JPH08504602A - Ｔｉａ−１結合タンパク質及びそれをコードする分離された相補的ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチドをコードする配列を有する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を分離した。一実施態様では、ポリペプチドは、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と免疫反応性である。特異的ｃＤＮＡが決定され、それからアミノ酸配列が演繹された。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＩＡ−１結合タンパク質及びそれをコードする分離された相補的ＤＮＡ 発明の分野 本発明は、ＴＩＡ−１に結合するタンパク質及びリンパ球関連タンパク質に関 する。また、本発明は、結合タンパク質をコードする分離されたｃＤＮＡに関す る。 発明の背景 細胞溶解性リンパ球（ＣＴＬ）は、標的細胞認識に応答して放出される細胞質 顆粒を有する。ＣＴＬ顆粒は、標的細胞死に寄与すると考えられるパーホリン及 びセリンプロテアーゼ等の分泌タンパク質を含有している。パーホリンは、直接 的に細胞溶解性であることが示された。Ｃａ⁺⁺の存在下で、パーホリンは、標的 細胞形質膜に入り、そこで凝集して浸透的に活性なイオンチャンネルを形成する ｛Ｌｉｃｈｔｅｎｈｅｌｄ、Ｍ．Ｇ．等（１９８８）、”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｆｏｒｉｎ”、Ｎａｔｕ ｒｅ 、３３５：４４８〜４５１；Ｈａｍｅｅｄ、Ａ．等（１９８９）、”Ｃｙｔ ｏｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｃａ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｐｏｒｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｅｘｔｅ ｎｓｉｖｅ ＤＮＡ−ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ”、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９：７６５〜７７７｝。ラット好塩基球性白血 病（ＲＢＬ）細胞へのパーホリンｃＤＮＡの形質移入により調節分泌機構を介し て赤血球を溶解する能力が付与されるとすることが最近明らかにされ、これによ り、リンパ球介在細胞溶解菌にパーホリンが直接係わっていることが支持され ている｛Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．及びＰ．Ａ．Ｈｅｎｋａｒｔ、（１９９１）、 ”Ａ ｎｏｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ＩｇＥ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔ ｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ／ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｇｅｎｅ”、Ｃｅｌｌ ６４：１１７ ５〜１１８１｝。しかしながら、パーホリン形質導入ＲＢＬ細胞が有核細胞を効 率的に溶解できないことは、最適リンパ球介在死滅にはさらなる顆粒成分が必要 であることを示唆している。パーホリンが唯一のエフェクター分子でないことは 、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とＣＴＬがパーホリン活性に必要とする細胞外 Ｃａ⁺⁺の不存在下においてある種の標的細胞を死滅させることができることによ り支持される｛Ｔｉｒｏｓｈ，Ｒ．及びＧ．Ｂｅｒｋｅ（１９８５）、”Ｔ Ｌ ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ ａｓ ａｎ ｅ ｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ．Ｉ．Ｅｖ ｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｓｉ ｔｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｔｉｏｎ”、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ７５：１１３〜１２３｝。さらに、パーホリンをほとんど発現しない細胞溶解性 リンパ球（例えば、ＣＤ４⁺ＣＴＬクローン）が、強力な細胞溶解性エフェクタ ー細胞であることが判明した｛Ｔａｋａｙａｍａ，Ｈ．等（１９９１）、”Ａｎ ｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔ ｃｅ ｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐｅｒｆｏｒｉｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅ ｃｌｏｎｅｓ”、Ｉｎｔｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：１１４９ 〜１１５６｝。これらの結果は、パーホリンとは関係のない細胞溶解性エフェク ター機構が、少なくともある種の形態の標的細胞死滅に寄与していることを意味 している。 パーホリン介在溶菌の他に、ＣＴＬは、標的細胞において、アポ プトシスとして知られているプログラム細胞死の経路を誘発することが判明した ｛Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｈ．（１９８３）、”Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｉｓｉｎｔ ｅｇｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙ ｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｄａｍａｇｅ”、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅ ｖ． 、７２：９７〜１１８｝。この自解経路の都合のよいマーカーは、標的細胞 ＤＮＡを複数の２００ｂｐヌクレオソームサイズのモノマーに断片化することで ある｛Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．、（１９８０）、”Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉ ｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｓ ａｓｓ ｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ ２８４：５５５〜５５６；Ｄｕｋｅ ，Ｒ．Ｃ．等（１９８３）、”Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓ ｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ａｎ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ”、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． 、８０：６３６１〜６３６５｝。得られ たＤＮＡ断片の「ラダー」は、このプログラム自殺経路の特徴と考えられる。 パーホリンが細胞溶解を誘発するがＤＮＡ断片化を誘発しないとの考察｛Ｄｕｋ ｅ，Ｒ．Ｃ．等（１９８９）、”Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｉｎｄ ｕｃｅｓ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ＤＮＡ ｆ ｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０：１４５１〜１４ ５６｝は、他の顆粒成分が、アポプトシス細胞死の誘発する傾向があることを示 唆している。顆粒関連セリンプロテアーゼの科であるグランザイムは、パーホリ ン無関係細胞溶解性エフェクター分子の候補である｛Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ，Ｍ ．Ｓ．及びＨ．Ｎ．Ｅｉｓｅｎ、（１９８５）、”Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｎ ｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈ ｏｃｙｔｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ、３１４：７４３〜７４５；Ｍａｓｓｏｎ，Ｄ． 及びＪ．Ｔｓｃｈｏｐｐ，（１９８７）、”Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｅｒｉ ｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｉｎ ｌｙｔｉｃ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｏｆ ｃｙ ｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”、Ｃｅｌｌ ４９：６７９〜６ ８５｝。精製グランザイムは直接的に細胞溶解性ではないが、プロテアーゼイン ヒビタがリンパ球介在細胞溶解をブロックできることは、グランザイムが標的細 胞死滅に役割を果たすことを示唆している｛Ｌａｖｉｅ，Ｇ．等（１９８５）、 ”Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉ ａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１３５：１４７０〜１４７６；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．０ ．等（１９８８），”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍ ｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｏ，Ｓ，Ｓ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏ ｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ ｉｓ ａｔ ａｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔ− ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｔｅｐ”、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：５６４ 〜５７０｝。最も豊富な顆粒関連セリンプロテアーゼであるグランザイムＡは洗 浄剤浸透化ＥＬ４細胞においてＤＮＡ断片化を誘発するとの考察は、これらの分 子がＣＴＬ標的におけるアポプトシスの誘発を寄与する可能性があることを示し ている｛Ｈａｙｅｓ，Ｍ．Ｐ．等（１９８９）、”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔ ｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇ ｒａｎｚｙｍｅ Ａ”、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０：９３３〜９４６｝。グ ランザイム とパーホリンの組み合わせは未浸透化標的細胞におけるＤＮＡ断片化を誘発する ことがあるとのさらなる実証は、パーホリンはグランザイムが標的細胞に排出さ れるのに関与している可能性があることを示唆している｛Ｈａｙｅｓ等、同書、 （１９８９）；Ｓｈｉ，Ｌ．等（１９９２）、”Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌ ｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ”、Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． 、１７５：５５３〜５６６｝。最後に、ＲＢＬ細胞にパーホリ ンとグランザイムＡとを組み合わせて形質移入することにより、選択された標的 細胞におけるＤＮＡ断片化誘発能が付与される｛Ｓｈｉｖｅｒ及びＨｅｎｋａｒ ｔ）同書、（１９９１）｝。これらの細胞により誘発されるＤＮＡ断片化量はＣ ＴＬにより誘発されるよりも顕著に少ないので、さらなる顆粒関連分子がアポプ トシス細胞死の誘発に関与している可能性がある。 最近、ＣＴＬ標的細胞におけるＤＮＡ断片化を誘発することができる別のクラ スの顆粒関連タンパク質も同定された。ＴＩＡ−１は、発現がＣＴＬ及びＮＫ細 胞に制限された１５ｋＤタンパク質と反応性があるモノクローナル抗体（２Ｇ９ ）により最初同定されたＲＮＡ結合タンパク質である｛Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ． 等（１９９０）、”Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔ ｉｖｅ ｗｉｔｈ ａ １５−ｋＤａ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｇｒａｎｕｌ ｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｓｕｂｐｏ ｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”、Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ． 、１４４：５７４〜５８２｝。分裂誘起活性化は、２８ｋＤ、４０ｋ Ｄ及び５３ｋＤで移動したＴＩＡ−１の免疫反応イソホームの発現を誘発した。 ＴＩＡ−１と反応性があるモノクローナル抗体を用いたλｇｔ１１ ｃＤＮＡラ イブラリーの免疫的選択により、ｐ１５−ＴＩＡ−１（１Ｔ４Ｔ８．９−５、１ ．６ｋｂ）及びｐ４０−ＴＩＡ−１（１２Ｇ ９．４、２．２ｋｂ）をコードする２種の関連ｃＤＮＡが同定された｛Ｔｉａｎ ，Ｑ．等（１９９１）、”Ａ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｆ ｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ”、Ｃｅｌｌ、６ ７：６２９〜６３９｝。両方のＴＩＡ−１イソホームは、浸透化標的細胞におい てＤＮＡ断片化を誘発できた。このことは、それらがＣＴＬ標的細胞におけるア ポプトシス細胞死の誘発の原因である顆粒関連タンパク質である可能性があるこ とを示唆している。ＴＩＡ−１が標的細胞におけるＤＮＡ断片化の引き金となる 分子機構については何も知られていない。ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードす るｃＤＮＡの同定は、ＴＩＡ−１作用の分子特徴付けの最初の工程であろう。さ らに、タンパク質の特徴付けは、標的細胞におけるアポプトシス死を誘発する医 薬についてのスクリーニングに有用であろう。 発明の概要 したがって、本発明の一つの目的は、ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードする ｃＤＮＡを同定することである。 上記及び他の目的は、二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチ ドをコードする配列を含む分離ｃＤＮＡを提供することにより達成された。 好ましい実施態様では、ポリペプチドをコードする分離ｃＤＮＡ配列は、配列 番号：１又は配列番号：３である。 さらに本発明によれば、配列番号：１又は配列番号：３の６〜少なくとも２０ ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有する６〜少なくとも２０ヌクレオチ ドセグメントを含んでなる核酸プローブにストリンジェント条件下でハイブリダ イゼーションする分離ｃＤ ＮＡが提供される。 さらに本発明によれば、配列番号：１又は配列番号：３のコード配列に相補的 な配列を含んでなる核酸プローブに低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼ ーションする分離ｃＤＮＡが提供される。 さらに本発明によれば、配列番号：１又は配列番号：３の６〜少なくとも２０ ヌクレオチドセグメント又は前記６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに 相補的な配列を有するセグメントを含んでなる核酸プローブにストリンジェント 条件下でハイブリダイゼーションする精製核酸が提供される。 さらに本発明によれば、配列番号：１又は配列番号：３のコード配列又は前記 コード配列に相補的な配列を含んでなる核酸プローブに低ストリンジェント条件 下でハイブリダイゼーションする精製核酸が提供される。 さらに本発明によれば、二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合する実質的に 純粋なポリペプチドが提供される。 好ましい実施態様では、分離ポリペプチドは、配列番号：２又は配列番号：４ であるアミノ酸配列を有している。 さらに本発明によれば、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブリド ーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である実質的に純 粋なポリペプチドが提供される。 図面の簡単な説明 第１図は、ＴＩＡ−１融合タンパク質の免疫ブロット解析を表す。酵母ＧＧＹ ：：１７１株を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとＴＩＡ−１（ｒｐ４０−ＧＡ Ｌ４ＤＮＡ）との間の融合タンパク質又はＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインのみ（Ｇ ＡＬ４ＤＮＡ）をコードするｐＭＡ４２４で形質転換した。酵母細胞溶解産物を 、２％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、１００ＭｍＮａＣｌ、１００ｍＭトリスＨＣ ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて調製した。溶解産物を、ポ リ（Ｕ）−アガロース又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥ免疫抗ＴＩＡ−１を用いてアフィ ニティー析出させた。１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセ ルロースに移した後、ブロットを抗ＴＩＡ−１でプローブし、ＥＣＬ法を用いて 展開した。 第２Ａ図は、ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを同定するのに 使用される二ハイブリッド系の概略図である。 第２Ｂ図は、どのようにＴＩＡＢＰ１とＴＩＡＢＰ２が、ＴＩＡ−１のそれぞ れＲＮＡ結合ドメイン及びカルボキシ末端補助ドメインと相互に影響すると思わ れるかを示した概略図である。 第３Ａ図及び第３Ｂ図は、ＴＩＡＢＰ１のヌクレオチド配列（配列番号：１） と演繹アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。 第４Ａ図、第４Ｂ図及び第４Ｃ図は、ＴＩＡＢＰ２のヌクレオチド配列（配列 番号：３）及び演繹アミノ酸配列（配列番号：４）である。 第５図は、ＴＩＡＢＰ１の演繹アミノ酸配列と公知のＥ２型ユビキチン接合酵 素のアミノ酸配列との比較を示す。全てのユビキチン接合酵素に共通のアミノ酸 は、太字で示されている。第５図において、ＨＨＲ６Ｂは、ＲＡＤ６のヒト相同 体を意味する｛Ｋｏｋｅｎ Ｍ．Ｈ．Ｍ．等（１９９１）”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａ ｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｒｅｐ ａｉｒ Ｇｅｎｅ ＲＡＤ６”、Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．、８ ８：８８６５〜８８６９｝；ヒトＥ２は、Ｅ２型ユビキチン接合酵素を意味する ；ＨＨＲ６Ａは、ＲＡＤ６のヒト相同体を意味する｛Ｋｏｋｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ． 等、同書（１９９１）｝；Ｄｈｒ６は、ＲＡＤ６のショウジョウバエ相同体を意 味する｛Ｋｏｋｅｎ Ｍ．等、（１９９１）｝、”Ｄｈｒ６，ａ Ｄｒｏｓｏｐ ｈｉｌａ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＤＮＡ−ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ＲＡＤ６”、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． 、８８：３８３２０３８３６｝；ｒｈｐ６は、ポン ベ（ｐｏｍｂｅ）におけるＲＡＤ６相同体を意味する｛Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｐ． 等（１９９０）、”Ｔｈｅ ｒｈｐ６± ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ：Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕ ｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ＲＡＤ６ Ｇｅｎｅ ｆｒ ｏｍ ｔｈｅ Ｄｉｓｔａｎｔｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”ＥＭＢＯ Ｊ．、９：１４２３〜１ ４３０｝；及びＲＡＤ６は、放射線変異体Ｎｏ．６｛Ｊｅｎｔｓｃｈ Ｓ．等（ １９８７）、”Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｇｅｎｅ ＲＡＤ ６ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ Ｅｎ ｚｙｍｅ”、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：１３１〜１３４｝。 第６Ａ図及び第６Ｂ図は、ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ１との間の相互作用を阻害 する薬剤に関してのスクリーニングに使用される二ハイブリッド系の概略図であ る。 第７図は、種々の組織におけるＴＩＡＢＰ２をコードするｍＲＮＡの発現を示 すノーザンブロット解析である。表示のヒト組織から抽出したポリ（Ａ）ｍＲＮ Ａを、ニトロセルロースに移す前に１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで分離 した。次に、ブロットを、ＴＩＡＢＰ２をコードする完全ｃＤＮＡでプローブし た。ＲＮＡサイズマーカーの相対移動を左に示す。 第８図は、ＴＩＡＢＰ２の演繹アミノ酸配列といくつかの公知のタンパク質キ ナーゼとの比較である。タンパク質キナーゼを定義する１０シグネチャーモチー フに相当するコンセンサス配列が、配列の下に示されている。コンセンサス配列 Ｖは省略されている。ＴＩＡＢＰ２配列上に付されている星印は、ＴＩＡＢＰ２ とＨＳＶ−２キナーゼＩＣＰ１０により共有されているアミノ酸を示す。ｓｒｃ 配列にはないＴＩＡＢＰ２配列に見出されるペプチドインサートは、 Ａ〜Ｇと表示した線によって示されている。 第９図は、Ｃｏｓ細胞における組み換えＴＩＡＢＰ２の発現を示す。 第９Ａ図について、ｐＭＴ２（ＴＩＡＢＰ２）で形質転換したＣｏｓ細胞を、 ＮＰ−４０細胞溶解緩衝液に溶解した。溶解産物を、次にＨＡｔａｇ（抗ＨＡ） 、ＴＩＡＢＰ２（抗ＴＩＡＫと命名した抗２Ｂ５）又はイソタイプ整合対照抗体 と反応性のモノクローナル抗体で免疫析出した。免疫析出物を、次に生体外キナ ーゼアッセイに附し｛Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．等（１９８４）、”Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ ｏｆ ｖ−ｓｒｃ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｃ−ｓｒｃ ｉｎ ｒａｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｄｉｆｆ ｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｐ６０ ｖ−ｓｒｃ ａｎｄ ｐｐ６０ ｃ−ｓｒｃ”、Ｃｅｌｌ、３７：１３１｝、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ルで分離し、オートラジオグラフィーに附した。血球凝集素タッグＴＩＡＢＰ２ 分子に予測されるサイズの主要な６５ｋＤタンパク質が、これらのオートラジオ グラム（矢印）に確認される。低分子量リンタンパク質は、全長ＴＩＡＢＰ２キ ナーゼのタンパク質分解生成物であるかもしれない。分子サイズマーカーの相対 移動を、左に示す。 第９Ｂ図について、ｐＭＴ２（ＨＡ−ＴＩＡＰＢ２）で形質転換した細胞から 調製したＣｏｓ細胞溶解産物（ここでは、Ｃｏｓ（ＨＡ−ＴＩＡＫ）と称する） 又はＰＭＴベクター単独（Ｃｏｓ（ベクター））を、血球凝集素タグ（抗ＨＡ） と反応性のモノクローナル抗体又はイソタイプ整合対照モノクローナル抗体で免 疫析出させた。アフィニティー析出物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで 分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、復元操作を行った後、³²ＰγＡＴＰを添加した。フ ィルターを洗浄後、オートラジオグラフィーに附した。自己リン酸化ＴＩＡＢＰ ２キナーゼが６５ｋＤリンタンパク質（矢印）として同定され、ＴＩＡＢＰ２の 固有キナーゼ活性が確認され た。自己リン酸化キナーゼを、次にＰＶＤＦフィルターから切り出し、アミノ酸 加水分解に附した。次に、加水分解されたアミノ酸を、二次元電気泳動、薄層ク ロマトグラフィー装置（第９Ｃ図）で分離した。ホスホセリン（ＰＳ）、ホスホ トリオニン（ＰＴ）及びホスホチロシン（ＰＹ）に関する標準の相対移動を示し てある。この解析から、ＴＩＡＢＰ２はセリン／トレオニンキナーゼであること が確認される。 第１０図は、天然ＴＩＡＢＰ２の特性決定である。 第１０Ａ図は、ＨｅＬａ細胞とＫ５６２細胞の溶解産物からの天然ＴＩＡＢＰ ２の免疫析出を示したものである。免疫析出物は、ＴＩＡＢＰ２（抗２Ｂ５、こ こでは抗ＴＩＡＫと表示）と反応性のあるモノクローナル抗体又はイソタイプ整 合対照モノクローナル抗体を用いて調製した。免疫析出物を、１０％ＳＤＳポリ アクリルアミドゲルで分離する前に生体外キナーゼアッセイに附した。ニトロセ ルロース膜に移した後、オートラジオグラムから、リン酸化ダブレットが、ＴＩ ＡＢＰ２と反応性のある抗体を用いて調製した免疫析出物に特異的に観察される ６５ｋＤ付近に集中することが判明した。細胞（本図に示されるＫ５６２等）に よっては、生体外キナーゼアッセイに附した免疫析出物は、５０ｋＤ、３４ｋＤ 及び２１ｋＤに移動する追加のリンタンパク質も含んでいた。これらの候補ＴＩ ＡＢＰ２基質のアイデンティティーは不明である。第１０Ｂ図は、天然ＴＩＡＢ Ｐ２は構成的にリン酸化されたタンパク質であることを示している。この実験で は、³²Ｐ−オルトリン酸塩で標識したＪｕｒｋａｔ細胞を、ＮＰ−４０細胞溶解 緩衝液で溶解し、ＴＩＡＢＰ２（抗２Ｂ５、ここでは抗ＴＩＡＫと表示）と反応 性のあるモノクローナル抗体又はイソタイプ整合対照抗体で免疫析出させた。Ｔ ＩＡＢＰ２と反応性のあるモノクローナル抗体により、６５ｋＤ（矢印）付近に 集中したリン酸化ダブレットが特異的に析出された。これらのリン酸化バンドを ゲルから切り出し、アミノ酸加水分解し たところ、天然ＴＩＡＫが、セリン及びトリオニン残基で専らリン酸化されたこ とが分かった（第１０Ｃ図）。 第１１図は、ＴＩＡＢＰ２とＴＩＡ−１との間の物理的関連を示している。Ｈ Ａ−ＴＩＡＢＰ２を発現するＣｏｓ形質転換体から調製した細胞溶解産物全体を 、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離するか（レーン１）、又はｍＡ ｂ２Ｂ５（レーン２）、固定化ＧＳＴ（レーン３）、ＧＳＴ−ｐ１５−ＴＩＡ− １（レーン４）若しくはＧＳＴ−ｐ４０−ＴＩＡ−１（レーン５）を用いてアフ ィニティー析出した。ニトロセルロースに移した後、ブロットを、抗２Ｂ５、Ｔ ＩＡＢＰ２と反応性のｍＡｂを用いてプローブした。分子サイズマーカーの相対 移動を左に示す。 第１２図は、ＴＩＡＢＰ２のキナーゼ活性に対するｐ１５−ＴＩＡ−１の影響 を示す。ＴＩＡＢＰ２で形質転換したＣｏｓ細胞から調製した溶解産物を、抗２ Ｂ５を用いて免疫析出し、発明の詳細な説明の欄に記載されているような５μｇ ／ｍｌＧＳＴ（レーン１）、５μｇ／ｍｌＧＳＴ−ｆｙｎ−ＳＨ３（アミノ末端 にＧＳＴ及びカルボキシ末端にｆｙｎキナーゼのＳＨ３結合ドメインをコードす る融合タンパク質）、（レーン２）、５μｇ／ｍｌＧＳＴ−ＴＩＡＲ（ＧＳＴと ＴＩＡ−１関連タンパク質ＴＩＡＲとの間の融合タンパク質）、（レーン３）、 １μｇ／ｍｌＧＳＴ−ｐ１５ＴＩＡ−１（レーン４）、５μｇ／ｍｌＧＳＴ−ｐ １５ＴＩＡ−１（レーン５）、１０μｇ／ｍｌＧＳＴ−ｐ１５ＴＩＡ−１（レー ン６）又は２０μｇ／ｍｌＧＳＴ−ｐ１５ＴＩＡ−１（レーン７）の存在下で生 体外キナーゼアッセイに附した。分子サイズマーカーの相対移動を左に示す。ま た、リン酸化基質の相対移動を、右に示す。 発明の詳細な説明 リンパ球介在細胞溶解に関与していると思われる細胞障害性顆粒関連ＲＮＡ結 合タンパク質（ＴＩＡ−１及びＴＩＡＲ）の科が同定 され、米国特許第５，０７９，３４３号、第５，２９８，４０７号及び第５，３ ４０，９３５号に記載されている（これら３つの特許は、全て引用することによ り本明細書の開示の一部とされる）。精製組み換えＴＩＡ−１及びＴＩＡＲのジ ギトニン浸透化胸腺細胞におけるＤＮＡ断片化誘発能は、これらの分子がＣＴＬ 標的細胞におけるプログラム細胞死の内因性経路を活性化することを示唆してい る。ＴＩＡ−１及びＴＩＡＲがプログラム細胞死の引き金となる分子相互作用は 不明である。本発明者等は、遺伝的手法を用いて、プログラム細胞死経路に関与 している可能性があるＴＩＡ−１に対する分子基質を同定した。二ハイブリッド 系を用いて、本発明者等は、ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードする２種の別個 のｃＤＮＡを分離し、それらをＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２と命名した。ＴＩ ＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２は、ＴＩＡ−１のそれぞれＲＮＡ結合ドメイン及びカ ルボキシ末端補助ドメインと相互作用する。ＴＩＡＢＰ２の演繹アミノ酸配列は タンパク質キナーゼに関連し、ＴＩＡＢＰ１の演繹アミノ酸配列から、それがＥ ２型ユビキチン接合酵素の科の一員であることが分かる。ユビキチン経路は、精 子発生、芽抱形成、ＤＮＡ修復及びプログラム細胞死等の多様な生物学的プロセ スに関与しているので、ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ１との間の相互作用は、直接的 又は間接的にプログラム細胞死経路の引き金となることが予測される。驚くべき ことに、本発明者等は、プログラム細胞死に関与している腫瘍抑制分子であるｐ ５３も、ユビキチン接合酵素ＴＩＡＢＰ１と相互作用することを見出した。ｐ５ ３のユビキチン介在分解は乳頭腫ウイルスにより誘発される悪性形質転換に必須 であると考えられるので、ＴＩＡＢＰ１とｐ５３との間の相互作用を破壊する薬 剤は、ＨＰＶ−誘発ヒト癌に対して抗腫瘍活性を有していると予測される。 本発明は、二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチドをコード する配列を含んでなる分離ｃＤＮＡ含んでいる。この 分離ｃＤＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインを結合するポリペプチドをコードする配列 と、ＴＩＡ−１のカルボキシ末端補助ドメインを結合する別の配列とを含んでい る。 カルボキシ末端補助ドメインを結合するポリペプチドは、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１ １７２１と命名されたハイブリドーマにより産生したモノクローナル抗体２Ｂ５ と免疫反応性である。 好ましい実施態様では、分離ｃＤＮＡは、配列番号：１又は配列番号：３と実 質的に同一であるポリペプチドをコードする配列を有している。 配列番号：１及び配列番号：３を有しているｃＤＮＡを担持しているプラスミ ドは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づ き、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２にあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に１９９３年７月３０日寄託された。これらのプラスミド は、それぞれＡＴＣＣ＃６９３７１及びＡＴＣＣ＃６９３７２と命名された。 ＴＩＡＢＰ２及びＴＩＡＢＰ２の断片と反応するモノクローナル抗体を産生す るハイブリドーマも、ブダペスト条約に基づき１９９４年９月２７日にＡＴＣＣ に寄託された。このハイブリドーマは、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名され た。 ここで使用される用語「ポリペプチド」は、成熟タンパク質、成熟タンパク質 の前駆体及びどちらか一方の断片を意味する。 本明細書で使用される表現「分離相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」とは、ＴＩＡ− １結合タンパク質をコードする天然ｍＲＮＡに相補的であり、それが含むポリペ プチドコード配列が、そのようなポリペプチドコード配列が由来する微生物の天 然ゲノムにおいて、そのような配列をフランクする遺伝子によってはフランクさ れないように構成又は合成したＤＮＡ分子を指すことを意図する。 本明細書で使用される表現「精製核酸」とは、細胞内で自然に会合している他 の核酸分子（例えば、精製核酸標本の３０％未満は、このような汚染天然分子か ら構成されている）を実質的に含有しないＲＮＡ又はＤＮＡ分子を意味する。精 製核酸又は分離ｃＤＮＡは、例えば、ゲノミックＤＮＡの断片のクローニングに よるか、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを形成することによるか、適当な配列の核酸 を合成することにより製造できる。 ハイブリダイゼーションを説明するのに本明細書で使用される表現「ストリン ジェント条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ Ｙ、１９８９に記載されている条件を意味する。ハイブリダイゼーションを説明 するのに本明細書で使用される「低ストリンジェント条件」とは、以下のことを 意味する：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ ｐＨ７．４）、５ｘＤｅｎｈａｒｔ及び５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中２ ０℃で４〜１２時間予備ハイブリダイゼーション；２０℃で１２〜２４時間ハイ ブリダイゼーション；０．１％ＳＤＳ含有５ｘＳＳＣ、２０℃で洗浄。 本明細書で使用される表現「二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合する」と は、ＤＮＡによりコードされているポリペプチドが、本明細書の実施例Ｉにおい てより詳細に記載されているような二重形質転換（２種の融合タンパク質が発現 され、各融合タンパク質がマーカー遺伝子の発現に必要なドメインを含んでなる ）において結合することを意味する。一方の融合タンパク質はドメインの一方に 隣接してポリペプチドを含んでなり、他の融合タンパク質はドメインの他方に隣 接してＴＩＡ−１を含んでなる。ポリペプチドがＴＩＡ−１を結合すると、２つ のドメインが共同でマーカー遺伝子を発現する。 本明細書で使用される表現「免疫反応性がある」とは、抗体と抗原が十分な特 異性で互いに結合（即ち、免疫複合体を形成する）して、標準条件下で抗原又は 抗体のイムノアッセイが可能となることを意味する。この表現は、抗体が他の抗 原を結合する可能性を必ずしも排除しない：例えば、下記で説明する抗原又は関 連タンパク質の多量体。 本明細書で使用される用語「ＴＩＡ−１」とは、その範囲内に、天然ＴＩＡ− １だけでなく、ｐ４０−ＴＩＡ−１及びｐ４０−ＴＩＡ−１のイソホームも含む 。 上記ｐ４０−ＴＩＡ−１のイソホームは、米国特許第５，０７９，３４３号、 第５，２９８，４０７号及び第５，３４０，９３５号に開示されているものであ る。これらのイソホームには、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１と命名されたポリペプチド 及びｒｐ１５−ＴＩＡ−１と命名されたポリペプチドが含まれる。これらは、上 記特許に記載さている特異的アミノ酸配列を有していてもよい。 用語「実質的に同一」とは、記載の機能を有するポリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列について言えば、特定のアミノ酸をコードする一つのコドンを同じアミ ノ酸をコードする別のコドンの代わりに変更するすることができるＤＮＡ配列だ けでなく、一つ以上のヌクレオチド置換、欠失及び／又は挿入を有するが、コー ドされたポリペプチドがその記載の機能を保持しているＤＮＡ配列をも意味する 。したがって、例えば、ｐ４０−ＴＩＡ−１又はそのイソホームを結合するポリ ペプチドをコードする配列に実質的に同一なＤＮＡ塩基配列は、その配列がＴＩ Ａ−１を結合するポリペプチドをコードするする限りは、ヌクレオチド置換、欠 失及び／又は挿入を有することができる。同様に、セリン／トレオニンキナーゼ 活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列は、コードされたポリペ プチドがセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する限りは、ヌクレオチド置換、 欠失及び／又は挿入を有することができる。 「実質的に同一」なｃＤＮＡ配列には、対立変異体が含まれる。 適当な置換、欠失及び／又は挿入は、当業者により行い、試験できる。具体的 には、ＴＩＡＢＰ１又はＴＩＡＢＰ２をコードするｃＤＮＡを変更して、部位指 向変異誘発を用いて一つ以上のコドンを特異的に欠失又は挿入することができる ｛Ｆｏｓｓ Ｋ．及びＷ．Ｈ．ＭｃＣｌａｉｎ、（１９８７）、Ｇｅｎｅ、５９ ：２８５〜２９０｝。例えば、ＧＡＬ４活性化ドメインを用いてこれらのｃＤＮ Ａを融合タンパク質として発現し、実施例Ｉで記載のようにして二重形質転換体 を産生することにより変異体のＴＩＡ−１結合特性に対する影響を測定できる。 ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２をコードしている配列に「実質的に同一」であ り、したがって、ＴＩＡ−１を結合する能力を保持するＤＮＡ配列は、以下の方 法で調製できる。リンカースキャニング変異誘発を用いることにより、Ｋｐｎ１ 及びＡｓｐ７１８制限酵素により認識されるリンカー配列（ＧＧＴＡＣＣ：Ｋｐ ｎ１はシトシン残基間で切断し、Ａｓｐ７１８はグアニン残基間で切断する）を 、ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２ ｃＤＮＡ全体を通じて３０ヌクレオチド間隔 で挿入する。個々のリンカー配列は、当該技術分野において一般的な方法である オリゴヌクレオチド介在変異誘発を用いて構成できる。これらのリンカースキャ ニング変異体の構成により、コード配列全体を通じて１０アミノ酸欠失をコード するｃＤＮＡを構成できる。同様の方法で、これらの変異体により、コード領域 内のいずれかの位置にランダムな１０アミノ酸配列を挿入できる。この配列は、 Ｋｐｎ１ Ａｓｐ７１８によりフランクされるランダムアミノ酸配列をコードす るオリゴヌクレオチドを用いて製造できる。 この配列は、上流リンカーをＫｐｎ１で切断し、下流リンカーをＡｓｐ７１８ で切断することにより、コード配列に挿入できる。各変異体を、次に、ＴＩＡ− １タンパク質に特異的に結合する能力について試験することができる。このよう に、コードされたタンパク質がＴＩＡ−１タンパク質と相互作用する能力に影響 しない欠失又は挿入を有する実質的に同一なｃＤＮＡを同定できる。 また、上記したようなストリンジェント条件下で、配列番号：１又は配列番号 ：３の６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有する６ヌ クレオチドセグメント（好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましく は少なくとも２０ヌクレオチド）を含んでなる核酸プローブにハイブリダイゼー ションする分離ｃＤＮＡも、本発明の範囲内である。 また、本発明には、上記で定義したような低ストリンジェント条件下で、配列 番号：１又は配列番号：３のコード配列に相補的な配列を含んでなる核酸プロー ブにハイブリダイゼーションする分離ｃＤＮＡも含まれる。 さらなる実施態様において、本発明には、上記で定義したようなストリンジェ ント条件下で、配列番号：１又は配列番号：３の６ヌクレオチドセグメント（好 ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオ チド）、又は６〜少なくと も２０ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有するセグメントを含んでなる 核酸プローブにハイブリダイゼーションする精製核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）も含 まれる。 さらに、本発明には、上記で定義したような低ストリンジェント条件下で、配 列番号：１又は配列番号：３のコード配列又はそのコード配列に相補的な配列を 含んでなる核酸プローブにハイブリダイゼーションする精製核酸（ＤＮＡ又はＲ ＮＡ）も含まれる。 本明細書において二重形質転換においてＴＩＡ−１に結合及び／又はハイブリ ドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１により産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５ と免疫反応性であるとして述べられている実質的に純粋なポリペプチドは、天然 化合物、組み換え産生化合物又は合成的に調製した化合物若しくは化合物の断片 である。遺伝学的に構成した形態又は合成的に製造したものは、記載の機能を保 持する限りは、配列番号：２及び４により定義されるタンパク質とは、アミノ酸 残基一つ以上（但し約７０％未満）異なって（即ち、アミノ酸の同一性は約３０ ％なければならない）いてもよい。 表現「に実質的に同一なアミノ酸配列」とは、記載の配列とは、そのアミノ酸 残基の一つ以上（但し、７０％未満）異なり、且つ通常の実験により決定される レファレンスアミノ酸配列の機能を保持するアミノ酸配列を意味する。 Ｉ．ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードしているｃＤＮＡクローン の分離 ｐ４０−ＴＩＡ−１をコードするｃＤＮＡを、公知の方法で公的に入手できる ｐＭＡ４２４ベクターのマルチリンカーにクローニングして、アミノ末端がＧＡ Ｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（１〜１４７）からなり、カルボキシル末端がｐ４０ −ＴＩＡ−１からなる融合タンパク質を産生した。酵母株ＧＧＹ：：１７１をこ の組み換えプラスミドで形質転換した後ＳＣ−Ｈｉｓプレートで選択すること により、第１図に示すような融合タンパク質を効率的に発現させた。この融合タ ンパク質はＧＡＬ４活性化ドメインを欠いているので、ＧＧＹ：：１７１におい てＧＡＬ４プロモータの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼ発現を誘発すること はできない。次に、ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定を、 ＧＧＹ：：１７１細胞をｐＭＡ４２４（ＴＩＡ−１）並びに、アミノ末端がＧＡ Ｌ４活性化ドメイン（７６８〜８８１）からなり、カルボキシル末端が個々のｃ ＤＮＡによりコードされているペプチドからなる融合タンパク質を発現するｃＤ ＮＡライブラリー（例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡをｐＳＥ１１０７のＸｈｏＩ部位に クローニングする）からのクローンで形質転換することにより行うことができる （第２Ａ図）。β−ガラクトシダーゼを発現している二重形質転換体（即ち、Ｘ −ｇａ１プレートでの青色コロニー）を選択することにより、ＴＩＡ−１：ＴＩ Ａ−１結合タンパク質相互作用の結果ＧＡＬ４活性化ドメインとＧＡＬ４ ＤＮ Ａ結合ドメインを並置候補ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードｃＤＮＡを同定す る。このように二重形質転換体をスクリーニングすることにより、β−ガラクト シダーゼ発現コロニーを同定できる。これらのうち、本発明のＴＩＡ−１結合タ ンパク質（ＴＩＡＢＰＩ及びＴＩＡＢＰ２）をコードする１．２ｋｂインサート を発現するもの及び１．５ｋｂインサートを発現するものを分離した。 一つのコロニーは、他のコロニーよりも顕著によりβ−ガラクトシダーゼの発 現を誘発し、それを選択してさらなる解析を行った。このコロニーから分離した ｐＳＥ１１０７プラスミドは、ＧＡＬ４トランスアクチベーションドメインに融 合したＴＩＡＢＰ２と命名されたアミノ酸ペプチドをコードできる１．５ｋｂ ｃＤＮＡインサートを含有していた。３つのＲＮＡ結合ドメイン（デルタ２０７ ）のみを有しているＴＩＡ−１のトランケーション変異体はＴＩＡＢＰ２でのβ −ガラクトシダーゼ発現を誘発しなかったので、Ｔ ＩＡＢＰ２は第２Ｂ図に概略示したようなＴＩＡ−１（データは図示してない） のカルボキシ末端タンパク質相互作用領域と相互作用するものと思われる。興味 深いことに、ＴＩＡＢＰ２とＴＩＡＲ｛Ｋａｗａｋａｍｉ、Ａ．Ｔ．等、（１９ ９２）、”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ１ｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＴＩＡ−１−ｒｅｌａｔｅｄ ｎ ｕｃｌｅｏｌｙｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８９： ８６８１〜８６８５｝、浸透化胸腺においてＤＮＡ断片化の引き金となることが できるＴＩＡ−１関連ＲＮＡ結合タンパク質、との相互作用も、酵母二ハイブリ ッド系でのβ−ガラクトシダーゼ発現を誘発した。しかしながら、ＴＩＡＢＰ２ は、別のＲＲＭ型ＲＮＡ結合タンパク質、ヒトポリ（Ａ）結合タンパク質、と相 互作用しないだけでなく、ｐ５３及びＲｂを含む数種の制御タンパク質とも相互 作用せず、ＴＩＡＢＰ２とＴＩＡ−１及びＴＩＡＲとの相互作用は特異的である ことが分かる。ＴＩＡＢＰ２をコードする１．５ｋｂインサートを使用して、ハ イブリダイゼーションによりプラセンタｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング した。これにより、１．８ｋｂ ｃＤＮＡが分離された。第一メチオニンがコン センサス「Ｋｏｚａｋ」配列｛Ｋｏｚａｋ、Ｍ．１９８４．Ｃｏｍｐｉｌａｔｉ ｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｐｓｔｒｅａ ｍ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１ ２：８５７｝と一致しているので、開始メチオニンをコードするものと思われる 。この１．８ｋｂ ｃＤＮＡを用いてプローブしたノーザンブロットにより、広 範に発現された１．８ｋｂ ｍＲＮＡ（第７図）が検出された。 ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２のヌクレオチド配列（配列番号：１及び配列番 号：３）及び演繹アミノ酸配列（配列番号：２及び配 列番号：４）を、それぞれ第３図及び第４図に示す。 ３個のＲＮＡ結合ドメイン（デルタ２０７）のみを有しているＴＩＡ−１のト ランケーション変異体はＴＩＡＢＰ１でのβ−ガラクトシダーゼ発現を誘発した が、ＴＩＡＢＰ２での発現を誘発しなかったので、ＴＩＡＢＰ１は、ＴＩＡ−１ のＲＮＡ結合ドメインと相互作用するものと思われる。さらに、ＴＩＡＢＰ１の 演繹アミノ酸配列は、データーベースＧｅｎＢａｎｋ−７６及びＮＢＲＦ ＰＩ Ｒ−３６に見られるＥ２型ユビキチン活性化酵素（第５図）の科に構造的に関連 していることが判明した。 ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２は、当該技術分野において公知の方法により、 原核細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ内及び真核細胞内で発現できる。ＴＩＡＢＰ １とＴＩＡＢＰ２の両方をｐＧＥＸベクターにクローニングし、グルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼを用いて融合タンパク質として発現させた。これらの組 み換え発現ベクターでのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５株の形質転換により、ＴＩＡＢＰ １及びＴＩＡＢＰ２を含む融合ペプチドが精製された。さらに、ＴＩＡＢＰ１と ＴＩＡＢＰ２の両方をｐＭＴ２ベクターにクローニングし、トランジエントアッ セイでＣｏｓ細胞を形質転換するのに使用した。両方のタンパク質を、各ポリペ プチドに特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方との反応性 により表されるこれらの細胞で発現させた。 ＩＩ．ＴＩＡＢＰ１とｐ５３との間の相互作用 Ｅ２型ユビキチン接合酵素（ＵＣＥ）は、ユビキチンを、選択された基質上の リジン残基のイプシロンアミノ基に転移させる。個々のＵＣＥに対する基質特異 性の決定因子はよく理解されていないが、個々のＵＣＥは複数の基質をユビキチ ン化する可能性がある。このため、ＴＩＡＢＰ１を、ＴＩＡ−１のように細胞周 期進行に関与するかもしれない分子基質との相互作用能力についてスクリーニン グ した。下表に示すように、腫瘍抑制因子ｐ５３は、独自にＴＩＡＢＰ１と相互作 用して、酵母形質転換体内でβ−ガラクトシダーゼの発現を誘発できた。重要な ことに、上記で同定した腫瘍抑制活性を欠いたｐ５３の変異体（即ち、１７５、 ２７３）は、β−ガラクトシダーゼ発現の誘発がこれよりも顕著に低かった。各 々の場合において、融合タンパク質は、ｐ５３のトランスアクチベーションドメ イン（ａａ１−７３）を排除するように設計して、β−ガラクトシダーゼの転写 活性化への影響を回避した。 ｐ５３遺伝子生成物は、Ｇ１／Ｓ境界での細胞周期進行をブロックすると考え られる。したがって、その発現は抗増殖性であり、その不活性化は、多数種の細 胞の悪性形質転換に必要であると思われる。ｐ５３のユビキチン介在分解は、ｐ ５３発現の調節にとって重要な翻訳後工程であることが判明した。乳頭腫ウイル スにより誘発される悪性形質転換では、ｐ５３の不活性化には、ユビキチン介在 分解を高めるＥ６ウイルスタンパク質が必要である。乳頭腫ウイルス感染から生 じる子宮頸癌は、ｐ５３発現が低レベルである特徴がある。もしＴＩＡＢＰ１が ｐ５３のユビキチン介在分解に特異的に 関与するならば、この相互作用は、悪性形質転換に極めて重要な工程であるかも しれない。 ＩＩＩ．ＴＩＡＢＰ２のタンパク質キナーゼ活性 ＴＩＡＢＰ２のアミノ酸配列とＥＭＢＬタンパク質データーベースにおける配 列との比較により、ヘルペス単式ウイルス（ＨＳＶ）１及び２（第８図）により コードされるセリン／トレオニンキナーゼとわずかな類似性があることが判明し た。この考察に基づき、本発明者等は、ＴＩＡＢＰ２のアミノ酸配列と、タンパ ク質キナーゼ活性を示すサイン配列とを比較した（第８図）。ＴＩＡＢＰ２は「 不変」コンセンサス残基の全てはコードしないが、その配列は、１０個の高度に 保存された領域の各々における公知なキナーゼの配列と類似している（第８図） 。ＴＩＡＢＰ２は、アミノ末端血球凝集素（ＨＡ）エピトープ標識をコードする 融合タンパク質としてＣｏｓ細胞内で発現される。抗ＨＡを用いて調製した免疫 析出物を、生体外キナーゼアッセイに附し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ルで分離した。これらの免疫析出物は予測された６５ｋＤ ＨＡ−ＴＩＡＢＰ２ 融合タンパク質（第９Ａ図、矢印）を含有し、ＴＩＡＢＰ２が固有タンパク質キ ナーゼ活性を有することが分かった。 ＴＩＡＢＰ２のタンパク質キナーゼ活性は、第９Ｂ図に示した復元キナーゼアッ セイで確認された。この実験において、血球凝集素標識ＴＩＡＢＰ２か、ベクタ ーのみで形質転換したＣｏｓ細胞を、ＮＰ−４０細胞溶解緩衝液で溶解し、ＨＡ 標識と反応性のある抗体で免疫析出した。ＨＡ−ＴＩＡＢＰ２を発現するＣｏｓ 細胞（ここでは、ＨＡ−ＴＩＡＫと命名する）は、この復元キナーゼアッセイで リン酸化された６５ｋＤタンパク質を特異的に含んでいた（第９Ｂ図、矢印）。 このアッセイにより、６５ｋＤリンタンパク質が固有チロシンキナーゼ活性を有 し、会合タンパク質キナーゼのリン酸基転移生成物ではないことが確認される。 ＴＩＡＢＰ２キナーゼのア ミノ酸特異性を、第９Ｃ図に示す自動リン酸化ＴＩＡＢＰ２キナーゼの加水分解 消化物を分析することにより測定した。この分析から、ＴＩＡＢＰ２がセリン／ トレオニンキナーゼであることが分かる。 ＩＶ．天然ＴＩＡＢＰ２の特性付け 組み換えＴＩＡＢＰ２（第１０Ａ図、標識抗ＴＩＡＫ）と反応性があるがイソ タイプ整合制御抗体ではないモノクローナル抗体は、生体外キナーゼアッセイで 特異的に標識されたＨｅＬａとＫ５６２溶解産物の両方から６５ｋＤ付近に集中 したダブレットを析出した。Ｋ５６２細胞溶解産物から調製された免疫析出物は 、５０ｋＤ、３４ｋＤ及び２１ｋＤに移動しているさらなるリンタンパク質も含 んでいた。これらの会合タンパク質のアイデンティティーは不明であるが、ＴＩ ＡＢＰ２のキナーゼ活性の基質と考えられる。Ｊｕｒｋａｔ細胞内で発現された 天然ＴＩＡＢＰ２は、６５ｋＤ付近に集中したダブレット（第１０Ｂ図、矢印） として移動した構造的にリン酸化されたタンパク質であることが判明した。この ＴＩＡＢＰ２の構成リン酸化は、第１０Ｃ図に示すリンアミノ酸解析に示すよう にセリン及びトレオニン残基で専ら生じた。 Ｖ．ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ２との間の物理的相互作用 酵母二ハイブリッド系を用いて得られた結果は、ＴＩＡＢＰ２とＴＩＡ−１の タンパク質相互作用ドメインとの間の特異的相互作用を示唆した。これらの結果 は、Ｃｏｓ形質転換体由来の溶解産物に含有されるＴＩＡＢＰ２が、ＴＩＡ−１ のタンパク質相互作用ドメインを発現するＧＳＴ融合タンパク質により特異的に 共析出されることを示すことにより確認された。第１１図は、ＴＩＡＢＰ２で形 質転換したＣｏｓ細胞から調製した溶解産物はＴＩＡＢＰ２と反応性のあるモノ クローナル抗体により認識される６５ｋＤタンパク質を含むことを示している（ レーン１）。ＧＳＴに結合したグルタチ オンビーズを用いて調製したアフィニティー析出物は、６５ｋＤ組み換えＴＩＡ ＢＰ２タンパク質を含有していなかった（レーン２）。ＧＳＴ−ｐ１５−ＴＩＡ −１（レーン３）かＧＳＴ−ｐ４０−ＴＩＡ−１（レーン４）に結合したグルタ チオンビーズを用いて調製したアフィニティー析出物は、６５ｋＤ ＴＩＡＢＰ ２タンパク質を含んでいた。この結果は、二ハイブリッド系を用いて得られた結 果と一致し、ＴＩＡＢＰ２がＴＩＡ−１のカルボキシ末端タンパク質相互作用ド メインと相互作用することを示唆している。 ＶＩ．ＴＩＡ−１によるＴＩＡＢＰ２の調節 ＴＩＡＢＰ２をコードするｃＤＮＡで形質転換したＣｏｓ細胞を、ＮＰ−４０ 細胞溶解緩衝液で溶解し、抗２Ｂ５を用いて免疫析出物させた。これらの免疫析 出物を、制御ペプチードかｐ１５−ＴＩＡ−１をコードするＧＳＴ−融合タンパ ク質の存在下で生体外キナーゼアッセイに附した（第１２図）。これらの免疫析 出物の各々は、ＴＩＡＢＰ２（第１２図ではＴＩＡＫと表示）について予測され る位置に移動する６５ｋＤリンタンパク質を発現した。ＧＳＴ単独又はｆｙｎチ ロシンキナーゼのＳＨ３ドメインをコードするＧＳＴ−融合タンパク質の存在下 では、さらなるリン酸基転移基質は確認されなかった。しかしながら、ｐ１５− ＴＩＡ−１をコードするＧＳＴ−融合タンパク質の存在下では、３４ｋＤ及び２ １ｋＤに移動するリン酸基転移基質が使用量に依存して誘発された。２１ｋＤリ ンタンパク質は、ＧＳＴ−ｐ１５−ＴＩＡ−１の最高濃度（２０μｇ／ｍｌ）で は観察されなかった。この濃度では、ＧＳＴ−ｐ１５−ＴＩＡ−１自体がリン酸 化の標的となり、２種のタンパク質のリン酸化の競合によりこの結果を生じるこ とを示唆している。ＴＩＡＢＰ２の自動リン酸化は、ＧＳＴ−ｐ１５−ＴＩＡ− １の存在下でも不存在下でも変化しなかった。これらの結果は、ＴＩＡ−１は、 ＴＩＡＢＰ２の会合基質リン酸基転移化能を変更できることを示唆し ている。 ＶＩＩ．用途 ＴＩＡ−１がＴＩＡＢＰ２のタンパク質キナーゼ活性を高めることができるこ とは、ＴＩＡＢＰ２の活性化がアポプトシス細胞死の誘発に必要であることを示 唆している。ＴＩＡＢＰ２のキナーゼ活性が生体外で容易に測定できるので、こ のセリン／トレオニンキナーゼの活性を活性化又は阻害する少量の薬剤について スクリーニングすることが可能であろう。また、標的細胞のＣＴＬ介在死滅中に 生じ易いＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ２との間の特異的会合を破壊する少量の薬剤に ついてのスクリーニングも可能であろう。このような薬剤は、細胞障害Ｔリンパ 球により誘発される標的細胞のＴＩＡ−１介在死滅が疾病の病態生理に重要であ る炎症状態に対する防御活性を有することが予想される。このような疾病として は、例えば、皮膚の対宿主性移植片病、腎同種異系移植片拒絶及び全ての移植臓 器拒絶が挙げられるであろう。 ＴＩＡ−１は、細胞障害顆粒関連ＲＮＡ結合タンパク質であり、標的細胞の破 壊において細胞障害リンパ球により使用される候補トキシンである。ＴＩＡ−１ の毒性効果の分子的機構は不明であるが、精製組み換えＴＩＡ−１の浸透化標的 細胞におけるＤＮＡ断片化誘発能は、このタンパク質が、導入された細胞内にお いてアポプトシス死を誘発する可能性かあることを示唆している。 ＴＩＡ−１と相互作用する標的細胞タンパク質は、標的細胞死を生じる分子カ スケードにおける候補基質である。ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２をコードする ｃＤＮＡ並びにそれらがコードする組み換えタンパク質自体を、生体外アッセイ に使用して、ＴＩＡ−１と個々のＴＩＡＢＰとの間の特異的相互作用を破壊する 能力を有する薬剤を調査することができる。このような用途の一例は、実施例Ｉ Ｉに概要が記載されている。 ＴＩＡＢＰ１がＥ２型ユビキチン接合酵素であるので、ＴＩＡ−１のユビキチ ン介在分解に関与し易い。ＴＩＡ−１等の毒性分子の発現は、細胞内で厳密に制 御して望ましくない毒性効果を防止しなければならない。本発明者等は、ＴＩＡ −１がウサギ網状赤血球溶解産物においてユビキチンに依存して迅速に分解され ることを見出した。もしＴＩＡＢＰ１類似体がこのプロセスに特異的に関与して いるならば、ＴＩＡＢＰ１タンパク質自体の制御がＴＩＡ−１の発現の制御にも 重要であるかもしれない。ＴＩＡＢＰ１と反応性のあるｃＤＮＡ並びに組み換え 及び天然ＴＩＡＢＰ１タンパク質と反応性のあるポリクローナル抗血清を用いて 、この調節タンパク質の発現を消す転写レギュレーターについてスクリーニング することが可能であろう。このような化合物は、ＴＩＡ−１の発現を増加し、そ の結果、細胞の死を生じることが予想される。もし迅速成長細胞により優先的に 取り出される化合物を単離できれば、このような化合物は、抗癌剤として使用で きるであろう。ＴＩＡＢＰ１も腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現を制御することがあ るので、その発現が減少することによってもｐ５３タンパク質が増加し、したが って、迅速成長細胞のアポプトシスの引き金となる。 精製組み換えＴＩＡＢＰ２タンパク質及びＴＩＡＢＰ２をコードするｃＤＮＡ により、類似の方法で、ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ２との間の特異的会合を破壊す るか増強することができる少量の薬剤のスクリーニングが可能となるであろう。 ＴＩＡ−１が分子トキシンとして役割を果たす可能性であるとすれば、このよう な薬剤は、抗癌剤となり得るであろう。 実施例 以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例には限定さ れない。 実施例Ｉ ＴＩＡ−１結合タンパク質ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２をコードする２種のｃ ＤＮＡクローンの分離及び特性付け 酵母発現ベクターＰＶＡ４２４を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域に続くマルチリ ンカー領域内で切断する制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化した。この線 状化ベクターを１％低メルトアガロースゲル電気泳動で分離後、バンドを徹照に より可視化し、ゲルから切除した。ｐ４０−ＴＩＡ−１をコードするｃＤＮＡを 、ＢｓｔＥＩＩ及びＢａｍＨＩで二重消化することによりｐＳＰ６５（λ２６９ ．４）ベクターから切除した。１％低メルトアガロースゲルで電気泳動分離した 後、小さい方の線状ＤＮＡを、ゲルから切除した。２つの切除したＤＮＡ断片を 上流にＥｃｏＲ１をコードし、下流端にＢｓｔＥＩＩをコードしている以下の配 列の合成オリゴリンカーと結合した： （EcoRI） AAGTCGTCG （配列番号：１２） GCAGCCATTG （BstEII） （配列番号：１３） 結さつに続いて、ＰＭＡ４２４（ｐ４０−ＴＩＡ−１）と命名した全長プラスミ ドを分離し、伸長し、精製した。 この組み換えプラスミドによる酵母ＧＧＹ：：１７１の形質転換を、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、（１９９１）、１９：５７９１に記載の 酢酸リチウム方により行った。ＳＣ−ｈｉｓドロップアウトプレート上での選択 に続いて、個々の形質転換体を、第１図に示すようなｐ４０−ＴＩＡ−１−Ｇａ ｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質の発現に関して分析した。組み換えｐ ４０−ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインで形質転換した酵母からの溶解産物は、ポ リ（Ｕ）−アガロースとＴＩＡ−１反応性モノクローナル抗体との両方により認 識された約６５ｋＤに移動するタンパク質を含有していた。逆に、ＧＡＬ４ Ｄ ＮＡ結合ドメインをコードするベクターのみで形質転換した酵母細胞からの溶解 産物は、この免疫反応性物質を含有していなかった。両方の場合において、酵母 細 胞溶解産物を、２％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて調製した。ポ リ（Ｕ）−アガロース又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥ固定抗ＴＩＡ−１抗体を用いたア フィニティー析出に続いて、析出物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分 離し、ニトロセルロースに移した。次に、個々のブロットを、ＴＩＡ−１と反応 性のモノクローナル抗体でプローブし、ＥＣＬ法を用いて展開した。 次に、ＴＩＡ−１結合タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定を、ＧＧＹ：： １７１細胞をＰＭＡ４２４（ｐ４０−ＴＩＡ−１）及びｃＤＮＡライブラリー（ ｃＤＮＡを転写しｐＳＥ１１０７ベクターのＸｈｏＩ部位にクローニングしたヒ トＢ細胞由来のポリ（Ａ）ＲＮＡから調製）で共形質転換することにより行った 。ｃＤＮＡライブラリーでは、個々のｃＤＮＡを、第２Ａ図に概略示すようなア ミノ末端に位置するＧＡＬ４活性化ドメイン（残基７６８〜８８１）とカルボシ キ末端に位置するそれぞれ個々のｃＤＮＡによりコードされたペプチドからなる 融合タンパク質として発現させた。共形質移入後、細胞をＳＣ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ ドロップアウト培地プレートに植えつけて、二重形質転換体についての選択を行 った。３０℃で３日保持した後、酵母コロニーを、Ｘ−ｇａｌを含有するＳｃ− Ｌｅｕ−Ｈｉｓドロップアウト培地プレートにレプリカプレーティングし、β− ガラクトシダーゼを発現するコロニーを選択した。陽性コロニーを選択し、伸長 した。陽性コロニーからＤＮＡを分離するために、個々のコロニーを、細胞溶解 緩衝液（２％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、 １００ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌ＋フ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール１００μｌに懸濁した。ガラス ビーズ０．１ｇを添加後、これらの配合物を２分間渦巻かせ、エッペンドルフ遠 心分離機で遠心分離し、上清を清浄な エッペンドルフ管に移した。次に、３Ｍ ＮａＯＡｃ、２５０μｌエタノールを 添加してＤＮＡを析出させた。ＴＥ緩衝液４μｌに析出ＤＮＡを再懸濁した後、 このＤＮＡ２μｌを使用して、エレクトロポーレーションによりＥ．ｃｏｌｉ ＬｅｕＢ−株（Ｗ９２１）を形質転換した。ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体 から分離し、ＸｈｏＩで消化してｃＤＮＡインサートを遊離した。酵母細胞の４ ００，０００二重形質転換体をスクリーニングして、４つの陽性コロニーを得た 。これらは、コードされたＴＩＡＢＰ１（１．２ｋｂインサート）３つとコード されたＴＩＡＢＰ２（１．５ｋｂインサート）であった。 ＴＩＡＢＰ１のヌクレオチド配列（配列番号：１）と演繹アミノ酸配列（配列 番号：２）を、第３図に示す。ＴＩＡＢＰ２のヌクレオチド配列（配列番号：３ ）と演繹アミノ酸配列（配列番号：４）を、第４図に示す。ＧＳＴ融合タンパク質 ＴＩＡＢＰ２をコードする１．８ｋｂ ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドリン カーを用いてｐＧＥＸ−３Ｘのポリリンカー領域のＥｃｏＲ１部位にクローニン グした。これらの構成モノクローナル抗体は、グルタチオン−Ｓ−転写酵素を用 いて融合タンパク質としてＴＩＡＢＰ２を発現するように設計した。ｐＧＥＸ− ３Ｘ／ＴＩＡＢＰ２で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５）細菌細胞の個々のコ ロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地２５ｍｌに接 種した。培養を、３７℃で一晩振とう成長させた。一晩培養したもの２０ｍｌを 、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有２Ｘ ＹＴ培地８００ｍｌに接種した。培 養を、Ｏ．Ｄ．₆₀₀が約０．６となるまで、３７℃で振とうした。そのとき、Ｉ ＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭまで添加し、培養を３０℃でさらに３時間インキュ ベーションした。次に、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心 分離することにより採取した。ペレットを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ 、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。次に、細胞を、 音波処理により破壊し、４０，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離 して、不溶性菌体を除去した。上清を、グルタチオン−アガロースビーズカラム （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）に附し、４℃で３０分間イ ンキュベーションした。次に、ビーズを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳのみで２回洗浄し た。次に、個々の融合タンパク質を、グルタチオンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０に最終濃度１０ｍＭで添加したもので競合することにより溶離した。溶出 液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８． ０に対して透析して、遊離グルタチオンを除去した。精製融合タンパク質を、１ ０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでクーマシーブルー染色することにより解析 した。また、融合タンパク質を、組み換えＴＩＡＢＰ２に対するウサギポリクロ ーナル抗血清を用いた免疫ブロットによっても解析した。ノーザンブロット解析 表記組織から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含んだニトロセルロースフィルターを Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。各フィルターを、５０％ホルムアミド、５ＸＳ ＳＣ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５ＸＤｅｎｈａｒｔ’ｓ 及び５０ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で４時間予備ハイブリダイゼ ーションした。１．８ｋｂＴＩＡＢＰ２インサートＤＮＡを、ニックトランスレ ーションにより³²Ｐ標識し、上記溶液に希釈し、フィルターに４２℃で２４時間 ハイブリダイゼーションした。次に、このフィルターを、０．１％ＳＤＳ含有Ｉ ＸＳＳＣで２回洗浄し、０．１％ＳＤＳ含有０．１ＸＳＳＣで２回洗浄後、オー トラジオグラフ照射を 行った。Ｃｏｓ細胞形質移入 Ｃｏｓ細胞を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍ ａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載されているジエチルアミノエチルデキスト ラン法を用いて、表記インサートＤＮＡ含有プラスミドｐＭＴ−２を用いて形質 移入した。培養３日後、形質移入細胞を、細胞溶解性緩衝液で可溶化し、免疫析 出及び免疫ブロット実験に使用した。免疫析出 表記細胞型を、ＮＰ−４０細胞溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、上記した方法を用いて免疫析出 を行った：Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ｐ．等（１９９０）、”Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａ ｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ａ １５ｋＤ ｃｙｔｏ ｐｌａｓｍｌｃ ｇｒａｎｕｌｅ−ａｓｓｏｃ１ａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄ ｅｆｉｎｅｓ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ−ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４４：５ ７４。個々の免疫析出物を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニ トロセルロース又はＰＶＤＦフィルターに移し、以下で述べるポリクローナル抗 体及びモノクローナル抗体を用いて明らかとし展開させた。免疫ブロット解析 上記したようにして免疫ブロット解析を実施した｛Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ｐ．等 、（１９９０）、”Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔ ｉｖｅ ｗｉｔｈ ａ １５−ｋＤａ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｄ ｇｒａｎｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ ｉｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１４４：５７４｝。免疫ブロ ットを、ＴＩＡＢＰ２と反応性のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を 用いて展開後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体タンパク質Ａ／Ｇにより 展開した。ブロットをＥＣＬ検出系（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、マサチューセツ 州ボストンにあるＤｕＰｏｎｔ社製）を用いて明らかとした。 実施例ＩＩ ＴＩＡＢＰ１：Ｐ５３又はＴＩＡ−１相互作用のインヒビタに関するスクリーニ ング法 既存の技術を用いて、ＴＩＡＢＰ１とその基質との間の相互作用を阻害する薬 剤についてのスクリーニングを行った。ｐ５３：ＴＩＡＢＰ１相互作用の場合に は、このような薬剤は、低レベルのｐ５３を発現するＨＰＶ関連癌に対して抗腫 瘍活性を有する可能性がある。ＴＩＡ−１：ＴＩＡＢＰ１相互作用の場合には、 このような薬剤は、ＣＴＬが組織破壊に関与している自己免疫疾患に有用である 可能性がある。上記疾患としては、例えば、対宿主性移植片病、臓器移植後の同 種異系移植片拒絶、自己免疫甲状腺炎及び自己免疫真正糖尿病が挙げられる。 哺乳類細胞用に適合させたＴＩＡＢＰ１：ＴＩＡ−１、ＴＩＡＢＰ１：ｐ５３ 及びＴＩＡＢＰ２：ＴＩＡ−１相互作用のインヒビタについてのスクリーニング のための二ハイブリッド系の変形も用いることができる。用いられる方法の概略 図を、第６Ａ図及び第６Ｂ図に示す。一般的な方法には、相互作用が哺乳類細胞 におけるリポーター遺伝子の転写の引き金となるキメラ融合タンパク質をコード するプラスミドの構築が含まれる。いくつかのプロモータのうち の一つ、リポーター遺伝子、ＤＮＡ結合タンパク質及びトランスアクチベーショ ンドメインを使用できる。一例（第６Ａ図）では、ｉ）ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ド メインとＴＩＡ−１との間、及びｉｉ）ＴＩＡＢＰ１とＶＰ１６活性化ドメイン （４１１〜４５５）との間にキメラ融合タンパク質をコードするプラスミドを用 いて、ＧＡＬ４プロモータの制御下での分泌アルカリ性ホスファターゼ用遺伝子 の転写を活性化する。この例では、ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ１との間の相互作用 により、分泌アルカリ性ホスファターゼの構成発現が生じる。これらの細胞をＴ ＩＡ−１：ＴＩＡＢＰ１相互作用の候補インヒビタの存在下で培養することによ り、細胞上清を、減少したアルカリ性ホスファターゼ活性についてスクリーニン グできる。別の例（第６Ｂ図）では、ｉ）テトラサイクリンレプレッサーとＴＩ Ａ−１との間、及びｉｉ）ＴＩＡＢＰ１とＶ１６トランスアクチベーションドメ イン（４１１〜４５５）との間に融合タンパク質をコードするプラスミドを用い て、テトラサイクリンプロモータの制御下でリシンＡ等のトキシン遺伝子を発現 する細胞を形質転換する。次に、細胞を、ｔｅｔＲとｔｅｔプロモータとの間の 相互作用を防止するテトラサイクリンの存在下で培養する。コンフリュエンス（ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）でテトラサイクリンを除去し、個々の薬剤を添加する。 ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ１との間の相互作用により、リシンＡの転写が生じ、細 胞が死滅する。ＴＩＡ−１とＴＩＡＢＰ１との間の相互作用をブロックする薬剤 の存在下で培養した細胞は生存する。生体色素を使用して生存可能な細胞をスク リーニングすることができる。 実施例ＩＩＩ ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２の精製・分離 オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２をコー ドするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−３Ｘのポリリンカー領域 のＥｃｏＲ１部位にクローニングした。これらの構成物は、グルタチオン−Ｓ− 転写酵素を用いて融合タンパク質としてＴＩＡＢＰ１及びＴＩＡＢＰ２を発現す るように設計した。各組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５）に形質移入 し、ＩＰＴＧを添加することにより融合タンパク質を誘発した。ｐＧＥＸ−３Ｘ ／ＴＩＡＢＰ１又はｐＧＥＸ−３Ｘ／ＴＩＡＢＰ２で形質転換したＤＨ５細菌細 胞の個々のコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地 ２５ｍｌに接種した。培養を、３７℃で一晩振とう成長させた。一晩培養したも の２０ｍｌを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有２Ｘ ＹＴ培地８００ｍｌに 接種した。培養を、Ｏ．Ｄ．₆₀₀が約０．６となるまで、３７℃で振とうした。 そのとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭまで添加し、培養を３０℃でさらに３ 時間インキュベーションした。次に、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心 分離することにより採取した。ペレットを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ 、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。次に、細胞を、 音波処理により破壊し、４０，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離 して、不溶性菌体を除去した。上清を、グルタチオン−アガロースビーズカラム （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）に附し、４℃で３０分間イ ンキュベーションした。次に、ビーズを、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ１０ｍｌで３回洗浄し、そしてＰＢＳの みで２回洗浄した。次に、個々の融合タンパク質を、グルタチオンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に最終濃度１０ｍＭで添加したもので競合することにより 溶離した。溶出液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｄ ＴＴ、ｐＨ８．０に対して透析して、遊離グルタチオンを除去した。精製融合タ ンパク質を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでクーマシーブルー染色する ことにより解析した。また、融合タンパク質を、組み換えＴＩＡ−１及び組み換 えＴＩＡＲに対する ウサギポリクローナル抗血清を用いた免疫ブロットによっても解析した。 本発明を具体的実施態様により説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱す ることなく変更及び修正が可能であることは当業者には明らかであろう。 配列表 配列番号：１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２０６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１７２．．６４８ （ｘｉ）配列：配列番号：１： 配列番号：２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：２： 配列番号：３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７７６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１．．１７７６ （ｘｉ）配列：配列番号：３： 配列番号：４： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５９２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：４： 配列番号：５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：５： 配列番号：６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：６： 配列番号：７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：７： 配列番号：８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：８： 配列番号：９： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：９： 配列番号：１０： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１０： 配列番号：１１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１１： 配列番号：１２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） （ｘｉ）配列：配列番号：１２： ＡＡＧＴＣＧＴＣＧ 配列番号：１３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） （ｘｉ）配列：配列番号：１３： ＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧ 配列番号：１４： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１．．３９ （ｘｉ）配列：配列番号：１４： 配列番号：１５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１５： 配列番号：１６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４３０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１６： 配列番号：１７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３８２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１７： 配列番号：１８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１８： 配列番号：１９： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１９： 配列番号：２０： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：２０： 配列番号：２１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トロポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：２１：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/12 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチドをコードする配 列を含んでなる分離ｃＤＮＡ。 ２．前記配列がＴＩＡ−１のＲＮＡ結合ドメインを結合するポリペプチドをコ ードする請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ。 ３．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：１と実質的に同一である 請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ。 ４．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：１である請求項１に記載 の分離ｃＤＮＡ。 ５．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：１のヌクレオチド１７２ 〜ヌクレオチド６４５の配列と実質的に同一である請求項１に記載の分離ｃＤＮ Ａ。 ６．ポリペプチドをコードしている前記配列が配列番号：１のヌクレオチド１ ７２〜ヌクレオチド６４５の配列である請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ。 ７．前記配列がＴＩＡ−１のカルボキシ末端補助ドメインを結合しているポリ ペプチドをコードする請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ ８．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：３と実質的に同一である 請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ。 ９．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：３である請求項１に記載 の分離ｃＤＮＡ。 １０．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：３のヌクレオチド２６ ５〜ヌクレオチド１６６８の配列と実質的に同一である請求項１に記載の分離ｃ ＤＮＡ。 １１．ポリペプチドをコードする前記配列が配列番号：３のヌクレオチド２６ ５〜ヌクレオチド１６６８の配列である請求項１に記載の分離ｃＤＮＡ。 １２．二重形質転換においてｐ４０−ＴＩＡ−１又はｐ４０−Ｔ ＩＡ−１のイソホームを結合するポリペプチドをコードする配列を含んでなる分 離ｃＤＮＡ。 １３．前記ポリペプチドが、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である請求項 １，７，８，９，１０，１１又は１２のいずれか１項に記載の分離ｃＤＮＡ。 １４．配列番号：１の６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに相補的な 配列を有する６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントを含んでなる核酸プロ ーブにストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする分離ｃＤＮＡ。 １５．配列番号：３の６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに相補的な 配列を有する６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントを含んでなる核酸プロ ーブにストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする分離ｃＤＮＡ。 １６．配列番号：１のコード配列に相補的な配列を含んでなる核酸プローブに 低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする分離ｃＤＮＡ。 １７．配列番号：３のコード配列に相補的な配列を含んでなる核酸プローブに 低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする分離ｃＤＮＡ。 １８．二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチドをコードする 配列を含んでなる精製核酸。 １９．二重形質転換においてｐ４０−ＴＩＡ−１又はｐ４０−ＴＩＡ−１のイ ソホームを結合するポリペプチドをコードする配列を含んでなる精製核酸。 ２０．前記ポリペプチドが、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である請求項 １８又は１９のいずれか１項に記載の精製核酸。 ２１．配列番号：１の６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメント又は前記６ 〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有するセグメントを 含んでなる核酸プローブにストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションす る精製核酸。 ２２．配列番号：３の６〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメント又は前記６ 〜少なくとも２０ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有するセグメントを 含んでなる核酸プローブにストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションす る精製核酸。 ２３．配列番号：１のコード配列又は前記コード配列に相補的な配列を含んで なる核酸プローブに低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする精 製核酸。 ２４．配列番号：３のコード配列又は前記コード配列に相補的な配列を含んで なる核酸プローブに低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする精 製核酸。 ２５．ベクターの精製標本であって、前記ベクターが二重形質転換においてＴ ＩＡ−１を結合するポリペプチド又は前記ポリペプチドの断片をコードする配列 を含んでなる分離ｃＤＮＡを含んでなるベクターの精製標本。 ２６．ベクターの精製標本であって、前記ベクターが二重形質転換においてｐ ４０−ＴＩＡ−１又はｐ４０−ＴＩＡ−１のイソホームを結合するポリペプチド をコードする配列を含んでなる分離ｃＤＮＡを含んでなるベクターの精製標本。 ２７．前記ポリペプチドが、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である請求項 ２５又は２６に記載のベクターの精製標本。 ２８．ＡＴＣＣ＃６９３７１として寄託されているプラスミド。 ２９．ＡＴＣＣ＃６９３７２として寄託されているプラスミド。 ３０．二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合するポリペプチド をコードする配列を含んでなる分離ｃＤＮＡで形質転換された細胞。 ３１．二重形質転換においてｐ４０−ＴＩＡ−１又はｐ４０−ＴＩＡ−１のイ ソホームを結合するポリペプチドをコードする配列を含んでなる分離ｃＤＮＡで 形質転換された細胞。 ３２．前記ポリペプチドが、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である請求項 ３０又は３１に記載の細胞。 ３３．二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合する実質的に純粋なポリペプチ ド。 ３４．ＴＩＡ−１のＲＮＡ結合ドメインに結合する請求項３３に記載の実質的 に純粋なポリペプチド。 ３５．配列番号：２と実質的に同一なアミノ酸配列を有する請求項３３に記載 の実質的に純粋なポリペプチド。 ３６．配列番号：２であるアミノ酸配列を有する請求項３３に記載の実質的に 純粋なポリペプチド。 ３７．ＴＩＡ−１のカルボキシ末端補助ドメインに結合する請求項３３に記載 の実質的に純粋なポリペプチド。 ３８．配列番号：４と実質的に同一なアミノ酸配列を有する請求項３３に記載 の実質的に純粋なポリペプチド。 ３９．配列番号：４であるアミノ酸配列を有する請求項３３に記載の実質的に 純粋なポリペプチド。 ４０．二重形質転換においてｐ４０−ＴＩＡ−１又はｐ４０−ＴＩＡ−１のイ ソホームを結合する実質的に純粋なポリペプチド。 ４１．前記ポリペプチドが、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である請求項 ３３，３７，３８，３９又は４０のいずれか１項に記載の実質的に純粋なポリペ プチド。 ４２．ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブリドーマにより産生さ れるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である実 質的に純粋なポリペプチド。 ４３．ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１１７２１と命名されたハイブリドーマにより産生さ れるモノクローナル抗体２Ｂ５と免疫反応性である実質的に純粋なセリン／トレ オニンキナーゼ。 ４４．二重形質転換においてＴＩＡ−１を結合する請求項４３に記載の実質的 に純粋なセリン／トレオニンキナーゼ。 ４５．タンパク質の製造方法であって、請求項３０に記載の細胞を前記分離ｃ ＤＮＡが発現する条件下で培養する工程と、前記分離ｃＤＮＡによりコードされ たタンパク質を回収する工程とを含んでなるタンパク質の製造方法。