JPH0576357A - グリコシルホスフアチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼｄ - Google Patents
グリコシルホスフアチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼｄInfo
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- JPH0576357A JPH0576357A JP3276792A JP27679291A JPH0576357A JP H0576357 A JPH0576357 A JP H0576357A JP 3276792 A JP3276792 A JP 3276792A JP 27679291 A JP27679291 A JP 27679291A JP H0576357 A JPH0576357 A JP H0576357A
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
- C07K2319/912—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation containing a GPI (phosphatidyl-inositol glycane) anchor
Abstract
(57)【要約】
【構成】 実質的に純粋な形の蛋白グリコシルホスファ
チジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−
ＰＬＤ）、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードするポリヌクレオチ
ド、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする単離されたポリヌクレ
オチドを含むベクター、およびＧＰＩ−ＰＬＤをコード
するポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された
細胞に関する。また、グリコシルホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＤと共にグリコシルホスフ
ァチジルイノシトール固定蛋白をコードする遺伝子で真
核細胞を同時トランスフェクトすることから成る、真核
細胞から分泌されうる蛋白の生産方法に関する。 【効果】
チジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−
ＰＬＤ）、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードするポリヌクレオチ
ド、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする単離されたポリヌクレ
オチドを含むベクター、およびＧＰＩ−ＰＬＤをコード
するポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された
細胞に関する。また、グリコシルホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＤと共にグリコシルホスフ
ァチジルイノシトール固定蛋白をコードする遺伝子で真
核細胞を同時トランスフェクトすることから成る、真核
細胞から分泌されうる蛋白の生産方法に関する。 【効果】
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛋白、組み換えＤＮＡ
および遺伝子工学の分野に関する。
および遺伝子工学の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近の研究により、多くの細胞表面蛋白
はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ア
ンカーへの共有結合により膜につなぎとめられているこ
とが明らかになった。この新しいクラスの膜アンカーが
果たす生理学的役割は知られていないが、１つの可能性
はそれが in vivoで特異的ホスホリパーゼによる分子の
放出を促進するということである。
はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ア
ンカーへの共有結合により膜につなぎとめられているこ
とが明らかになった。この新しいクラスの膜アンカーが
果たす生理学的役割は知られていないが、１つの可能性
はそれが in vivoで特異的ホスホリパーゼによる分子の
放出を促進するということである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】蛋白からＧＰＩアンカ
ーを取り除くことができると思われる数種の哺乳類ホス
ホリパーゼ活性が報告された。これらは最初ホスファチ
ジルイノシトール（ＰＩ）特異的ホスホリパーゼＣの作
用に属するとされた。その理由は、この特異性の酵素が
哺乳類組織に広く分布しているからである。しかしなが
ら、哺乳類ＰＩ特異的ホスホリパーゼＣは細胞内に存在
すると考えられるのに、ＧＰＩ固定蛋白は細胞表面に存
在するので、このようなプロセスの生理学的意義には問
題が残された。その後、胎盤ＰＩ特異的ホスホリパーゼ
Ｃ活性はＧＰＩアンカー切断活性に影響を及ぼさないこ
とが見いだされ、ＧＰＩ固定蛋白の放出には他の酵素が
関与していることが示された。こうして、この活性はＧ
ＰＩアンカーに対して特異性を有する新規なホスホリパ
ーゼＤによることが示唆された。最近、いくつかのグル
ープは哺乳動物血漿および血清中に高レベルのＧＰＩ特
異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）が存在するこ
とを報告した〔Low,M.G., and Prasad,A.R.S.(1988) Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 980-984; Davitz,M.A., He
reld,D., Shak,S., Krakow,J., Englund,P.L., and Nus
senzweig,V. (1987) Science, 238, 81-84; Cardoso de
Almeida,M.L., Turner,M.J., Stambuk,B.B. and Schen
kman,S.(1988) Biochem.Biophys.Res.Commun., 150, 47
6-482 〕。この酵素は、細胞外に存在し且つＧＰＩに対
して特異的であるために、in vivo で細胞表面からＧＰ
Ｉ固定蛋白を放出させるのに関係があると思われる。
ーを取り除くことができると思われる数種の哺乳類ホス
ホリパーゼ活性が報告された。これらは最初ホスファチ
ジルイノシトール（ＰＩ）特異的ホスホリパーゼＣの作
用に属するとされた。その理由は、この特異性の酵素が
哺乳類組織に広く分布しているからである。しかしなが
ら、哺乳類ＰＩ特異的ホスホリパーゼＣは細胞内に存在
すると考えられるのに、ＧＰＩ固定蛋白は細胞表面に存
在するので、このようなプロセスの生理学的意義には問
題が残された。その後、胎盤ＰＩ特異的ホスホリパーゼ
Ｃ活性はＧＰＩアンカー切断活性に影響を及ぼさないこ
とが見いだされ、ＧＰＩ固定蛋白の放出には他の酵素が
関与していることが示された。こうして、この活性はＧ
ＰＩアンカーに対して特異性を有する新規なホスホリパ
ーゼＤによることが示唆された。最近、いくつかのグル
ープは哺乳動物血漿および血清中に高レベルのＧＰＩ特
異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）が存在するこ
とを報告した〔Low,M.G., and Prasad,A.R.S.(1988) Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 980-984; Davitz,M.A., He
reld,D., Shak,S., Krakow,J., Englund,P.L., and Nus
senzweig,V. (1987) Science, 238, 81-84; Cardoso de
Almeida,M.L., Turner,M.J., Stambuk,B.B. and Schen
kman,S.(1988) Biochem.Biophys.Res.Commun., 150, 47
6-482 〕。この酵素は、細胞外に存在し且つＧＰＩに対
して特異的であるために、in vivo で細胞表面からＧＰ
Ｉ固定蛋白を放出させるのに関係があると思われる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、他の蛋白を実
質的に含まない蛋白グリコシルホスファチジルイノシト
ール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）または
その生物学的に活性な断片、ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその
生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチド、
ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性な断片をコー
ドするポリヌクレオチドを含むベクター、並びにこのよ
うなベクターにより形質転換された細胞に関する。
質的に含まない蛋白グリコシルホスファチジルイノシト
ール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）または
その生物学的に活性な断片、ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその
生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチド、
ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性な断片をコー
ドするポリヌクレオチドを含むベクター、並びにこのよ
うなベクターにより形質転換された細胞に関する。
【０００５】他の実施態様において、本発明はまた、天
然ＧＰＩ−ＰＬＤの生物学的活性を実質的に保持するＧ
ＰＩ−ＰＬＤの変異体またはその生物学的に活性な断
片、これらの変異体をコードするポリヌクレオチド、こ
れらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびこのよ
うなベクターにより形質転換された細胞に関する。さら
に、本発明は、このようなＧＰＩ−ＰＬＤ活性化合物を
コードする組み換えベクターを保有する宿主を適当な生
育条件下で培養して前記化合物を発現させ、そして前記
化合物を単離することから成る、ＧＰＩ−ＰＬＤまたは
その生物学的に活性な断片、もしくはＧＰＩ−ＰＬＤの
変異体またはその断片の生産方法に関する。
然ＧＰＩ−ＰＬＤの生物学的活性を実質的に保持するＧ
ＰＩ−ＰＬＤの変異体またはその生物学的に活性な断
片、これらの変異体をコードするポリヌクレオチド、こ
れらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびこのよ
うなベクターにより形質転換された細胞に関する。さら
に、本発明は、このようなＧＰＩ−ＰＬＤ活性化合物を
コードする組み換えベクターを保有する宿主を適当な生
育条件下で培養して前記化合物を発現させ、そして前記
化合物を単離することから成る、ＧＰＩ−ＰＬＤまたは
その生物学的に活性な断片、もしくはＧＰＩ−ＰＬＤの
変異体またはその断片の生産方法に関する。
【０００６】本発明の他の実施態様は、グリコシルホス
ファチジルイノシトール固定蛋白とグリコシルホスファ
チジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤをコードす
る遺伝子で真核細胞をトランスフェクトすることから成
る、真核細胞から分泌可能な蛋白を生産する方法であ
る。さらに、本発明は、細胞が増殖しつつある細胞培養
物に適当な洗剤と組合わせたグリコシルホスファチジル
イノシトール特異的ホスホリパーゼＤを投与することか
ら成る、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカ
ーによって細胞に固定されている蛋白を切断する方法に
関する。
ファチジルイノシトール固定蛋白とグリコシルホスファ
チジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤをコードす
る遺伝子で真核細胞をトランスフェクトすることから成
る、真核細胞から分泌可能な蛋白を生産する方法であ
る。さらに、本発明は、細胞が増殖しつつある細胞培養
物に適当な洗剤と組合わせたグリコシルホスファチジル
イノシトール特異的ホスホリパーゼＤを投与することか
ら成る、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカ
ーによって細胞に固定されている蛋白を切断する方法に
関する。
【０００７】最後に、本発明は、他の蛋白を実質的に含
まないＧＰＩ−ＰＬＤに特異的な抗体に関する。図にお
いて、図１は、ＧＰＩアンカー構造の模型である。蛋白
のＣＯＯＨ末端アミノ酸がエタノールアミン残基に結合
し、このエタノールアミン残基がホスホジエステル結合
を介して複合グリカン部分に結合する。ＧＰＩ−ＰＬＤ
の加水分解部位が矢印で示してある。
まないＧＰＩ−ＰＬＤに特異的な抗体に関する。図にお
いて、図１は、ＧＰＩアンカー構造の模型である。蛋白
のＣＯＯＨ末端アミノ酸がエタノールアミン残基に結合
し、このエタノールアミン残基がホスホジエステル結合
を介して複合グリカン部分に結合する。ＧＰＩ−ＰＬＤ
の加水分解部位が矢印で示してある。
【０００８】図２は、ヒドロキシアパタイトおよびＺｎ
キレートマトリックスクロマトグラフィーにより精製さ
れた試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。試料（１−３μ
ｇ）は還元条件下に１０％ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。（予備染
色した）蛋白標準品はベセスダリサーチ研究所（Bethes
da Research Labs. ）から得られた。レーン１：ヒドロ
キシアパタイト流動プール（〜３μｇ）；レーン２：Ｚ
ｎキレートプール１（〜１μｇ）；レーン３：Ｚｎキレ
ートプール２（〜３μｇ）。
キレートマトリックスクロマトグラフィーにより精製さ
れた試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。試料（１−３μ
ｇ）は還元条件下に１０％ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。（予備染
色した）蛋白標準品はベセスダリサーチ研究所（Bethes
da Research Labs. ）から得られた。レーン１：ヒドロ
キシアパタイト流動プール（〜３μｇ）；レーン２：Ｚ
ｎキレートプール１（〜１μｇ）；レーン３：Ｚｎキレ
ートプール２（〜３μｇ）。
【０００９】図３は、イムノアフィニティークロマトグ
ラフィー法により精製された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥで
ある。試料は還元条件下に８．５％アクリルアミドゲル
で電気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。レー
ン１：イムノアフィニティー溶出液、〜１０μｇ；レー
ン２：レクチンセファロース溶出液、〜５．０μｇ；レ
ーン３：Mono Q-FPLC プール、〜２．５μｇ。
ラフィー法により精製された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥで
ある。試料は還元条件下に８．５％アクリルアミドゲル
で電気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。レー
ン１：イムノアフィニティー溶出液、〜１０μｇ；レー
ン２：レクチンセファロース溶出液、〜５．０μｇ；レ
ーン３：Mono Q-FPLC プール、〜２．５μｇ。
【００１０】図４は、クローンｐＢＪ１５４９およびｐ
ＢＪ１６４４由来のスプライスされた挿入物の制限地図
および塩基配列決定戦略である。２つのラムダｇｔ１１
クローンからのウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤｃＤＮＡ挿入物
をｐＧＥＭ４Ｚ（Promega Biotec, Madison, WI ）にサ
ブクローニングし、シークエナーゼ酵素（U.S.Biochemi
cal Corp., Cleveland, OH）を使って両鎖の塩基配列を
決定した。黒丸および白丸の付いた矢印はそれぞれ、よ
り小さいサブクローンのＳＰ６／Ｔ７プロモータープラ
イマーから決定された配列および合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーから決定された配列を表す。翻訳開始およ
び終止コドンの位置を示してある。クローンｐＢＪ１５
４９およびｐＢＪ１６４４はそれぞれヌクレオチド１−
１５７７およびヌクレオチド１４３８−２５７８にわた
っていた。Ａ，ＡｃｃＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｈ，Ｈｉｎ
ｄIII ；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｎ，ＮｃｏＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；
Ｓ，ＳａｃＩ；Ｖ，ＰｖｕII。
ＢＪ１６４４由来のスプライスされた挿入物の制限地図
および塩基配列決定戦略である。２つのラムダｇｔ１１
クローンからのウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤｃＤＮＡ挿入物
をｐＧＥＭ４Ｚ（Promega Biotec, Madison, WI ）にサ
ブクローニングし、シークエナーゼ酵素（U.S.Biochemi
cal Corp., Cleveland, OH）を使って両鎖の塩基配列を
決定した。黒丸および白丸の付いた矢印はそれぞれ、よ
り小さいサブクローンのＳＰ６／Ｔ７プロモータープラ
イマーから決定された配列および合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーから決定された配列を表す。翻訳開始およ
び終止コドンの位置を示してある。クローンｐＢＪ１５
４９およびｐＢＪ１６４４はそれぞれヌクレオチド１−
１５７７およびヌクレオチド１４３８−２５７８にわた
っていた。Ａ，ＡｃｃＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｈ，Ｈｉｎ
ｄIII ；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｎ，ＮｃｏＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；
Ｓ，ＳａｃＩ；Ｖ，ＰｖｕII。
【００１１】図５は、ウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのＤＮＡ
配列および推定アミノ酸配列である。矢印は成熟蛋白の
Ｎ末端を示す。インテグリンαサブユニットの金属イオ
ン結合ドメインへの配列類似性を示す領域には下線が引
いてある。図６は、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞
の培地およびリゼイトのウェスターンブロット分析であ
る。完全２．６ｋｂクローン化ｃＤＮＡをｐＢＣ１２Ｂ
１のＨｉｎｄIII ／Ｓｍａｌ部位に連結し、この組み換
えプラスミドｐＢＪ１６８２を標準ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介法を使ってＣＯＳ−７細胞に導入した。ＣＯＳ
細胞は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ修飾イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）で最初の２４時間にわたり培養し、
その後内因性ＰＬＤを除くために１％ニュートリドーマ
（Nutridoma; Boehringer Mannheim, Indianapolis, I
N）を含む無血清ＤＭＥＭに交換した。無血清培地交換
の４８時間後に培地を集め、遠心して浮遊細胞をペレッ
ト化し、セントリコン１０（Centricon; Amicon, Danve
rs, MA）を使って１５倍に濃縮した。細胞リゼイトはア
プロチニン（３０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０μ
ｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１０μｇ／ｍｌ）、および
フッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）を含むＰＢ
Ｓ中の０．５％ノニデット（Nonidet ）Ｐ−４０ １ｍ
ｌあたり５ｘ１０7 細胞−同等物の濃度に調製した。こ
のリゼイトを１３，０００ｇ、４℃で２０分遠心し、上
清を集めた。ゲル電気泳動およびニトロセルロースへの
ブロッティング後、ウシ血清ＧＰＩ−ＰＬＤに対する５
種類のモノクローナル抗体（各々１μｇ／ｍｌ）のプー
ルおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ（Jackson Immuno-Research, WestGrove,PA）を使っ
て蛋白を検出した。レーン１、擬似トランスフェクト細
胞のリゼイト；レーン２、擬似トランスフェクト細胞か
らの培地；レーン３、等量のｐＢＪ１６８２−トランス
フェクト細胞からのリゼイトおよび擬似トランスフェク
ト細胞からの培地；レーン４、等量のｐＢＪ１６８２−
トランスフェクト細胞からの培地および擬似トランスフ
ェクト細胞からのリゼイト；レーン５、５０ｎｇの精製
した血清ＧＰＩ−ＰＬＤ；レーン６、擬似トランスフェ
クト細胞からの培地と混合した２００ｎｇの精製した血
清ＧＰＩ−ＰＬＤ。
配列および推定アミノ酸配列である。矢印は成熟蛋白の
Ｎ末端を示す。インテグリンαサブユニットの金属イオ
ン結合ドメインへの配列類似性を示す領域には下線が引
いてある。図６は、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞
の培地およびリゼイトのウェスターンブロット分析であ
る。完全２．６ｋｂクローン化ｃＤＮＡをｐＢＣ１２Ｂ
１のＨｉｎｄIII ／Ｓｍａｌ部位に連結し、この組み換
えプラスミドｐＢＪ１６８２を標準ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介法を使ってＣＯＳ−７細胞に導入した。ＣＯＳ
細胞は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ修飾イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）で最初の２４時間にわたり培養し、
その後内因性ＰＬＤを除くために１％ニュートリドーマ
（Nutridoma; Boehringer Mannheim, Indianapolis, I
N）を含む無血清ＤＭＥＭに交換した。無血清培地交換
の４８時間後に培地を集め、遠心して浮遊細胞をペレッ
ト化し、セントリコン１０（Centricon; Amicon, Danve
rs, MA）を使って１５倍に濃縮した。細胞リゼイトはア
プロチニン（３０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０μ
ｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１０μｇ／ｍｌ）、および
フッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）を含むＰＢ
Ｓ中の０．５％ノニデット（Nonidet ）Ｐ−４０ １ｍ
ｌあたり５ｘ１０7 細胞−同等物の濃度に調製した。こ
のリゼイトを１３，０００ｇ、４℃で２０分遠心し、上
清を集めた。ゲル電気泳動およびニトロセルロースへの
ブロッティング後、ウシ血清ＧＰＩ−ＰＬＤに対する５
種類のモノクローナル抗体（各々１μｇ／ｍｌ）のプー
ルおよびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ（Jackson Immuno-Research, WestGrove,PA）を使っ
て蛋白を検出した。レーン１、擬似トランスフェクト細
胞のリゼイト；レーン２、擬似トランスフェクト細胞か
らの培地；レーン３、等量のｐＢＪ１６８２−トランス
フェクト細胞からのリゼイトおよび擬似トランスフェク
ト細胞からの培地；レーン４、等量のｐＢＪ１６８２−
トランスフェクト細胞からの培地および擬似トランスフ
ェクト細胞からのリゼイト；レーン５、５０ｎｇの精製
した血清ＧＰＩ−ＰＬＤ；レーン６、擬似トランスフェ
クト細胞からの培地と混合した２００ｎｇの精製した血
清ＧＰＩ−ＰＬＤ。
【００１２】図７は、 3Ｈ標識ＶＳＧの加水分解による
トランスフェクトＣＯＳ細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＤ活
性の証明である。擬似トランスフェクトされたまたはｐ
ＢＪ１６８２−トランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、
図６で説明したトランスフェクションの２４時間後に無
血清培地に変えた。（Ａ）ホスホリパーゼ活性の時間依
存性。無血清培地に交換後いろいろな時点で培地からア
リコート（１０μｇ）を抜き取り、ホスホリパーゼ活性
について検定した。１単位の活性は１分あたりに１％の
〔3 Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧを加水分解する酵素の
量として定義される。△─△はＤＮＡトランスフェクト
細胞における活性を示す；○─○は擬似トランスフェク
ト細胞における活性を示す。（Ｂ）培地および細胞リゼ
イトにおけるホスホリパーゼ活性の比較。細胞を無血清
培地で４４時間増殖させた後、１０μｌの培地を抜き取
り、ホスホリパーゼ活性について検定した。細胞リゼイ
トは図６に記載する通りに調製し、同時に検定した。
トランスフェクトＣＯＳ細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＤ活
性の証明である。擬似トランスフェクトされたまたはｐ
ＢＪ１６８２−トランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、
図６で説明したトランスフェクションの２４時間後に無
血清培地に変えた。（Ａ）ホスホリパーゼ活性の時間依
存性。無血清培地に交換後いろいろな時点で培地からア
リコート（１０μｇ）を抜き取り、ホスホリパーゼ活性
について検定した。１単位の活性は１分あたりに１％の
〔3 Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧを加水分解する酵素の
量として定義される。△─△はＤＮＡトランスフェクト
細胞における活性を示す；○─○は擬似トランスフェク
ト細胞における活性を示す。（Ｂ）培地および細胞リゼ
イトにおけるホスホリパーゼ活性の比較。細胞を無血清
培地で４４時間増殖させた後、１０μｌの培地を抜き取
り、ホスホリパーゼ活性について検定した。細胞リゼイ
トは図６に記載する通りに調製し、同時に検定した。
【００１３】図８は、薄層クロマトグラフィーによる加
水分解ＶＳＧの生成物の分析である。ｐＢＪ１６８２−
および擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞培地と血清から
精製されたＧＰＩ−ＰＬＤの試料（５０μｌ）を、４０
μＭトリス−マレエート、ｐＨ７．０、０．２％ＮＰ−
４０、および３ｘ１０4 ｃｐｍ 3Ｈ標識ＶＳＧを含むＶ
ＳＧカクテル１００μｌと３７℃で３０分間インキュベ
ートした。この反応は０．５ｍｌブタノールの添加によ
り停止させ、２５μｇずつのジミリストイルホスファチ
ジン酸（ＤＭＰＡ）およびジミリストイルグリセロール
（ＤＭＧ）を加えた。遠心による相分離後、０．３５ｍ
ｌのブタノール上相を蒸発乾固させ、反応生成物を２０
μｌのＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）に懸濁
させて、ＤＭＰＡおよびＤＭＧ標準と一緒に、シリカゲ
ル６０Ｆ２５４プレート（Merck)にスポットした。プレ
ートはＣＨＣｌ3 ：ピリジン：７０％ギ酸（５０：３
０：７，ｖ／ｖ／ｖ）から成る溶剤系中で展開した。１
０ｃｍの距離を展開後、プレートを一晩自然乾燥させ、
標準を沃素で視覚化した。０．５ｃｍのゾーンをこすり
取り、１５０μｌのＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ：ブタノール
（１：１：１，ｖ／ｖ／ｖ）で溶出し、シンチレーショ
ン蛍光体中で計数した。○─○、擬似トランスフェクト
細胞培地；□─□、ｐＢＪ１６８２−トランスフェクト
細胞培地；●─●、精製された血清ＧＰＩ−ＰＬＤ。
水分解ＶＳＧの生成物の分析である。ｐＢＪ１６８２−
および擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞培地と血清から
精製されたＧＰＩ−ＰＬＤの試料（５０μｌ）を、４０
μＭトリス−マレエート、ｐＨ７．０、０．２％ＮＰ−
４０、および３ｘ１０4 ｃｐｍ 3Ｈ標識ＶＳＧを含むＶ
ＳＧカクテル１００μｌと３７℃で３０分間インキュベ
ートした。この反応は０．５ｍｌブタノールの添加によ
り停止させ、２５μｇずつのジミリストイルホスファチ
ジン酸（ＤＭＰＡ）およびジミリストイルグリセロール
（ＤＭＧ）を加えた。遠心による相分離後、０．３５ｍ
ｌのブタノール上相を蒸発乾固させ、反応生成物を２０
μｌのＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）に懸濁
させて、ＤＭＰＡおよびＤＭＧ標準と一緒に、シリカゲ
ル６０Ｆ２５４プレート（Merck)にスポットした。プレ
ートはＣＨＣｌ3 ：ピリジン：７０％ギ酸（５０：３
０：７，ｖ／ｖ／ｖ）から成る溶剤系中で展開した。１
０ｃｍの距離を展開後、プレートを一晩自然乾燥させ、
標準を沃素で視覚化した。０．５ｃｍのゾーンをこすり
取り、１５０μｌのＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ：ブタノール
（１：１：１，ｖ／ｖ／ｖ）で溶出し、シンチレーショ
ン蛍光体中で計数した。○─○、擬似トランスフェクト
細胞培地；□─□、ｐＢＪ１６８２−トランスフェクト
細胞培地；●─●、精製された血清ＧＰＩ−ＰＬＤ。
【００１４】図９は、ヒト肝臓グリコシルホスファチジ
ルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド
配列および推定上のアミノ酸配列である。図１０は、ヒ
トおよびウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ成熟蛋白のアミノ酸配
列の整合である。図１１は、ヒト膵臓グリコシルホスフ
ァチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤのヌクレ
オチド配列および推定上のアミノ酸配列である。
ルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド
配列および推定上のアミノ酸配列である。図１０は、ヒ
トおよびウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ成熟蛋白のアミノ酸配
列の整合である。図１１は、ヒト膵臓グリコシルホスフ
ァチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤのヌクレ
オチド配列および推定上のアミノ酸配列である。
【００１５】図１２は、ＰＬＤの存在下および不在下で
のＥＬＡＭ−１−ＧＰＩ（カラムＡ）およびＥＬＡＭ−
１−２−ＧＰＩ（カラムＢ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥである。さらに、本明細書では、次の略語が用いら
れる：ＧＰＩ、グリコシルホスファチジルイノシトー
ル；ＰＬＤ、ホスホリパーゼＤ；ＰＩ、ホスファチジル
イノシトール；ＶＳＧ、変異型表面糖蛋白；ＣＨＡＰ
Ｓ、（３−〔（３−クロラミドプロピル）シメチル−ア
ンモニオ〕１−プロパンスルホネート；ＰＥＧ、ポリエ
チレングリコール；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＥＧ
ＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢
酸；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＰＡＧＥ、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動；ＨＰ（またはＦＰ）Ｌ
Ｃ、高性能（または高速蛋白）液体クロマトグラフィ
ー；ＰＴＨ、フェニルチオヒダントイン；ＥＬＩＳＡ、
酵素免疫吸着検定法；ＨＲＰ、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ。
のＥＬＡＭ−１−ＧＰＩ（カラムＡ）およびＥＬＡＭ−
１−２−ＧＰＩ（カラムＢ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥである。さらに、本明細書では、次の略語が用いら
れる：ＧＰＩ、グリコシルホスファチジルイノシトー
ル；ＰＬＤ、ホスホリパーゼＤ；ＰＩ、ホスファチジル
イノシトール；ＶＳＧ、変異型表面糖蛋白；ＣＨＡＰ
Ｓ、（３−〔（３−クロラミドプロピル）シメチル−ア
ンモニオ〕１−プロパンスルホネート；ＰＥＧ、ポリエ
チレングリコール；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＥＧ
ＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢
酸；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＰＡＧＥ、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動；ＨＰ（またはＦＰ）Ｌ
Ｃ、高性能（または高速蛋白）液体クロマトグラフィ
ー；ＰＴＨ、フェニルチオヒダントイン；ＥＬＩＳＡ、
酵素免疫吸着検定法；ＨＲＰ、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ。
【００１６】ここに引用したすべての文献の教示内容は
参照によりここに引用されるものとする。本発明は、他
の蛋白を実質的に含まないグリコシルホスファチジルイ
ノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）
またはその生物学的に活性な断片に関する。この酵素は
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定
蛋白、ＧＰＩ脂質および関連分子のイノシトール−ホス
フェート結合を選択的に加水分解する。図１を参照され
たい。
参照によりここに引用されるものとする。本発明は、他
の蛋白を実質的に含まないグリコシルホスファチジルイ
ノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）
またはその生物学的に活性な断片に関する。この酵素は
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定
蛋白、ＧＰＩ脂質および関連分子のイノシトール−ホス
フェート結合を選択的に加水分解する。図１を参照され
たい。
【００１７】ウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのＤＮＡ配列およ
び推定アミノ酸配列は図５に示してある；ヒト肝臓ＧＰ
Ｉ−ＰＬＤのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は図９
に示してある；そして図１１はヒト膵臓ＧＰＩ−ＰＬＤ
のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。組み換え
ＤＮＡ技術の慣用方法を使って（例えば、Maniatiset a
l., “Molecular Cloning-A Laboratory Manual ”, C
old Spring HarborLaboratory, 1989 を参照）、組み換
えＧＰＩ−ＰＬＤをコードする発現ベクターを構築する
ことができる。これらの発現ベクターを原核および真核
細胞宿主に導入すると、組み換えＧＰＩ−ＰＬＤが合成
される。
び推定アミノ酸配列は図５に示してある；ヒト肝臓ＧＰ
Ｉ−ＰＬＤのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は図９
に示してある；そして図１１はヒト膵臓ＧＰＩ−ＰＬＤ
のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。組み換え
ＤＮＡ技術の慣用方法を使って（例えば、Maniatiset a
l., “Molecular Cloning-A Laboratory Manual ”, C
old Spring HarborLaboratory, 1989 を参照）、組み換
えＧＰＩ−ＰＬＤをコードする発現ベクターを構築する
ことができる。これらの発現ベクターを原核および真核
細胞宿主に導入すると、組み換えＧＰＩ−ＰＬＤが合成
される。
【００１８】本発明はまた、ＧＰＩ−ＰＬＤ蛋白または
その生物学的に活性な断片をコードする二本鎖あるいは
一本鎖のポリヌクレオチドに関する。ウシ肝臓ＧＰＩ−
ＰＬＤ、ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤおよびヒト膵臓ＧＰＩ
−ＰＬＤをコードするヌクレオチド配列はそれぞれ図
５、９および１１に示してある。従って、本発明はこれ
らのヌクレオチド配列またはそれらの相同もしくは縮重
配列に関し、これは同一機能を有するが異なる種（例え
ばヒト）に由来するヌクレオチド配列、あるいは遺伝暗
号の縮重の結果としてのヌクレオチド配列を意味する。
ポリヌクレオチドは天然源から得ることができ、また当
分野で習熟した者に知られた方法を使って合成的に製造
することもできる。
その生物学的に活性な断片をコードする二本鎖あるいは
一本鎖のポリヌクレオチドに関する。ウシ肝臓ＧＰＩ−
ＰＬＤ、ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤおよびヒト膵臓ＧＰＩ
−ＰＬＤをコードするヌクレオチド配列はそれぞれ図
５、９および１１に示してある。従って、本発明はこれ
らのヌクレオチド配列またはそれらの相同もしくは縮重
配列に関し、これは同一機能を有するが異なる種（例え
ばヒト）に由来するヌクレオチド配列、あるいは遺伝暗
号の縮重の結果としてのヌクレオチド配列を意味する。
ポリヌクレオチドは天然源から得ることができ、また当
分野で習熟した者に知られた方法を使って合成的に製造
することもできる。
【００１９】さらに、本発明は、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
を含む複製可能な微生物ベクター、この種の複製可能な
微生物ベクターで形質転換された宿主生物に関し、この
宿主は前記ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸配列を発現する能力をもっている。二本鎖ＤＮＡのク
ローニングには、宿主／クローニングベヒクルのいろい
ろな組合わせが使用される。例えば、有用なクローニン
グベヒクルは染色体、非染色体または合成ＤＮＡ配列の
セグメントから成り、例えば既知の細菌プラスミド
（例．ｐＢＲ３２２のような大腸菌プラスミド）、ファ
ージＤＮＡ、並びにプラスミドおよびファージＤＮＡの
組合わせから誘導されたベクター（例．ファージＤＮＡ
または他の発現調節配列もしくは酵母プラスミドを使用
するように修飾されたプラスミド）が含まれる。有用な
宿主には微生物、哺乳動物細胞、植物細胞などが含まれ
る。中でも、好ましくは微生物と哺乳動物細胞が利用さ
れる。好ましい微生物として、アクチノミセス（Actino
myces ）や大腸菌（Escherichia coli）のような酵母お
よび細菌を挙げることができる。哺乳動物宿主の中では
ＣＨＯ細胞が好適である。
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
を含む複製可能な微生物ベクター、この種の複製可能な
微生物ベクターで形質転換された宿主生物に関し、この
宿主は前記ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸配列を発現する能力をもっている。二本鎖ＤＮＡのク
ローニングには、宿主／クローニングベヒクルのいろい
ろな組合わせが使用される。例えば、有用なクローニン
グベヒクルは染色体、非染色体または合成ＤＮＡ配列の
セグメントから成り、例えば既知の細菌プラスミド
（例．ｐＢＲ３２２のような大腸菌プラスミド）、ファ
ージＤＮＡ、並びにプラスミドおよびファージＤＮＡの
組合わせから誘導されたベクター（例．ファージＤＮＡ
または他の発現調節配列もしくは酵母プラスミドを使用
するように修飾されたプラスミド）が含まれる。有用な
宿主には微生物、哺乳動物細胞、植物細胞などが含まれ
る。中でも、好ましくは微生物と哺乳動物細胞が利用さ
れる。好ましい微生物として、アクチノミセス（Actino
myces ）や大腸菌（Escherichia coli）のような酵母お
よび細菌を挙げることができる。哺乳動物宿主の中では
ＣＨＯ細胞が好適である。
【００２０】外来性ポリヌクレオチドを含むクローニン
グベヒクルまたはベクターは、そのポリヌクレオチドが
コードする蛋白またはその一部を宿主に発現させるべく
その宿主を形質転換するために使用される。適当な宿主
の選択は当分野で認められる多くの要因によっても左右
される。これらには、例えば、所定のベクターとの適合
性、ハイブリッドプラスミドによりコードされる蛋白の
毒性、目的とする蛋白の回収容易性、発現特性、生物安
全性およびコストが含まれる。本発明で使用するのに適
した発現ベクターは真核細胞の発現プラスミドｐＢＣ１
２ＢＩである（Cullen(1987), Methods in Enzymology
152, 684-704）。他の適当なクローニングまたは発現ベ
クターは実施例に記載されるか、または当分野で知られ
ている。
グベヒクルまたはベクターは、そのポリヌクレオチドが
コードする蛋白またはその一部を宿主に発現させるべく
その宿主を形質転換するために使用される。適当な宿主
の選択は当分野で認められる多くの要因によっても左右
される。これらには、例えば、所定のベクターとの適合
性、ハイブリッドプラスミドによりコードされる蛋白の
毒性、目的とする蛋白の回収容易性、発現特性、生物安
全性およびコストが含まれる。本発明で使用するのに適
した発現ベクターは真核細胞の発現プラスミドｐＢＣ１
２ＢＩである（Cullen(1987), Methods in Enzymology
152, 684-704）。他の適当なクローニングまたは発現ベ
クターは実施例に記載されるか、または当分野で知られ
ている。
【００２１】本発明はまた、天然ＧＰＩ−ＰＬＤの生物
学的活性を実質的に保持するＧＰＩ−ＰＬＤの変異体ま
たはその生物学的に活性な断片に関する。さらに、本発
明は変異型ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性な
断片をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は
また、変異型ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性
な断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクタ
ーに関する。これらの変異体はＤＮＡ配列の部位特異的
突然変異誘発、突然変異ＤＮＡ構築物の発現ベクターへ
の挿入、および発現ベクターを適当な原核または真核細
胞宿主に導入することによる変異型ＧＰＩ−ＰＬＤの生
産のような既知方法を使って製造することができる。ま
た、変異型ＧＰＩ−ＰＬＤはＧＰＩ−ＰＬＤ蛋白の酵素
による切断および固相合成によっても製造される。変異
型蛋白はその後ここに記載される検定法によってＰＬＤ
活性を示す能力について検定される。
学的活性を実質的に保持するＧＰＩ−ＰＬＤの変異体ま
たはその生物学的に活性な断片に関する。さらに、本発
明は変異型ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性な
断片をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は
また、変異型ＧＰＩ−ＰＬＤまたはその生物学的に活性
な断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクタ
ーに関する。これらの変異体はＤＮＡ配列の部位特異的
突然変異誘発、突然変異ＤＮＡ構築物の発現ベクターへ
の挿入、および発現ベクターを適当な原核または真核細
胞宿主に導入することによる変異型ＧＰＩ−ＰＬＤの生
産のような既知方法を使って製造することができる。ま
た、変異型ＧＰＩ−ＰＬＤはＧＰＩ−ＰＬＤ蛋白の酵素
による切断および固相合成によっても製造される。変異
型蛋白はその後ここに記載される検定法によってＰＬＤ
活性を示す能力について検定される。
【００２２】本発明によれば、ＧＰＩ−ＰＬＤは実施例
１に記載する方法により精製され、性状決定される。Ｇ
ＰＩ−ＰＬＤの精製のために開発され、それに使用しう
る方法は以下で論じられ、それぞれの精製段階で得られ
た活性酵素化合物の同定について記載する。この方法で
は、大部分の血清アルブミンと一部の他の夾雑蛋白がＰ
ＥＧ沈降により除かれた。上清をその後Ｑセファロース
（アニオン交換）でクロマトグラフィーにかけ、続いて
Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。ＧＰ
Ｉ−ＰＬＤ活性は≧２５０ｋＤａの分子量を示す広い第
二蛋白ピークに溶出された。この広い活性溶出は血清中
のＧＰＩ−ＰＬＤが他の血清蛋白と複合体を形成してい
ることを示唆するものである。
１に記載する方法により精製され、性状決定される。Ｇ
ＰＩ−ＰＬＤの精製のために開発され、それに使用しう
る方法は以下で論じられ、それぞれの精製段階で得られ
た活性酵素化合物の同定について記載する。この方法で
は、大部分の血清アルブミンと一部の他の夾雑蛋白がＰ
ＥＧ沈降により除かれた。上清をその後Ｑセファロース
（アニオン交換）でクロマトグラフィーにかけ、続いて
Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。ＧＰ
Ｉ−ＰＬＤ活性は≧２５０ｋＤａの分子量を示す広い第
二蛋白ピークに溶出された。この広い活性溶出は血清中
のＧＰＩ−ＰＬＤが他の血清蛋白と複合体を形成してい
ることを示唆するものである。
【００２３】ＧＰＩ−ＰＬＤは小麦胚芽レクチン−セフ
ァロースおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーによりさらに精製した。この段階で、ＧＰＩ−ＰＬＤ
は、Lemmli, U.K.(1970), Nature, 227, 680-685に記載
される方法を使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定して、
約１０％の純度であった。精製の最終段階はＺｎキレー
トクロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣおよびス
ペロース（Superose）１２−ＨＰＬＣから成っていた。
ヒドロキシアパタイト精製物質をＺｎキレートでクロマ
トグラフィーにかけたとき、２つのＧＰＩ−ＰＬＤ活性
ピークが観察された。第一の活性ピーク（プール１）は
洗液画分に溶出され、大部分の夾雑蛋白から分離されて
比較的高い比活性を示した。このプールはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで〜１００ｋＤａの見掛け分子量を有する主要蛋白
バンドとその他の少量の蛋白バンドを含んでいた。第二
活性ピーク（プール２）は１０ｍＭヒスチジンにより溶
出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで〜１００および〜１８０ｋ
Ｄａの分子量を有する２本の主要蛋白バンドと数種の少
量成分を含んでいた。
ァロースおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーによりさらに精製した。この段階で、ＧＰＩ−ＰＬＤ
は、Lemmli, U.K.(1970), Nature, 227, 680-685に記載
される方法を使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定して、
約１０％の純度であった。精製の最終段階はＺｎキレー
トクロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣおよびス
ペロース（Superose）１２−ＨＰＬＣから成っていた。
ヒドロキシアパタイト精製物質をＺｎキレートでクロマ
トグラフィーにかけたとき、２つのＧＰＩ−ＰＬＤ活性
ピークが観察された。第一の活性ピーク（プール１）は
洗液画分に溶出され、大部分の夾雑蛋白から分離されて
比較的高い比活性を示した。このプールはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで〜１００ｋＤａの見掛け分子量を有する主要蛋白
バンドとその他の少量の蛋白バンドを含んでいた。第二
活性ピーク（プール２）は１０ｍＭヒスチジンにより溶
出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで〜１００および〜１８０ｋ
Ｄａの分子量を有する２本の主要蛋白バンドと数種の少
量成分を含んでいた。
【００２４】Ｚｎキレートクロマトグラフィーからの２
つの活性プールは別々にＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣでさらに
精製した。Ｚｎキレートプール１はＭｏｎｏＱ−ＨＰＬ
Ｃにより０．２Ｍ ＮａＣｌで単一の活性ピークとして
溶出され、これは図２のレーン２に示すようにＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分子量〜１００ｋＤａの単一バンドに相当し
た。対照的に、Ｚｎキレートプール２はＭｏｎｏＱ−Ｈ
ＰＬＣにより０．２Ｍおよび０．３Ｍ ＮａＣｌで２つ
の活性ピークに分割された。両方のピークは図２のレー
ン３に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで〜１００ｋＤａの
主要蛋白バンドと〜１８０ｋＤａに相当する別のバンド
を含んでいた。
つの活性プールは別々にＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣでさらに
精製した。Ｚｎキレートプール１はＭｏｎｏＱ−ＨＰＬ
Ｃにより０．２Ｍ ＮａＣｌで単一の活性ピークとして
溶出され、これは図２のレーン２に示すようにＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分子量〜１００ｋＤａの単一バンドに相当し
た。対照的に、Ｚｎキレートプール２はＭｏｎｏＱ−Ｈ
ＰＬＣにより０．２Ｍおよび０．３Ｍ ＮａＣｌで２つ
の活性ピークに分割された。両方のピークは図２のレー
ン３に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで〜１００ｋＤａの
主要蛋白バンドと〜１８０ｋＤａに相当する別のバンド
を含んでいた。
【００２５】Ｚｎキレートプール１に溶出された物質を
スペロース１２−ＨＰＬＣで分析したとき、この溶出プ
ロフィールは、ＧＰＩ−ＰＬＤが分子量マーカー（Bio-
Radのゲル濾過標品）により測定して約２００ｋＤａの
見掛け分子量を有する単一ピークとして溶出され、この
酵素がダイマーとして存在することを示した。しかしな
がら、Ｚｎキレートプール２のピーク２の物質をスペロ
ース１２−ＨＰＬＣで分析したとき、３つの活性ピーク
が観察された。実際の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た結果、大部分のＧＰＩ−ＰＬＤは２００ｋＤａより高
い分子量を有する領域に相当する画分に溶出されること
が見いだされ、これはＧＰＩ−ＰＬＤがより高分子量の
アグリゲートとして溶出されることを示唆した。高分子
量アグリゲート（ピーク１）は基質としてアルカリホス
ファターゼ（１．０ｘ１０3 Ｕ／ｍｇ）よりもＶＳＧ
（〜２．３ｘ１０4 Ｕ／ｍｇ）に対して一層高い比活性
を示した。
スペロース１２−ＨＰＬＣで分析したとき、この溶出プ
ロフィールは、ＧＰＩ−ＰＬＤが分子量マーカー（Bio-
Radのゲル濾過標品）により測定して約２００ｋＤａの
見掛け分子量を有する単一ピークとして溶出され、この
酵素がダイマーとして存在することを示した。しかしな
がら、Ｚｎキレートプール２のピーク２の物質をスペロ
ース１２−ＨＰＬＣで分析したとき、３つの活性ピーク
が観察された。実際の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た結果、大部分のＧＰＩ−ＰＬＤは２００ｋＤａより高
い分子量を有する領域に相当する画分に溶出されること
が見いだされ、これはＧＰＩ−ＰＬＤがより高分子量の
アグリゲートとして溶出されることを示唆した。高分子
量アグリゲート（ピーク１）は基質としてアルカリホス
ファターゼ（１．０ｘ１０3 Ｕ／ｍｇ）よりもＶＳＧ
（〜２．３ｘ１０4 Ｕ／ｍｇ）に対して一層高い比活性
を示した。
【００２６】実施例１には、スペロース１２−ＨＰＬＣ
段階を含む上記のプロトコールを利用して、２．５リッ
トルのウシ血清からＧＰＩ−ＰＬＤを精製することが要
約してある。Ｚｎキレート、プール１から精製されたダ
イマーＧＰＩ−ＰＬＤは最も高い比活性を示した（アル
カリホスファターゼおよびＶＳＧに対してそれぞれ６．
３ｘ１０5 および４．５ｘ１０5 Ｕ／ｍｇ）。これは〜
２，２５０倍の精製および約０．５％の全回収率を表す
（表１）。
段階を含む上記のプロトコールを利用して、２．５リッ
トルのウシ血清からＧＰＩ−ＰＬＤを精製することが要
約してある。Ｚｎキレート、プール１から精製されたダ
イマーＧＰＩ−ＰＬＤは最も高い比活性を示した（アル
カリホスファターゼおよびＶＳＧに対してそれぞれ６．
３ｘ１０5 および４．５ｘ１０5 Ｕ／ｍｇ）。これは〜
２，２５０倍の精製および約０．５％の全回収率を表す
（表１）。
【００２７】本発明はさらに他の蛋白を実質的に含まな
いＧＰＩ−ＰＬＤまたはその断片、もしくはＧＰＩ−Ｐ
ＬＤ変異体またはその断片に対して特異的な抗体に関す
る。これらの抗体は例えば以下でおよび実施例１で述べ
るようなＧＰＩ−ＰＬＤ活性化合物の精製に使用するの
に適している。ＧＰＩ−ＰＬＤに対するモノクローナル抗体の生産 ダイマーおよびアグリゲートＧＰＩ−ＰＬＤの混合物を
免疫原として使って、マウスにＧＰＩ−ＰＬＤに対する
ポリクローナル抗血清を産生せしめた。３匹の免疫マウ
スはすべてＥＬＩＳＡ分析で測定したとき免疫原に対す
る抗体を産生した。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は精製した又は
部分精製した蛋白を使用したとき抗血清により完全に失
活した。部分精製した物質をイムノブロッティングで分
析すると、１００ｋＤａ蛋白が抗血清と反応性であった
（データは示してない）。
いＧＰＩ−ＰＬＤまたはその断片、もしくはＧＰＩ−Ｐ
ＬＤ変異体またはその断片に対して特異的な抗体に関す
る。これらの抗体は例えば以下でおよび実施例１で述べ
るようなＧＰＩ−ＰＬＤ活性化合物の精製に使用するの
に適している。ＧＰＩ−ＰＬＤに対するモノクローナル抗体の生産 ダイマーおよびアグリゲートＧＰＩ−ＰＬＤの混合物を
免疫原として使って、マウスにＧＰＩ−ＰＬＤに対する
ポリクローナル抗血清を産生せしめた。３匹の免疫マウ
スはすべてＥＬＩＳＡ分析で測定したとき免疫原に対す
る抗体を産生した。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は精製した又は
部分精製した蛋白を使用したとき抗血清により完全に失
活した。部分精製した物質をイムノブロッティングで分
析すると、１００ｋＤａ蛋白が抗血清と反応性であった
（データは示してない）。
【００２８】１００ｋＤａ蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤである
ことをさらに確かめるために、この酵素に対するモノク
ローナル抗体が生産された。血清はＧＰＩ−ＰＬＤを含
むので、ハイブリドーマは融合後無血清培地で増殖させ
た。我々はＧＰＩ−ＰＬＤ活性の中和によりハイブリド
ーマをスクリーニングすることを試みた。ハイブリドー
マの上清はＥＬＩＳＡで分析した。高レベルのＩｇＧ抗
体を分泌するクローンは、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性に対する
免疫枯渇検定法（immunodepletion assay ）でさらにス
クリーニングした。サブクローニング後に２４個のクロ
ーンが得られた。免疫沈降生成物をさらに分析するため
に、免疫枯渇検定法において 125Ｉ標識免疫原を使用
し、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果は、ハ
イブリドーマ上清中の抗体がＧＰＩ−ＰＬＤ活性および
１００ｋＤａ蛋白を選択的に沈降させたことを示す（デ
ータは示してない）。
ことをさらに確かめるために、この酵素に対するモノク
ローナル抗体が生産された。血清はＧＰＩ−ＰＬＤを含
むので、ハイブリドーマは融合後無血清培地で増殖させ
た。我々はＧＰＩ−ＰＬＤ活性の中和によりハイブリド
ーマをスクリーニングすることを試みた。ハイブリドー
マの上清はＥＬＩＳＡで分析した。高レベルのＩｇＧ抗
体を分泌するクローンは、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性に対する
免疫枯渇検定法（immunodepletion assay ）でさらにス
クリーニングした。サブクローニング後に２４個のクロ
ーンが得られた。免疫沈降生成物をさらに分析するため
に、免疫枯渇検定法において 125Ｉ標識免疫原を使用
し、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果は、ハ
イブリドーマ上清中の抗体がＧＰＩ−ＰＬＤ活性および
１００ｋＤａ蛋白を選択的に沈降させたことを示す（デ
ータは示してない）。
【００２９】ＥＬＩＳＡ陽性および免疫枯渇陽性ウェル
からの細胞をサブクローニングした。２４個のクローン
を単離し、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス内で腹水腫として
増殖させた。モノクローナル抗体は精製後、イムノブロ
ット分析により１００ｋＤａ蛋白との反応性についてス
クリーニングした。それらのうちで、１９個が強い反応
性を示した。１００ｋＤａ蛋白の免疫反応性は抗体濃度
に依存し、過剰の抗体で飽和された。過剰の精製ＧＰＩ
−ＰＬＤによる抗体の予備吸収は免疫反応性を減少させ
た。精製抗体はまた溶液中でのＧＰＩ−ＰＬＤ活性の直
接阻害についてスクリーニングした。それらはどれもＧ
ＰＩ−ＰＬＤを阻害しなかった。イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＧＰＩ
−ＰＬＤの精製 モノクローナル抗体のうちどれがイムノアフィニティー
クロマトグラフィーに最も適しているかを調べるための
実験を行った。ＥＬＩＳＡでＧＰＩ−ＰＬＤに対して異
なる親和性を有する抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース
に別々に結合させた。粗製ウシ血清をイムノアフィニテ
ィーカラムに負荷し、異なる試薬を使ってＧＰＩ−ＰＬ
Ｄ活性を溶出した。結果は、低親和性抗体を使用すると
き、結合ＧＰＩ−ＰＬＤが活性の約６０％の回収率で３
Ｍ ＭｇＣｌ2 により溶出されることを示した。しかし
ながら、高親和性抗体を使用した場合は、極めて少量の
ＧＰＩ−ＰＬＤが３Ｍ ＭｇＣｌ2 で溶出されただけだ
った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は残存する結合蛋白の大部
分が０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．８）に
より溶出されることを示したが、酵素活性は失われた。
それ故に、イムノアフィニティー精製のために低親和性
抗体が選ばれた。イムノアフィニティークロマトグラフ
ィーからの溶出液は約９．７５ｘ１０3 Ｕ／ｍｇの比活
性を与え、これは１２３倍の精製を表す（表２参照）。
この比活性（精製酵素は４．５ｘ１０5 Ｕ／ｍｇの比活
性をもつと仮定する）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基
づいて、ＧＰＩ−ＰＬＤ純度は約２％であると算出され
た。図３のレーン１を参照されたい。
からの細胞をサブクローニングした。２４個のクローン
を単離し、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス内で腹水腫として
増殖させた。モノクローナル抗体は精製後、イムノブロ
ット分析により１００ｋＤａ蛋白との反応性についてス
クリーニングした。それらのうちで、１９個が強い反応
性を示した。１００ｋＤａ蛋白の免疫反応性は抗体濃度
に依存し、過剰の抗体で飽和された。過剰の精製ＧＰＩ
−ＰＬＤによる抗体の予備吸収は免疫反応性を減少させ
た。精製抗体はまた溶液中でのＧＰＩ−ＰＬＤ活性の直
接阻害についてスクリーニングした。それらはどれもＧ
ＰＩ−ＰＬＤを阻害しなかった。イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＧＰＩ
−ＰＬＤの精製 モノクローナル抗体のうちどれがイムノアフィニティー
クロマトグラフィーに最も適しているかを調べるための
実験を行った。ＥＬＩＳＡでＧＰＩ−ＰＬＤに対して異
なる親和性を有する抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース
に別々に結合させた。粗製ウシ血清をイムノアフィニテ
ィーカラムに負荷し、異なる試薬を使ってＧＰＩ−ＰＬ
Ｄ活性を溶出した。結果は、低親和性抗体を使用すると
き、結合ＧＰＩ−ＰＬＤが活性の約６０％の回収率で３
Ｍ ＭｇＣｌ2 により溶出されることを示した。しかし
ながら、高親和性抗体を使用した場合は、極めて少量の
ＧＰＩ−ＰＬＤが３Ｍ ＭｇＣｌ2 で溶出されただけだ
った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は残存する結合蛋白の大部
分が０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．８）に
より溶出されることを示したが、酵素活性は失われた。
それ故に、イムノアフィニティー精製のために低親和性
抗体が選ばれた。イムノアフィニティークロマトグラフ
ィーからの溶出液は約９．７５ｘ１０3 Ｕ／ｍｇの比活
性を与え、これは１２３倍の精製を表す（表２参照）。
この比活性（精製酵素は４．５ｘ１０5 Ｕ／ｍｇの比活
性をもつと仮定する）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基
づいて、ＧＰＩ−ＰＬＤ純度は約２％であると算出され
た。図３のレーン１を参照されたい。
【００３０】イムノアフィニティー精製ＧＰＩ−ＰＬＤ
は３Ｍ ＭｇＣｌ2中に安定した状態で貯蔵することが
できなかったので、それは直ちに２．５ｍＭずつのＣａ
Ｃｌ2 と酢酸亜鉛を補給した緩衝液Ｃ（実施例１参照）
で６倍に希釈した。希釈緩衝液中のカルシウムおよび亜
鉛イオンは、酵素活性がカルシウムおよび亜鉛イオンに
依存してＭｇ2+に依存しないという以前の観察と一致し
て、この酵素活性を安定化させると思われた。その後、
希釈試料中のＧＰＩ−ＰＬＤは小麦胚芽レクチンセファ
ロースでさらに精製した。表２に示すように、レクチン
セファロースクロマトグラフィーにより１０倍の精製が
達成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３、レーン２）で、
レクチンセファロース溶出液は、主要な夾雑蛋白が試料
中にまだ存在するが、１００ｋＤａのＧＰＩ−ＰＬＤが
濃縮されたことを示した。ＧＰＩ−ＰＬＤはＭｏｎｏＱ
−ＦＰＬＣでさらに精製した。溶出プロフィールは、極
めて少量の活性が０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出されるが、
大部分の活性は０．２ＭＮａＣｌでピーク中に溶出され
ることを示した。この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析す
ると、主要活性ピークは１００ｋＤａの分子量を有する
単一バンドを示した。図３のレーン３を参照されたい。
小さい活性ピーク中の試料も他の夾雑蛋白と共に少量
（カラムから回収された全ＧＰＩ−ＰＬＤの１０％未
満）の１００ｋＤａ蛋白を示した。精製したＧＰＩ−Ｐ
ＬＤをスペロース１２−ＨＰＬＣで分析すると、それは
２００ｋＤａの見掛け分子量を有する単一ピークとして
溶出された。
は３Ｍ ＭｇＣｌ2中に安定した状態で貯蔵することが
できなかったので、それは直ちに２．５ｍＭずつのＣａ
Ｃｌ2 と酢酸亜鉛を補給した緩衝液Ｃ（実施例１参照）
で６倍に希釈した。希釈緩衝液中のカルシウムおよび亜
鉛イオンは、酵素活性がカルシウムおよび亜鉛イオンに
依存してＭｇ2+に依存しないという以前の観察と一致し
て、この酵素活性を安定化させると思われた。その後、
希釈試料中のＧＰＩ−ＰＬＤは小麦胚芽レクチンセファ
ロースでさらに精製した。表２に示すように、レクチン
セファロースクロマトグラフィーにより１０倍の精製が
達成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３、レーン２）で、
レクチンセファロース溶出液は、主要な夾雑蛋白が試料
中にまだ存在するが、１００ｋＤａのＧＰＩ−ＰＬＤが
濃縮されたことを示した。ＧＰＩ−ＰＬＤはＭｏｎｏＱ
−ＦＰＬＣでさらに精製した。溶出プロフィールは、極
めて少量の活性が０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出されるが、
大部分の活性は０．２ＭＮａＣｌでピーク中に溶出され
ることを示した。この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析す
ると、主要活性ピークは１００ｋＤａの分子量を有する
単一バンドを示した。図３のレーン３を参照されたい。
小さい活性ピーク中の試料も他の夾雑蛋白と共に少量
（カラムから回収された全ＧＰＩ−ＰＬＤの１０％未
満）の１００ｋＤａ蛋白を示した。精製したＧＰＩ−Ｐ
ＬＤをスペロース１２−ＨＰＬＣで分析すると、それは
２００ｋＤａの見掛け分子量を有する単一ピークとして
溶出された。
【００３１】実施例１中の表２には、上で述べたような
イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いた２０
０ｍｌのウシ血清からのＧＰＩ−ＰＬＤの精製が要約し
てある。イムノアフィニティー法から精製されたＧＰＩ
−ＰＬＤの比活性は８段階法で得られたものとほぼ同じ
であった。しかしながら、全回収率（２６％）はかなり
高かった。ＧＰＩ−ＰＬＤの性状決定 精製ＧＰＩ−ＰＬＤによる〔 3Ｈ〕ミリステート標識Ｖ
ＳＧ加水分解の生成物は、シリカゲルによる薄層クロマ
トグラフィーにより２種類の異なる溶剤系（クロロホル
ム：ピリジン：７０％ギ酸、５０：３０：７またはクロ
ロホルム：メタノール：氷酢酸：Ｈ2 Ｏ、５０：３０：
８：４）を使って分析した。 3Ｈ標識生成物はジミリス
チルホスファチジン酸標準と共に泳動した。ミリスチン
酸や１，２−ジミリストイルグリセロールのような他の
存在しうるホスホリパーゼ生成物は検出できなかった
（すなわち、回収された放射能の５％未満）。この結果
はダイマー形とより高分子量のアグリゲートの両方の場
合に得られた。
イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いた２０
０ｍｌのウシ血清からのＧＰＩ−ＰＬＤの精製が要約し
てある。イムノアフィニティー法から精製されたＧＰＩ
−ＰＬＤの比活性は８段階法で得られたものとほぼ同じ
であった。しかしながら、全回収率（２６％）はかなり
高かった。ＧＰＩ−ＰＬＤの性状決定 精製ＧＰＩ−ＰＬＤによる〔 3Ｈ〕ミリステート標識Ｖ
ＳＧ加水分解の生成物は、シリカゲルによる薄層クロマ
トグラフィーにより２種類の異なる溶剤系（クロロホル
ム：ピリジン：７０％ギ酸、５０：３０：７またはクロ
ロホルム：メタノール：氷酢酸：Ｈ2 Ｏ、５０：３０：
８：４）を使って分析した。 3Ｈ標識生成物はジミリス
チルホスファチジン酸標準と共に泳動した。ミリスチン
酸や１，２−ジミリストイルグリセロールのような他の
存在しうるホスホリパーゼ生成物は検出できなかった
（すなわち、回収された放射能の５％未満）。この結果
はダイマー形とより高分子量のアグリゲートの両方の場
合に得られた。
【００３２】ＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロリ
ンに対する酵素活性の感受性が研究された。表３はすべ
ての酵素活性がＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロ
リンにより阻害され、すべての形のＧＰＩ−ＰＬＤが金
属イオンの必要性を共有することを示している。ダイマ
ーおよびアグリゲート形のＧＰＩ−ＰＬＤの物理的性質
をさらに研究するために、精製ＧＰＩ−ＰＬＤを 125Ｉ
で標識し、スペロース１２−ＨＰＬＣを使って異なる形
のＧＰＩ−ＰＬＤを分離した。その後、それぞれの形の
ＧＰＩ−ＰＬＤを再度スペロース１２−ＨＰＬＣにかけ
た。結果は、これらの形の溶出位置が未変化のままであ
り、これらの形が互いに平衡状態でないことを示した。
ンに対する酵素活性の感受性が研究された。表３はすべ
ての酵素活性がＥＧＴＡおよび１，１０−フェナントロ
リンにより阻害され、すべての形のＧＰＩ−ＰＬＤが金
属イオンの必要性を共有することを示している。ダイマ
ーおよびアグリゲート形のＧＰＩ−ＰＬＤの物理的性質
をさらに研究するために、精製ＧＰＩ−ＰＬＤを 125Ｉ
で標識し、スペロース１２−ＨＰＬＣを使って異なる形
のＧＰＩ−ＰＬＤを分離した。その後、それぞれの形の
ＧＰＩ−ＰＬＤを再度スペロース１２−ＨＰＬＣにかけ
た。結果は、これらの形の溶出位置が未変化のままであ
り、これらの形が互いに平衡状態でないことを示した。
【００３３】ダイマーおよびより大きいアグリゲート形
の１００ｋＤａ蛋白は分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離
し、アミノ末端配列分析に付した。結果はすべての形の
ＧＰＩ−ＰＬＤが同じアミノ末端配列（Ｈ2 Ｎ−Ｘ−Ｇ
−Ｉ−Ｓ−Ｔ−（Ｈ）−Ｉ−Ｅ−Ｉ−Ｇ−Ｘ−（Ｒ）−
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ−Ｌ−−）を共有することを示す。コン
ピュータープログラムＴＦＡＳＴＡおよびＳＥＡＲＣＨ
を用いたＧｅｎＢａｎｋおよびＮＢＲＦデータベースの
範囲内の検索は、他の既知蛋白の配列に対する強い配列
相同を全く示さなかった。
の１００ｋＤａ蛋白は分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離
し、アミノ末端配列分析に付した。結果はすべての形の
ＧＰＩ−ＰＬＤが同じアミノ末端配列（Ｈ2 Ｎ−Ｘ−Ｇ
−Ｉ−Ｓ−Ｔ−（Ｈ）−Ｉ−Ｅ−Ｉ−Ｇ−Ｘ−（Ｒ）−
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ−Ｌ−−）を共有することを示す。コン
ピュータープログラムＴＦＡＳＴＡおよびＳＥＡＲＣＨ
を用いたＧｅｎＢａｎｋおよびＮＢＲＦデータベースの
範囲内の検索は、他の既知蛋白の配列に対する強い配列
相同を全く示さなかった。
【００３４】これらの形のＧＰＩ−ＰＬＤ間の一次構造
関係はそれらのトリプシンペプチド地図を比較すること
によっても研究された。両方の試料をトリプシンで消化
し、切断生成物をＣ8 カラムによる逆相ＨＰＬＣで分離
した。トリプシンペプチド地図はほとんど同じであり、
このことは２つの形のＧＰＩ−ＰＬＤが同一蛋白を表す
か、または構造的に非常に類似することを示している。
関係はそれらのトリプシンペプチド地図を比較すること
によっても研究された。両方の試料をトリプシンで消化
し、切断生成物をＣ8 カラムによる逆相ＨＰＬＣで分離
した。トリプシンペプチド地図はほとんど同じであり、
このことは２つの形のＧＰＩ−ＰＬＤが同一蛋白を表す
か、または構造的に非常に類似することを示している。
【００３５】トリプシンペプチドは蛋白ミクロシークエ
ンス分析によりさらに分析した。実施例１中の表４に
は、９のピーク画分から誘導された配列が要約してあ
る。本発明はまた、真核細胞から分泌可能な蛋白を生産
する方法に関し、この方法は次の段階： ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を有するポリペプチドをコード
する組み換えベクターおよびＧＰＩ固定蛋白をコードす
る組み換えベクターで宿主細胞を形質転換すること； ｂ）形質転換細胞を両蛋白が発現されるような適当な生
育条件下で培養すること；および ｃ）ＧＰＩアンカーが切り離された該蛋白を単離するこ
と；から成っている。
ンス分析によりさらに分析した。実施例１中の表４に
は、９のピーク画分から誘導された配列が要約してあ
る。本発明はまた、真核細胞から分泌可能な蛋白を生産
する方法に関し、この方法は次の段階： ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を有するポリペプチドをコード
する組み換えベクターおよびＧＰＩ固定蛋白をコードす
る組み換えベクターで宿主細胞を形質転換すること； ｂ）形質転換細胞を両蛋白が発現されるような適当な生
育条件下で培養すること；および ｃ）ＧＰＩアンカーが切り離された該蛋白を単離するこ
と；から成っている。
【００３６】分泌可能な蛋白は、対象の蛋白をコードす
るＤＮＡ配列を、グリコシルホスファチジルイノシトー
ルアンカー（ＧＰＩアンカー）の蛋白への結合を合図す
るペプチドをコードするＤＮＡ配列と、スプライスする
ことにより生産される。ＧＰＩアンカーの蛋白への結合
を合図するこのようなＣ末端ＧＰＩシグナルペプチドの
例はＣＤ１６のＣ末端３７アミノ酸を有するペプチド、
すなわち：
るＤＮＡ配列を、グリコシルホスファチジルイノシトー
ルアンカー（ＧＰＩアンカー）の蛋白への結合を合図す
るペプチドをコードするＤＮＡ配列と、スプライスする
ことにより生産される。ＧＰＩアンカーの蛋白への結合
を合図するこのようなＣ末端ＧＰＩシグナルペプチドの
例はＣＤ１６のＣ末端３７アミノ酸を有するペプチド、
すなわち：
【００３７】
【式１】
【００３８】
【００３９】である。Ｃ末端ＧＰＩシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列は、蛋白−ＧＰＩアンカー構築物
を形成するために蛋白の機能ドメインをコードするＤＮ
Ａ配列にスプライスされる。蛋白−ＧＰＩアンカーハイ
ブリッド構築物はその後、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする
遺伝子と共に、蛋白−ＧＰＩアンカーシグナルペプチド
ハイブリッド構築物とＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子の両方が発
現されるようにＣＯＳ細胞のような真核細胞にトランス
フェクトされる。ＧＰＩアンカーは蛋白に結合されてＧ
ＰＩアンカー−蛋白を形成する；ＧＰＩ−ＰＬＤ酵素は
アンカーを切り離し、蛋白を細胞から分泌させる。この
ような方法で生産・分泌されうる蛋白の例は、２，３の
名を挙げると、ＣＤ４、ＥＬＡＭ−１、ＩＬ−２レセプ
ターのｐ７０のようなサイトカインレセプター、インテ
グリンおよびセレクチンファミリーの仲間である。
コードするＤＮＡ配列は、蛋白−ＧＰＩアンカー構築物
を形成するために蛋白の機能ドメインをコードするＤＮ
Ａ配列にスプライスされる。蛋白−ＧＰＩアンカーハイ
ブリッド構築物はその後、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする
遺伝子と共に、蛋白−ＧＰＩアンカーシグナルペプチド
ハイブリッド構築物とＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子の両方が発
現されるようにＣＯＳ細胞のような真核細胞にトランス
フェクトされる。ＧＰＩアンカーは蛋白に結合されてＧ
ＰＩアンカー−蛋白を形成する；ＧＰＩ−ＰＬＤ酵素は
アンカーを切り離し、蛋白を細胞から分泌させる。この
ような方法で生産・分泌されうる蛋白の例は、２，３の
名を挙げると、ＣＤ４、ＥＬＡＭ−１、ＩＬ−２レセプ
ターのｐ７０のようなサイトカインレセプター、インテ
グリンおよびセレクチンファミリーの仲間である。
【００４０】本発明はまた、細胞が増殖している細胞培
養物に、ＣＨＡＰＳまたはＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０のよ
うな適当な界面活性剤と組合わせたＧＰＩ−ＰＬＤを投
与することから成る、グリコシルホスファチジルイノシ
トールアンカーによって細胞に固定されている蛋白を切
り離す方法に関する。ＧＰＩ−ＰＬＤアンカーを切り離
すためには、蛋白は必ずしも細胞に固定されている必要
はない。
養物に、ＣＨＡＰＳまたはＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０のよ
うな適当な界面活性剤と組合わせたＧＰＩ−ＰＬＤを投
与することから成る、グリコシルホスファチジルイノシ
トールアンカーによって細胞に固定されている蛋白を切
り離す方法に関する。ＧＰＩ−ＰＬＤアンカーを切り離
すためには、蛋白は必ずしも細胞に固定されている必要
はない。
【００４１】本発明は以下の実施例によりさらに例示さ
れるであろう。
れるであろう。
【００４２】
【００４３】
【実施例１】 ＰＬＤの精製および性状決定 物質─ウシ血清は Pel-Freez Biologicalsから得られ
た。ＰＥＧ−５０００はPolyscience Inc.から得られ
た。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Ultrogel）は
IBF Biotechnicsから入手した。ＣＮＢｒ活性化セファ
ロース、Ｑセファロース、小麦胚芽レクチン−セファロ
ースおよびセファクリルＳ−３００はPharmacia から得
られた。ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳおよび固定化（フラクト
ゲルＴＳＫ ＨＷ−６５Ｆ）イミノジ酢酸は Pierce か
ら得られた。ＣＨＡＰＳ、４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、
トリトンＸ−１１４および１００、ノニデットＰ４０、
並びにヤギ抗マウスＩｇＧアガロースは Sigmaから入手
した。ＨＲＰ結合ヤギＦ（ａｂ′）２抗マウスＩｇＧは
ＴＡＧＯから得られた。雌Ｂａｌｂ／ｃおよびＢａｌｂ
／ｃＢｙＪマウスはそれぞれ Charles RiverLabsおよび
Jackson Labs から得られた。
た。ＰＥＧ−５０００はPolyscience Inc.から得られ
た。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Ultrogel）は
IBF Biotechnicsから入手した。ＣＮＢｒ活性化セファ
ロース、Ｑセファロース、小麦胚芽レクチン−セファロ
ースおよびセファクリルＳ−３００はPharmacia から得
られた。ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳおよび固定化（フラクト
ゲルＴＳＫ ＨＷ−６５Ｆ）イミノジ酢酸は Pierce か
ら得られた。ＣＨＡＰＳ、４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、
トリトンＸ−１１４および１００、ノニデットＰ４０、
並びにヤギ抗マウスＩｇＧアガロースは Sigmaから入手
した。ＨＲＰ結合ヤギＦ（ａｂ′）２抗マウスＩｇＧは
ＴＡＧＯから得られた。雌Ｂａｌｂ／ｃおよびＢａｌｂ
／ｃＢｙＪマウスはそれぞれ Charles RiverLabsおよび
Jackson Labs から得られた。
【００４４】本明細書に記載されるこれらおよび他の試
薬供給源は単に便宜上与えられるものであり、本発明を
制限するものではない。 溶液─緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、およ
び０．０１ｍＭ 酢酸亜鉛；緩衝液Ｂ：５０ｍＭ トリ
ス、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ、および０．０２％ ＮａＮ3 ；緩衝液Ｃ：５０
ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣｌ、０．６
％ ＣＨＡＰＳ、および０．０２％ ＮａＮ3 。
薬供給源は単に便宜上与えられるものであり、本発明を
制限するものではない。 溶液─緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、およ
び０．０１ｍＭ 酢酸亜鉛；緩衝液Ｂ：５０ｍＭ トリ
ス、ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ、および０．０２％ ＮａＮ3 ；緩衝液Ｃ：５０
ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣｌ、０．６
％ ＣＨＡＰＳ、および０．０２％ ＮａＮ3 。
【００４５】ＧＰＩ−ＰＬＤ検定─ＧＰＩ−ＰＬＤの８
段階精製のために、酵素活性は基質としてＧＰＩ固定胎
盤アルカリホスファターゼを使って、Low,M.G., and Pr
asad,A.R.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
980-984に記載される通りに検定した。一般的には、ア
ルカリホスファターゼ基質（Malik,A.S. and Low,M.G.
(1986) Biochem. J., 240, 519-527に記載されるように
精製した、１ｖｏｌのアルカリホスファターゼ、２ｖｏ
ｌの１％ＮＰ−４０および２ｖｏｌの０．２Ｍトリス−
マレエート、ｐＨ７を含む０．０５ｍｌ）は全容量０．
２ｍｌ中で試料のアリコートと３７℃で３０分間インキ
ュベートした。その後この混合物は０．８ｍｌの氷冷緩
衝液Ａで希釈した。アリコート（０．０５ｍｌ）を取り
出し、０．２ｍｌの緩衝液Ａおよび０．２５ｍｌの２％
予備凝縮トリトンＸ−１１４と混合した。全アルカリホ
スファターゼ活性検定用の０．１ｍｌアリコートを採取
した後、混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、
直ちに室温で２分間遠心し、そして上相（水相）の０．
１ｍｌアリコートを採取した。アルカリホスファターゼ
活性が調べられた。アンカー切断は上相中の活性（すな
わち、切断形態）を相分離前の全混合物中の活性と比較
することにより測定した。１単位は記載される検定条件
下で１分あたりに１％のアルカリホスファターゼを加水
分解する酵素の量として定義される。
段階精製のために、酵素活性は基質としてＧＰＩ固定胎
盤アルカリホスファターゼを使って、Low,M.G., and Pr
asad,A.R.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
980-984に記載される通りに検定した。一般的には、ア
ルカリホスファターゼ基質（Malik,A.S. and Low,M.G.
(1986) Biochem. J., 240, 519-527に記載されるように
精製した、１ｖｏｌのアルカリホスファターゼ、２ｖｏ
ｌの１％ＮＰ−４０および２ｖｏｌの０．２Ｍトリス−
マレエート、ｐＨ７を含む０．０５ｍｌ）は全容量０．
２ｍｌ中で試料のアリコートと３７℃で３０分間インキ
ュベートした。その後この混合物は０．８ｍｌの氷冷緩
衝液Ａで希釈した。アリコート（０．０５ｍｌ）を取り
出し、０．２ｍｌの緩衝液Ａおよび０．２５ｍｌの２％
予備凝縮トリトンＸ−１１４と混合した。全アルカリホ
スファターゼ活性検定用の０．１ｍｌアリコートを採取
した後、混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、
直ちに室温で２分間遠心し、そして上相（水相）の０．
１ｍｌアリコートを採取した。アルカリホスファターゼ
活性が調べられた。アンカー切断は上相中の活性（すな
わち、切断形態）を相分離前の全混合物中の活性と比較
することにより測定した。１単位は記載される検定条件
下で１分あたりに１％のアルカリホスファターゼを加水
分解する酵素の量として定義される。
【００４６】イムノアフィニティークロマトグラフィー
によるＧＰＩ−ＰＬＤの精製のために、〔 3Ｈ〕ミリス
テートで生合成的に標識したＶＳＧが基質として使用さ
れた。これは Hereld,D., Krakow,J.L., Bangs,J.D., H
art,G.W., and Englund,P.T.(1986) J. Biol. Chem., 2
61, 13813-13819に記載される方法の変法により製造し
た。一般的には、T.brucei（MItat 117 または118 ）を
感染ラットから調製し、in vitroにて〔 3Ｈ〕ミリスチ
ン酸で標識し、そして 3Ｈ標識ＶＳＧを単離した。〔 3
Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧ（４，０００−５，０００
ｃｐｍ、２μｇ）は０．０２ｍｌの０．２Ｍトリス−マ
レエート、ｐＨ７．０、０．０２ｍｌの１％ＮＰ−４０
および０．０６ｍｌのＨ2 Ｏと混合した。その後、基質
（０．１ｍｌ）をＧＰＩ−ＰＬＤ試料（０．１ｍｌ）と
３７℃で３０分間インキュベートした。この反応は１Ｍ
水酸化アンモニウムで飽和したブタノール０．５ｍｌの
添加により停止させた。ボルテックス混合後、１，５０
０ｘｇで３分間遠心して相を分離した。上（ブタノー
ル）相（０．３５ｍｌ）を抜き取り、４ｍｌのシンチレ
ーション流体と混合し、計数した。基質としてＶＳＧを
用いたＧＰＩ−ＰＬＤ活性の１単位は１分あたりに１％
の〔 3Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧを加水分解する酵素
の量として定義される。
によるＧＰＩ−ＰＬＤの精製のために、〔 3Ｈ〕ミリス
テートで生合成的に標識したＶＳＧが基質として使用さ
れた。これは Hereld,D., Krakow,J.L., Bangs,J.D., H
art,G.W., and Englund,P.T.(1986) J. Biol. Chem., 2
61, 13813-13819に記載される方法の変法により製造し
た。一般的には、T.brucei（MItat 117 または118 ）を
感染ラットから調製し、in vitroにて〔 3Ｈ〕ミリスチ
ン酸で標識し、そして 3Ｈ標識ＶＳＧを単離した。〔 3
Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧ（４，０００−５，０００
ｃｐｍ、２μｇ）は０．０２ｍｌの０．２Ｍトリス−マ
レエート、ｐＨ７．０、０．０２ｍｌの１％ＮＰ−４０
および０．０６ｍｌのＨ2 Ｏと混合した。その後、基質
（０．１ｍｌ）をＧＰＩ−ＰＬＤ試料（０．１ｍｌ）と
３７℃で３０分間インキュベートした。この反応は１Ｍ
水酸化アンモニウムで飽和したブタノール０．５ｍｌの
添加により停止させた。ボルテックス混合後、１，５０
０ｘｇで３分間遠心して相を分離した。上（ブタノー
ル）相（０．３５ｍｌ）を抜き取り、４ｍｌのシンチレ
ーション流体と混合し、計数した。基質としてＶＳＧを
用いたＧＰＩ−ＰＬＤ活性の１単位は１分あたりに１％
の〔 3Ｈ〕ミリステート標識ＶＳＧを加水分解する酵素
の量として定義される。
【００４７】ＧＰＩ−ＰＬＤの基質特異性を調べるため
に、精製ＧＰＩ−ＰＬＤによる〔 3Ｈ〕ミリステート標
識ＶＳＧ加水分解の生成物は、Low,M.G., and Prasad,
A.R.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 980-
984に記載されるように薄層クロマトグラフィーで分析
した。〔 3Ｈ〕コリン標識ホスファチジルコリンおよび
〔 3Ｈ〕イノシトール標識ＰＩの加水分解は上記のイン
キュベーション混合物中でＶＳＧの代わりにそれらを使
用することにより測定した。リン脂質から放出された水
溶性放射能は、Low,M.G., Stiernberg,J., Waneck,G.
L., Flavell,R.A.,and Kincade,P.W. (1988) J. Immuno
l. Methods, 113, 101-111 に記載されるように測定し
た。８段階法によるＧＰＩ−ＰＬＤの精製 この精製段階は表１に要約してある。
に、精製ＧＰＩ−ＰＬＤによる〔 3Ｈ〕ミリステート標
識ＶＳＧ加水分解の生成物は、Low,M.G., and Prasad,
A.R.S. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 980-
984に記載されるように薄層クロマトグラフィーで分析
した。〔 3Ｈ〕コリン標識ホスファチジルコリンおよび
〔 3Ｈ〕イノシトール標識ＰＩの加水分解は上記のイン
キュベーション混合物中でＶＳＧの代わりにそれらを使
用することにより測定した。リン脂質から放出された水
溶性放射能は、Low,M.G., Stiernberg,J., Waneck,G.
L., Flavell,R.A.,and Kincade,P.W. (1988) J. Immuno
l. Methods, 113, 101-111 に記載されるように測定し
た。８段階法によるＧＰＩ−ＰＬＤの精製 この精製段階は表１に要約してある。
【００４８】
【表１】
【００４９】ウシ血清（２．５ｌ）は０．５ｍＭ ＰＭ
ＳＦおよび０．０２％ ＮａＮ3 の存在下に４℃で解凍
した。４℃で攪拌しながら、ＰＥＧ−５０００を徐々に
加えて最終濃度を９％とした。この混合物をさらに１時
間攪拌し、１０，０００ｘｇで２５分間遠心した。上清
を回収し、等容量の緩衝液Ｂで希釈した。後続の精製段
階は、特に指定しない限り、すべて４℃で行った。
ＳＦおよび０．０２％ ＮａＮ3 の存在下に４℃で解凍
した。４℃で攪拌しながら、ＰＥＧ−５０００を徐々に
加えて最終濃度を９％とした。この混合物をさらに１時
間攪拌し、１０，０００ｘｇで２５分間遠心した。上清
を回収し、等容量の緩衝液Ｂで希釈した。後続の精製段
階は、特に指定しない限り、すべて４℃で行った。
【００５０】希釈上清は緩衝液Ｂで平衡化したＱセファ
ロースカラム（９ｘ１０ｃｍ）に３０ｍｌ／分の流速で
負荷した。平衡緩衝液で洗浄後、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を
４ｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．０２％ Ｎａ
Ｎ3 および０．５ｍＭ ＰＭＳＦ中の０．１−１．０Ｍ
ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。活性含有画分をプー
ルし、ＹＭ−１０（Amicon）メンブラン濾過で約２００
ｍｌに濃縮した。この濃縮物は縦に連結した２本のＳ−
３００カラム（１０ｘ５３ｃｍ）に緩衝液Ｂで３．８ｍ
ｌ／分の流速で加えた。活性画分をプールし、蛋白の凝
集を最小限に抑えるためにＮａＣｌおよびＣＨＡＰＳを
加え、それぞれ０．２Ｍおよび０．６％の最終濃度とし
た。試料の半分を５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．２
Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ3 および０．６％
ＣＨＡＰＳで平衡化した４０ｍｌ（直径２．５ｃｍ）小
麦胚芽レクチンカラムに負荷した（流速：１７ｍｌ／
時）。洗浄後、０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミンを
含む平衡緩衝液でＧＰＩ−ＰＬＤ活性を溶出した。２つ
の実験からの溶出液を合わせて１０ｍｌに濃縮した。９
倍容量の５ｍＭ ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８、０．４％
ＣＨＡＰＳおよび０．０２％ ＮａＮ3 を加え、この試
料を５ｍＭ ＮａＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．６％ ＣＨ
ＡＰＳおよび０．０２％ ＮａＮ3 でヒドロキシアパタ
イトウルトロゲルの４．２ｘ２２ｃｍカラムに室温（流
速：３ｍｌ／分）で負荷した。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は洗
液画分中に回収され、夾雑蛋白を０．５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4 、ｐＨ６．８、０．６％ ＣＨＡＰＳおよび０．０
２％ ＮａＮ3で溶出した。
ロースカラム（９ｘ１０ｃｍ）に３０ｍｌ／分の流速で
負荷した。平衡緩衝液で洗浄後、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を
４ｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．０２％ Ｎａ
Ｎ3 および０．５ｍＭ ＰＭＳＦ中の０．１−１．０Ｍ
ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。活性含有画分をプー
ルし、ＹＭ−１０（Amicon）メンブラン濾過で約２００
ｍｌに濃縮した。この濃縮物は縦に連結した２本のＳ−
３００カラム（１０ｘ５３ｃｍ）に緩衝液Ｂで３．８ｍ
ｌ／分の流速で加えた。活性画分をプールし、蛋白の凝
集を最小限に抑えるためにＮａＣｌおよびＣＨＡＰＳを
加え、それぞれ０．２Ｍおよび０．６％の最終濃度とし
た。試料の半分を５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．２
Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ3 および０．６％
ＣＨＡＰＳで平衡化した４０ｍｌ（直径２．５ｃｍ）小
麦胚芽レクチンカラムに負荷した（流速：１７ｍｌ／
時）。洗浄後、０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミンを
含む平衡緩衝液でＧＰＩ−ＰＬＤ活性を溶出した。２つ
の実験からの溶出液を合わせて１０ｍｌに濃縮した。９
倍容量の５ｍＭ ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８、０．４％
ＣＨＡＰＳおよび０．０２％ ＮａＮ3 を加え、この試
料を５ｍＭ ＮａＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．６％ ＣＨ
ＡＰＳおよび０．０２％ ＮａＮ3 でヒドロキシアパタ
イトウルトロゲルの４．２ｘ２２ｃｍカラムに室温（流
速：３ｍｌ／分）で負荷した。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は洗
液画分中に回収され、夾雑蛋白を０．５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4 、ｐＨ６．８、０．６％ ＣＨＡＰＳおよび０．０
２％ ＮａＮ3で溶出した。
【００５１】ヒドロキシアパタイトアガロースクロマト
グラフィーからのＧＰＩ−ＰＬＤ活性画分はプールし、
ＹＭ−１０メンブラン濾過で２１ｍｌに濃縮し、そして
１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の２０倍希釈液の添加
によりｐＨを調整した。この試料は亜鉛でキレート化し
且つ緩衝液Ｃで平衡化したフラクトゲルＴＳＫ ＨＷ−
６５Ｆ上のイミノジ酢酸のカラム（１．５ｘ５．０ｃ
ｍ）に負荷した。第一の活性ピークは平衡緩衝液で１０
−１５ベッドボリュームの洗液中に回収され、より鋭い
第二の活性ピークは平衡緩衝液中の１０ｍＭヒスチジン
で溶出された。
グラフィーからのＧＰＩ−ＰＬＤ活性画分はプールし、
ＹＭ−１０メンブラン濾過で２１ｍｌに濃縮し、そして
１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の２０倍希釈液の添加
によりｐＨを調整した。この試料は亜鉛でキレート化し
且つ緩衝液Ｃで平衡化したフラクトゲルＴＳＫ ＨＷ−
６５Ｆ上のイミノジ酢酸のカラム（１．５ｘ５．０ｃ
ｍ）に負荷した。第一の活性ピークは平衡緩衝液で１０
−１５ベッドボリュームの洗液中に回収され、より鋭い
第二の活性ピークは平衡緩衝液中の１０ｍＭヒスチジン
で溶出された。
【００５２】２つのＺｎキレート活性プールは別々にＹ
Ｍ−１０メンブラン濾過で濃縮した。各試料（５ｍｌ）
を緩衝液Ｃ（ＮａＮ3 を含まない）で平衡化したＭｏｎ
ｏＱ（ＨＲ５／５、Pharmacia ）カラムに室温で注入し
た。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は１ｍｌ／分の流速で５０ｍＭ
トリス、ｐＨ７．５、および０．６％ ＣＨＡＰＳ中の
０．１−０．１９Ｍ ＮａＣｌの勾配を使って６分間溶
出し、次に０．１９ＭＮａＣｌで５分間イソクラチック
溶出し、最後に０．１９−０．４Ｍ ＮａＣｌの勾配を
使って１４分間溶出した。これらの条件下で、第一のＺ
ｎキレートプールは０．２Ｍ ＮａＣｌで１つの活性ピ
ークとして溶出されたが、第二のＺｎキレートプールは
０．２Ｍおよび０．３Ｍ ＮａＣｌで２つの活性ピーク
に分割された。
Ｍ−１０メンブラン濾過で濃縮した。各試料（５ｍｌ）
を緩衝液Ｃ（ＮａＮ3 を含まない）で平衡化したＭｏｎ
ｏＱ（ＨＲ５／５、Pharmacia ）カラムに室温で注入し
た。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は１ｍｌ／分の流速で５０ｍＭ
トリス、ｐＨ７．５、および０．６％ ＣＨＡＰＳ中の
０．１−０．１９Ｍ ＮａＣｌの勾配を使って６分間溶
出し、次に０．１９ＭＮａＣｌで５分間イソクラチック
溶出し、最後に０．１９−０．４Ｍ ＮａＣｌの勾配を
使って１４分間溶出した。これらの条件下で、第一のＺ
ｎキレートプールは０．２Ｍ ＮａＣｌで１つの活性ピ
ークとして溶出されたが、第二のＺｎキレートプールは
０．２Ｍおよび０．３Ｍ ＮａＣｌで２つの活性ピーク
に分割された。
【００５３】ＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣからのＧＰＩ−ＰＬ
Ｄ活性画分をプールし、濃縮し、そして各試料（０．４
ｍｌ）を緩衝液Ｃで平衡化したスペロース１２−ＨＰＬ
Ｃ（ＨＲ１０／３０、Pharmacia ）カラムに注入した。
蛋白は０．３ｍｌ／分の流速で溶出し、０．５ｍｌ画分
を集めた。イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＧＰＩ
−ＰＬＤの精製 モノクローナル抗体ＰＬＤ２１６．１はＣＮＢｒ活性化
セファロースに１ｍｇ／ｍｌ樹脂の最終濃度で結合させ
た。ウシ血清（２００ｍｌ）は１６，０００ｘｇで２０
分遠心し、上清を１．２リットルの緩衝液Ｂおよび０．
５％ＮＰ−４０で希釈した。０．２２μｍメンブラン
（Nalgene フィルターユニット）を通して濾過した後、
試料をイムノアフィニティーカラム（２０ｍｌ、２．５
ｘ４ｃｍ）に３０ｍｌ／時の流速で負荷した。その後、
このカラムを４００ｍｌの緩衝液Ｃで洗い、ＧＰＩ−Ｐ
ＬＤを緩衝液Ｃ中の３Ｍ ＭｇＣｌ2 で溶出した。活性
画分をプールし（１００ｍｌ、４０ｍｇ）、すぐに６倍
容量の緩衝液Ｃおよび２．５ｍＭずつのＣａＣｌ2 と酢
酸亜鉛で希釈した。試料はその後５０ｍＭトリス、ｐＨ
７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．６％ ＣＨＡＰＳ、
０．０２％ ＮａＮ3 および２．５ｍＭずつのＣａＣｌ
2 と酢酸亜鉛（平衡緩衝液）で平衡化した２０ｍｌ（直
径２．５ｃｍ）小麦胚芽レクチンセファロースカラムに
３０ｍｌ／時の流速で負荷した。カラムを洗浄後、試料
は平衡緩衝液中の０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン
で溶出した。
Ｄ活性画分をプールし、濃縮し、そして各試料（０．４
ｍｌ）を緩衝液Ｃで平衡化したスペロース１２−ＨＰＬ
Ｃ（ＨＲ１０／３０、Pharmacia ）カラムに注入した。
蛋白は０．３ｍｌ／分の流速で溶出し、０．５ｍｌ画分
を集めた。イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＧＰＩ
−ＰＬＤの精製 モノクローナル抗体ＰＬＤ２１６．１はＣＮＢｒ活性化
セファロースに１ｍｇ／ｍｌ樹脂の最終濃度で結合させ
た。ウシ血清（２００ｍｌ）は１６，０００ｘｇで２０
分遠心し、上清を１．２リットルの緩衝液Ｂおよび０．
５％ＮＰ−４０で希釈した。０．２２μｍメンブラン
（Nalgene フィルターユニット）を通して濾過した後、
試料をイムノアフィニティーカラム（２０ｍｌ、２．５
ｘ４ｃｍ）に３０ｍｌ／時の流速で負荷した。その後、
このカラムを４００ｍｌの緩衝液Ｃで洗い、ＧＰＩ−Ｐ
ＬＤを緩衝液Ｃ中の３Ｍ ＭｇＣｌ2 で溶出した。活性
画分をプールし（１００ｍｌ、４０ｍｇ）、すぐに６倍
容量の緩衝液Ｃおよび２．５ｍＭずつのＣａＣｌ2 と酢
酸亜鉛で希釈した。試料はその後５０ｍＭトリス、ｐＨ
７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．６％ ＣＨＡＰＳ、
０．０２％ ＮａＮ3 および２．５ｍＭずつのＣａＣｌ
2 と酢酸亜鉛（平衡緩衝液）で平衡化した２０ｍｌ（直
径２．５ｃｍ）小麦胚芽レクチンセファロースカラムに
３０ｍｌ／時の流速で負荷した。カラムを洗浄後、試料
は平衡緩衝液中の０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン
で溶出した。
【００５４】小麦胚芽レクチンセファロース溶出液のプ
ール（６０ｍｌ、２．５ｍｇ）はＹＭ−１０メンブラン
濾過で約１５ｍｌに濃縮し、等容量の５０ｍＭトリス、
ｐＨ７．５、および０．６％ ＣＨＡＰＳで希釈した。
試料はその後緩衝液Ｃ（ＮａＮ3 を含まない）で平衡化
したＭｏｎｏＱ−ＦＰＬＣに室温で負荷した。ＧＰＩ−
ＰＬＤは上記のようなＮａＣｌの勾配を使って１ｍｌ／
分の流速で溶出した。
ール（６０ｍｌ、２．５ｍｇ）はＹＭ−１０メンブラン
濾過で約１５ｍｌに濃縮し、等容量の５０ｍＭトリス、
ｐＨ７．５、および０．６％ ＣＨＡＰＳで希釈した。
試料はその後緩衝液Ｃ（ＮａＮ3 を含まない）で平衡化
したＭｏｎｏＱ−ＦＰＬＣに室温で負荷した。ＧＰＩ−
ＰＬＤは上記のようなＮａＣｌの勾配を使って１ｍｌ／
分の流速で溶出した。
【００５５】各精製段階の結果を表２に要約する。
【００５６】
【表２】
【００５７】表２から、ＧＰＩ−ＰＬＤはウシ血清中に
約７μｇ／ｍｌの濃度で存在すると概算される。蛋白の測定 ─精製中の蛋白濃度は２８０ｎｍでの吸光度
により監視した。さらに、精製調製物の蛋白濃度は Bra
dford,M (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254の方法に
より Bio-Radの蛋白検定用試薬を使って測定した。１ｍ
ｇ／ｍｌの精製ＧＰＩ−ＰＬＤは２８０ｎｍで１光学密
度単位に相当する。
約７μｇ／ｍｌの濃度で存在すると概算される。蛋白の測定 ─精製中の蛋白濃度は２８０ｎｍでの吸光度
により監視した。さらに、精製調製物の蛋白濃度は Bra
dford,M (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254の方法に
より Bio-Radの蛋白検定用試薬を使って測定した。１ｍ
ｇ／ｍｌの精製ＧＰＩ−ＰＬＤは２８０ｎｍで１光学密
度単位に相当する。
【００５８】トリプシンペプチドマッピング─Ｍｏｎｏ
Ｑ−ＨＰＬＣからのピーク１および２中の１００ｋＤａ
蛋白は分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離した。蛋白は Hun
kapillar,M.W., Lujan,E., Ostrader,F., and Hood,L.
E. (1983) Methods Enzymol.,91, 227-236 に記載され
るような６７ｍＭ Ｎ−エチルモルホリンアセテート、
ｐＨ８．６、および０．０５％ ＳＤＳでの電気溶出に
より回収した。電気溶出後、蛋白（１００μｇ）は１０
ｍＭジチオトレイトールを使って３７℃で２時間還元
し、暗室にて２０ｍＭヨード酢酸を使って室温で３０分
間アルキル化した。反応を止めるためにこの混合物に追
加の１０ｍＭジチオトレイトールを加えた。この試料を
凍結乾燥し、蛋白をアセトン：酢酸：トリエチルアミ
ン：水（８５：５：５：５、容量基準）で沈降させた。
沈降した蛋白は氷冷アセトンで２回洗い、乾燥し、０．
３ｍｌの０．１ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 、ｐＨ８．０、および
０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 中に再懸濁した。試料はＴＰＣ
Ｋ処理トリプシン（Cooper Biomedical 、全量６μｇ）
を使って３７℃で１６時間消化した。トリプシンは３つ
の等しいアリコートに分けて添加した：すなわち、最初
は０時間に、２回目は４時間後に、そして３回目は１２
時間のインキュベーション後に加えた。試料はギ酸を使
って１５％へ酸性化し、Ｃ8 カラム（Phase Separation
Inc. 、０．２ｘ１５ｃｍ）での逆相ＨＰＬＣにかけ
た。ペプチドは０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニ
トリル（０−７０％）の勾配を用いて溶出した（流速：
０．２ｍｌ／分）。
Ｑ−ＨＰＬＣからのピーク１および２中の１００ｋＤａ
蛋白は分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離した。蛋白は Hun
kapillar,M.W., Lujan,E., Ostrader,F., and Hood,L.
E. (1983) Methods Enzymol.,91, 227-236 に記載され
るような６７ｍＭ Ｎ−エチルモルホリンアセテート、
ｐＨ８．６、および０．０５％ ＳＤＳでの電気溶出に
より回収した。電気溶出後、蛋白（１００μｇ）は１０
ｍＭジチオトレイトールを使って３７℃で２時間還元
し、暗室にて２０ｍＭヨード酢酸を使って室温で３０分
間アルキル化した。反応を止めるためにこの混合物に追
加の１０ｍＭジチオトレイトールを加えた。この試料を
凍結乾燥し、蛋白をアセトン：酢酸：トリエチルアミ
ン：水（８５：５：５：５、容量基準）で沈降させた。
沈降した蛋白は氷冷アセトンで２回洗い、乾燥し、０．
３ｍｌの０．１ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 、ｐＨ８．０、および
０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 中に再懸濁した。試料はＴＰＣ
Ｋ処理トリプシン（Cooper Biomedical 、全量６μｇ）
を使って３７℃で１６時間消化した。トリプシンは３つ
の等しいアリコートに分けて添加した：すなわち、最初
は０時間に、２回目は４時間後に、そして３回目は１２
時間のインキュベーション後に加えた。試料はギ酸を使
って１５％へ酸性化し、Ｃ8 カラム（Phase Separation
Inc. 、０．２ｘ１５ｃｍ）での逆相ＨＰＬＣにかけ
た。ペプチドは０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニ
トリル（０−７０％）の勾配を用いて溶出した（流速：
０．２ｍｌ／分）。
【００５９】蛋白シークエンシング─アミノ酸配列分析
は Applied Biosystems （ＡＢＩ，Foster City, CA ）
気相シークエンサー４７０Ａ型を使って行った。ＰＴＨ
アミノ酸は逆相Ｃ−１８カラム（２．１ｘ２２０ｍｍ、
ＡＢＩ）を使ってＡＢＩ １２０Ａ型ＰＴＨアナライザ
ーで“ on line”同定した。この方法で得られた異なる
トリプシンペプチドの配列を表３に示す。
は Applied Biosystems （ＡＢＩ，Foster City, CA ）
気相シークエンサー４７０Ａ型を使って行った。ＰＴＨ
アミノ酸は逆相Ｃ−１８カラム（２．１ｘ２２０ｍｍ、
ＡＢＩ）を使ってＡＢＩ １２０Ａ型ＰＴＨアナライザ
ーで“ on line”同定した。この方法で得られた異なる
トリプシンペプチドの配列を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】ＧＰＩ−ＰＬＤに対するモノクローナル抗
体の生産─雌ＢＡＬＢ／ｃマウスはフロインド完全アジ
ュバントと１：１で混合したＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣ精製
ＧＰＩ−ＰＬＤ（蛋白６０μｇ）の２つの形の混合物を
腹腔内に注射して免疫した。４週間後、マウスはフロイ
ンド不完全アジュバント中の同量の免疫原を腹腔内に注
射して追加免疫した。１週間後に試験用の血液を採取
し、ＥＬＩＳＡおよびＧＰＩ−ＰＬＤ活性を中和する直
接検定を用いて抗血清を調べた。
体の生産─雌ＢＡＬＢ／ｃマウスはフロインド完全アジ
ュバントと１：１で混合したＭｏｎｏＱ−ＨＰＬＣ精製
ＧＰＩ−ＰＬＤ（蛋白６０μｇ）の２つの形の混合物を
腹腔内に注射して免疫した。４週間後、マウスはフロイ
ンド不完全アジュバント中の同量の免疫原を腹腔内に注
射して追加免疫した。１週間後に試験用の血液を採取
し、ＥＬＩＳＡおよびＧＰＩ−ＰＬＤ活性を中和する直
接検定を用いて抗血清を調べた。
【００６２】融合の３日前に、マウスの尾静脈に６０μ
ｇの免疫原を注射してさらに追加免疫した。マウス由来
の脾細胞は、Thomas,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E., and
Levin,W. (1984) J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記
載される方法を使って、ミエローマ細胞系列ＰＡＩ−０
と融合させた。融合の１０日後、細胞を無血清培地（Ｈ
Ｌ−１、Ventrex Laboratories）に移し、４０時間後上
清を免疫原に対するＩｇＧ生産についてＥＬＩＳＡを使
って分析した。ＥＬＩＳＡ陽性培養物を無血清培地で増
殖させた。無血清培地中で弱い増殖を示すハイブリドー
マは０．５％ウマ血清中で増殖させた。このような条件
下で、内因性ウマ血清ＧＰＩ−ＰＬＤはＥＬＩＳＡや免
疫枯渇検定を妨げなかった。確立されたハイブリドーマ
細胞はその後プリスタン−プライムＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ
マウスにおいて腹水腫として増殖させた。抗ＧＰＩ−Ｐ
ＬＤモノクローナル抗体は、Reik,L.M., Maines,S.L.,
Ryan,D.E., Levin,W., Bandiera,S., and Thomas,P.E.
(1987) J. Immunol.Methods,100, 123-130に記載される
ようなカプリル酸および硫酸アンモニウム沈殿により腹
水から精製した。
ｇの免疫原を注射してさらに追加免疫した。マウス由来
の脾細胞は、Thomas,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E., and
Levin,W. (1984) J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記
載される方法を使って、ミエローマ細胞系列ＰＡＩ−０
と融合させた。融合の１０日後、細胞を無血清培地（Ｈ
Ｌ−１、Ventrex Laboratories）に移し、４０時間後上
清を免疫原に対するＩｇＧ生産についてＥＬＩＳＡを使
って分析した。ＥＬＩＳＡ陽性培養物を無血清培地で増
殖させた。無血清培地中で弱い増殖を示すハイブリドー
マは０．５％ウマ血清中で増殖させた。このような条件
下で、内因性ウマ血清ＧＰＩ−ＰＬＤはＥＬＩＳＡや免
疫枯渇検定を妨げなかった。確立されたハイブリドーマ
細胞はその後プリスタン−プライムＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ
マウスにおいて腹水腫として増殖させた。抗ＧＰＩ−Ｐ
ＬＤモノクローナル抗体は、Reik,L.M., Maines,S.L.,
Ryan,D.E., Levin,W., Bandiera,S., and Thomas,P.E.
(1987) J. Immunol.Methods,100, 123-130に記載される
ようなカプリル酸および硫酸アンモニウム沈殿により腹
水から精製した。
【００６３】ＥＬＩＳＡ─非競合ＥＬＩＳＡ検定は、Th
omas,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E.,and Levin,W. (198
4) J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記載されるよう
に、マウス抗血清および培養上清に対して行った。免疫
原または部分精製した（小麦胚芽レクチン−またはＺｎ
キレートマトリックス−）ＧＰＩ−ＰＬＤを９６ウェル
のポリスチレン製マイクロテストプレートに被覆した。
ＧＰＩ−ＰＬＤ被覆プレートへの抗体の結合は、Thoma
s,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E.,and Levin,W. (1984)
J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記載されるように、
ＨＲＰ結合第二抗体および適当な色素原を使って検出し
た。
omas,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E.,and Levin,W. (198
4) J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記載されるよう
に、マウス抗血清および培養上清に対して行った。免疫
原または部分精製した（小麦胚芽レクチン−またはＺｎ
キレートマトリックス−）ＧＰＩ−ＰＬＤを９６ウェル
のポリスチレン製マイクロテストプレートに被覆した。
ＧＰＩ−ＰＬＤ被覆プレートへの抗体の結合は、Thoma
s,P.E., Reik,L.M., Ryan,D.E.,and Levin,W. (1984)
J. Biol. Chem., 259, 3890-3899に記載されるように、
ＨＲＰ結合第二抗体および適当な色素原を使って検出し
た。
【００６４】免疫枯渇検定─ハイブリドーマ上清はＧＰ
Ｉ−ＰＬＤ活性を免疫沈降させる能力についてスクリー
ニングした。培養上清（０．５ｍｌ）をヤギ抗マウスＩ
ｇＧ−アガロースの５０％懸濁液５０μｌと３７℃で１
時間インキュベートした。キャリアー蛋白としてＢＳＡ
（０．５ｍｇ）を加えた。ビーズを１ｍｌ緩衝液Ａおよ
び０．５％ＮＰ−４０で２回洗い、緩衝液Ａおよび１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡで希釈した４０μｌの小麦胚芽レクチ
ン精製ＧＰＩ−ＰＬＤとインキュベートした。３７℃で
１時間後、１，５００ｘｇで０．５分間遠心してビーズ
を除き、上清は基質としてアルカリホスファターゼまた
は 3Ｈ−ＶＳＧを使ってＧＰＩ−ＰＬＤ活性について分
析した。
Ｉ−ＰＬＤ活性を免疫沈降させる能力についてスクリー
ニングした。培養上清（０．５ｍｌ）をヤギ抗マウスＩ
ｇＧ−アガロースの５０％懸濁液５０μｌと３７℃で１
時間インキュベートした。キャリアー蛋白としてＢＳＡ
（０．５ｍｇ）を加えた。ビーズを１ｍｌ緩衝液Ａおよ
び０．５％ＮＰ−４０で２回洗い、緩衝液Ａおよび１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡで希釈した４０μｌの小麦胚芽レクチ
ン精製ＧＰＩ−ＰＬＤとインキュベートした。３７℃で
１時間後、１，５００ｘｇで０．５分間遠心してビーズ
を除き、上清は基質としてアルカリホスファターゼまた
は 3Ｈ−ＶＳＧを使ってＧＰＩ−ＰＬＤ活性について分
析した。
【００６５】イムノブロッティング─イムノブロット法
は Towbin,H., Staehlin,T., andGordon,J. (1979) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354に記載される
ように実施した。抗体（マウス抗血清または精製モノク
ローナル抗体）および第二抗体（ＨＲＰ−ヤギＦ（ａ
ｂ′）２抗マウスＩｇＧ）はリン酸緩衝溶液、１％ＢＳ
Ａ、５％正常ヤギ血清、および０．０５％トゥイーン２
０で希釈した。数回の洗浄後、ペルオキシダーゼ活性は
Nielsen,P.J., Manchester,K.L., Towbin,H.,Gordon,
J., and Thomas,G. (1982) J. Biol. Chem., 257, 1231
6-12321に記載されるように、４−クロロ−１−ナフト
ールおよび過酸化水素により検出した。
は Towbin,H., Staehlin,T., andGordon,J. (1979) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354に記載される
ように実施した。抗体（マウス抗血清または精製モノク
ローナル抗体）および第二抗体（ＨＲＰ−ヤギＦ（ａ
ｂ′）２抗マウスＩｇＧ）はリン酸緩衝溶液、１％ＢＳ
Ａ、５％正常ヤギ血清、および０．０５％トゥイーン２
０で希釈した。数回の洗浄後、ペルオキシダーゼ活性は
Nielsen,P.J., Manchester,K.L., Towbin,H.,Gordon,
J., and Thomas,G. (1982) J. Biol. Chem., 257, 1231
6-12321に記載されるように、４−クロロ−１−ナフト
ールおよび過酸化水素により検出した。
【００６６】免疫沈降─ダイマーＧＰＩ−ＰＬＤはＩＯ
ＤＯ−ＢＥＡＤＳを使って 125Ｉでヨウ素化した。遊離
125Ｉを脱塩カラム（Econo-Pac 10DG, Bio-Rad ）を使
って除いた。ハイブリドーマ上清（それぞれ０．２５ｍ
ｌ）はヤギ抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズ（０．０
５ｍｌの５０％スラリー）と３７℃で１．５時間インキ
ュベートした。インキュベーションの間キャリアー蛋白
として各試料にＢＳＡ（０．２ｍｇ）を加えた。その後
この混合物を１，５００ｘｇで０．５分間遠心し、ビー
ズを０．２５ｍｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、および１ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ中で 125Ｉ標識ＧＰＩ−ＰＬＤ（３．５
ｘ１０5 ｃｐｍ）と４℃にて一晩インキュベートした。
ビーズを遠心により分離し、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．
５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．５％ ＮＰ−４０
で３回（それぞれ０．８ｍｌ）洗った。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ還元性試料緩衝液（４０μｌ）をビーズに加え、アリ
コート（２０μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。電
気泳動後、ゲルを真空下で乾燥し、オートラジオグラフ
ィーに付した。
ＤＯ−ＢＥＡＤＳを使って 125Ｉでヨウ素化した。遊離
125Ｉを脱塩カラム（Econo-Pac 10DG, Bio-Rad ）を使
って除いた。ハイブリドーマ上清（それぞれ０．２５ｍ
ｌ）はヤギ抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズ（０．０
５ｍｌの５０％スラリー）と３７℃で１．５時間インキ
ュベートした。インキュベーションの間キャリアー蛋白
として各試料にＢＳＡ（０．２ｍｇ）を加えた。その後
この混合物を１，５００ｘｇで０．５分間遠心し、ビー
ズを０．２５ｍｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、および１ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ中で 125Ｉ標識ＧＰＩ−ＰＬＤ（３．５
ｘ１０5 ｃｐｍ）と４℃にて一晩インキュベートした。
ビーズを遠心により分離し、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．
５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．５％ ＮＰ−４０
で３回（それぞれ０．８ｍｌ）洗った。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ還元性試料緩衝液（４０μｌ）をビーズに加え、アリ
コート（２０μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。電
気泳動後、ゲルを真空下で乾燥し、オートラジオグラフ
ィーに付した。
【００６７】要約すると、ＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ
Ｄは２つの異なる方法によってウシ血清から精製され
た。この酵素は初めに８段階法を使って精製された。精
製酵素を免疫原として用いて、ＧＰＩ−ＰＬＤに対する
モノクローナル抗体が生産された。また、ウシ血清由来
の精製ＧＰＩ−ＰＬＤはイムノアフィニティークロマト
グラフィー、小麦胚芽レクチンセファロースおよびＭｏ
ｎｏＱ−ＦＰＬＣを伴う単純な方法によっても得られ
た。後者の方法で精製した酵素は、ゲル濾過−ＨＰＬＣ
で分析したとき、ダイマーとして存在している。しかし
ながら、８段階法で精製した物質はダイマーと高分子量
アグリゲートの混合物を含んでいる。これらの形態のＧ
ＰＩ−ＰＬＤはＭｏｎｏＱ−およびゲル濾過−ＨＰＬＣ
で分離することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、精製酵
素は１００ｋＤａの分子量を有する単一の蛋白バンドを
示す。自然等電点電気泳動（データは示してない）で、
それぞれの形のＧＰＩ−ＰＬＤは約５．６の共通のｐＩ
を示す。基質としてＶＳＧまたはアルカリホスファター
ゼを使うと、ダイマーは高分子量アグリゲートよりも一
層高い比活性を示す。
Ｄは２つの異なる方法によってウシ血清から精製され
た。この酵素は初めに８段階法を使って精製された。精
製酵素を免疫原として用いて、ＧＰＩ−ＰＬＤに対する
モノクローナル抗体が生産された。また、ウシ血清由来
の精製ＧＰＩ−ＰＬＤはイムノアフィニティークロマト
グラフィー、小麦胚芽レクチンセファロースおよびＭｏ
ｎｏＱ−ＦＰＬＣを伴う単純な方法によっても得られ
た。後者の方法で精製した酵素は、ゲル濾過−ＨＰＬＣ
で分析したとき、ダイマーとして存在している。しかし
ながら、８段階法で精製した物質はダイマーと高分子量
アグリゲートの混合物を含んでいる。これらの形態のＧ
ＰＩ−ＰＬＤはＭｏｎｏＱ−およびゲル濾過−ＨＰＬＣ
で分離することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、精製酵
素は１００ｋＤａの分子量を有する単一の蛋白バンドを
示す。自然等電点電気泳動（データは示してない）で、
それぞれの形のＧＰＩ−ＰＬＤは約５．６の共通のｐＩ
を示す。基質としてＶＳＧまたはアルカリホスファター
ゼを使うと、ダイマーは高分子量アグリゲートよりも一
層高い比活性を示す。
【００６８】１００ｋＤａ蛋白およびそのトリプシンペ
プチドをアミノ酸配列分析にかけたとき、配列データは
他の既知蛋白の配列に対して強い相同性を全く示さなか
った。ただし、２つのトリプシンペプチド配列が互いに
対しておよびカルシウム結合蛋白のＣａ2+結合ドメイン
に対して相同性を示した。２つの可能な金属結合配列の
発見は、この酵素活性が２価金属イオンキレート化剤、
例えば表４に示すようなＥＧＴＡや１，１０−フェナン
トロリン、の添加に対して感受性であるというここに報
告したデータを考慮すると、興味を起こさせる。
プチドをアミノ酸配列分析にかけたとき、配列データは
他の既知蛋白の配列に対して強い相同性を全く示さなか
った。ただし、２つのトリプシンペプチド配列が互いに
対しておよびカルシウム結合蛋白のＣａ2+結合ドメイン
に対して相同性を示した。２つの可能な金属結合配列の
発見は、この酵素活性が２価金属イオンキレート化剤、
例えば表４に示すようなＥＧＴＡや１，１０−フェナン
トロリン、の添加に対して感受性であるというここに報
告したデータを考慮すると、興味を起こさせる。
【００６９】
【表４】
【００７０】
【実施例２】ウシ・グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホ
スホリパーゼＤのクローニングおよび発現 ウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーは精製したウシ・グリコ
シルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ
Ｄ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）から誘導されたペプチド配列に一
致する合成オリゴヌクレオチドを使ってスクリーニング
した。２つの重複するフローンが単離され、これらは一
緒になって、配列決定がなされた８つのトリプシン断片
の正確なアミノ酸配列を予言する。２つのクローンのＤ
ＮＡ配列は、８１６アミノ酸の成熟蛋白と２３アミノ酸
の追加のシグナルペプチドを予言した。この推定配列は
８つの存在しうるＮ結合グリコシル化部位、およびイン
テグリンファミリーの仲間の金属イオン結合ドメインに
類似した配列を有する少なくとも４つの領域を含んでい
た〔Hynes,R.O. (1987) Cell, 48, 549-554 〕。これら
の観察は、性状決定されたＧＰＩ−ＰＬＤが１００ｋｄ
の大きさであり、グリコシル化されており、且つ金属イ
オン依存性であることと一致していた。クローン化ｃＤ
ＮＡは生物学的活性に関する２つの検定法により同定し
た。第一に、この遺伝子でトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ細胞の培養培地および細胞リゼイトは、in vitro検定
において基質としてアフリカトリパノソーマの 3Ｈ標識
ＧＰＩ固定変異型表面糖蛋白（ＶＳＧ）を使用すること
により、ホスホリパーゼ活性を示した。薄層クロマトグ
ラフィーによるin vitroＶＳＧ検定からの生成物の分析
はホスファチジン酸が反応生成物であることを示し、ホ
スホリパーゼ活性がホスホリパーゼＤによることを確か
めた。第二に、ＧＰＩ固定胎盤アルカリホスファターゼ
（ＰＬＡＰ）をコードする遺伝子でトランスフェクトさ
れたＣＯＳ細胞は、ＧＰＩ−ＰＬＤクローンと同時トラ
ンスフェクトされたとき、相当量のＰＬＡＰを培地に放
出したが、単独でトランスフェクトされたときには放出
しなかった。これらの結果は、ＧＰＩ−ＰＬＤが in vi
voでＧＰＩ固定蛋白の細胞表面発現の調節に１つの役割
を果たすことを示唆している。
スホリパーゼＤのクローニングおよび発現 ウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーは精製したウシ・グリコ
シルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ
Ｄ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）から誘導されたペプチド配列に一
致する合成オリゴヌクレオチドを使ってスクリーニング
した。２つの重複するフローンが単離され、これらは一
緒になって、配列決定がなされた８つのトリプシン断片
の正確なアミノ酸配列を予言する。２つのクローンのＤ
ＮＡ配列は、８１６アミノ酸の成熟蛋白と２３アミノ酸
の追加のシグナルペプチドを予言した。この推定配列は
８つの存在しうるＮ結合グリコシル化部位、およびイン
テグリンファミリーの仲間の金属イオン結合ドメインに
類似した配列を有する少なくとも４つの領域を含んでい
た〔Hynes,R.O. (1987) Cell, 48, 549-554 〕。これら
の観察は、性状決定されたＧＰＩ−ＰＬＤが１００ｋｄ
の大きさであり、グリコシル化されており、且つ金属イ
オン依存性であることと一致していた。クローン化ｃＤ
ＮＡは生物学的活性に関する２つの検定法により同定し
た。第一に、この遺伝子でトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ細胞の培養培地および細胞リゼイトは、in vitro検定
において基質としてアフリカトリパノソーマの 3Ｈ標識
ＧＰＩ固定変異型表面糖蛋白（ＶＳＧ）を使用すること
により、ホスホリパーゼ活性を示した。薄層クロマトグ
ラフィーによるin vitroＶＳＧ検定からの生成物の分析
はホスファチジン酸が反応生成物であることを示し、ホ
スホリパーゼ活性がホスホリパーゼＤによることを確か
めた。第二に、ＧＰＩ固定胎盤アルカリホスファターゼ
（ＰＬＡＰ）をコードする遺伝子でトランスフェクトさ
れたＣＯＳ細胞は、ＧＰＩ−ＰＬＤクローンと同時トラ
ンスフェクトされたとき、相当量のＰＬＡＰを培地に放
出したが、単独でトランスフェクトされたときには放出
しなかった。これらの結果は、ＧＰＩ−ＰＬＤが in vi
voでＧＰＩ固定蛋白の細胞表面発現の調節に１つの役割
を果たすことを示唆している。
【００７１】ウシＧＰＩ−ＰＬＤからの８つのトリプシ
ン断片のアミノ酸配列は、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンによりウシＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ための４つの縮重オリゴヌクレオチドプローブをデザイ
ンするために使用された。ＰＬＤ活性は肝臓抽出物中に
検出されていたので、初めに肝臓ｃＤＮＡライブラリー
がスクリーニングされた。スクリーニングした５ｘ１０
5 個のクローンの中には陽性クローンが検出されなかっ
た。しかしながら、ウシゲノムライブラリーのスクリー
ニングは４つのオリゴヌクレオチドプローブの１つとハ
イブリダイズする１個の陽性クローンをもたらした。こ
のクローンの部分ＤＮＡ配列分析は２２アミノ酸のトリ
プシン断片Ｔ３４の配列を正確に予言するオープン・リ
ーディング・フレームを明らかにした。しかし、このコ
ード配列は長さがたった７９ｂｐであると思われたエク
ソン中に存在していた。このゲノムクローンの特性をこ
れ以上調べる代わりに、ｃＤＮＡクローンを単離する第
二の試みが７９ｂｐエクソン配列に一致する２つの非縮
重３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを使って行われた。さ
らに、新しいウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーが第一鎖の
合成を開始させるために無作為のヘキサヌクレオチドを
使って作製された。スクリーニングした５ｘ１０5 個の
クローンから２個の陽性クローンが単離され、長い方の
挿入物は鎖長が１．６ｋｂであった（クローンｐＢＪ１
５４９）。この１．６ｋｂ挿入物の完全なヌクレオチド
配列を決定し、これはゲノムクローンによりコードされ
る断片Ｔ３４を（予想通りに）含む８つのトリプシン断
片のうちの５つのアミノ酸配列を正確に予言することが
分かった。推定された蛋白配列と完全ＧＰＩ−ＰＬＤの
Ｎ末端配列を比較することにより、このクローンはこの
蛋白の成熟Ｎ末端（図５のＣｙｓ1 ）をコードすること
が判明した。これは初期翻訳産物が２３アミノ酸ペプチ
ドを含むことを意味している。
ン断片のアミノ酸配列は、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンによりウシＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ための４つの縮重オリゴヌクレオチドプローブをデザイ
ンするために使用された。ＰＬＤ活性は肝臓抽出物中に
検出されていたので、初めに肝臓ｃＤＮＡライブラリー
がスクリーニングされた。スクリーニングした５ｘ１０
5 個のクローンの中には陽性クローンが検出されなかっ
た。しかしながら、ウシゲノムライブラリーのスクリー
ニングは４つのオリゴヌクレオチドプローブの１つとハ
イブリダイズする１個の陽性クローンをもたらした。こ
のクローンの部分ＤＮＡ配列分析は２２アミノ酸のトリ
プシン断片Ｔ３４の配列を正確に予言するオープン・リ
ーディング・フレームを明らかにした。しかし、このコ
ード配列は長さがたった７９ｂｐであると思われたエク
ソン中に存在していた。このゲノムクローンの特性をこ
れ以上調べる代わりに、ｃＤＮＡクローンを単離する第
二の試みが７９ｂｐエクソン配列に一致する２つの非縮
重３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを使って行われた。さ
らに、新しいウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーが第一鎖の
合成を開始させるために無作為のヘキサヌクレオチドを
使って作製された。スクリーニングした５ｘ１０5 個の
クローンから２個の陽性クローンが単離され、長い方の
挿入物は鎖長が１．６ｋｂであった（クローンｐＢＪ１
５４９）。この１．６ｋｂ挿入物の完全なヌクレオチド
配列を決定し、これはゲノムクローンによりコードされ
る断片Ｔ３４を（予想通りに）含む８つのトリプシン断
片のうちの５つのアミノ酸配列を正確に予言することが
分かった。推定された蛋白配列と完全ＧＰＩ−ＰＬＤの
Ｎ末端配列を比較することにより、このクローンはこの
蛋白の成熟Ｎ末端（図５のＣｙｓ1 ）をコードすること
が判明した。これは初期翻訳産物が２３アミノ酸ペプチ
ドを含むことを意味している。
【００７２】クローンｐＢＪ１５４９は、１）８０−１
００ｋｄのコア蛋白が予想されるのに、それはたった５
０ｋｄの蛋白をコードしていた、２）８つのトリプシン
断片のうち３つが明らかにされなかった、３）in-frame
翻訳終止コドンが存在しなかった、ので不完全であると
見なされた。Ｃ末端をコードするクローンを単離するた
めに、肝臓ｃＤＮＡライブラリーはｐＢＪ１５４９の
３′末端からのニックトランスレートされた４００ｂｐ
断片を用いてスクリーニングした。１．１ｋｂの挿入物
を含む１個のクローンが単離された（クローンｐＢＪ１
６４４）。配列分析は、この挿入物がｐＢＪ１５４９の
ヌクレオチド１４５０から始まって、Ｃ末端の方向に１
０９０ヌクレオチド延びていることを示した。２つのク
ローンは１４０塩基の重複領域に同一の配列をもってい
た。ｐＢＪ１５４９で確認されたオープン・リーディン
グ・フレームはｐＢＪ１６４４中のヌクレオチド２５５
７の終止コドンまで続いていた。ｐＢＪ１６４４挿入物
はｐＢＪ１５４９がコードしない３つのトリプシン断片
を正確にコードしていた。それらは、一緒になって、２
３アミノ酸のシグナルペプチドと、８つの存在しうるＮ
結合グリコシル化部位を有する８１６アミノ酸の成熟蛋
白（９０．２ｋｄ）をコードしていた。これらのデータ
は、組合わせたこれらの２つのクローンがこの蛋白の完
全なコード配列を含むことを示した。
００ｋｄのコア蛋白が予想されるのに、それはたった５
０ｋｄの蛋白をコードしていた、２）８つのトリプシン
断片のうち３つが明らかにされなかった、３）in-frame
翻訳終止コドンが存在しなかった、ので不完全であると
見なされた。Ｃ末端をコードするクローンを単離するた
めに、肝臓ｃＤＮＡライブラリーはｐＢＪ１５４９の
３′末端からのニックトランスレートされた４００ｂｐ
断片を用いてスクリーニングした。１．１ｋｂの挿入物
を含む１個のクローンが単離された（クローンｐＢＪ１
６４４）。配列分析は、この挿入物がｐＢＪ１５４９の
ヌクレオチド１４５０から始まって、Ｃ末端の方向に１
０９０ヌクレオチド延びていることを示した。２つのク
ローンは１４０塩基の重複領域に同一の配列をもってい
た。ｐＢＪ１５４９で確認されたオープン・リーディン
グ・フレームはｐＢＪ１６４４中のヌクレオチド２５５
７の終止コドンまで続いていた。ｐＢＪ１６４４挿入物
はｐＢＪ１５４９がコードしない３つのトリプシン断片
を正確にコードしていた。それらは、一緒になって、２
３アミノ酸のシグナルペプチドと、８つの存在しうるＮ
結合グリコシル化部位を有する８１６アミノ酸の成熟蛋
白（９０．２ｋｄ）をコードしていた。これらのデータ
は、組合わせたこれらの２つのクローンがこの蛋白の完
全なコード配列を含むことを示した。
【００７３】推定アミノ酸配列の分析は、互いに２１−
５４％の同一性（５４−７５％の類似性）を示す４つの
内部類似領域を明らかにした。アミノ酸およびヌクレオ
チド配列データベースでのコンピューター検索により、
これらの反復領域はインテグリンαサブユニットの金属
イオン結合ドメインと有意に類似することが分かった。
それらはインテグリンに特異な短い保存セグメントに挟
まれたアスパルテートに富むコア配列を共有する。グル
タメート残基の不在を別にすれば、コア配列：ＤＸ（Ｄ
／Ｎ）ＸＤＧＸＸＤはカルモジュリン、トロポニンＣ、
パルブアルブミンのような多くのＣａ2+／Ｍｇ2+結合蛋
白に特徴的なＥＦ−ハンドコンセンサスモチーフにマッ
チする。ここに報告した遺伝子がインテグリンの金属イ
オン結合ドメインに類似したドメインを含むという観察
は、酵素検定におけるＧＰＩ−ＰＬＤのカルシウム必要
性と一致する。
５４％の同一性（５４−７５％の類似性）を示す４つの
内部類似領域を明らかにした。アミノ酸およびヌクレオ
チド配列データベースでのコンピューター検索により、
これらの反復領域はインテグリンαサブユニットの金属
イオン結合ドメインと有意に類似することが分かった。
それらはインテグリンに特異な短い保存セグメントに挟
まれたアスパルテートに富むコア配列を共有する。グル
タメート残基の不在を別にすれば、コア配列：ＤＸ（Ｄ
／Ｎ）ＸＤＧＸＸＤはカルモジュリン、トロポニンＣ、
パルブアルブミンのような多くのＣａ2+／Ｍｇ2+結合蛋
白に特徴的なＥＦ−ハンドコンセンサスモチーフにマッ
チする。ここに報告した遺伝子がインテグリンの金属イ
オン結合ドメインに類似したドメインを含むという観察
は、酵素検定におけるＧＰＩ−ＰＬＤのカルシウム必要
性と一致する。
【００７４】クローン化ｃＤＮＡを発現させて、コード
化蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤであることを確かめるために、
初めに、２つの挿入物をそれらの重複領域内のＡｃｃＩ
部位で一緒にスプライスし、生成した２．６ｋｂ ｃＤ
ＮＡを真核細胞発現プラスミドｐＢＣ１２ＢＩ（Cullen
(1987) Methodsin Enzymology 152, 684-704）に連結
した。得られたプラスミドｐＢＪ１６８２をＣＯＳ細胞
に導入し、そして精製血清酵素に対するモノクローナル
抗体のプールを使って、１）透過細胞の免疫蛍光（デー
タは示してない）および２）ウェスターンブロット分析
を行うことにより発現を確かめた。擬似トランスフェク
ト細胞の培地およびリゼイトはウェスターンブロットで
検出可能な免疫反応性蛋白を示さなかった（図６のレー
ン１および２）が、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細
胞は培地とリゼイトの両方において検出可能な、グリコ
シル化９０ｋｄコア蛋白の大きさと一致する大きさの免
疫反応性蛋白を生産した（レーン３および４）。しかし
ながら、リゼイト中に検出された蛋白は培地に分泌され
た蛋白よりもわずかに速く泳動し、分泌蛋白は精製され
た血清ＧＰＩ−ＰＬＤよりも速く泳動した。これらの泳
動差が試料のタイプ（例えば、リゼイト対培地）の相違
によるものでないことを証明するために、ゲルに負荷す
る前に、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細胞の培地ま
たはリゼイトをそれぞれ等容量の擬似トランスフェクト
細胞のリゼイトまたは培地と混合した。これらの大きさ
の差異（リゼイトと精製血清蛋白では１０ｋｄほどの差
があると概算された）の本質は、この酵素の活性型がそ
の不活性型とどのように相違するかについての重要な手
がかりを与えるかもしれない。
化蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤであることを確かめるために、
初めに、２つの挿入物をそれらの重複領域内のＡｃｃＩ
部位で一緒にスプライスし、生成した２．６ｋｂ ｃＤ
ＮＡを真核細胞発現プラスミドｐＢＣ１２ＢＩ（Cullen
(1987) Methodsin Enzymology 152, 684-704）に連結
した。得られたプラスミドｐＢＪ１６８２をＣＯＳ細胞
に導入し、そして精製血清酵素に対するモノクローナル
抗体のプールを使って、１）透過細胞の免疫蛍光（デー
タは示してない）および２）ウェスターンブロット分析
を行うことにより発現を確かめた。擬似トランスフェク
ト細胞の培地およびリゼイトはウェスターンブロットで
検出可能な免疫反応性蛋白を示さなかった（図６のレー
ン１および２）が、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細
胞は培地とリゼイトの両方において検出可能な、グリコ
シル化９０ｋｄコア蛋白の大きさと一致する大きさの免
疫反応性蛋白を生産した（レーン３および４）。しかし
ながら、リゼイト中に検出された蛋白は培地に分泌され
た蛋白よりもわずかに速く泳動し、分泌蛋白は精製され
た血清ＧＰＩ−ＰＬＤよりも速く泳動した。これらの泳
動差が試料のタイプ（例えば、リゼイト対培地）の相違
によるものでないことを証明するために、ゲルに負荷す
る前に、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細胞の培地ま
たはリゼイトをそれぞれ等容量の擬似トランスフェクト
細胞のリゼイトまたは培地と混合した。これらの大きさ
の差異（リゼイトと精製血清蛋白では１０ｋｄほどの差
があると概算された）の本質は、この酵素の活性型がそ
の不活性型とどのように相違するかについての重要な手
がかりを与えるかもしれない。
【００７５】その後、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト
または擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞の培養培地およ
びリゼイトを調製し、 3Ｈ標識ＧＰＩ固定変異型表面糖
蛋白（ＶＳＧ）とインキュベートしてホスホリパーゼ活
性について試験した。図７Ａに示すように、ＤＮＡトラ
ンスフェクト細胞の培地中にかなりの量のホスホリパー
ゼ活性が検出されたが、擬似トランスフェクト細胞では
バックグラウンドレベルの活性しか検出されなかった。
無血清培地で４６時間後、分泌されたホスホリパーゼ活
性の量は６５Ｕ／ｍｌ（ＣＯＳ細胞により分泌された酵
素が精製されたウシ血清酵素と同じ比活性をもつと仮定
すると約０．１５μｇ／ｍｌ）に達した。図７Ｂは、ｐ
ＢＪ１６８２トランスフェクト細胞の培地と比べて、リ
ゼイトでは少量のホスホリパーゼ活性しか観察されない
ことを示す。これらの結果は、クローン化遺伝子がホス
ホリパーゼ酵素をコードすること、および大部分の酵素
活性が細胞から分泌されることを示した。
または擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞の培養培地およ
びリゼイトを調製し、 3Ｈ標識ＧＰＩ固定変異型表面糖
蛋白（ＶＳＧ）とインキュベートしてホスホリパーゼ活
性について試験した。図７Ａに示すように、ＤＮＡトラ
ンスフェクト細胞の培地中にかなりの量のホスホリパー
ゼ活性が検出されたが、擬似トランスフェクト細胞では
バックグラウンドレベルの活性しか検出されなかった。
無血清培地で４６時間後、分泌されたホスホリパーゼ活
性の量は６５Ｕ／ｍｌ（ＣＯＳ細胞により分泌された酵
素が精製されたウシ血清酵素と同じ比活性をもつと仮定
すると約０．１５μｇ／ｍｌ）に達した。図７Ｂは、ｐ
ＢＪ１６８２トランスフェクト細胞の培地と比べて、リ
ゼイトでは少量のホスホリパーゼ活性しか観察されない
ことを示す。これらの結果は、クローン化遺伝子がホス
ホリパーゼ酵素をコードすること、および大部分の酵素
活性が細胞から分泌されることを示した。
【００７６】 3Ｈ標識ＶＳＧ加水分解検定の反応生成物
の分析により、ＤＮＡトランスフェクト細胞のホスホリ
パーゼ活性はホスホリパーゼＤによることが確認できた
（図８参照）。精製血清ＧＰＩ−ＰＬＤまたはトランス
フェクト細胞のコンディションド培地による加水分解か
ら得られた主要量の 3Ｈ標識生成物は薄層クロマトグラ
フィーにおいてジミリストイルホスファチジン酸と共泳
動した。
の分析により、ＤＮＡトランスフェクト細胞のホスホリ
パーゼ活性はホスホリパーゼＤによることが確認できた
（図８参照）。精製血清ＧＰＩ−ＰＬＤまたはトランス
フェクト細胞のコンディションド培地による加水分解か
ら得られた主要量の 3Ｈ標識生成物は薄層クロマトグラ
フィーにおいてジミリストイルホスファチジン酸と共泳
動した。
【００７７】トランスフェクトＣＯＳ細胞のリゼイトお
よびコンディションド培地はさらにエタノールの存在下
で非ＧＰＩ結合ジパルミトイルホスファチジルコリン基
質に対するそれらの特異性について試験した。ＰＡもホ
スファチジルエタノール（エタノールの存在下でのホス
ファチジルコリン特異的ＰＬＤのホスファチジル基転移
反応生成物）も薄層クロマトグラフィーで検出されず
（データは示してない）、クローン化遺伝子がＰＬＤの
ＧＰＩ特異的形態であると確認できた。
よびコンディションド培地はさらにエタノールの存在下
で非ＧＰＩ結合ジパルミトイルホスファチジルコリン基
質に対するそれらの特異性について試験した。ＰＡもホ
スファチジルエタノール（エタノールの存在下でのホス
ファチジルコリン特異的ＰＬＤのホスファチジル基転移
反応生成物）も薄層クロマトグラフィーで検出されず
（データは示してない）、クローン化遺伝子がＰＬＤの
ＧＰＩ特異的形態であると確認できた。
【００７８】
【実施例３】ＧＰＩ固定蛋白のみをコードする遺伝子およびＧＰＩ−
ＰＬＤをコードする遺伝子によるＣＯＳ細胞のトランス
フェクション ＧＰＩ固定基質に対する in vivoホスホリパーゼ活性を
試験するために、ＣＯＳ細胞はＧＰＩ固定胎盤アルカリ
ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のみをコードする遺伝子で
トランスフェクトし、またｐＢＪ１６８２を用いて同時
トランスフェクトした。細胞培地およびリゼイトをアル
カリホスファターゼ活性について検定した。ＣＯＳ細胞
をＰＬＡＰｃＤＮＡ単独でトランスフェクトした場合、
ＰＬＡＰ活性の大部分は細胞リゼイトに検出された。こ
れはＰＬＡＰがＧＰＩ固定蛋白であることと一致した。
ＣＯＳ細胞をＰＬＡＰとｐＢＪ１６８２の両方で同時ト
ランスフェクトした場合は、培地に分泌されたＰＬＡＰ
の量がＰＬＡＰｃＤＮＡのみでトランスフェクトした細
胞の場合よりもかなり高かった。同時トランスフェクト
細胞のリゼイト中のＰＬＡＰ活性はＰＬＡＰのみでトラ
ンスフェクトした細胞の場合よりもわずかに高く、この
ことは同時トランスフェクト細胞においてＧＰＩ固定Ｐ
ＬＡＰが絶えず合成され、ホスホリパーゼ活性により放
出されていることを示唆している。これはまた、同時ト
ランスフェクト細胞の培地およびリゼイト中に検出され
た全ＰＬＡＰ活性が、ＰＬＡＰのみでトランスフェクト
した細胞の場合よりも、常にかなり高いという事実によ
っても支持された。ｐＢＪ１６８２ＤＮＡ単独でトラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞では、バックグラウンドレ
ベルの内因性ＰＬＡＰが培地やリゼイトに検出されただ
けだった。これらの結果は、クローン化ホスホリパーゼ
がＧＰＩ固定蛋白の細胞表面発現に大いに影響を与える
ことを立証した。
ＰＬＤをコードする遺伝子によるＣＯＳ細胞のトランス
フェクション ＧＰＩ固定基質に対する in vivoホスホリパーゼ活性を
試験するために、ＣＯＳ細胞はＧＰＩ固定胎盤アルカリ
ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のみをコードする遺伝子で
トランスフェクトし、またｐＢＪ１６８２を用いて同時
トランスフェクトした。細胞培地およびリゼイトをアル
カリホスファターゼ活性について検定した。ＣＯＳ細胞
をＰＬＡＰｃＤＮＡ単独でトランスフェクトした場合、
ＰＬＡＰ活性の大部分は細胞リゼイトに検出された。こ
れはＰＬＡＰがＧＰＩ固定蛋白であることと一致した。
ＣＯＳ細胞をＰＬＡＰとｐＢＪ１６８２の両方で同時ト
ランスフェクトした場合は、培地に分泌されたＰＬＡＰ
の量がＰＬＡＰｃＤＮＡのみでトランスフェクトした細
胞の場合よりもかなり高かった。同時トランスフェクト
細胞のリゼイト中のＰＬＡＰ活性はＰＬＡＰのみでトラ
ンスフェクトした細胞の場合よりもわずかに高く、この
ことは同時トランスフェクト細胞においてＧＰＩ固定Ｐ
ＬＡＰが絶えず合成され、ホスホリパーゼ活性により放
出されていることを示唆している。これはまた、同時ト
ランスフェクト細胞の培地およびリゼイト中に検出され
た全ＰＬＡＰ活性が、ＰＬＡＰのみでトランスフェクト
した細胞の場合よりも、常にかなり高いという事実によ
っても支持された。ｐＢＪ１６８２ＤＮＡ単独でトラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞では、バックグラウンドレ
ベルの内因性ＰＬＡＰが培地やリゼイトに検出されただ
けだった。これらの結果は、クローン化ホスホリパーゼ
がＧＰＩ固定蛋白の細胞表面発現に大いに影響を与える
ことを立証した。
【００７９】ＣＯＳ細胞から分泌されたＧＰＩ−ＰＬＤ
が細胞表面ＧＰＩ固定ＰＬＡＰを加水分解するかどうか
を試験するために、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細
胞からの培地をＰＬＡＰトランスフェクト細胞とインキ
ュベートし、１、３、８および２４時間のインキュベー
ション後、培地のアリコートのＰＬＡＰ活性を検定し
た。ＰＬＡＰ活性は、たとえ培地が２４時間のインキュ
ベーション期間の前後でＶＳＧ検定において活性であっ
ても、全く検出されなかった。
が細胞表面ＧＰＩ固定ＰＬＡＰを加水分解するかどうか
を試験するために、ｐＢＪ１６８２トランスフェクト細
胞からの培地をＰＬＡＰトランスフェクト細胞とインキ
ュベートし、１、３、８および２４時間のインキュベー
ション後、培地のアリコートのＰＬＡＰ活性を検定し
た。ＰＬＡＰ活性は、たとえ培地が２４時間のインキュ
ベーション期間の前後でＶＳＧ検定において活性であっ
ても、全く検出されなかった。
【００８０】ＧＰＩ固定蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤにより加
水分解されるかどうかを調べる別の方法として、同時ト
ランスフェクトＣＯＳ細胞の培養上清を３Ｈ−エタノー
ルアミンで標識後免疫沈降により試験した。もしもＧＰ
Ｉ固定蛋白が実際にＧＰＩ−ＰＬＤにより加水分解され
るならば、加水分解産物は３Ｈ−エタノールアミン部分
を保持すると予想され、蛋白加水分解により誘導された
産物はこの基を含まないだろう。ＰＬＡＰとＣＤ１６は
両方ともエタノールアミン残基をまだ含む形でＧＰＩ−
ＰＬＤ同時トランスフェクト細胞から放出される。これ
らの結果は、放出された蛋白が蛋白の加水分解により誘
導された産物であるという可能性を排除し、少なくとも
２つの異なるＧＰＩ固定蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤにより放
出されることを示している。
水分解されるかどうかを調べる別の方法として、同時ト
ランスフェクトＣＯＳ細胞の培養上清を３Ｈ−エタノー
ルアミンで標識後免疫沈降により試験した。もしもＧＰ
Ｉ固定蛋白が実際にＧＰＩ−ＰＬＤにより加水分解され
るならば、加水分解産物は３Ｈ−エタノールアミン部分
を保持すると予想され、蛋白加水分解により誘導された
産物はこの基を含まないだろう。ＰＬＡＰとＣＤ１６は
両方ともエタノールアミン残基をまだ含む形でＧＰＩ−
ＰＬＤ同時トランスフェクト細胞から放出される。これ
らの結果は、放出された蛋白が蛋白の加水分解により誘
導された産物であるという可能性を排除し、少なくとも
２つの異なるＧＰＩ固定蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤにより放
出されることを示している。
【００８１】
【実施例４】ヒト肝臓ホスホリパーゼＤ遺伝子の分子クローニング ウシＧＰＩ−ＰＬＤのトリプシンペプチド断片配列と部
分ウシゲノムクローンからのＤＮＡ配列を利用すること
ができた。この情報を使って、一対のオリゴヌクレオチ
ド（＃１ｓ、＃１ａ）をデザインし、ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクションによりＰＬＤｍＲＮＡのヒト源を
検索した。肝臓において、８１−ｂｐアンプリコンによ
りメッセージの存在が検出された。ウシｃＤＮＡ配列に
基づいてプライマー（＃５ｓ、＃４ａ）を作製し、ヒト
肝臓第一鎖ｃＤＮＡからのホスホリパーゼＤ転写物の
５′半分に対応する１．２ｋｂ断片を増幅させた。
分ウシゲノムクローンからのＤＮＡ配列を利用すること
ができた。この情報を使って、一対のオリゴヌクレオチ
ド（＃１ｓ、＃１ａ）をデザインし、ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクションによりＰＬＤｍＲＮＡのヒト源を
検索した。肝臓において、８１−ｂｐアンプリコンによ
りメッセージの存在が検出された。ウシｃＤＮＡ配列に
基づいてプライマー（＃５ｓ、＃４ａ）を作製し、ヒト
肝臓第一鎖ｃＤＮＡからのホスホリパーゼＤ転写物の
５′半分に対応する１．２ｋｂ断片を増幅させた。
【００８２】部分ヒトＧＰＩ−ＰＬＤｃＤＮＡクローン
はライブラリースクリーニングにより単離した。ヒト肝
臓ポリＡ+ ｍＲＮＡをオリゴｄＴを使って分離し、大き
さにより選別した。ＥｃｏＲＩリンカーを結合させたｃ
ＤＮＡをラムダＺＡＰIIベクター（Stratagene）にクロ
ーニングした。２５０万個の組み換え体から成るこのラ
イブラリーは、（低ストリンジェンシーで）ウシｃＤＮ
Ａと（高ストリンジェンシーで）１．２ｋｂヒトＧＰＩ
−ＰＬＤアンプリコンを使って二通りに未増幅のままス
クリーニングした。陽性クローンが両方のプローブによ
って同定され、挿入物の配列が分析された。この部分ｃ
ＤＮＡクローン（ヌクレオチド６８８−１２４７）は１
８６個のアミノ酸残基（２３０−４１６）をコードして
いた。
はライブラリースクリーニングにより単離した。ヒト肝
臓ポリＡ+ ｍＲＮＡをオリゴｄＴを使って分離し、大き
さにより選別した。ＥｃｏＲＩリンカーを結合させたｃ
ＤＮＡをラムダＺＡＰIIベクター（Stratagene）にクロ
ーニングした。２５０万個の組み換え体から成るこのラ
イブラリーは、（低ストリンジェンシーで）ウシｃＤＮ
Ａと（高ストリンジェンシーで）１．２ｋｂヒトＧＰＩ
−ＰＬＤアンプリコンを使って二通りに未増幅のままス
クリーニングした。陽性クローンが両方のプローブによ
って同定され、挿入物の配列が分析された。この部分ｃ
ＤＮＡクローン（ヌクレオチド６８８−１２４７）は１
８６個のアミノ酸残基（２３０−４１６）をコードして
いた。
【００８３】ヒトＧＰＩ−ＰＬＤの成熟アミノ末端はウ
シ蛋白のその部分により高度に保存されていることが判
明し（最初の１２個のうち１１個のアミノ酸が同一）、
しかもヒト膵臓ＰＬＤｃＤＮＡの部分Ｃ末端配列を利用
することができたので、２つのオリゴヌクレオチド（＃
５ｓ、＃９ａ）を作製して、ヒト肝臓第一鎖ｃＤＮＡか
ら２．５ｋｂアンプリコンを増幅させた。このセグメン
トは成熟ヒトホスホリパーゼＤ遺伝子産物をコードする
配列と一致する。このアンプリコンはベクターｐＲｃＣ
ｍＶ（Invitrogen）および哺乳動物細胞による発現に適
するｐＢＣ１２ＢＩ誘導ベクターにクローニングした。
シ蛋白のその部分により高度に保存されていることが判
明し（最初の１２個のうち１１個のアミノ酸が同一）、
しかもヒト膵臓ＰＬＤｃＤＮＡの部分Ｃ末端配列を利用
することができたので、２つのオリゴヌクレオチド（＃
５ｓ、＃９ａ）を作製して、ヒト肝臓第一鎖ｃＤＮＡか
ら２．５ｋｂアンプリコンを増幅させた。このセグメン
トは成熟ヒトホスホリパーゼＤ遺伝子産物をコードする
配列と一致する。このアンプリコンはベクターｐＲｃＣ
ｍＶ（Invitrogen）および哺乳動物細胞による発現に適
するｐＢＣ１２ＢＩ誘導ベクターにクローニングした。
【００８４】成熟ヒトＧＰＩ−ＰＬＤ蛋白をコードする
ＤＮＡ配列は２．５ｋｂアンプリコン、部分ｃＤＮＡク
ローンおよび１．２ｋｂアンプリコン（上で述べた；図
９参照）の２つの独立して単離されたクローンから得ら
れた。予想されたペプチド配列は８１７アミノ酸であ
り、ウシ配列と８２％が同一である。ヒトＧＰＩ−ＰＬ
Ｄのシグナルペプチドをクローニングするために、オリ
ゴヌクレオチド（＃５ＲＴ）をデザインし、肝臓ポリＡ
＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。アダプター−リンカ
ーをｃＤＮＡの末端に連結した後、アダプタープライマ
ーおよびオリゴヌクレオチド＃５ａｍｐ次に＃２３７を
使って、２ラウンドのＰＣＲを行った。サザンブロット
で＃５ｓにより検出された３００ｂｐアンプリコンをサ
ブクローニングし、７つのクローンの配列を解析した。
ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのシグナルペプチドは長さが２
４アミノ酸であり、この配列はウシＧＰＩ−ＰＬＤのそ
れとよく合っていた（１４アミノ酸が同一）。ヒト肝臓
シグナルペプチドをｐＲｃＣＭＶ発現構築物中のＨｐａ
Ｉ部位を介して成熟蛋白コード配列に結合させた。
ＤＮＡ配列は２．５ｋｂアンプリコン、部分ｃＤＮＡク
ローンおよび１．２ｋｂアンプリコン（上で述べた；図
９参照）の２つの独立して単離されたクローンから得ら
れた。予想されたペプチド配列は８１７アミノ酸であ
り、ウシ配列と８２％が同一である。ヒトＧＰＩ−ＰＬ
Ｄのシグナルペプチドをクローニングするために、オリ
ゴヌクレオチド（＃５ＲＴ）をデザインし、肝臓ポリＡ
＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。アダプター−リンカ
ーをｃＤＮＡの末端に連結した後、アダプタープライマ
ーおよびオリゴヌクレオチド＃５ａｍｐ次に＃２３７を
使って、２ラウンドのＰＣＲを行った。サザンブロット
で＃５ｓにより検出された３００ｂｐアンプリコンをサ
ブクローニングし、７つのクローンの配列を解析した。
ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのシグナルペプチドは長さが２
４アミノ酸であり、この配列はウシＧＰＩ−ＰＬＤのそ
れとよく合っていた（１４アミノ酸が同一）。ヒト肝臓
シグナルペプチドをｐＲｃＣＭＶ発現構築物中のＨｐａ
Ｉ部位を介して成熟蛋白コード配列に結合させた。
【００８５】上記方法では、以下のオリゴヌクレオチド
およびＰＣＲ条件を採用した。
およびＰＣＲ条件を採用した。
【００８６】
【式２】
【００８７】
【００８８】ＰＣＲでは、鋳型として、プラスミドまた
はゲノムＤＮＡ、一本鎖ｃＤＮＡ、もしくはラムダファ
ージを使用した。５０μｌの反応混合物は１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、鋳型ＤＮＡ、一対のオリゴヌクレオチドプライマー
（それぞれ５０ｐｍｏｌ）、２．５単位のＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（Cetus-Perkin Elmer）および２００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含んでい
る。鋳型ＤＮＡは９４℃で７分間変性し、Perkin Elmer
サーモサイクラーで２５−３５サイクルの増幅を実施し
た。各サイクルは９４℃で１分間の変性段階、５５℃で
２分間のアニーリング段階、および７２℃で３分間の伸
長段階から成っている。最初のサイクルの変性段階は７
分に延長し、そして最後のサイクルの伸長段階は７２℃
で１０分に延長した。ＰＣＲ産物は１−４％アガロース
ゲルで分析した。増幅ＤＮＡをゲルから切り出し、ガラ
スビーズ（Geneclean ）で精製し、一般用のクローニン
グベクターｐＢＳ（Stratgene ）のＨｉｎｃII部位にサ
ブクローニングした。ライブラリー構築およびスクリー
ニングは次のように行った：ヒト肝臓ｍＲＮＡを Clont
ech Labsから購入し、Gubler and Hoffmann (1983)の方
法によりｃＤＮＡを合成した。５０μｌの反応混合物
（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５
ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ）中で、１．２５μｇ
のオリゴ−ｄＴを付加した１μｇのｍＲＮＡを、ＲＮａ
ｓｅＨ陰性ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を使って、
一本鎖ｃＤＮＡに変換した。この反応混合物は３７℃で
１時間インキュベートした。この反応混合物に１０μＣ
ｉ32Ｐ−ｄＣＴＰを加えて、ＴＣＡ沈殿後に取り込まれ
た放射能を測定することにより収量を監視した。
はゲノムＤＮＡ、一本鎖ｃＤＮＡ、もしくはラムダファ
ージを使用した。５０μｌの反応混合物は１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、鋳型ＤＮＡ、一対のオリゴヌクレオチドプライマー
（それぞれ５０ｐｍｏｌ）、２．５単位のＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（Cetus-Perkin Elmer）および２００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含んでい
る。鋳型ＤＮＡは９４℃で７分間変性し、Perkin Elmer
サーモサイクラーで２５−３５サイクルの増幅を実施し
た。各サイクルは９４℃で１分間の変性段階、５５℃で
２分間のアニーリング段階、および７２℃で３分間の伸
長段階から成っている。最初のサイクルの変性段階は７
分に延長し、そして最後のサイクルの伸長段階は７２℃
で１０分に延長した。ＰＣＲ産物は１−４％アガロース
ゲルで分析した。増幅ＤＮＡをゲルから切り出し、ガラ
スビーズ（Geneclean ）で精製し、一般用のクローニン
グベクターｐＢＳ（Stratgene ）のＨｉｎｃII部位にサ
ブクローニングした。ライブラリー構築およびスクリー
ニングは次のように行った：ヒト肝臓ｍＲＮＡを Clont
ech Labsから購入し、Gubler and Hoffmann (1983)の方
法によりｃＤＮＡを合成した。５０μｌの反応混合物
（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５
ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ）中で、１．２５μｇ
のオリゴ−ｄＴを付加した１μｇのｍＲＮＡを、ＲＮａ
ｓｅＨ陰性ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を使って、
一本鎖ｃＤＮＡに変換した。この反応混合物は３７℃で
１時間インキュベートした。この反応混合物に１０μＣ
ｉ32Ｐ−ｄＣＴＰを加えて、ＴＣＡ沈殿後に取り込まれ
た放射能を測定することにより収量を監視した。
【００８９】第二鎖の合成は Amersham ｃＤＮＡ合成・
クローニングキットからの緩衝液を使って次のように行
った。２５０μｌの反応混合物は５０μｌの第一鎖合成
反応混合物、９３．５μｌの第二鎖合成緩衝液、４Ｕの
ＲＮａｓｅＨ、１１５ＵのＤＮＡポリメラーゼＩおよび
９１．５μｌの水を含む。合成は１４℃で１時間次に室
温で１時間行い、最後に７０℃で１０分間インキュベー
トした。２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（４Ｕ／μ
ｌ）を加え、この混合物を３７℃で１０分間インキュベ
ートした。この反応の収量はＴＣＡ沈殿ｃＤＮＡをカウ
ントすることにより概算した。精製した二本鎖ｃＤＮＡ
は、４μｌのＭ緩衝液、１ｘｓ−アデノシルメチオニン
および３０ＵのＥｃｏＲＩメチラーゼを含む２０μｌの
反応混合物中でメチル化した。この混合物を３７℃で１
時間次に７０℃で１０分間インキュベートして酵素を不
活性化した。このメチル化ｃＤＮＡ（１．５μｇ）に、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ中で１５℃にて一晩かけてＥｃｏＲＩ
リンカー（１．５μｇ）を連結した。１００μｌの反応
混合物中のリンカー付加ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ（１００
Ｕ）を用いて３７℃で５時間消化した。その後、消化し
たｃＤＮＡはセファクリルＳ５００カラムにかけて大き
さにより分画化し、高分子量画分をプールして精製し
た。
クローニングキットからの緩衝液を使って次のように行
った。２５０μｌの反応混合物は５０μｌの第一鎖合成
反応混合物、９３．５μｌの第二鎖合成緩衝液、４Ｕの
ＲＮａｓｅＨ、１１５ＵのＤＮＡポリメラーゼＩおよび
９１．５μｌの水を含む。合成は１４℃で１時間次に室
温で１時間行い、最後に７０℃で１０分間インキュベー
トした。２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（４Ｕ／μ
ｌ）を加え、この混合物を３７℃で１０分間インキュベ
ートした。この反応の収量はＴＣＡ沈殿ｃＤＮＡをカウ
ントすることにより概算した。精製した二本鎖ｃＤＮＡ
は、４μｌのＭ緩衝液、１ｘｓ−アデノシルメチオニン
および３０ＵのＥｃｏＲＩメチラーゼを含む２０μｌの
反応混合物中でメチル化した。この混合物を３７℃で１
時間次に７０℃で１０分間インキュベートして酵素を不
活性化した。このメチル化ｃＤＮＡ（１．５μｇ）に、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ中で１５℃にて一晩かけてＥｃｏＲＩ
リンカー（１．５μｇ）を連結した。１００μｌの反応
混合物中のリンカー付加ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ（１００
Ｕ）を用いて３７℃で５時間消化した。その後、消化し
たｃＤＮＡはセファクリルＳ５００カラムにかけて大き
さにより分画化し、高分子量画分をプールして精製し
た。
【００９０】遺伝子ライブラリーはベクターラムダＺＡ
ＰII（Strategen ）に構築した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
とその緩衝液を含む１０μｌの反応混合物中で、Ｅｃｏ
ＲＩ消化リン酸化ベクターに１４℃で一晩かけてｃＤＮ
Ａを連結させた。連結ｃＤＮＡはギガパック（Gigapac
k）キットを使って、Stratageneにより示唆される条件
のもとでファージにパッケージした。
ＰII（Strategen ）に構築した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
とその緩衝液を含む１０μｌの反応混合物中で、Ｅｃｏ
ＲＩ消化リン酸化ベクターに１４℃で一晩かけてｃＤＮ
Ａを連結させた。連結ｃＤＮＡはギガパック（Gigapac
k）キットを使って、Stratageneにより示唆される条件
のもとでファージにパッケージした。
【００９１】２５０万個のクローンのライブラリーが得
られ、ＸＬ−１ブルーセルにプレートし、２組のフィル
ターに写しとった。プラーク・ハイブリダイゼーション
はBenton and Davis (1977) Science 196, 180-182の方
法に従った。放射性32Ｐ標識ＤＮＡプローブ（２．５ｘ
１０8 ｃｐｍ／μｇ）をランダムプライミング法（Fein
berg and Vogelstein (1984) Anal..Biochem. 137, 266
-267）により作製した。ハイブリダイゼーションは６ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５ｘ Denhardt 、１００μｇ
／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、２５−５０％ホルムアミド中
で４２℃一晩行った。オートラジオグラフィーの前に
０．１−２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３７℃（低ス
トリンジェンシー）または５５℃（高ストリンジェンシ
ー）にてフィルターを洗った。ＤＮＡシークエンシング 二本鎖プラスミドＤＮＡはシークエナーゼ（Sequenase;
ＵＳＢ）マニュアルに記載される方法により配列決定を
実施した。図９には、ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのヌクレ
オチド配列および翻訳アミノ酸配列が示してある。図１
０には、ヒトおよびウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ成熟蛋白の
アミノ酸配列の整合が示してある。
られ、ＸＬ−１ブルーセルにプレートし、２組のフィル
ターに写しとった。プラーク・ハイブリダイゼーション
はBenton and Davis (1977) Science 196, 180-182の方
法に従った。放射性32Ｐ標識ＤＮＡプローブ（２．５ｘ
１０8 ｃｐｍ／μｇ）をランダムプライミング法（Fein
berg and Vogelstein (1984) Anal..Biochem. 137, 266
-267）により作製した。ハイブリダイゼーションは６ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５ｘ Denhardt 、１００μｇ
／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、２５−５０％ホルムアミド中
で４２℃一晩行った。オートラジオグラフィーの前に
０．１−２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３７℃（低ス
トリンジェンシー）または５５℃（高ストリンジェンシ
ー）にてフィルターを洗った。ＤＮＡシークエンシング 二本鎖プラスミドＤＮＡはシークエナーゼ（Sequenase;
ＵＳＢ）マニュアルに記載される方法により配列決定を
実施した。図９には、ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのヌクレ
オチド配列および翻訳アミノ酸配列が示してある。図１
０には、ヒトおよびウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ成熟蛋白の
アミノ酸配列の整合が示してある。
【００９２】
【実施例５】ヒト膵臓ホスホリパーゼＤｃＤＮＡクローンの単離およ
び性状決定 全ＲＮＡは、Gubler et al., (1983) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 80, 4311-4314に記載されるように、ヒト
膵臓腫瘍から単離した。ポリＡ+ ＲＮＡが、ＲＮＡ全量
に対して２．５％（ｗ／ｗ）の収率で得られた。ｃＤＮ
ＡライブラリーをSambrook,J., Fritsch,E.F. and Mani
atis,T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S
econd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
1989に発表された方法に従ってλｇｔ１１に構築し、
増幅させた。ｃＤＮＡライブラリーはプローブとしてウ
シＧＰＩ−ＰＬＤニックトランスレートｃＤＮＡ〔Koch
a,J.et al. (1986) Cell 44, 689-696〕を用いて低スト
リンジェンシー（２５％ホルムアミド）条件下でスクリ
ーニングした。２つの陽性クローンがプラーク精製さ
れ、ｃＤＮＡ挿入物をｐＧｅｍ３ｚ（Promega Biotec）
にサブクローニングして、シークエナーゼの製造者（Un
ited States Biochemical Corp. ）により推薦されるジ
デオキシシークエンシング法を使ってそれらの配列を解
析した。クローンｐＪＪ１９３５ａの配列は図１１に示
してあり、ヌクレオチド１（ウシＧＰＩ−ＰＬＤヌクレ
オチドのヌクレオチド１６０９に対応する）から始ま
る。クローンｐＪＪ１９３９の配列はｐＪＪ１９３５ａ
のヌクレオチド位置４１０から始まるものの、あとはｐ
ＪＪ１９３５ａと同一である。
び性状決定 全ＲＮＡは、Gubler et al., (1983) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 80, 4311-4314に記載されるように、ヒト
膵臓腫瘍から単離した。ポリＡ+ ＲＮＡが、ＲＮＡ全量
に対して２．５％（ｗ／ｗ）の収率で得られた。ｃＤＮ
ＡライブラリーをSambrook,J., Fritsch,E.F. and Mani
atis,T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S
econd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
1989に発表された方法に従ってλｇｔ１１に構築し、
増幅させた。ｃＤＮＡライブラリーはプローブとしてウ
シＧＰＩ−ＰＬＤニックトランスレートｃＤＮＡ〔Koch
a,J.et al. (1986) Cell 44, 689-696〕を用いて低スト
リンジェンシー（２５％ホルムアミド）条件下でスクリ
ーニングした。２つの陽性クローンがプラーク精製さ
れ、ｃＤＮＡ挿入物をｐＧｅｍ３ｚ（Promega Biotec）
にサブクローニングして、シークエナーゼの製造者（Un
ited States Biochemical Corp. ）により推薦されるジ
デオキシシークエンシング法を使ってそれらの配列を解
析した。クローンｐＪＪ１９３５ａの配列は図１１に示
してあり、ヌクレオチド１（ウシＧＰＩ−ＰＬＤヌクレ
オチドのヌクレオチド１６０９に対応する）から始ま
る。クローンｐＪＪ１９３９の配列はｐＪＪ１９３５ａ
のヌクレオチド位置４１０から始まるものの、あとはｐ
ＪＪ１９３５ａと同一である。
【００９３】ヒト膵臓ＧＰＩ−ＰＬＤの部分アミノ酸配
列の分析は、ウシアミノ酸配列と比較したとき、高レベ
ルの同一性（８１％）を示し、ヌクレオチドレベルでは
８４％が同一であった。
列の分析は、ウシアミノ酸配列と比較したとき、高レベ
ルの同一性（８１％）を示し、ヌクレオチドレベルでは
８４％が同一であった。
【００９４】
【実施例６】組み換え体、分泌可能蛋白の新規な生産方法 通常ＧＰＩ固定されない他の蛋白は、それらの遺伝子を
３′末端でＧＰＩ結合のシグナル配列をコードするよう
に修飾することにより、ＧＰＩ固定されるように誘導す
ることができる。細胞をこの修飾遺伝子とＧＰＩ−ＰＬ
Ｄの遺伝子の両方でトランスフェクトすると、蛋白が分
泌されるようになる。
３′末端でＧＰＩ結合のシグナル配列をコードするよう
に修飾することにより、ＧＰＩ固定されるように誘導す
ることができる。細胞をこの修飾遺伝子とＧＰＩ−ＰＬ
Ｄの遺伝子の両方でトランスフェクトすると、蛋白が分
泌されるようになる。
【００９５】ＧＰＩ固定蛋白の分泌の原理が他の蛋白に
一般的に適用されるかどうか調べるために、ＣＤ１６の
ＧＰＩアンカーを他の蛋白に移し、その後ＧＰＩ−ＰＬ
Ｄの存在または不在下でそれらの発現を監視した。ＧＰ
Ｉ結合のシグナルを送るＣＤ１６の部分をコードするＤ
ＮＡ断片〔Scallon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.US
A 86, 5079-5083 (1989), Selvaraj et al., Nature 33
3, 565-567 (1988) および Simmons et al., Nature 33
3, 568-570 (1988) を参照〕、すなわちＣ末端３７アミ
ノ酸：
一般的に適用されるかどうか調べるために、ＣＤ１６の
ＧＰＩアンカーを他の蛋白に移し、その後ＧＰＩ−ＰＬ
Ｄの存在または不在下でそれらの発現を監視した。ＧＰ
Ｉ結合のシグナルを送るＣＤ１６の部分をコードするＤ
ＮＡ断片〔Scallon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.US
A 86, 5079-5083 (1989), Selvaraj et al., Nature 33
3, 565-567 (1988) および Simmons et al., Nature 33
3, 568-570 (1988) を参照〕、すなわちＣ末端３７アミ
ノ酸：
【００９６】
【式３】
【００９７】
【００９８】は、内皮白血球付着分子−１（Endothelia
l Leukocyte Adhesion Molecule-1 ：ＥＬＡＭ−１）の
細胞外ドメインをコードするＤＮＡに〔Bevilacqua,M.
P. etal., (1989) Science 243, 1160-1165〕；および
ＩＬ−２レセプターのｐ７０サブユニットの細胞外ドメ
インをコードするＤＮＡに（Hatakeyama,M., (1989)Sci
ence 244, 551-556）一般的な方法を使ってスプライス
した。
l Leukocyte Adhesion Molecule-1 ：ＥＬＡＭ−１）の
細胞外ドメインをコードするＤＮＡに〔Bevilacqua,M.
P. etal., (1989) Science 243, 1160-1165〕；および
ＩＬ−２レセプターのｐ７０サブユニットの細胞外ドメ
インをコードするＤＮＡに（Hatakeyama,M., (1989)Sci
ence 244, 551-556）一般的な方法を使ってスプライス
した。
【００９９】詳細には、ＥＬＡＭ−１の場合、２つの独
立した構築物、すなわちＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩおよ
びＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ、がＰＣＲ技法を用いて作
製された。ＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩでは、オリゴヌク
レオチド５′−ＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧ−３′（５′センスプライマー）
と５′−ＴＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＴ−３′（３′アンチセンスプライマー）
を使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコン
はその後制限酵素ＢｅｌＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩの構築に使用されるＥ
ＬＡＭ細胞外コード配列（アミノ酸１５−５３２）を含
んでいた。ＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩでは、オリゴヌク
レオチド５′−ＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧ−３′（５′センスプライマー）
と５′−ＴＡＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＣ
ＡＣＴＴＧＡＧ−３′（３′アンチセンスプライマー）
を使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコン
はその後制限酵素ＢｅｌＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩの構築に使用されるＥ
ＬＡＭ−１細胞外コード配列（アミノ酸１５−１５７）
を含んでいた。
立した構築物、すなわちＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩおよ
びＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ、がＰＣＲ技法を用いて作
製された。ＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩでは、オリゴヌク
レオチド５′−ＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧ−３′（５′センスプライマー）
と５′−ＴＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＴ−３′（３′アンチセンスプライマー）
を使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコン
はその後制限酵素ＢｅｌＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩの構築に使用されるＥ
ＬＡＭ細胞外コード配列（アミノ酸１５−５３２）を含
んでいた。ＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩでは、オリゴヌク
レオチド５′−ＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧ−３′（５′センスプライマー）
と５′−ＴＡＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＣ
ＡＣＴＴＧＡＧ−３′（３′アンチセンスプライマー）
を使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコン
はその後制限酵素ＢｅｌＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩの構築に使用されるＥ
ＬＡＭ−１細胞外コード配列（アミノ酸１５−１５７）
を含んでいた。
【０１００】ｐ７０−ＧＰＩの場合は、オリゴヌクレオ
チド５′−ＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡ
ＡＧＧＧＣＴＧＣ−３′（３′アンチセンスプライマ
ー）と５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴ
ＣＴＧＣＣＣＣＴＣ−３′（５′センスプライマー）を
使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコンは
その後制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはｐ７０−ＧＰＩの構築に使用されるｐ７０細胞外
コード配列（アミノ酸２１−２１４）を含んでいた。
チド５′−ＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡ
ＡＧＧＧＣＴＧＣ−３′（３′アンチセンスプライマ
ー）と５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴ
ＣＴＧＣＣＣＣＴＣ−３′（５′センスプライマー）を
使ってアンプリコンを形成させた。このアンプリコンは
その後制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。
これはｐ７０−ＧＰＩの構築に使用されるｐ７０細胞外
コード配列（アミノ酸２１−２１４）を含んでいた。
【０１０１】また、ＣＤ１６からのＣ末端ＧＰＩシグナ
ルペプチドもＰＣＲ技法を用いて単離した。オリゴヌク
レオチド５′−ＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡ
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡ−３′（５′センスプライマー）と
５′−ＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣ
ＴＴ−３′（３′アンチセンスプライマー）を使ってア
ンプリコンを形成させ、これを制限酵素ＳａｌＩおよび
ＳｔｕＩ（アンプリコンの内部制限部位）で消化した。
この消化物はＣＤ１６蛋白のアミノ酸１８０−２１６７
をコードしていた。種々のＧＰＩキメラ構築物を作製す
るために、対象となる蛋白の蛋白コード領域をＣＤ１６
ＧＰＩアンカー配列に連結させ、次いで真核細胞発現ベ
クターｐＢＣ１２ＢＩ（ＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化し
ておいた）に連結させた。それぞれのＧＰＩ構築物はコ
ロニーハイブリダイゼーションにより同定し、制限酵素
分析およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。
ルペプチドもＰＣＲ技法を用いて単離した。オリゴヌク
レオチド５′−ＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡ
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡ−３′（５′センスプライマー）と
５′−ＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣ
ＴＴ−３′（３′アンチセンスプライマー）を使ってア
ンプリコンを形成させ、これを制限酵素ＳａｌＩおよび
ＳｔｕＩ（アンプリコンの内部制限部位）で消化した。
この消化物はＣＤ１６蛋白のアミノ酸１８０−２１６７
をコードしていた。種々のＧＰＩキメラ構築物を作製す
るために、対象となる蛋白の蛋白コード領域をＣＤ１６
ＧＰＩアンカー配列に連結させ、次いで真核細胞発現ベ
クターｐＢＣ１２ＢＩ（ＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化し
ておいた）に連結させた。それぞれのＧＰＩ構築物はコ
ロニーハイブリダイゼーションにより同定し、制限酵素
分析およびＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１０２】ハイブリッドＧＰＩ−蛋白が、ＧＰＩ−Ｐ
ＬＤで同時トランスフェクトされたとき、分泌されるか
どうか調べるために、ＣＯＳ細胞をｐＢＪ１６８２の存
在または不在下にＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩ（図１２
Ａ）、ＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ（図１２Ｂ）、または
ｐ７０−ＧＰＩ（図示せず）でトランスフェクトした。
トランスフェクションの２日後、細胞は35Ｓ−システイ
ンを用いて２時間代謝的に標識した。対象の蛋白に対し
て誘導された抗体を使って、培地または抽出物を免疫沈
降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し、そしてフルオロ
グラフィーにより視覚化した。試験したすべての細胞抽
出物において対象の蛋白が検出されたが、上清中にはＧ
ＰＩ−ＰＬＤ構築物を同時トランスフェクトしたときだ
け検出された。これらの結果は、ＧＰＩアンカーが通常
ＧＰＩ固定されない蛋白に結合されること、この新規ハ
イブリッド蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤ酵素の存在下で発現さ
れるときに分泌されること、を証明している。このよう
な分泌蛋白は、用いるハイブリッド蛋白に応じて、いろ
いろな疾患の治療に関係するだろう。
ＬＤで同時トランスフェクトされたとき、分泌されるか
どうか調べるために、ＣＯＳ細胞をｐＢＪ１６８２の存
在または不在下にＥＬＡＭ−１−１−ＧＰＩ（図１２
Ａ）、ＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ（図１２Ｂ）、または
ｐ７０−ＧＰＩ（図示せず）でトランスフェクトした。
トランスフェクションの２日後、細胞は35Ｓ−システイ
ンを用いて２時間代謝的に標識した。対象の蛋白に対し
て誘導された抗体を使って、培地または抽出物を免疫沈
降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し、そしてフルオロ
グラフィーにより視覚化した。試験したすべての細胞抽
出物において対象の蛋白が検出されたが、上清中にはＧ
ＰＩ−ＰＬＤ構築物を同時トランスフェクトしたときだ
け検出された。これらの結果は、ＧＰＩアンカーが通常
ＧＰＩ固定されない蛋白に結合されること、この新規ハ
イブリッド蛋白がＧＰＩ−ＰＬＤ酵素の存在下で発現さ
れるときに分泌されること、を証明している。このよう
な分泌蛋白は、用いるハイブリッド蛋白に応じて、いろ
いろな疾患の治療に関係するだろう。
【０１０３】下記の文献を含めて本明細書中で引用した
全ての文献の教示内容は参照によりここに挿入されるも
のとする。
全ての文献の教示内容は参照によりここに挿入されるも
のとする。
【０１０４】
【表５】
【図１】ＧＰＩアンカー構造の模型を示す図。
【図２】ヒドロキシアパタイトおよびＺｎキレートマト
リックスクロマトグラフィーにより精製された試料のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す図（電気泳動図）。
リックスクロマトグラフィーにより精製された試料のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す図（電気泳動図）。
【図３】イムノアフィニティークロマトグラフィー法に
より精製された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図（電気
泳動図）。
より精製された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図（電気
泳動図）。
【図４】クローンｐＢＪ１５４９およびｐＢＪ１６４４
由来のスプライスされた挿入物の制限地図および塩基配
列決定戦略を示す図。
由来のスプライスされた挿入物の制限地図および塩基配
列決定戦略を示す図。
【図５】ウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤのＤＮＡ配列および推
定アミノ酸配列を示す図。
定アミノ酸配列を示す図。
【図６】トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培地およ
びリゼイトのウェスターンブロット分析を示す図（電気
泳動図）。
びリゼイトのウェスターンブロット分析を示す図（電気
泳動図）。
【図７】 3Ｈ標識ＶＳＧの加水分解によるトランスフェ
クトＣＯＳ細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＤ活性の証明を示
す図。
クトＣＯＳ細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＤ活性の証明を示
す図。
【図８】薄層クロマトグラフィーによる加水分解ＶＳＧ
の生成物の分析を示す図。
の生成物の分析を示す図。
【図９】ヒト肝臓グリコシルホスファチジルイノシトー
ル特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す図。
ル特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す図。
【図10】ヒトおよびウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ成熟蛋白の
アミノ酸配列の整合を示す図。
アミノ酸配列の整合を示す図。
【図11】ヒト膵臓グリコシルホスファチジルイノシトー
ル特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す図。
ル特異的ホスホリパーゼＤのヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す図。
【図12】ＰＬＤの存在下および不在下でのＥＬＡＭ−１
−ＧＰＩ（カラムＡ）およびＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ
（カラムＢ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図
（電気泳動図）。
−ＧＰＩ（カラムＡ）およびＥＬＡＭ−１−２−ＧＰＩ
（カラムＢ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図
（電気泳動図）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 ジヤレマ ピーター コチヤン アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 07044，ベロナ，クレストモント ロード ７ (72)発明者 シヤーリー シアオ−ハン リー アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 07028，グレンリツジ，ブルームフイール ド アベニユー 969 (72)発明者 ユ−チン ユジエン パン アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 07058，パインブルツク，クレーンドライ ブ 10 (72)発明者 バーナード ジエームス スカローン アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 07110，ナツトリー，センターストリート 500 (72)発明者 トーマス クリストフアー ヒン−シン ツアン アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 07109，ベルビル，デウイツトアベニユー 468
Claims (22)
- 【請求項１】 他の蛋白を実質的に含まない、蛋白グリ
コシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパー
ゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）またはその生物学的に活性な断
片。 - 【請求項２】 請求項１に記載の化合物の変異型であ
る、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホス
ホリパーゼＤ活性化合物。 - 【請求項３】 請求項１の蛋白はウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬ
Ｄである、請求項１または２の化合物。 - 【請求項４】 ウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤは図５に示すア
ミノ酸配列を有する、請求項３の化合物。 - 【請求項５】 請求項１の蛋白はヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬ
Ｄである、請求項１または２の化合物。 - 【請求項６】 ヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤは図９に示すア
ミノ酸配列を有する、請求項５の化合物。 - 【請求項７】 請求項１の蛋白はヒト膵臓ＧＰＩ−ＰＬ
Ｄである、請求項１または２の化合物。 - 【請求項８】 ヒト膵臓ＧＰＩ−ＰＬＤは図１１に示す
部分アミノ酸配列を有する、請求項７の化合物。 - 【請求項９】 請求項３−８のいずれか１項に記載の化
合物のグリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホ
スホリパーゼＤ活性断片。 - 【請求項10】 請求項３−８のいずれか１項に記載の化
合物のグリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホ
スホリパーゼＤ活性変異体。 - 【請求項11】 請求項３−８のいずれか１項に記載の化
合物の変異体のグリコシルホスファチジルイノシトール
特異的ホスホリパーゼＤ活性断片。 - 【請求項12】 請求項１−１１のいずれか１項に記載の
蛋白をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。 - 【請求項13】 発現ＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結
された請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む組み
換えベクター。 - 【請求項14】 真核または原核細胞内で複製可能なプラ
スミドまたはウイルスベクターである、請求項１３の組
み換えベクター。 - 【請求項15】 請求項１３または１４に記載のベクター
で形質転換されたもしくはトランスフェクトされた原核
または真核宿主細胞。 - 【請求項16】 請求項１−１１のいずれか１項に記載の
蛋白を生産する方法であって、請求項１３または１４の
いずれかに記載の組み換えベクターを含む宿主を適当な
生育条件下で培養して前記蛋白を発現させ、そして前記
蛋白を単離することから成る方法。 - 【請求項17】 宿主はＣＨＯ細胞である、請求項１６の
方法。 - 【請求項18】 細胞から蛋白を分泌させる方法であっ
て、 ａ）宿主細胞を請求項１３または１４のいずれかに記載
の組み換えベクターとＧＰＩ固定蛋白をコードする組み
換えベクターとで形質転換すること； ｂ）形質転換細胞を適当な生育条件下で培養して両蛋白
を発現させること；および ｃ）ＧＰＩアンカーが切り離された蛋白を培地から単離
すること；から成る方法。 - 【請求項19】 ＧＰＩ固定蛋白は対象の蛋白にＣ末端Ｇ
ＰＩシグナルペプチドをスプライスすることにより形成
される、請求項１８の方法。 - 【請求項20】 Ｃ末端ＧＰＩシグナルペプチドはＣＤ１
６蛋白から誘導される、請求項１９の方法。 - 【請求項21】 請求項１−１１のいずれか１項に記載の
蛋白および適当な洗剤と反応させることによりＧＰＩア
ンカーに結合された蛋白をＧＰＩアンカーから切り離す
ことを特徴とする、グリコシルホスファチジルイノシト
ールアンカーに結合された蛋白を切断するための請求項
１−１１のいずれか１項に記載の蛋白の使用。 - 【請求項22】 請求項１−１１のいずれか１項に記載の
蛋白に特異的な抗体。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
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