/mL程度とすることができる。

例えば、Ｌ−フェニルセリンアルドラーゼのＬ−エリスロ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の分解活性は以下のように測定することができる。２０ｍＭ ＤＬ−エリスロ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸、２００ｍＭ TAPS-NaOH緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM ピリドキサール−５’−リン酸（以下、ＰＬＰと省略する）および酵素を含む０．５mLの反応液中で、３０℃、１０分間反応を行い、1 N ＨＣｌを０．５mL添加することによって反応を停止する。生成したシクロヘキシルアルデヒドを次の方法によって定量する。

１．０mLの反応終了液に０．５mLの２．５ｍM ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを含む１．２N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、３０℃、２０分静置する。更に、３mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、０．８５mLの３N NaOHを加え、１０分間静置する。その溶液の４７５nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、３０℃において1分間に1μmolのシクロヘキシルアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。

反応温度は酵素活性物質がその酵素作用を維持できる温度を選択することができる。具体的には、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃を示すことができる。また反応ｐＨも、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる範囲を選択することができる。通常は、ｐＨ６〜１１、好ましくは、ｐＨ７〜１０、より好ましくはｐＨ８〜９．５を示すことができる。反応は、攪拌下で行うことができる。

L-フェニルセリンアルドラーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ属に属し、下記（１）−（３）の性状により特徴づけられるL-フェニルセリンアルドラーゼ産生能を有する微生物より調製することができる。シュードモナス・プチダ属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を好適に挙げることができる。すなわちシュードモナス・プチダ属から単離され、以下の性状によって特徴付けられるL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明における酵素活性物質として利用することができる。あるいは、当該酵素を産生するシュードモナス・プチダ属微生物そのもの、あるいはその処理物を本発明の酵素活性物質として利用することができる。
（１） 作用
L-フェニルセリンに作用し、ベンズアルデヒドとグリシンを生成する。
（２） 基質特異性
(a) L-スレオ-フェニルセリン、およびL-エリスロ-フェニルセリンに共に作用するが、D-スレオ-フェニルセリン、およびD-エリスロ−フェニルセリンには実質的に作用しない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体には作用するが、D-エリスロ体には実質的に作用しない。
（３） 分子量
ゲル濾過における分子量が190,000-210,000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が35,000。

本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性は、例えば次のように確認することができる。
活性測定法：
２０mM ＤＬ−スレオ-フェニルセリン、２００mM TAPS-NaOH緩衝液(pH８．５)、５０μM ＰＬＰおよび酵素を含む０．５mLの反応液中で、３０℃、１０分間反応を行い、1 N ＨＣｌを０．５mL添加することによって反応を停止する。生成したベンズアルデヒドを次の方法によって定量する。１．０mLの反応終了液に０．５mLの２．５ｍM ２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを含む１．２N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、３０℃、２０分静置する。更に、３mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、０．８５mLの３N NaOHを加え、１０分間静置する。その溶液の４７５nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、３０℃において1分間に1μmolのベンズアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。

また本発明において、触媒作用の影響を受けないとは、基質として各化合物を与えたときに、同じ条件で測定された両基質に対する活性を１００としたときに、当該化合物に対する活性がたとえば１０％以下、好ましくは５％以下の場合に、影響を受けないと言う。具体的には、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株由来のL-フェニルセリンアルドラーゼの、以下の化合物に対する活性は、それぞれ対応する両基質に対して以下のとおりである。
(a) L-スレオ-フェニルセリンまたはL-エリスロ-フェニルセリンに対する活性を１００とするとき、D-スレオ-フェニルセリンおよびD-エリスロ−フェニルセリンに対する活性は確認できない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体に対する活性を１００とするとき、D-エリスロ体に対する作用は確認できない。

シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本酵素は、DL-スレオ-フェニルセリンなどにより誘導されるため、培地に誘導物質を添加することが好ましい。例えば、１．０％ペプトン、０．２％リン酸1水素2カリウム、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキスを含むｐＨ７．２のペプトン培地に０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地が好適に利用される。

L-フェニルセリンアルドラーゼは、微生物の培養物から、例えば、以下のようにして精製することができる。シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を上記０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含むペプトン培地中で十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護するのが望ましい。
還元剤：2-メルカプトエタノール等
プロテアーゼ阻害剤：フェニルメタンフルホニルフルオリド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、および金属キレーター等
ＰＬＰ
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、たとえば以下のような各種の蛋白質の分画方法、およびクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。
蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー
より具体的には、たとえば、以下の各工程にしたがって、無細胞抽出液から目的とする酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
４０−６０％硫安分割；
ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー；
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；
ＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換クロマトグラフィー(２回目)
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；(２回目)
ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー；

シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株に由来するL-フェニルセリンアルドラーゼは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる。本発明に利用する酵素活性物質はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログを含む。すなわち本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質とは、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を含む。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド

あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、更に付加的なアミノ酸配列を有する蛋白質も、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の活性を有する限り、本発明における酵素活性物質として利用することができる。たとえば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列にHisタグなどを付加した蛋白質は、本発明における酵素活性物質に含まれる。更に、これらの蛋白質を発現する形質転換体、およびそれが産生する組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。

本発明に利用するL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物理化学的、酵素化学的性状を有することを意味する。

当業者であれば、配列番号：１記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを得ることが可能である。

配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。

また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性状（１）および（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSC を含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。

さらに、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。

配列番号：２に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い相同性を示したのは、ラルストニア・ソラナシアラム(Ralstonia solanacearum)由来の予想低基質特異性アルドラーゼ（６８％）であった。機能が同定されている蛋白質の中では、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) PAO1株由来の低基質特異性L-スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列は、配列番号：２に対する相同性が４１%であった。

L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドをプローブとして、土壌等の環境サンプルから直接得られたDNAからスクリーニングすることによっても目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、環境サンプルから得られたDNAの物理的消化物、酵素的消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。上記方法で、ハイブリダイズするＤＮＡを得た後、得られたＤＮＡ塩基配列を解析した結果、コードするアミノ酸配列がL-フェニルセリンアルドラーゼと７０％以上の相同性を有するものは、同様の機能を有することが期待できる。こうして得られたDNAをもつプラスミドによって形質転換された大腸菌も、本発明に利用することができる。

L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより目的のDNAを得ることができる。
あるいは、PCRによって得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株のライブラリーをスクリーニングすることによって目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。

また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列情報に基づいて、その5'側あるいは3'側の塩基配列を取得することもできる。このような方法として、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）を利用することができる。あるいは、既知の断片配列情報に基づいて未知の領域を取得するための方法として、逆PCR(Inverse PCR;Genetics 120, 621-623 ,1988）も公知である。逆PCRにおいては、自己環化によって環状化されたDNAライブラリーが用いられる。このようなライブラリーは、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させることにより得ることができる。一方、逆PCR用のプライマーは、既知のcDNAの塩基配列に対して、その外側（未知の領域）に向かって相補鎖合成反応が進むようにデザインされる。鋳型となるDNAは環状化されているので、逆PCRによって未知の領域を増幅産物として得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。

このようにして単離された、ホモログをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログの発現ベクターを得ることができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを組換え体として得ることができる。こうして得られた形質転換体、およびそれが産生するホモログの組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。

本発明においてL-フェニルセリンアルドラーゼまたはそのホモログを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。

エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属等宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ

形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。

微生物菌体内などにおいて、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。

エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。

バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。

シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。

ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。

コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175, 1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。

ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。

ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614,1979)等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。

ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003,1992)。

ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99,1991)、pUWL-KS （Gene 165,149-150, 1995)等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53, 1997)。

サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。

クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド(J. Bacteriol. 145, 382-390, 1981)、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。

シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である(Mol. Cell. Biol. 6, 80,1986)。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J. 6, 729, 1987)。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。

チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267, 1985)などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター(Agri. Biol. Chem. 54, 2521, 1990)等が利用可能である。

ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である(Yeast 7, 431-443, 1991)。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており(Mol. Cell. Biol. 5, 3376, 1985)、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる(Nucleic Acids Res. 15, 3859, 1987)。

キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587,1987)、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。

アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287,1989)。

トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる(Biotechnology 7, 596-603, 1989)。

また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されている。具体的には、蚕などの昆虫(Nature 315, 592-594,1985)、あるいは菜種、トウモロコシ、およびジャガイモ等の植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されている。これらの宿主・ベクター系も、本発明に利用できる。

本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応溶液の接触形態は任意である。たとえば原料を含む溶媒に、酵素活性物質を混合することによって、両者を接触させることができる。酵素活性物質が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素活性物質が分散され、必要に応じて両者を分離することができる。あるいは原料を含む溶媒と、酵素活性物質を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形態は、酵素活性物質の回収と再利用を容易にする。本発明において、両者の接触形態は、これらの具体例に限定されない。
本発明において、酵素活性物質としては、配列番号：２に記載の蛋白質、またはそのホモログを機能的に発現する形質転換体並びにその処理物を用いることができる。例えば、pKK-PSA1により形質転換された大腸菌は、本発明における形質転換体として好ましい。

更に、本発明における酵素活性物質には、具体的には以下に示す酵素活性物質が含まれる。
界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生
物；
凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体；
ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液；
無細胞抽出液を部分精製したもの；
精製された酵素；
形質転換体あるいは酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物；

本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応液に、任意の添加物を添加することができる。添加物は、酵素活性の増強、酵素活性の安定化、あるいは反応液の流動性の増加などを目的として添加される。本発明において好適に用いることができる酵素活性物質は、補酵素としてＰＬＰを利用する。したがって反応液中にＰＬＰを添加することによって、その酵素活性を増強し、そして安定化すことができる。

ＰＬＰの反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０mM、好ましくは０．００１〜１mM、より好ましくは０．００５〜０．１mMである。また、反応においてアルデヒド誘導体が生じる場合には、亜硫酸水素ナトリウムを添加することによって、酵素活性を安定化することもできる。亜硫酸水素ナトリウムの反応液中の濃度は、通常、生じるアルデヒド誘導体の０．０５〜５等量、好ましくは０．１〜２等量、より好ましくは、０．５〜１等量である。

本発明に基づいてリン酸イオンを添加された反応液においては、原料物質の一部、あるいは蓄積する光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が析出していても、反応液の流動性が維持される。流動性が維持された反応液においては、反応開始直後から、酵素活性物質と原料との十分な接触頻度が達成される。
一方、リン酸イオンを含まない反応液の流動性は著しく低下する。流動性が低下した反応液においては、原料物質と酵素活性物質とを十分に混合することができない。その結果、反応液の均一性を維持できない。このような反応液においては、酵素活性物質と原料との十分な接触頻度が期待できず、反応効率が低下する。したがって、工業的レベルにおいて、反応の進行に最適な反応液を調製することができない。

反応時の原料濃度は、適宜設定できるが、通常１〜６０％、好ましくは２〜３０％、より好ましくは５〜１５％、さらに好ましくは２．５〜７．５％とすることができる。原料は反応開始時に一括して添加することもできるし、反応液中に連続的、間欠的に添加してもよい。

反応液の反応温度は、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる温度を選択することができる。具体的には、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃を示すことができる。また反応ｐＨも、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる範囲を選択することができる。通常は、ｐＨ６〜１１、好ましくは、ｐＨ７〜１０、より好ましくはｐＨ８〜９．５を示すことができる。

原料溶液、酵素活性物質、リン酸イオンを与えるリン酸あるいはリン酸塩、並びに補酵素などの補助的な成分を混合し、最終的に、反応液のｐＨがこれらの好適なｐＨとなるように、各成分の混合量とｐＨが調整される。更に、反応に好適なｐＨを与える適当な緩衝液を反応液に加えることもできる。本発明の反応は、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。

本発明によるD-β-ヒドロキシアミノ酸（またはL-体）の製造は、水系溶媒中、水に溶解しにくい有機溶媒中、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水系溶媒の２相系中で実施することができる。本発明に利用することができる水に溶解しにくい有機溶媒として、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどを示すことができる。一方、本発明における水系溶媒としては、水、あるいは酵素活性物質の酵素活性を維持する緩衝液などを示すことができる。

更に、水に溶解する有機溶媒中、あるいは水系溶媒と水に溶解する有機溶媒との混合系中で、原料と酵素活性物質を接触させることもできる。水に溶解する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどを示すことができる。

本発明において、反応の完結とは、反応液中のＬ体（またはD体）がほとんど存在しない状態を言う。通常、９０％e.e.以上、好ましくは９５％e.e.以上のＤ体（またはL体）が反応液中に蓄積している状態を言う。

反応により蓄積したD-β-ヒドロキシアミノ酸（またはL体）は、可溶化、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより精製することができる。D-β-ヒドロキシアミノ酸は、アルカリ性化、もしくは、酸性化により可溶化することができる。

生成物を溶解させた後、必要により凝集剤を添加した後に、遠心分離や膜濾過等により除菌、除タンパクを行うことができる。反応により生じたアルデヒドは、アルデヒドの溶解性が高く、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の溶解性が低い有機溶媒を用いて抽出することにより除去することができる。このような有機溶媒としては、ヘキサン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルターシャリーブチルエーテル、メチルイソブチルケトン等を示すことができる。有機溶媒で抽出したアルデヒドは回収して再利用することもできる。有機溶媒抽出後の水相からは、濃縮、等電点沈殿などによる晶析法やイオン交換樹脂処理、膜分離等の公知の方法によりD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を回収することができる。

本発明においては、原料に酵素活性物質を作用させることによって、原料中のL-β-ヒドロキシアミノ酸が消費され、反応系には目的の化合物であるD-β-ヒドロキシアミノ酸が残される場合もある。本発明においては、立体特異的に目的とする化合物が残されることを、生成と言うことがある。本発明においては、Ｄ体とＬ体を含む原料のＬ体を酵素的に除去し、残存するＤ体が目的物として回収される。Ｄ体そのものは、もともと原料に含まれていた物質である。しかし、Ｌ体と混在するＤ体を、光学純度の高い状態とすることは、「Ｄ体の生成」あるいは「Ｄ体の蓄積」に他ならない。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度は以下の分析方法−１により分析した。

分析方法―１（D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度分析方法）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−Ｈ（φ４．６mm×２５０mm）
温度：２５℃
検出：ＵＶ２１０ nm
流速：１．０ mL/min
溶媒：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
［実施例１］ シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株 (Pseudomonas putida biovar A24-1)由来L-フェニルセリンアルドラーゼを発現する菌体懸濁液の調製
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株(Pseudomonas putida biovar A24-1)由来L-フェニルセリンアルドラーゼを発現するプラスミドpKK-PSA1を保持した大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ１０１ （pKK-PSA1））をアンピシリン（５０ μg/mL）含有ＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で培養した。培養後、０．１ mM ＩＰＴＧを培地に添加して上記L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌して大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ１０１ （pKK-PSA1））の菌体を得た。

［実施例２］ エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度分析
反応液０．０５ｇをサンプリングし、５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．８）０．５mLを添加して懸濁し、遠心分離して得た上清に、メタノール０．５mLと無水Ｎ−ターシャリーブトキシカルボニル０．０１ｇを加えて３０℃で１時間反応させた。その後、反応液に５％硫酸水素カリウム水溶液０．４mLを加え、酢酸エチル２mLで抽出した。有機層を乾固させ、ヘキサン／エタノール＝９０／１０の溶媒に溶解し、分析方法−１にしたがって光学純度を測定した。

［実施例３］ D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成
実施例１で得られた大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ１０１ （pKK-PSA1））の菌体を用いて、ｐＨ１３．６の強アルカリ性溶液形状の９％DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸溶液を原料として、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。

終濃度６％のDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸溶液となるように上記原料を反応容器に加え、更に硫酸を加えてｐＨ８．０程度とした。次いで、１０、２５、５０、７５、１００、１５０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した。さらに、５０μMピリドキサール-5’-リン酸及び菌体を加えた総重量２０ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度を実施例２に記載の方法によって分析した。

反応液中のリン酸ナトリウム緩衝液濃度と反応液中に残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度、及び反応液の液性を表１に示す。５０mM以上のリン酸イオン濃度下において、反応は完結し、且つ、反応液の固化を抑制する効果があった。

［実施例４］ D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸溶液の合成
実施例１で得られた大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ１０１ （pKK-PSA1））の菌体を用いて、ｐＨ１３．６の強アルカリ性溶液形状の９％DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸溶液を原料として、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
終濃度６％のDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸となるように原料を反応容器に加え、リン酸を加えて中和した。次いで、１５４、１７５、２７２mMのリン酸イオン濃度とした後、１M 水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ ８．０とした。さらに、５０μM ピリドキサール-5’-リン酸及び菌体を加えた総重量２０gの反応液を、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度を実施例２に記載の方法によって分析した。

反応液中のリン酸イオン濃度と反応液中に残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度、及び反応液の液性を表２に示す。何れのリン酸イオン濃度下においても、反応は完結し、且つ、反応液の固化を抑制する効果があった。

Claims (6)

1. ５０mM以上の濃度のリン酸イオンを含む反応液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に接触させ、反応液に蓄積する一方の光学異性体であるDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
2. 反応液におけるリン酸イオンの濃度が、５０mM〜５００mMである請求項１に記載の方法。
3. DL-β-ヒドロキシアミノ酸が下式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
   

   

   で表されるβ−ヒドロキシアミノ酸である、請求項１または請求項２に記載の製造方法。
4. Ｒが置換されていてもよいシクロヘキシル基である請求項３記載の製造方法。
5. 酵素活性物質がL-フェニルセリンアルドラーゼ、L-フェニルセリンアルドラーゼを発現する微生物、またはそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の製造方法。
6. 酵素活性物質が下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５記載の製造方法。
   (a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
   (b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
   (c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
   (d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
   (e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド