WO2019189724A1 - 新規加水分解酵素及びそれを利用した（１ｓ，２ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法 - Google Patents

新規加水分解酵素及びそれを利用した（１ｓ，２ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法 Download PDF

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豊和 吉田
石田　浩一
良磨 三宅
崇敦 井浦
潤 川端
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株式会社エーピーアイ コーポレーション
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    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a novel hydrolase (esterase) that can be used for the production of (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid and its use.
  • esterase novel hydrolase
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid is a useful intermediate for the production of various HCV NS3 protease inhibitors and the like under development as therapeutic agents for hepatitis C.
  • Non-patent Document 1 and Patent Document 2 dimethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid is hydrolyzed with an enzyme to produce (1S, 2S) -1-methoxycarbonyl-2-vinylcyclohexane.
  • a method for obtaining propanecarboxylic acid is described.
  • Non-Patent Document 1 has insufficient optical selectivity, and the optical purity of the obtained (1S, 2S) -1-methoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid is also 90%. It was insufficient as ee and unsuitable as an industrial production method for pharmaceutical intermediates.
  • the enzymes used in Patent Document 1 and Patent Document 2 have insufficient optical selectivity, and other than the intended (1S, 2S) -1-methoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the present invention solves the problem of providing a novel hydrolase (esterase) for producing (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid with high optical purity and high selectivity. It should be a challenge. Furthermore, the present invention provides a novel method for industrially producing (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid having high optical purity at high efficiency and at low cost. It is a problem to be solved.
  • esterase novel hydrolase
  • Rhodococcus sp. D32 strain Rhodococcus sp. D32 strain
  • Pseudocardia dioxaniborans CB1190 strain Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 strain
  • microbacteria Enzyme derived from um cocolatam Mocrobacterium chocolatum hydrolyzes dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid with high selectivity to give (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid It was found that the acid can be obtained with high efficiency.
  • the enzyme, a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell (hereinafter referred to as these) (Sometimes referred to as “enzymes, etc.”) are brought into contact with dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid to obtain (1S, 2S) -1 with high optical purity, high selectivity and high concentration. It was found that -alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid can be obtained at low cost.
  • a hydrolase comprising a polypeptide of any one of the following (a) to (e): (A) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 and having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (1)
  • R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • polypeptide having catalytic activity having an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and an activity catalyzing the reaction shown in the above formula (1)
  • E having an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and the amino acid sequence includes the following (i) to (iv):
  • nucleic acid encoding the hydrolase according to [1] or [2].
  • nucleic acid according to [3] wherein the nucleic acid comprises a base sequence shown in the following (f), (g), (h) or (i).
  • (g) Substitution, deletion, and / or addition of one or more bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 A nucleic acid encoding a polypeptide having a nucleotide sequence having the activity of catalyzing the reaction represented by formula (1)
  • R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Nucleic acid to be encoded (i) A base sequence that hybridizes with a complementary strand of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 under stringent conditions and catalyzes the reaction represented by the above formula (1)
  • Nucleic acid encoding a polypeptide having activity [5] [1] or [2], a microorganism or cell having the ability to produce the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or the A culture solution containing the enzyme obtained by culturing microorganisms or cells is brought into contact with a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid represented by the formula (I), and represented by the formula (II).
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-bi It comprises producing the Le cyclopropanecarboxylic acid, (1S, 2S) -1- alkoxy manufacturing method of-2- vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to [3] or [4].
  • a transformant comprising the recombinant vector according to [7].
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid useful as an intermediate for the production of a therapeutic agent for hepatitis C and the like is produced with high optical purity and high selectivity.
  • the novel hydrolase (esterase) can be provided.
  • the present invention also provides a novel method for industrially producing (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid with high optical purity at high efficiency and at low cost. Can do.
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced by the method of the present invention and (1R, 2S) -1-amino-1-alkoxycarbonyl- produced using the same 2-Vinylcyclopropane can be used as a starting material or a production intermediate in the production of a therapeutic agent for hepatitis C and the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction product obtained using a bacterial cell having the amino acid sequence D32Est in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction product obtained using cells having the amino acid sequence PnbA3027-m26.
  • FIG. 3 is a diagram showing alignment of hydrolases.
  • the hydrolase of the present invention includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence (hereinafter, Containing a polypeptide having an activity of hydrolyzing diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid (hereinafter referred to as “hydrologase homolog”) It may be said).
  • the novel hydrolase of the present invention comprises a polypeptide shown in the following (a), (b), (c), (d) or (e).
  • R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably having 1 to 3 carbon atoms.
  • a linear or branched alkyl group is mentioned.
  • Two Rs in the formula (I) may be the same or different, but are preferably the same.
  • the homologue of the hydrolase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 includes the polypeptide shown in (c), (d) or (e).
  • the polypeptide shown in (c) above has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6. And a polypeptide having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (1).
  • substitution one in which one or more amino acids are conservatively substituted is preferable.
  • amino acid is conservatively substituted means substitution between amino acids having similar chemical properties, for example, substitution of a basic amino acid with a basic amino acid, Substitution with an acidic amino acid can be mentioned.
  • one to a plurality of amino acids is usually 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5 amino acids.
  • the polypeptide shown in (d) has an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and catalyzes the reaction shown in the above formula (1)
  • a polypeptide having the activity of Preferably, it has an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with the entire length of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and the above formula ( It is a polypeptide having the activity of catalyzing the reaction shown in 1).
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, the algorithm described in Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [the algorithms include NBLAST and XBLAST] (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman et al., J. Mol.
  • the activity of catalyzing the reaction represented by the formula (1) means that the dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid represented by the formula (I) is hydrolyzed and the formula (II) It is the activity that catalyzes the reaction to produce (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • dialkyl22-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid has two types of stereoisomers, (2R) and (2S), but it is a special case in which stereo inversion occurs at the 2-position. Unless it is a condition, basically only the (2S) form can be a raw material for the desired (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the activity of catalyzing the reaction represented by the formula (1) is that of two alkoxycarbonyl groups bonded to the 1-position prochiral carbon of dialkyl (2S) -2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid.
  • pro-R is a notation that distinguishes two Xs on CX 2 YZ, and priorities are determined for each substituent on C by the CIP rule. At that time, it is assumed that one of the two Xs has a higher priority than the other, and the relationship between the priorities of Y and Z is not changed. Based on the provisional priorities, the central notation of R or S is determined by the RS notation. In the case of R body, X which is given priority at that time is designated as pro-R, and in the case of S body, it is designated as pro-S.
  • the generation ratio of the (1S, 2S) body and the (1R, 2S) body can be compared using the ratio of the generated Anti body and Syn body as an index.
  • Anti and Syn isomers mean geometric isomers, (1S, 2S) and (1R, 2R) are Anti, and (1R, 2S) and (1S, 2R) are Syn. It is.
  • (1S, 2S) isomers are the main products of the hydrolysis product, so when quantifying the products, not only the evaluation system for quantifying the (1S, 2S) isomers alone, but also the anti isomer and The amount produced can be quantified using an evaluation system that can separate Syn bodies.
  • the (1S, 2S) isomer when the (1S, 2S) isomer is quantified, it can be substituted by quantifying the production amount of the Anti isomer.
  • the (1R, 2S) form when the (1R, 2S) form is quantified, it can be substituted by quantifying the production amount of the Syn form.
  • the lower the production ratio of the Syn isomer the higher the yield of (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, which is advantageous in industrialization.
  • selectivities are obtained by bringing the target hydrolase or the like into contact with racemic dialkyl ⁇ ⁇ 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid to produce 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • racemic dialkyl ⁇ ⁇ 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid to produce 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the contact method is not particularly limited.
  • a racemic dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid is added to a liquid containing the target hydrolase, and an appropriate temperature (for example, 10 ° C. to Reaction at about 45 ° C.) or pressure (for example, about atmospheric pressure).
  • the (2R) form can be hydrolyzed to form the (1S, 2R) form and the (1R, 2R) form.
  • the polypeptide shown in (e) has an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6, and the amino acid sequence includes the following ( A polypeptide having one or more motif sequences selected from i) to (iv) motif sequences.
  • the motif sequence refers to a small structural portion found in the amino acid sequence of a polypeptide. It is known that a characteristic motif sequence is commonly present in a group of polypeptides (proteins) having a specific function. For example, in certain types of hydrolases, it is known that serine (S), aspartic acid (D), and histidine (H) are amino acid residues necessary for catalytic activity (hydrolysis function). . Specifically, the hydrolase RhEst1 shown in Catalysis Science and Technology, 2015, vol.5, 2622 has serine (S), aspartic acid (D) and histidine (H) as amino acid residues. As shown in FIG. 3, hydrolase AFX20780 described in US Pat. No. 8,298,799 also has serine (S), aspartic acid (D) and histidine (H) as specific amino acid residues.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 of the present invention is also serine (S), aspartic acid (D) and histidine (H) in the same manner as the hydrolases RhEst1 and AFX20780. ) At a specific position, it can be seen that it has catalytic activity (hydrolysis function).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 of the present invention is selected from the following motif sequences (i) to (iv) as characteristic motif sequences: It has the above motif sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 of the present invention has in common other than serine (S), aspartic acid (D) and histidine (H) described above.
  • S serine
  • D aspartic acid
  • H histidine
  • These motif sequences may function alone or may exhibit a desired function when a plurality of motif sequences act simultaneously.
  • the hydrolase of the present invention includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or a homologue of the amino acid sequence, which is a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1 , which includes a polypeptide having 1-dicarboxylic acid hydrolyzing activity.
  • the degree of hydrolase activity of a hydrolase containing a polypeptide having a homologue of the amino acid sequence has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Although it may be quantitatively equivalent to a hydrolase containing a polypeptide, it may differ within an acceptable range (eg, about 0.1 to about 5 times, preferably about 0.3 to about 3 times).
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4 and 6 are Rhodococcus sp. D32 strain (Rhodococcus spD32 strain), Pseudonocardia dioxaniborans CB1190 strain (Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 strain) and Microbacterium cocolatam ( Microbacterium chocolatum). These amino acid sequences have been identified by the present inventors as a hydrolase of dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a polypeptide derived from Rhodococcus sp. Strain D32, and the strain is a fungus recovered from a soil sample. From the analysis of the N-terminal sequence of the dialkyl ⁇ ⁇ 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid hydrolase produced by the bacterium and the analysis of the chromosomal DNA of Rhodococcus spD32, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was obtained. It was.
  • polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 6 are sequences obtained from the genome information of the microorganism from which they are derived.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 6 are identical to GenBank accession No. WP-013673631 and WP-053548180, which are amino acid sequences encoded by DNA sequences predicted to encode proteins, respectively. None of them have been reported as having been actually confirmed, such as being isolated as a protein, and of course the function as a protein was completely unknown.
  • polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 the yield of (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid is high, and the selection is made.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferred because of its high properties.
  • the hydrolase containing the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 of the present invention is Rhodococcus sp. D32 strain (Rhodococcus sp. D32 strain), Pseudocardia dioxaniborans CB1190, respectively.
  • Strains (Pseudonocardia ⁇ ⁇ ⁇ dioxanivorans CB1190 strain) and microbacterium cocoratam (Microbacterium chocolatum) may be purified and isolated by known methods.
  • examples of the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the hydrolase of the present invention can also be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding it and separating and purifying the hydrolase from the resulting culture.
  • the nucleic acid encoding the hydrolase of the present invention may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera. Preferably, DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid.
  • a single strand it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • DNA encoding the hydrolase of the present invention include synthetic DNA.
  • total RNA prepared from cells or tissues derived from Rhodococcus sp. D32 (Rhodococcus sp.
  • the full-length hydrolase cDNA directly amplified by Reverse Transcriptase-PCR using the mRNA fraction as a template can be obtained from known kits such as MutanTM-super Express Km (TAKARA BIO INC.), MutanTM-K (TAKARA BIO INC. ), Etc., can be obtained by conversion according to a method known per se such as the ODA-LA PCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the cloned cDNA is converted by the colony or plaque hybridization method or the PCR method according to the above method. Can also be obtained.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • nucleic acid encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 examples include nucleic acids each including the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5. As long as it encodes a polypeptide having an activity that catalyzes the reaction shown in Formula (1), a nucleic acid containing a nucleotide sequence having high identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5 (hereinafter referred to as “nucleic acid homolog”) It may be). That is, examples of the nucleic acid encoding the potypeptide include those having the base sequences shown in the following (f), (g), (h) or (i).
  • nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 (g) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5, one or more bases are substituted, deleted and / or Or a nucleic acid encoding a polypeptide having an added base sequence and having an activity of catalyzing the reaction shown in the above formula (1) (h) and a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 and 60 % Nucleic acid encoding a polypeptide having a base sequence having a sequence identity of at least% and having an activity of catalyzing the reaction shown in the above formula (1) (i) a base represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 Nucleic acid that encodes a polypeptide having a base sequence that hybridizes with a complementary strand of the sequence under stringent conditions and having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1)
  • the nucleic acid homologue shown in (g) above includes a nucleotide sequence in which one or more bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5. And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1).
  • substitution, insertion or addition those in which one or more bases are substituted, inserted or added are preferred.
  • “one to a plurality of bases” means, for example, 1 to 300, preferably 1 to 150, more preferably 1 to 60, still more preferably 1 to 30, particularly preferably. Is 1 to 15 bases.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 are hydrolase RsD32Est (SEQ ID NO: 2) derived from Rhodococcus sp. D32 strain, Pseudonocardia dioxaniborans CB1190 strain, respectively. Codon optimized for E. coli expression of hydrolytic enzyme PdEst (SEQ ID NO: 4) from (Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 strain) and microenzyme McEst (SEQ ID NO: 6) from Microbacterium chocolatum It is a base sequence.
  • PdEst hydrolytic enzyme
  • McEst SEQ ID NO: 6
  • the DNA whose codon is optimized according to the host to be transformed is also included in the nucleic acid encoding the polypeptide having the activity of catalyzing the reaction shown in the above formula (1) which can be used in the present invention. Is done.
  • the nucleic acid homologue shown in (h) above has a base sequence having 60% or more sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5, and the reaction shown in the above formula (1) And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of catalyzing the above. Preferably, it is 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more homology (also referred to as identity) with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5. And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1).
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the nucleic acid homologue shown in (h) is stringent with the complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5 as long as it encodes a polypeptide having the activity of catalyzing the reaction shown in the above formula (1). It may be a nucleic acid that hybridizes under conditions.
  • stringent conditions can be set as appropriate with reference to the previously reported conditions (eg, Current Protocols in Molecular Molecular Biology, John Wiley and Sons, 6.3.16.3.6, 1999).
  • Is for example, 60 ° C, 1 x SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 x SSC, 0.1% SDS, more preferably 65 ° C, 0.1 x SSC, 0.1% SDS, which are washing conditions for normal Southern hybridization And a condition of washing once, more preferably 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1% x SSC, 0.1%% SDS, etc. (high stringent conditions).
  • the nucleic acid of the present invention can encode a polypeptide having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1).
  • the nucleic acid of the present invention has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or the base sequence having high identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5, the polypeptide encoded by the nucleic acid
  • the degree of hydrolytic activity of a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid of a hydrolase containing a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or the amino acid It may be quantitatively equivalent to that comprising a polypeptide having a sequence homolog, but may vary within an acceptable range (eg, about 0.1 to about 5 times, preferably about 0.3 to about 3 times).
  • DNA Databank of JAPAN DDBJ
  • a homology search can be performed on the database to obtain amino acid sequence information of a polypeptide having an activity of catalyzing the reaction shown in Formula (1) or base sequence information of DNA encoding the polypeptide.
  • the hydrolase of the present invention has an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1) with higher selectivity than the conventionally known hydrolase containing the polypeptide represented by SEQ ID NO: 24.
  • the hydrolase of the present invention when hydrolyzing dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid, (1S, 2R) form of 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, The production ratio of (1R, 2S) and / or (1R, 2R) is low, in particular, the (1S, 2R), (1R, , 2S) and / or (1R, 2R) isomers.
  • the above hydrolase may be directly used for the reaction with dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid, but a microorganism having the ability to produce the enzyme Alternatively, it is preferable to use a culture solution containing a cell, the microorganism or a processed product of the cell, and / or the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell.
  • microorganism or cell having the ability to produce the hydrolase of the present invention a microorganism or cell having the ability to produce the hydrolase originally may be used, or a microorganism or cell to which the production ability has been imparted by breeding. It may be.
  • microorganisms or cells for example, resting cells can be suitably used regardless of whether they are alive or dead.
  • examples of the type of microorganism or cell having the ability to produce the hydrolase of the present invention include those described later as “host microorganism” or “host cell”.
  • transformation transformation
  • transformation method include a method of introducing the target DNA, a method of enhancing expression of the target DNA by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter on the chromosome, and the like.
  • the nucleic acid (DNA) encoding the polypeptide (hydrolase) of the present invention is Rhodococcus sp. D32 strain (Rhodococcus sp. D32 strain), Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 strain (Pseudonocardia dioxanivorans CB1190). And chromosomal DNA derived from Microbacterium chocolatum can be used as a template and cloned by PCR using appropriate primers.
  • the nucleic acid (DNA) encoding the polypeptide (hydrolase) of the present invention as described above, is Rhodococcus sp. D32 strain (Rhodococcus sp.
  • the polypeptide gene expression vector of the present invention is provided by inserting the DNA encoding the polypeptide of the present invention obtained as described above into a known expression vector in an arrangement capable of expression. Then, by transforming host cells with the expression vector, a transformant introduced with the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • a transformant can also be obtained by incorporating a DNA encoding the polypeptide of the present invention into a chromosomal DNA of a host so that it can be expressed by a technique such as homologous recombination.
  • the term “expression vector” is used to replicate and express a protein having a desired function in the host organism by introducing a polynucleotide encoding the protein having the desired function into the host organism. Genetic factor. Examples include, but are not limited to, plasmids, viruses, phages, cosmids and the like. Preferably, the expression vector is a plasmid.
  • the “transformant” refers to a microorganism that has been introduced with a target gene using the expression vector or the like, and can express a desired trait related to a protein having a desired function, or Means a cell.
  • a method for producing a transformant specifically, an expression vector constructed by introducing a DNA encoding the polypeptide of the present invention into a plasmid vector, a phage vector, or a virus vector that is stably present in a host cell. And a method for introducing the DNA directly into the host genome and transcribing and translating the genetic information.
  • an appropriate promoter in the host is preferably linked to the 5′-upstream side of the DNA, and more preferably a terminator is linked to the 3′-downstream side.
  • Such promoters and terminators are not particularly limited as long as they are known to function in a cell used as a host. For example, in “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Publishing” The detailed vectors, promoters and terminators can be used.
  • the host microorganism to be transformed for expressing the hydrolase of the present invention is a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid or (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-
  • 2-vinylcyclopropanecarboxylic acid is not adversely affected, and examples thereof include the following microorganisms.
  • Escherichia genus Bacillus genus, Pseudomonas genus, Serratia genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium genus, Streptococcus genus, Lactobacillus genus ) Bacteria with established host vector systems belonging to the genus and the like.
  • the procedure for producing a transformant, the construction of a recombinant vector suitable for the host, and the method of culturing the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, the method described in Molecular Cloning).
  • plasmid vectors include pBR and pUC plasmids, and include lac ( ⁇ -galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (lac, trp). Fusion), promoters derived from ⁇ phage PL, PR and the like.
  • lac ⁇ -galactosidase
  • trp tryptophan operon
  • tac tac
  • trc lac, trp
  • Fusion promoters derived from ⁇ phage PL, PR and the like.
  • the terminator include trpA-derived, phage-derived, and rrnB ribosomal RNA-derived terminators.
  • examples of the vector include a pUB110 series plasmid and a pC194 series plasmid, and can also be integrated into a chromosome.
  • promoter and terminator promoters and terminators of enzyme genes such as alkaline protease, neutral protease, ⁇ -amylase and the like can be used.
  • vectors include general host vector systems established in Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, etc., plasmids involved in the degradation of toluene compounds, and TOL plasmids. And a broad host range vector (including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010) pKT240 (Gene, 26, 273-82 (1983)).
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39,281 (1985)).
  • plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39,281 (1985)
  • promoter and terminator various promoters and terminators used in E. coli can be used.
  • plasmids such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799) and pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) are used as vectors.
  • Vector In the genus Corynebacterium, particularly Corynebacterium glutamicum, plasmids such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799) and pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) are used as vectors. Vector.
  • vectors include YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids.
  • promoters and terminators of various enzyme genes such as alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, acid phosphatase, ⁇ -galactosidase, phosphoglycerate kinase, and enolase can be used.
  • examples of the vector include a plasmid vector derived from Schizosaccharomyces pombe described in Mol. Cell. Biol.
  • pAUR224 is commercially available from Takara Bio Inc. and can be easily used.
  • Aspergillus Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, etc. are the most well studied among molds, and integration into plasmids and chromosomes is available. Promoters derived from external proteases or amylases can be used (Trendsin Biotechnology 7,283-287 (1989)).
  • host vector systems corresponding to various microorganisms have been established, and these can be used as appropriate.
  • processed microorganisms or cells having the ability to produce the hydrolase of the present invention include, for example, those microorganisms or cells treated with an organic solvent or surfactant such as acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), toluene, Cell preparations such as those freeze-dried, physically or enzymatically disrupted, microorganisms or enzyme fractions in cells taken out as crude or purified products, and further, these are polyacrylamide gel, carrageenan Examples thereof include those immobilized on a carrier typified by a gel.
  • an organic solvent or surfactant such as acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), toluene
  • Cell preparations such as those freeze-dried, physically or enzymatically disrupted, microorganisms or enzyme fractions in cells taken out as crude or purified products, and further, these are polyacrylamide gel, carrageenan Examples thereof include those immobilized on a carrier typified by a gel.
  • Examples of the culture liquid containing the enzyme or the microorganism obtained by culturing cells having the ability to produce the hydrolase of the present invention include suspensions of the cells and liquid medium, and secreted expression types of the cells.
  • a supernatant obtained by removing the cells by centrifugation or the like and a concentrate thereof can be mentioned.
  • composition of the present invention comprises the hydrolase of the present invention, a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or the microorganism or cell.
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, using a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid as a substrate. It catalyzes the reaction that produces the acid.
  • composition of the present invention is used as a catalyst to industrially produce (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid with high optical purity at high efficiency and at low cost. It is useful because it can.
  • composition of the present invention may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like in addition to active ingredients (enzymes and the like).
  • excipient lactose, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • stabilizer propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • R ′ represents an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 12 carbon atoms.
  • the “1-10 alkyl group” in the “optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms” represented by R ′ is a straight chain having 1 to 10 carbon atoms or A branched or cyclic alkyl group is exemplified, and a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is more preferred.
  • a normal hexyl group, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and the like are preferable, and an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is more preferable, and a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is preferred.
  • a group is more preferred, and an ethyl group is particularly preferred.
  • substituent in the “optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms” include a halogen atom (eg, chlorine atom, bromine atom), a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms (eg, , Methoxy, ethoxy), nitro group and the like.
  • the “aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms” in the “aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms which may be substituted” represented by R ′ is preferably an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms.
  • benzyl group, 2-phenylethyl group, 1-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the substituent in the “optionally substituted aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms” include a halogen atom (eg, chlorine atom, bromine atom), a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, Methyl, ethyl), linear or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, methoxy, ethoxy) and the like.
  • Examples of the “optionally substituted aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms” include benzyl group, 4-methylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 2-phenylethyl.
  • Preferred examples include a group, 1-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group and the like.
  • Examples of the “aryl group having 6 to 12 carbon atoms” in the “optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms” represented by R ′ include, for example, a phenyl group, a 1-naphthyl group, and a 2-naphthyl group. Etc.
  • substituent in the “optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms” include halogen atoms (eg, chlorine atom, bromine atom), linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, , Methyl, ethyl), linear or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, methoxy, ethoxy), nitro groups, and the like.
  • Examples of the “optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms” include, for example, a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, o-methylphenyl group, m-methylphenyl group, p-methylphenyl.
  • o-methoxyphenyl group m-methoxyphenyl group, p-methoxyphenyl group, 2,3-dimethylphenyl group, 2,4-dimethylphenyl group, 2,5-dimethylphenyl group, 2,6-dimethylphenyl group Group, 3,4-dimethylphenyl group, 3,5-dimethylphenyl group, 2,3,5-trimethylphenyl group, 2,3,6-trimethylphenyl group, 2,4,6-trimethylphenyl group, o- Preferable examples include nitrophenyl group, m-nitrophenyl group, p-nitrophenyl group and the like.
  • R ′ is particularly preferably a methyl group, an ethyl group, a tert-butyl group, or a benzyl group, and more preferably an ethyl group.
  • Two R ′ in the formula (I ′) may be the same or different, but are preferably the same.
  • the hydrolase of the present invention When the hydrolase of the present invention is brought into contact with the dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′), the hydrolase of the present invention, which has been purified or roughly purified, has the ability to produce the hydrolase of the present invention.
  • a culture containing a microorganism or cell for example, a transformant having a DNA encoding the polypeptide of the present invention
  • a processed product of the microorganism or cell and / or the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell
  • the carboxylic acid monoester represented by the formula (II ′) can be produced by bringing the liquid into contact with the dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′).
  • the hydrolase of the present invention may be used for a direct reaction, but is obtained by culturing a microorganism or cell having the ability to produce the enzyme, a treated product of the microorganism or cell, and / or the microorganism or cell. It is preferable to use the obtained culture solution containing the enzyme, and among these, it is preferable to use a transformant having DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • the amount of the microorganism or cells to be added to the reaction solution, the treated product of the microorganisms or cells, and / or the culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganisms or cells, when adding the microorganisms or cells It is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cell is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% in terms of wet body weight, In the case of using a treated product or a culture solution, the specific activity of the enzyme is determined, and an amount is added so as to achieve the above cell concentration when added.
  • w / v% represents weight / volume%.
  • dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′) which is a reaction substrate of the hydrolase of the present invention
  • (2S) isomer or racemic isomer is usually used.
  • the reaction method is not particularly limited, and a dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′) as a substrate is added to a liquid containing the hydrolase of the present invention, and the reaction is performed at an appropriate temperature and pressure (for example, about atmospheric pressure). Can be reacted. Thereby, the carboxylic acid monoester represented by the formula (II ′) can be produced.
  • the dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′) serving as a reaction substrate usually has a substrate concentration in the range of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • Used in The reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction. However, from the viewpoint of reducing the effects when there is enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product, it may be continuous or intermittent. It is desirable to add to.
  • the reaction is usually performed in an aqueous medium or a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water and a buffer solution.
  • organic solvents include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone, dimethyl sulfoxide, and the like, the solubility of the dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′) as a reaction substrate. Higher ones can be used.
  • organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane, etc.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 to 72 hours.
  • the carboxylic acid monoester represented by the formula (II ′) produced by the production method of the present invention is separated or known to those skilled in the art, such as centrifugation, membrane treatment, etc. After separation by purification method, extraction with organic solvents such as 1-butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin or silica gel, crystallization at the isoelectric point, monohydrochloride, dihydrochloride Purification can be carried out by appropriately combining crystallization with calcium salt or the like.
  • the hydrolase of the present invention is a method for producing (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid by hydrolyzing diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid. Can be used particularly preferably.
  • dicarboxylic acid diester represented by the formula (I ′) as a substrate can be produced by the reaction of the following formula (3).
  • R 3 is an optionally substituted arylsulfonyl group having 6 to 12 carbon atoms, an optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 10 carbon atoms, or an optionally substituted carbon atom having 7 carbon atoms.
  • R ′ is as defined above.
  • the “arylsulfonyl group having 6 to 12 carbon atoms” in the “optionally substituted arylsulfonyl group having 6 to 12 carbon atoms” represented by R 3 includes, for example, a benzenesulfonyl group, Examples thereof include 1-naphthalenesulfonyl group and 2-naphthalenesulfonyl group.
  • alkylsulfonyl group having 1 to 10 carbon atoms examples include a methanesulfonyl group, an ethanesulfonyl group, a propanesulfonyl group and the like.
  • alkylsulfonyl group having 7 to 20 carbon atoms examples include a benzylsulfonyl group and the like.
  • arylsulfonyl group having 6 to 12 carbon atoms “optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 10 carbon atoms” and “optionally substituted 7 to 20 carbon atoms aralkyl”
  • Substituents in the “sulfonyl group” include halogen atoms (eg, chlorine atoms, bromine atoms), straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl, ethyl), straight groups having 1 to 6 carbon atoms. Examples include chain or branched alkoxy groups (eg, methoxy, ethoxy), nitro groups, and the like.
  • R 3 include, for example, benzenesulfonyl group, p-toluenesulfonyl group, 1-naphthalenesulfonyl group, 2-naphthalenesulfonyl group, methanesulfonyl group, ethanesulfonyl group, propanesulfonyl group, trifluoromethanesulfonyl group. And a benzylsulfonyl group.
  • R 3 is preferably a methanesulfonyl group, a benzenesulfonyl group, and a p-toluenesulfonyl group, and particularly preferably a p-toluenesulfonyl group.
  • the compound represented by the formula (III) which is the raw material compound of the formula (3) was described in a known method, for example, Frederic Dolle et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1115-1125. It can be produced according to the method. Moreover, it can manufacture by reaction of the following formula
  • 1,4-butenediol (VI) is reacted with R 3 X (X represents a halogen atom such as a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom), and the resulting compound of the formula (V) is crystallized.
  • X represents a halogen atom such as a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom
  • the resulting compound of the formula (V) is crystallized.
  • X represents a halogen atom such as a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom
  • X 1 represents a hydrogen atom or R 1
  • X 2 represents a hydrogen atom or R 2
  • R 1 and R 2 each independently represents an alkylcarbonyl group having 2 to 11 carbon atoms, carbon An aralkylcarbonyl group having 8 to 21 carbon atoms or an arylcarbonyl group having 7 to 13 carbon atoms; However, the case where X 1 and X 2 simultaneously become hydrogen atoms is excluded.
  • R 1 and R 2 is R 2 and they are commercially available, more preferably R 1 and R 2 are both acetyl, ethylcarbonyl, tert-butylcarbonyl. Group or benzoyl group, more preferably both are acetyl groups.
  • the carboxylic acid monoester represented by the formula (II ′) obtained in the present invention is an intermediate useful for the production of various HCV NS3 protease inhibitors and the like being developed as therapeutic agents for hepatitis C ( 1R, 2S) -1-amino-1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropane (VIII) and its salts can be prepared. Furthermore, by using the carboxylic acid monoester represented by the formula (II ′) thus obtained, (1R, 2S) -1-amino having high efficiency, low cost and high optical purity. -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropane can also be produced.
  • Example 1 Cloning of hydrolase gene Rhodococcus sp. Strain D32 was obtained from a soil sample by searching for hydrolysis activity as an index. New hydrolase RsD32Est (SEQ ID NO: 2) was obtained from analysis of hydrolase produced by this microorganism and analysis of genetic information. Based on this amino acid sequence information, a gene sequence (SEQ ID NO: 1) codon-optimized for expression of E. coli encoding RsD32Est was artificially synthesized by DNA2.0 to obtain pJ411RsD32Est.
  • Pseudocardia dioxanivorans CB1190 Pseudonocardia dioxanivorans CB1190
  • putative hydrolase PdEst GeneBank Accession No.WP_01367363, SEQ ID NO: 4
  • McEst GeneBank Accession No. WP_053548180, SEQ ID NO: 6
  • codon-optimized gene sequences for expression of E. coli that encode hydrolase AFX20780 GenBank Accession No.
  • AFX20780, SEQ ID NO: 8 (pedst_Ecodon, SEQ ID NO: 3, mcest_Ecodon, SEQ ID NO: 5 And afx20780_Ecodon) were artificially synthesized by DNA2.0, and plasmids inserted into pJExpress411 (manufactured by DNA2.0) (pJ411PdEst, pJ411McEst and pJ411AFX20780, respectively) were prepared.
  • the amino acid sequences encoded by the respective gene sequences were named RsD32Est, PdEst, McEst, and AFX20780, respectively.
  • Each amino acid sequence is as represented by SEQ ID NO: 2 (RsD32Est), SEQ ID NO: 4 (PdEst), SEQ ID NO: 6 (McEst), and SEQ ID NO: 8 (AFX20780), respectively.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by Invitrogen) was transformed according to a standard method, and recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) / pJ411RsD32Est, BL21 (DE3) / pJ411PdEst, BL21 (DE3 ) / PJ411McEst and BL21 (DE3) / pJ411AFX20780 were obtained.
  • each recombinant Escherichia coli was cultured at 30 ° C. using a liquid LB medium containing kanamycin and a lac promoter inducer, and collected after about 20 hours.
  • the Escherichia coli clone No. 26 prepared in Reference Example 1 described later was also cultured at 30 ° C. using a liquid LB medium containing a kanamycin and a lac promoter inducer, and was collected approximately 20 hours after the culture.
  • Example 2 Using each bacterial cell obtained in Example 1, 30 g / L of racemic diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid (hereinafter referred to as VCPDE) and 5% dimethyl sulfoxide are contained. In a 100 mmol / L potassium phosphate buffer solution, the mixture was reacted for 21 hours at 30 ° C. and pH 7. As each microbial cell, the microbial cell obtained by centrifugation from 0.4 mL of the culture solution prepared in Example 1 was used. VCPDE was synthesized according to the method described in the synthesis example of Japanese Patent No. 5657560.
  • Analysis condition (1) is an analysis condition for evaluating optical purity.
  • Analysis condition (2) is used to evaluate the quantification of the anti isomer of the 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced as a main component and the production ratio of the Syn isomer to the anti isomer. This is the analysis condition.
  • Table 1 shows the amount of anti-form of 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced when each microbial cell is used, the production ratio of Syn to the Anti-form, and the optical purity.
  • the hydrolase of the present invention having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 (RsD32Est), SEQ ID NO: 4 (PdEst) and SEQ ID NO: 6 (McEst) is SEQ ID NO: 8 (AFX20780) and SEQ ID NO:
  • the amount of 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced in the anti form is larger than that in the conventional hydrolase having the amino acid sequence of 24 (PnbA3027-m26), and the production ratio of the Syn form to the Anti form is higher. Low.
  • the hydrolase of the present invention having SEQ ID NO: 2 has an extremely large amount of 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid anti isomer to be produced, does not produce a Syn isomer, and has optical purity. Is extremely expensive.
  • Fig. 1 shows the results of HPLC analysis of reaction products obtained using cells having the amino acid sequence RsD32Est
  • Fig. 2 shows HPLC analysis of reaction products obtained using cells having the amino acid sequence PnbA3027-m26. It is a result.
  • the hydrolase of the present invention having the amino acid sequence RsD32Est is composed of (1S, 2R), (1R, 2S) and (1R) of 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid. , 2R) form is hardly produced, and (1S, 2S) form can be produced with high selectivity.
  • FIG. 1 shows the results of HPLC analysis of reaction products obtained using cells having the amino acid sequence RsD32Est
  • Fig. 2 shows HPLC analysis of reaction products obtained using cells having the amino acid sequence PnbA3027-m26. It is a result.
  • the hydrolase of the present invention having the amino acid sequence RsD32Est is composed of (1S, 2R), (1R, 2S) and (1R) of 1-
  • the conventional hydrolase having the amino acid sequence PnbA3027-m26 has a large amount of (1S, 2R) form of 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, and Selectivity is low compared with hydrolase.
  • Example 3 Production of (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid
  • 160 mL of 1 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7.0), demineralized water 1332 mL, diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid (84.2 g) and Escherichia coli clone BL21 (DE3) / pJ411RsD32Est obtained in Example 1 (24 g) were mixed, and the reaction temperature was 30 ° C.
  • the pH was 7.0 and the reaction was allowed to proceed for 24 hours under sufficient stirring speed.
  • the concentration of (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid at the end of the reaction was 22.3 g / L.
  • Reference Example 1 p-nitrobenzyl esterase gene (pnbA3027; SEQ ID NO: 9) cloned Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) one NBRC3027 a liquid medium culture collection designates each overnight culture to obtained cells cloning genes Thus, chromosomal DNA was prepared using DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen).
  • the DNA sequence inserted into the plasmid was analyzed and confirmed to contain a gene consisting of a 1467-bp ORF.
  • the resulting gene was named pnbA3027 and the sequence was as shown in SEQ ID NO: 9.
  • the amino acid sequence encoded by this DNA sequence was named PNBE3027, and the amino acid sequence was as shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of PNBE3027 showed 90% sequence identity to the known PNBE23857 sequence.
  • Reference Example 2 Modification of paranitrobenzyl esterase gene by mutagenesis Using the plasmid ppnbA3027 obtained in Reference Example 1 as a template, using the primer shown in SEQ ID NO: 17 (L70FW) and the primer shown in SEQ ID NO: 18 (L70RV) A random mutation was introduced into the base encoding leucine with amino acid number 70 using QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene).
  • Clone No. 26 was isolated from the obtained recombinant Escherichia coli and analyzed for the DNA sequence inserted into the plasmid of this clone.
  • the sequence (named pnbA3027-26) was as shown in SEQ ID NO: 23. Met.
  • the amino acid sequence encoded by this DNA sequence was named PNBE3027-m26, and the amino acid sequence was as shown in SEQ ID NO: 24.
  • (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid having high optical purity can be industrially produced at high efficiency and at low cost. it can.
  • the present invention is based on Japanese Patent Application No. 2018-070188 filed in Japan, the contents of which are all included in the present specification.

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Abstract

本発明は、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができる新規加水分解酵素、及び該酵素を用いた製造方法を提供する。

Description

新規加水分解酵素及びそれを利用した（１Ｓ，２Ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法
　本発明は、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造に利用可能な新規加水分解酵素（エステラーゼ）及びその利用に関するものである。
　(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸は、C型肝炎治療薬として開発中の各種HCV NS3プロテアーゼ阻害剤等の製造に有用な中間体である。
　非特許文献１、特許文献1及び特許文献2には、ジメチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を酵素により加水分解し、(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を得る方法が記載されている。
　しかしながら、非特許文献1で使用されている酵素は、光学的選択性が不十分であり、得られる(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の光学純度も90％e.e.と不十分であり、医薬品の中間体の工業的な製造法としては不向きであった。また、特許文献1及び特許文献2で使用されている酵素は、光学的選択性が不十分であり、目的とする(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸以外に、副生物である(1S,2R)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の生成量が多いため、目的物を高効率で製造することが難しく、また、工業的に製造する場合には大型の分離装置や精製装置が必要となりコストが高くなる。
　したがって、C型肝炎治療薬等の製造用中間体として有用な(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高純度、高効率、かつ低コストで、工業的に製造する方法が望まれていた。
特許第5613660号 特許第5657560号
C. Fliche他 Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)
　本発明は、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を高光学純度、高選択性で製造するための新規な加水分解酵素（エステラーゼ）を提供することを解決すべき課題とする。さらに、本発明は、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率、かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus sp.D32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）及びミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の酵素が、高い選択性でジアルキル2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解し、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を高効率で得ることが可能であることを見出した。また、該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「酵素等」という場合がある）を、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に接触させることにより、高光学純度、高選択性かつ高濃度の(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を低コストで得ることができることを見出した。さらに、このようにして得られた(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を用いることで高効率、かつ低コストで光学純度の高い(1R,2S)-1-アミノ-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンも製造することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［1］以下の（a）～（e）のいずれかのポリペプチドを含む加水分解酵素。
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（b）配列番号4又は6で表されるアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Rは、炭素数1～6のアルキル基を示す。）
（c）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列において、1～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
（d）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
（e）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記アミノ酸配列中に以下の（i）～（iv）のモチーフ配列から選ばれる1以上のモチーフ配列を有するポリペプチド
（i）連続する5残基（アスパラギン酸（D）、アラニン（A）、スレオニン（T）、アルギニン（R）、グリシン（G））からなる配列
（ii）連続する4残基（プロリン（P）、チロシン（Y）、グリシン（G）、フェニルアラニン（F））からなる配列
（iii）連続する4残基（アスパラギン（N）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
（iv）連続する５残基（プロリン（P）、グリシン（G）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
［2］式（1）におけるRがエチル基である、［1］に記載の加水分解酵素。
［3］［1］又は［2］に記載の加水分解酵素をコードする核酸。
［4］前記核酸が、以下の（f）、（g）、（h）又は（i）に示す塩基配列を含む、［3］に記載の核酸。
（f）配列番号1、3又は5で表される塩基配列
（g）配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、1～複数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列であって、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Rは、炭素数1～6のアルキル基を示す。）
（h）配列番号1、3又は5で表される塩基配列と60％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（i）配列番号1、3又は5で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
［5］［1］又は［2］に記載の加水分解酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を、式（I）で表されるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に接触させて、式（II）で表される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
［6］前記微生物又は細胞が、［3］又は［4］に記載の核酸で形質転換された微生物又は細胞である、［5］に記載の製造方法。
［7］［3］又は［4］に記載の核酸を含む組換えベクター。
［8］［7］に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
　本発明によれば、C型肝炎治療薬等の製造用中間体として有用な(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を高光学純度、高選択性で製造するための新規な加水分解酵素（エステラーゼ）を提供することができる。また、本発明によれば、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することができる。さらに、このようにして得られた(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を用いることにより、高効率、かつ低コストで、光学純度の高い(1R,2S)-1-アミノ-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンを製造することができる。
　本発明の方法により製造される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸や、これを用いて製造される(1R,2S)-1-アミノ-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンは、C型肝炎の治療薬等の製造における出発物質や製造用中間体として利用することができる。
図1は、実施例１において、アミノ酸配列D32Estを有する菌体を用いて得られた反応生成物のHPLC分析結果を示す図である。 図2は、アミノ酸配列PnbA3027-m26を有する菌体を用いて得られた反応生成物のHPLC分析結果を示す図である。 図3は、加水分解酵素のアライメントを示す図である。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
1．本発明の加水分解酵素
　本発明の加水分解酵素は、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むもの、又は該アミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列（以下、「アミノ酸配列のホモログ」という場合がある）を有し、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解する活性を有するポリペプチドを含むもの（以下、「加水分解酵素のホモログ」という場合がある）である。具体的には、本発明の新規加水分解酵素は、以下の（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）に示すポリペプチドを含むものである。
（a）配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（b）配列番号4又は6で表されるアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Rは、炭素数1～6のアルキル基を示す。）
（c）配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列において、1～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
（d）配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
（e）配列番号2、4、又は6で表されるアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、当該アミノ酸配列中に以下の（i）～（iv）のモチーフ配列から選ばれる１以上のモチーフ配列を有するポリペプチド
（i）連続する5残基（アスパラギン酸（D）、アラニン（A）、スレオニン（T）、アルギニン（R）、グリシン（G））からなる配列
（ii）連続する4残基（プロリン（P）、チロシン（Y）、グリシン（G）、フェニルアラニン（F））からなる配列
（iii）連続する4残基（アスパラギン（N）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
（iv）連続する5残基（プロリン（P）、グリシン（G）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
　式（1）において、Rで表される炭素数1～6のアルキル基としては、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数1～3の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基等が挙げられ、中でも、メチル基、エチル基が好ましく、エチル基が特に好ましい。なお、式（I）中の2つのRは、同一でも異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
　本発明において、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有する加水分解酵素のホモログは、前記（c）、（d）又は（e）に示すポリペプチドを含むものである。
　前記（c）に示すポリペプチドは、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列において、1～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドである。置換の場合は、1～複数個のアミノ酸が保守的に置換されたものが好ましい。本明細書において、「アミノ酸が保守的に置換された」とは、化学的性質等が類似するアミノ酸同士の置換を意味し、例えば、塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸で置換すること、酸性アミノ酸を酸性アミノ酸で置換することが挙げられる。
　「1～複数個のアミノ酸」とは、通常1個～100個、好ましくは1個～50個、より好ましくは1個～20個、さらに好ましくは1個～10個、特に好ましくは1個～5個のアミノ酸である。
　前記（d）に示すポリペプチドは、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列全長と80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドである。
　本明細書におけるアミノ酸配列の相同性（同一性又は類似性ともいう）は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら,J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
　本発明において、式（1）に示す反応を触媒する活性とは、式（I）で表されるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して、式（II）で表される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成する反応を触媒する活性のことである。
　ここで、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸には、(2R)体及び(2S)体の2種類の立体異性体が存在するが、2位での立体反転が起こる特殊な条件でない限り、基本的には(2S)体のみが目的とする(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の原料となり得る。
　したがって、式（1）に示す反応を触媒する活性とは、ジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成するという選択性を有する反応を触媒する活性である。
　なお、pro-Rとは、CX2YZ上にある2個のXについて、それらを区別する表記法であり、C上の各置換基についてCIP則により優先順位を決める。そのとき、2個のXのうち一方の優先順位を他方よりも高いものと仮定し、Y、Zとの優先順位の関係は変えない。仮の優先順位に基づき、RS表記法により中心炭素のキラリティがRかSかを決める。R体の場合は、そのときに優先させたXをpro-Rとし、S体の場合はpro-Sとする。
　この選択性は、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体と(1R,2S)体の比率を指標として確認することができる。(1S,2S)体の生成量に比して(1R,2S)体の生成量が低いものほど(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の収率が向上し、工業化において有利である。
　また、(1S,2S)体と(1R,2S)体の生成比率は、生成するAnti体とSyn体の比率を指標として比較可能である。Anti体、Syn体は幾何異性体を意味しており、(1S,2S)体と(1R,2R)体がAnti体であり、(1R,2S)体と(1S,2R)体がSyn体である。本発明においては、加水分解による生成物は(1S,2S)体が主成分であるため、生成物を定量する際に(1S,2S)体単独で定量する評価系だけでなく、Anti体とSyn体を分離できる評価系を用いて生成量を定量することが可能である。すなわち、(1S,2S)体を定量する場合に、Anti体の生成量を定量することで代用できる。同様に、(1R,2S)体を定量する場合に、Syn体の生成量を定量することで代用できる。Syn体の生成比率が低いものほど、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の収率が向上し、工業化において有利である。
　これらの選択性は、ラセミ体のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に、対象とする加水分解酵素等を接触させて1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成させ、生成した1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体と(1R,2S)体の生成量を測定すること又はAnti体とSyn体の生成量を測定することにより確認することができる。
　接触方法は特に限定されず、例えば、対象とする前記加水分解酵素を含む液体に、ラセミ体のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加え、適当な温度（例えば、10℃～45℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させること等が挙げられる。
　また、ラセミ体のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解する際に、(2R)体が加水分解すると(1S,2R)体及び(1R,2R)体を生成し得るが、目的とする(1S,2S)体のエナンチオマーにあたる(1R,2R)体の生成量は低く抑えることが好ましい。したがって、本発明においては、ジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2R)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する選択性を有することが更に好ましい。同様に、ジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に比してジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を優先的に加水分解する選択性を有することが更に好ましい。いずれの選択性も、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体の(1R,2R)体に対するエナンチオマー過剰率(％ e.e.)により測定可能である。(1S,2S)体のエナンチオマー過剰率が高いものほど、後の製造工程や製造された医薬品の生理活性に悪影響が生じる可能性が低く、工業的に有利である。
　前記(e)に示すポリペプチドは、配列番号2、4、又は6で表されるアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、当該アミノ酸配列中に以下の（i）～（iv）のモチーフ配列から選ばれる１以上のモチーフ配列を有するポリペプチドである。
（i）連続する5残基（アスパラギン酸（D）、アラニン（A）、スレオニン（T）、アルギニン（R）、グリシン（G））からなる配列
（ii）連続する4残基（プロリン（P）、チロシン（Y）、グリシン（G）、フェニルアラニン（F））からなる配列
（iii）連続する4残基（アスパラギン（N）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列、及び
（iv）連続する5残基（プロリン（P）、グリシン（G）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
　本発明において、モチーフ配列とは、ポリペプチドのアミノ酸配列中に認められる小さい構造部分を指す。特定の機能を保持する一群のポリペプチド（タンパク質）には、特徴的なモチーフ配列が共通して存在することが知られている。例えば、特定の種類の加水分解酵素においては、セリン（S）、アスパラギン酸（D）、及びヒスチジン（H）が触媒活性（加水分解機能）に必要なアミノ酸残基であることが知られている。具体的には、Catalysis Science and Technology, 2015, vol.5, 2622に示される加水分解酵素RhEst1は、アミノ酸残基としてセリン（S）、アスパラギン酸（D）及びヒスチジン（H）を有する。また、図３に示すように、米国特許第8298799号に記載の加水分解酵素AFX20780も、アミノ酸残基としてセリン（S）、アスパラギン酸（D）及びヒスチジン（H）を特定の位置に有する。
　図3に示すように、本発明の配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列も、前記加水分解酵素RhEst1及びAFX20780と同様に、セリン（S）、アスパラギン酸（D）及びヒスチジン（H）を特定の位置に有しており、触媒活性（加水分解機能）を有していることが分かる。
　また、図3に示すように、本発明の配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列は、特徴的なモチーフ配列として、以下の（i）～（iv）のモチーフ配列から選ばれる１以上のモチーフ配列を有する。
（i）連続する5残基（アスパラギン酸（D）、アラニン（A）、スレオニン（T）、アルギニン（R）、グリシン（G））からなる配列
（ii）連続する4残基（プロリン（P）、チロシン（Y）、グリシン（G）、フェニルアラニン（F））からなる配列
（iii）連続する4残基（アスパラギン（N）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
（iv）連続する5残基（プロリン（P）、グリシン（G）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
　これらのモチーフ配列は、本発明の配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列が、上述のセリン（S）、アスパラギン酸（D）及びヒスチジン（H）以外に共通して有しているものであるため、該アミノ酸配列を有する本発明の酵素が有している特徴的な機能である、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を立体選択的に加水分解するためのモチーフ配列であると推測される。これらのモチーフ配列は単独で機能する可能性もあるし、複数のモチーフ配列が同時に作用することにより所望の機能を発揮する可能性もある。
　上述のとおり、本発明の加水分解酵素は、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むもの、又は該アミノ酸配列のホモログであってジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸加水分解活性を有するポリペプチドを含むものである。該アミノ酸配列のホモログを有するポリペプチドを含む加水分解酵素のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸加水分解活性の程度は、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む加水分解酵素と定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば、約0.1～約5倍、好ましくは、約0.3～約3倍）で異なってもよい。
　配列番号2、4及び6で表されるアミノ酸配列は、それぞれ、ロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus spD32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）及びミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）に由来するものである。これらのアミノ酸配列は、本発明者らにより、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の加水分解酵素であると同定されたものである。
　配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Rhodococcus sp D32株に由来するポリペプチドであり、その菌株は土壌サンプルから回収された菌である。該菌が生産するジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸加水分解酵素のN末端配列の解析とRhodococcus spD32株の染色体DNAの解析から、配列番号2で表されるアミノ酸配列が得られた。
　配列番号4及び6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれが由来する微生物のゲノム情報から得られた配列である。配列番号4及び6で表されるアミノ酸配列は、それぞれ、タンパク質をコードすると予測されたDNA配列によりコードされるアミノ酸配列であるGenBank accession No.WP-013673631及びWP-053548180と同一である。いずれもタンパク質として単離される等、実際に存在を確認した報告例は無く、当然、タンパク質としての機能についても全く不明であったものである。
　本発明においては、配列番号2、4及び6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうち、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の収率が高く、選択性も高いことから、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド好ましい。
　本発明の配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む加水分解酵素は、それぞれロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus sp.D32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）、及びミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）から公知の方法により精製単離して得ることもできる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　また、本発明の加水分解酵素は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該加水分解酵素を分離精製することによって製造することもできる。本発明の加水分解酵素をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA：RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
　本発明の加水分解酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、ロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus sp.D32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）又はミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の細胞若しくは組織より調製した全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長加水分解酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（TAKARA BIO INC.）、MutanTM-K（TAKARA BIO INC.）等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
　配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸としては、それぞれ、配列番号1、3又は5で表される塩基配列を含む核酸が挙げられる。式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする限り、配列番号1、3又は5の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列を含む核酸（以下、「核酸のホモログ」という場合がある）でもよい。即ち、該ポチペプチドをコードする核酸としては、以下の（f）、（g）、（h）又は（i）に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
（f）配列番号1、3又は5で表される塩基配列を有する核酸
（g）配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、1～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸
（h）配列番号1、3又は5で表される塩基配列と60％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（i）配列番号1、3又は5で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸
　前記（g）に示す核酸のホモログとしては、配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、１～複数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含み、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸が挙げられる。置換、挿入又は付加の場合は、１～複数個の塩基が置換、挿入又は付加されたものが好ましい。ここで、「１～複数個の塩基」とは、例えば、1個～300個、好ましくは1個～150個、より好ましくは1個～60個、さらに好ましくは1個～30個、特に好ましくは1個～15個の塩基である。
　なお、配列番号1、3又は5で表される塩基配列は、それぞれロドコッカス・スピーシーズ（Rhodococcus sp.）D32株由来の加水分解酵素RsD32Est（配列番号2）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）由来の加水分解酵素PdEst（配列番号4）、及びミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の加水分解酵素McEst（配列番号6）の遺伝子を大腸菌発現用にコドンを最適化した塩基配列である。このように形質転換対象の宿主に応じてコドンが最適化されたDNAも当然に本発明に使用し得る上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸に包含される。
　前記（h）に示す核酸のホモログとしては、配列番号1、3又は5で表される塩基配列と60％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸が挙げられる。好ましくは、配列番号1、3又は5で表される塩基配列と80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、なお一層好ましくは98％以上の相同性（同一性ともいう）を有する塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸である。
　本明細書における塩基配列の相同性（同一性ともいう）は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝1；ミスマッチスコア＝－3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
　前記（h）に示す核酸のホモログとしては、上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする限り、配列番号1、3又は5の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、既報の条件（例：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.16.3.6, 1999）を参考に適宜設定することができ、具体的には、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1 x SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1 x SSC、0.1％ SDS、さらに好ましくは、65℃、0.1 x SSC、0.1％ SDSや68℃、0.1 x SSC、0.1％ SDS等（高ストリンジェントな条件）に相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2～3回洗浄する条件等が挙げられる。
　当業者であれば、配列番号1、3又は5で表される核酸に部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入及び／又は付加を行い、所望の変異を導入することにより、上記のような核酸のホモログを得ることが可能である。
　本発明の核酸は、上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードし得る。本発明の核酸が、配列番号1、3若しくは5に示す塩基配列、又は配列番号1、3若しくは5に示す塩基配列と高い同一性を有する塩基配列を有する場合、該核酸によりコードされるポリペプチドを含む加水分解酵素のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸加水分解活性の程度は、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むもの、又は該アミノ酸配列のホモログを有するポリペプチドを含むものと定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば、約0.1～約5倍、好ましくは約0.3～約3倍）で異なってもよい。
　また、配列番号2、4又は6のアミノ酸配列又はその一部や、配列番号1、3又は5で表される塩基配又はその一部をもとに、例えばDNA Databank of JAPAN（DDBJ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列情報又はそれをコードするDNAの塩基配列情報を手に入れることも可能である。
　本発明の加水分解酵素は、上記式（1）に示す反応を、従来公知の配列番号24に示すポリペプチドを含む加水分解酵素より、高い選択性で触媒する活性を有するものである。また、本発明の加水分解酵素は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解した際に、1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2R)体、(1R,2S)体及び／又は(1R,2R)体の生成比率が低いものであり、特に、配列番号24に示すポリペプチドを含む加水分解酵素より、該(1S,2R)体、(1R,2S)体及び／又は(1R,2R)体の生成比率が低いものである。
　後述する本発明の製造方法においては、ジアルキル2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に、上述した加水分解酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
　本発明の加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞としては、もともと当該加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を用いてもよいし、育種により前記生産能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。微生物若しくは細胞としては、その生死は問わず、例えば、休止菌体等を好適に用いることができる。本発明の加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の種類としては、「宿主微生物」又は「宿主細胞」として後述するものが挙げられる。
　育種により前記生産能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理等、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とするDNAを導入する方法、染色体上でプロモーター等の発現調節配列を改変して目的とするDNAの発現を強化する方法等が挙げられる。
　これらのうち、前記の本発明のポチペプチドをコードするDNAで形質転換された微生物若しくは細胞を用いることが好ましい。
　本発明のポリペプチド（加水分解酵素）をコードする核酸（DNA）は、前記の通り、ロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus sp.D32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）又はミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の染色体DNAを鋳型として用い、適切なプライマーを用いてPCRを行うことでクローニングできる。
　また、本発明のポリペプチド（加水分解酵素）をコードする核酸（DNA）は、前記の通り、ロドコッカス・スピーシーズD32株（Rhodococcus sp.D32株）、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）又はミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の全RNA若しくはmRNAを鋳型として用い、RT-PCR法によって直接増幅した全長加水分解酵素 cDNAを調製した後、適切なプライマーを用いてPCRを行うことによりクローニングできる。
　例えば、上記のようにして得た本発明のポリペプチドをコードするDNAを公知の発現ベクターに発現可能な配置で挿入することにより、本発明のポリペプチド遺伝子発現ベクターが提供される。そして、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドをコードするDNAが導入された形質転換体を得ることができる。形質転換体は、宿主の染色体DNAに本発明のポリペプチドをコードするDNAを相同組み換え等の手法によって発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
　本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
　本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクター等を用いて目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
　形質転換体の作製方法としては、具体的には、宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、本発明のポリペプチドをコードするDNAを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する方法や直接宿主ゲノム中に該DNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。この場合、宿主において適当なプロモーターをDNAの5'－側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを3'－側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」に詳述されているベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
　本発明の加水分解酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体がジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸や(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
　エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacteriuｍ）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属等に属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
　ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等に属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
　サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ピキア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
　ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属等に属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
　形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloningに記載の方法）。
　以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーター等の例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
　エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミド等が挙げられ、lac（β－ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc（lac、trpの融合）、λファージPL、PR等に由来するプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等が挙げられる。
　バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等を挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α－アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーター等が利用できる。
　シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240（Gene,26,273-82(1983)）等を挙げることができる。
　ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、ベクターとしては、pAJ43（Gene 39,281(1985)）等のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
　コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、ベクターとしては、pCS11（特開昭５７－１８３７９９号公報）、pCB101（Mol.Gen.Genet.196,175(1984)）等のプラスミドベクターが挙げられる。
　サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
　シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、ベクターとしては、Mol.Cell.Biol.6,80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクター等を挙げることができる。特に、pAUR224は、タカラバイオ株式会社から市販されており容易に利用できる。
　アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリジー（Aspergillus oryzae）等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989)）。
　また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
　また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（例えば、蚕）等の動物中（Nature 315,592-594(1985)）や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
　本発明の加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の処理物としては、例えば、該微生物若しくは細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の細胞調製物、微生物若しくは細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を挙げることができる。
　本発明の加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液としては、例えば、該細胞と液体培地の懸濁液や、該細胞が分泌発現型細胞である場合は該細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物を挙げることができる。
2．本発明の組成物
　本発明の組成物（酵素剤）は、本発明の加水分解酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を含み、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を基質とし、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成する反応を触媒するものである。本発明の組成物は、触媒として使用することで、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができるため、有用である。
　本発明の組成物は、有効成分（酵素等）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
3．本発明の加水分解酵素を用いた下式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルの製造
　本発明によれば、式（2）で表される製造、即ち、本発明の加水分解酵素を下式（I'）で表されるジカルボン酸エステルに作用させて、下式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルを製造することを含む、下式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルの製造方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、R'は置換されていてもよい炭素数1～10のアルキル基、炭素数7～20のアラルキル基、又は炭素数6～12のアリール基を示す。）
　式（2）において、R'で表される「置換されていてもよい炭素数1～10のアルキル基」における「1～10のアルキル基」としては、炭素数1～10の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基が挙げられる。これらのうち、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好適に挙げられ、炭素数1～4のアルキル基がより好ましく、直鎖状若しくは分岐状の炭素数1～4のアルキル基がさらに好ましく、エチル基が特に好ましい。「置換されていてもよい炭素数1～10のアルキル基」における置換基としては、ハロゲン原子（例、塩素原子、臭素原子）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ）、ニトロ基等が挙げられる。
　R'で表される「置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキル基」における「炭素数7～20のアラルキル基」としては、好ましくは炭素数7～12のアラルキル基である。これらのうち、ベンジル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルエチル基、3-フェニルプロピル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキル基」における置換基としては、ハロゲン原子（例、塩素原子、臭素原子）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルキル基（例、メチル、エチル）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ）等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキル基」としては、ベンジル基、4-メチルベンジル基、4-メトキシベンジル基、4-クロロベンジル基、4-ブロモベンジル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルエチル基、3-フェニルプロピル基等が好適に挙げられる。
　Ｒ'で表される「置換されていてもよい炭素数6～12のアリール基」における「炭素数6～12のアリール基」としては、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数6～12のアリール基」における置換基としては、ハロゲン原子（例、塩素原子、臭素原子）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルキル基（例、メチル、エチル）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ）、ニトロ基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数6～12のアリール基」としては、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、o-メチルフェニル基、m-メチルフェニル基、p-メチルフェニル基、o-メトキシフェニル基、m-メトキシフェニル基、p-メトキシフェニル基、2,3-ジメチルフェニル基、2,4-ジメチルフェニル基、2,5-ジメチルフェニル基、2,6-ジメチルフェニル基、3,4-ジメチルフェニル基、3,5-ジメチルフェニル基、2,3,5-トリメチルフェニル基、2,3,6-トリメチルフェニル基、2,4,6-トリメチルフェニル基、o-ニトロフェニル基、m-ニトロフェニル基、p-ニトロフェニル基等が好適に挙げられる。
　R'としては、特に好ましくはメチル基、エチル基、tert-ブチル基、又はベンジル基であり、より好ましくはエチル基である。
　なお、式（I'）中の2つのR'は、同一でも異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
　本発明の加水分解酵素を式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルに接触させる際には、精製又は粗精製した本発明の加水分解酵素、本発明の加水分解酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルに接触させることによって、式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルを製造することができる。
　本発明の加水分解酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、本発明のポリペプチドをコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1 w/v％～50 w/v％程度、好ましくは1 w/v％～20 w/v％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。ここで、w/v％は、重量（weight）／体積（volume）％を表す。
　本発明の加水分解酵素の反応基質である式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルとしては、通常、(2S)体又はラセミ体が用いられる。
　反応の方法は特に限定されず、本発明の加水分解酵素を含む液体に、基質となる式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルを加え、適当な温度や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルを製造することができる。
　反応基質となる式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルは、通常、基質濃度が0.01 w/v％～90 w/v％、好ましくは0.1 w/v％～30 w/v％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、tert-ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルの溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、4℃～60℃、好ましくは10℃～45℃の反応温度で、また、通常pH 3～11、好ましくはpH 5～8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間～72時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、1-ブタノール、tert-ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　本発明の加水分解酵素は、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造する方法に、特に好適に用いることができる。
　また、基質である式（I'）で表されるジカルボン酸ジエステルは、以下の式（3）の反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、R3は、置換されていてもよい炭素数6～12のアリールスルホニル基、置換されていてもよい炭素数1～10のアルキルスルホニル基、又は置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキルスルホニル基を示し、R'は前記と同義である。）
　すなわち、式（III）で表される化合物を、アルカリ金属アルコキシド又はアルカリ金属水素化物の存在下で、式（IV）で表されるマロン酸エステル類と反応させることにより製造することができる。
　式（III）において、R3で表される「置換されていてもよい炭素数6～12のアリールスルホニル基」における「炭素数6～12のアリールスルホニル基」としては、例えば、ベンゼンスルホニル基、1-ナフタレンスルホニル基、2-ナフタレンスルホニル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数1～10のアルキルスルホニル基」における「炭素数1～10のアルキルスルホニル基」としては、例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、プロパンスルホニル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキルスルホニル基」における「炭素数7～20のアラルキルスルホニル基」としては、例えば、ベンジルスルホニル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭素数6～12のアリールスルホニル基」、「置換されていてもよい炭素数1～10のアルキルスルホニル基」及び「置換されていてもよい炭素数7～20のアラルキルスルホニル基」における置換基としては、ハロゲン原子（例、塩素原子、臭素原子）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルキル基（例、メチル、エチル）、炭素数1～6の直鎖状若しくは分岐のアルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ）、ニトロ基等が挙げられる。R3の好適な具体例としては、例えば、ベンゼンスルホニル基、p-トルエンスルホニル基、1-ナフタレンスルホニル基、2-ナフタレンスルホニル基、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、プロパンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、及びベンジルスルホニル基等が挙げられる。R3は、好ましくはメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、及びp-トルエンスルホニル基であり、特に好ましくはp-トルエンスルホニル基である。
　ここで、式（3）の原料化合物である式（III）で表される化合物は、公知の方法、例えばFrederic Dolle他、Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1115-1125 等に記載された方法に準じて製造することができる。また、以下の式（4）の反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　すなわち、1,4-ブテンジオール（VI）をR3X（Xは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子を示す）と反応させて、得られた式（V）の化合物を晶析することにより、あるいは、市販されている原料化合物（VII）を酸又は塩基で加水分解して1,4-ブテンジオールを得、さらにR3Xと反応させて、得られた式（V）の化合物を晶析することにより製造することができる。
　式（4）中、X1は水素原子又はR1を示し、X2は水素原子又はR2を示し、R1及びR2はそれぞれ独立して、炭素数2～11のアルキルカルボニル基、炭素数8～21のアラルキルカルボニル基、又は炭素数7～13のアリールカルボニル基を示す。但し、X1及びX2が同時に水素原子となる場合を除く。好ましくは、X1がR1で、かつX2がR2であり、市販品として入手可能である点から、より好ましくはR1及びR2が共にアセチル基、エチルカルボニル基、tert-ブチルカルボニル基、又はベンゾイル基であり、さらに好ましくは共にアセチル基である。
　本発明で得られた式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルを用いることにより、C型肝炎治療薬として開発中の各種HCV NS3プロテアーゼ阻害剤等の製造に有用な中間体である(1R,2S)-1-アミノ-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパン(VIII)及びその塩を製造することができる。さらに、このようにして得られた式（II'）で表されるカルボン酸モノエステルを用いて製造することにより、高効率、低コストで、光学純度の高い(1R,2S)-1-アミノ-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンも製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　実施例1：加水分解酵素遺伝子のクローニング
　土壌サンプルから加水分解活性を指標に探索することによって、ロドコッカス・スピーシーズ（Rhodococcus sp.）D32株を得た。本微生物が産生する加水分解酵素の解析と遺伝子情報の解析から、新しい加水分解酵素RsD32Est（配列番号2）を得た。本アミノ酸配列情報を元にRsD32Estをコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列（配列番号1）をDNA2.0社にて人工合成し、pJ411RsD32Estを得た。
　シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株（Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株）、ミクロバクテリウム　ココラタム（Microbacterium chocolatum）由来の推定上の加水分解酵素PdEst（GenBank Accession No.WP_01367363、配列番号4）、McEst（GenBank Accession No.WP_053548180、配列番号6）及び加水分解酵素AFX20780（GenBank Accession No. AFX20780、配列番号8）をコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列（pedst_Ecodon、配列番号3、mcest_Ecodon、配列番号5及びafx20780_Ecodon）をDNA2.0社にて人工合成し、pJExpress411（DNA2.0社製）に挿入されたプラスミド（それぞれpJ411PdEst、pJ411McEst及びpJ411AFX20780）を作製した。それぞれの遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を、それぞれRsD32Est、PdEst、McEst、AFX20780と命名した。各アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号2（RsD32Est）、配列番号4（PdEst）、配列番号6（McEst）、配列番号8（AFX20780）で表されるとおりである。
　得られた各プラスミドを用いて、大腸菌（Eschelichia coli）BL21（DE3）（インビトロジェン社製）を定法に従い形質転換し、組換え大腸菌BL21（DE3）／pJ411RsD32Est、BL21（DE3）／pJ411PdEst、BL21（DE3）／pJ411McEst及びBL21（DE3）／pJ411AFX20780を得た。導入した遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてカナマイシン、及びlacプロモーター誘導物質を含む液体LB培地を用いて30℃で培養し、培養後約20時間で集菌した。
　後述の参考例１により作成した大腸菌クローンNo.26についても、カナマイシン及びlacプロモーター誘導物質を含む液体LB培地を用いて30℃で培養し、培養後約20時間で集菌した。
　実施例2
　実施例１で得られた各菌体を用いて、30 g/Lのラセミ体のジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸（以下、VCPDEという）、及び5％のジメチルスルホキシドを含む、100 mmol/Lリン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。各菌体としては、実施例1で作成した培養液0.4 mLから遠心分離によって得られた菌体を用いた。なお、VCPDEは、日本国特許第5657560号の合成例に記載の方法に準じて合成したものである。
　20時間反応後の反応液をアセトニトリルで適切な濃度に希釈後、下記条件の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した。分析条件(1)は、光学純度を評価する分析条件である。分析条件(2)は、生成した1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体を主成分とするAnti体の定量及びAnti体に対するSyn体の生成比率を評価するための分析条件である。
　分析条件(1)
　カラム：CHIRALPAK AD-3（4.6×250 mm、ダイセル化学社製）
　溶離液：ヘキサン:エタノール:トリフルオロ酢酸＝95：5：0.1
　流速：0.8 ml/min
　温度：30℃
　検出：UV 210 nm
　分析条件(2)
　カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6×250 mm、ナカライテスク社製）
　溶離液A：0.1％トリフルオロアセトフェノン含有水溶液 
　溶離液B：0.1％トリフルオロアセトフェノン含有アセトニトリル
　流速：0.8 ml/min
　温度：40℃
　検出：UV 210 nm
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表1に、各菌体を用いた場合に生成した1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体の量、Anti体に対するSyn体の生成比率及び光学純度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表2から明らかなように、配列番号2（RsD32Est）、配列番号4（PdEst）及び配列番号6（McEst）のアミノ酸配列を有する本発明の加水分解酵素は、配列番号8（AFX20780）や配列番号24（PnbA3027-m26）のアミノ酸配列を有する従来の加水分解酵素よりも、生成する1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体の量が多く、Anti体に対するSyn体の生成比率が低い。
　特に、配列番号2（RsD32Est）を有する本発明の加水分解酵素は、生成する1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体の量が極めて多く、Syn体が生成せず、光学純度も極めて高い。
　また、図1はアミノ酸配列RsD32Estを有する菌体を用いて得られた反応生成物のHPLC分析結果、図2はアミノ酸配列PnbA3027-m26を有する菌体を用いて得られた反応生成物のHPLC分析結果である。図1から明らかなように、アミノ酸配列RsD32Estを有する本発明の加水分解酵素は、1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2R)体、(1R,2S)体及び(1R,2R)体を殆ど生成せず、(1S,2S)体を高い選択性で生成することができる。図2から明らかなように、アミノ酸配列PnbA3027-m26を有する従来の加水分解酵素は、1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2R)体の生成量が多く、本発明の加水分解酵素と比べて選択性が低い。
　実施例3：(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造
　5 Lジャーファーメンターに、1 mol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）160 mL、脱塩水1332 mL、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸84.2 g及び実施例1で得られた大腸菌クローンBL21（DE3）／pJ411RsD32Estの湿菌体24 gを混合し、反応温度30℃、反応時のpH 7.0として、十分な撹拌速度の下、24時間反応させた。反応終点での(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の濃度は22.3 g/Lであった。
　反応終了後の液1100 mL（(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の純分は22.2 g）から、菌体及び菌体残渣を取り除いた後、トルエンを500 mL添加し、室温で20分間攪拌した後、トルエン層を分離して残存するジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を取り除いた。得られた水層に対して、6 N（＝3 mol/L）の硫酸を添加しpHを2.0に調整した。その後、トルエンを250 mL添加し、室温で20分間攪拌した後、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を含むトルエン層を取得した。得られた水層に対し再度トルエンを250 mL添加し、室温で20分間攪拌した後、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を含むトルエン層を取得した。得られたトルエン層のHPLC分析による純度分析及び光学純度分析の結果、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の純分は19.3 gであり、光学純度は99.7％e.e.であった。
　参考例1：パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子（pnbA3027；配列番号9）のクローニング
　遺伝子のクローニング
　バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027を菌株保存機関が指定する液体培地でそれぞれ一晩培養して得られた菌体より、DNeasy Blood & Tissue Kit (キアゲン社製)を用いて、染色体DNAをそれぞれ調製した。
　ゲノム配列公知株バシラス・サチリス(Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ（PNBE23857、GenBank Accession No. AQR87688、配列番号12）をコードする遺伝子配列（pnbA23857、配列番号11）を元に、パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーを設計、合成した。それぞれの塩基配列を、配列表の配列番号13（pnbA F）及び14（pnbA R）に示す。
　調製した染色体DNAを鋳型とし、pnbA F、pnbA Rをプライマーとして、PCRにより約1.5 kbpのDNA断片を増幅した。
　発現ベクターの調製
　特開2005-34025号公報記載の方法に準じて調整したプラスミドpKV32をテンプレートとし、配列番号15に示すプライマー（pKVXmaIFW）と配列番号16に示すプライマー（pKVXmaIRV）を用いて、PCRにより約4 kbpの断片を増幅した。増幅された断片をXmaIにより消化し、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)により自己閉環させ、得られたプラスミドをpKW32と命名した。
　発現用プラスミドの調製
　前記遺伝子のクローニングで得られたDNA断片を、常法に従って、上述の「発現ベクターの調製」で調製したクローニングベクターpKW32に導入した。以下、得られたプラスミドをppnbA3027とする。
　プラスミドに挿入されたDNA配列の解析を行い、1467 bpのORFからなる遺伝子を含むことを確認した。得られた遺伝子はpnbA3027と命名し、配列は配列番号9で示される通りであった。本DNA配列がコードするアミノ酸配列はPNBE3027と命名し、そのアミノ酸配列は配列番号10で示される通りであった。PNBE3027のアミノ酸配列は既知のPNBE23857の配列に対して90%の配列同一性を示した。
　参考例2：変異導入によるパラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の改変
　参考例1で得たプラスミドppnbA3027を鋳型として、配列表の配列番号17に示すプライマー（L70FW）と配列番号18に示すプライマー（L70RV）を用いて、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）によりアミノ酸番号70番のロイシンをコードする塩基にランダムな変異を導入した。同様に配列表の配列番号19に示すプライマー（L313FW）と配列番号20に示すプライマー（L313RV）を用いて、アミノ酸番号313番のロイシン残基をコードする塩基に対して、また、配列表の配列番号21に示すプライマー（L270L273FW）と配列番号22に示すプライマー（L270L273RV）を用いて、アミノ酸番号270と273番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、得られた変異導入プラスミドを用いて大腸菌（Escherichia coli） JM109（タカラバイオ株式会社製）を常法に従って形質転換した。
　得られた組換え大腸菌よりクローンNo.26を単離し、本クローンが有するプラスミドに挿入されたDNA配列の解析を行ったところ、その配列（pnbA3027-26と命名）は配列番号23で示される通りであった。本DNA配列がコードするアミノ酸配列をPNBE3027-m26と命名し、そのアミノ酸配列は配列番号24で示される通りであった。
　本発明の加水分解酵素等を用いることにより、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができる。
　本発明は、日本で出願された特願2018-070188を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　以下の（a）～（e）のいずれかのポリペプチドを含む加水分解酵素。
    （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
    （b）配列番号4又は6で表されるアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Rは、炭素数1～6のアルキル基を示す。）
    （c）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列において、1～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
    （d）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
    （e）配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記アミノ酸配列中に以下の（i）～（iv）のモチーフ配列から選ばれる1以上のモチーフ配列を有するポリペプチド
    （i）連続する5残基（アスパラギン酸（D）、アラニン（A）、スレオニン（T）、アルギニン（R）、グリシン（G））からなる配列
    （ii）連続する4残基（プロリン（P）、チロシン（Y）、グリシン（G）、フェニルアラニン（F））からなる配列
    （iii）連続する4残基（アスパラギン（N）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
    （iv）連続する５残基（プロリン（P）、グリシン（G）、トリプトファン（W）、プロリン（P）、グリシン（G））からなる配列
  2. 　式（1）におけるRがエチル基である、請求項1に記載の加水分解酵素。
  3. 　請求項1又は2に記載の加水分解酵素をコードする核酸。
  4. 　前記核酸が、以下の（f）、（g）、（h）又は（i）に示す塩基配列を含む、請求項3に記載の核酸。
    （f）配列番号1、3又は5で表される塩基配列
    （g）配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、1～複数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列であって、かつ式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Rは、炭素数1～6のアルキル基を示す。）
    （h）配列番号1、3又は5で表される塩基配列と60％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    （i）配列番号1、3又は5で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ上記式（1）に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
  5. 　請求項1又は2に記載の加水分解酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を、式（I）で表されるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に接触させて、式（II）で表される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
  6. 　前記微生物又は細胞が、請求項3又は4に記載の核酸で形質転換された微生物又は細胞である、請求項5に記載の製造方法。
  7. 　請求項3又は4に記載の核酸を含む組換えベクター。
  8. 　請求項7に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
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