JPH02231500A

JPH02231500A - 新規なｇｔｐ結合蛋白質及びその産生方法

Info

Publication number: JPH02231500A
Application number: JP1115831A
Authority: JP
Inventors: Yoshimi Takai; 義美高井; Atsushi Kondo; 淳近藤; Yasushi Matsui; 泰松井; Yutaka Teranishi; 豊寺西; Rie Matsui; 松井　理恵
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1990-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ｒａｓ発ガン遺伝子産物に対し抑制的に働く
新規なＧＴＰ結合蛋白質（Ｓｍｇ　　ｐ２１）及びそれ
をＭｉ換えＤＮＡ技術により宿主中で産生させる方法に
関する．（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）咄乳
動物の個体を構成する個々の細胞は、細胞外から絶えず
情報を受け、その刺激に応答するという形式で個体とし
ての役割を果たしている。

いわゆる第１次情報伝達物質が各細胞にもたらす情報を
受ける細胞膜情報転換ユニソトは、受容器（レセプター
）、伝達器（トランスジューサー）及び効果器（エフェ
クター）の３種類の蛋白質で構成されており、ＧＴＰ　
（グアノシン５一三リン酸）結合蛋白質（以下、「Ｇプ
ロテイン」という）はその内トランスジューサーとして
機能している。

即ち、レセプターが細胞外からの第１次情報を受けると
、不活性型のＧＤＰ−Ｇプロテインに作用し、Ｇプロテ
インに結合しているＧＤＰがＧＴＰに変換され、活性型
のＧＴＰ−Ｇプロテインとなる。そして、この活性型の
ＧＴＰ−Ｇプロテインがエフエクターに作用し、エフエ
クターから細胞内に情報（第２次情報）が伝達される。

従来、Ｇプロテインについては、種々の蛋白質（サブユ
ニット）から構成されている高分子量のＧプロテイン（
分子量約４万）の機能等が良く知られているが、最近低
分子ＩＣプロテインの存在が明らかにされてきた．低分子量Ｇプロテイン、即ち分子量が２〜２，５万のＧ
プロテインは少くとも１５種類存在するが、本発明者ら
の一部は、先に分子量２．４万のＧプロテイン（Ｓｍｇ
　　ｐ　２　５Ａ）及び分子量２．２万のＧプロテイン
（Ｓｍｇ　　Ｉ）２１：２２Ｋダルトン）をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにおいて単一の蛋白質として精製することに成功
したこと、そしてＳｍｇ　　ｐ２５ＡのＧプロテインに
ついてはその詳細を報告した〔実験医学、Ｖｏｌ．６，
ｆｋ５、第３４−４２頁，１９８８ｉジャーナル　オブ
　ザ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．），２６３．２８９７−２９０４．１９８８
）。

しかしながら、未だこれらＧプロテインの構造について
は明らかにされておらず、その機能についても全く不明
であった。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、分子量２．２万のＧプロテインについて
着目し、その全構造を決定して該Ｇプロテインの機能を
解明すべく鋭意検討を重ねた結果、該Ｇプロテインを精
製し、その部分アミノ酸配列を決定してブロープを作成
し、ＧプロテインのＣＤＮＡライブラリーから分子量２
，２万のＧプロテインのｃＤＮＡをクローン化し、その
塩基配列を決定することにより初めて分子量２．２万の
Ｇプロテインを単一分子種として得ることに成功した。

しかし、Ｓｍｇ　　ｐ２１は従来の蛋白化学的手法を用
いての精製では数１０μｇ程度の量しか精製できず、大
量に用いて、例えば抗ガン剤等の薬理試験に使用するこ
とは困難であった。また、人為的に変異を導入し、抗ｒ
ａｓ活性の強いＳｍｇｐ２１変異蛋白質を作ることも、
まだ不可能とされていた。

そこで本発明者らは、該Ｇプロテインを遺伝子工学的手
法により大量に生産すべく鋭意検討を重ねた結果、該Ｇ
プロテインをコードする遺伝子を初めて分離取得し、該
遺伝子を含んだ発現ベクターを得るに至り、本発明を完
成するに到達した。

即ち、本発明の要旨は、ＧＴＰ結合活性及びＧＴＰ加水
分解活性を有し、該ＧＴＰ結合活性がＮ−エチルマレイ
ミドで阻害される性質を有する下記アミノ酸配列（Ｔｈ
ｒ−ｌｉｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｓ　ｒ−Ｔｙ　ｒ）を
含み、分子量が約２２Ｋダルトンであることを特徴とす
るＧＴＰ結合蛋白質、第１図に示すアミノ酸配列で表わ
されることを特徴とするＧＴＰ結合蛋白質及びそれをコ
ードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を、発現用ベクタ
ーのプロモーターの下流に存在するクローニング部位に
導入し、ついで該ＤＮＡ断片を導入した発現ベクターを
宿主に導入して同宿主を培養し、該蛋白質を生成蓄積さ
せ、これを取得することを特徴とするＳｍｇ　　ｐ２１
の産生方法に存する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明のＧプロテインは、咄乳動物の細胞の細胞膜に存
在する。

例えば後述の実施例に示すように、牛の脳を破砕し、細
胞膜画分を得、コール酸ナトリウムによって粗膜画分を
抽出して、これをＵｌ　ｔ　ｒｏｇｅＬ　　ＡｃＡ−４
４　（ＬＫＢ社製）カラムクロマトグラフィー、フエニ
ルーセファロースＣＬ−４ＢファルマシアＬＫＢ社製）
カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト（生
化学工業社製）カラムクロマトグラフィー、Ｍｏｎｏ　
　Ｑ　　ＨＲ５／５　（ファルマシアＬＫＢ社製）カラ
ムクロマトグラフィー、Ｍｏｎｏ　　Ｓ　　ＨＲ　　５
／５　　（ファルマシアＬＫＢ社製）カラムクロマトグ
ラフィー及び再びＭｏｎｏ　　Ｑ　　Ｈ−Ｒ　　５／５
カラムクロマトグラフィーにかけることによって・、精
製された分子量約２２ＫダルトンのＧプロテインを得る
ことができる。

この精製された分子量約２２ＫダルトンのＧプロテイン
は、ＧＴＰ結合活性及びＧＴＰ加水分解活性を有する。

このＧＴＰ結合活性はＮ−エチルマレイミドによって阻
害されるが、その際にジチオスレイトールを存在させて
おくとその阻害はブロソクされる。

また、このＧプロテインは、抗ＡＲＦ　（ＡＤＰｒｉｂ
ｏｓｙｌａｔｏｔｎ　　Ｆａｃｔｏｒ）ポリクローナル
抗体及び抗ｒａｓ　　ｐ２１モノクローナル抗体との交
叉反応は示さない。

本発明においては、上記精製Ｇプロテインの部分アミノ
酸配列を決定してプローブを作成し、常法に従い、全ポ
リＡＲＮＡから調製したｃ　ＤＮＡライブラリーより分
子量約２２ＫダルトンのＧプロテインのｃＤＮＡをクロ
ーン化した。

クローン化されたｃＤＮＡから、分子量約２２Ｋダルト
ンのＧプロテインをコードするＤＮＡ断片を取得し、そ
の塩基配列を決定した（第３図）．この塩基配列から、
本発明のＧプロテインは、１８４個のアミノ酸残基から
なる蛋白質であることが分かった。また、本発明のＧプ
ロテインは、Ｎ末端の４４個のアミノ酸残基は、ｒａｓ
蛋白質と約７７％の相同性を有し、全体でも約５３％の
相同性を有する。そして、ｒａｓ蛋白質がエフエクター
と作用すると推定されている第３５−４０番目の領域（
Ｔｈｒ−１　１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ
）と同じ配列（第３５−４０番目）を有していることが
分った。

次に本発明のＧプロテインの産生方法について説明する
。

本発明において用いられる第３図で表わされるＤＮＡ断
片は、該ＤＮＡ断片に含まれるＤＮＡによってコードさ
れる物質がＳｍｇ　　ｐ２１と同様の生理活性を有する
物質をコードするものであれば、該塩基配列の一部が置
換もしくは削除され、又は塩基が付加された塩基配列で
あってもよい。

例えば、第１図に示すアミノ酸配列において、第１２番
目のグリシン（Ｇｌｙ）がバリン（Ｖａｌ）に、第３８
番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がアラニン（ＡＩ．ａ
）に、また第４０番目のチロシン（Ｔｙｒ）がリジン（
Ｌｙｓ）に置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
等が挙げられ、これら以外にも下記第１表に示したよう
なアミ５ノ酸の置換が考えられる。

このような改変ＧプロテインをコードするＤＮＡは合成
オリゴヌクレオチドを用いる公知の部位特異的変異誘起
や制限酵素により得られる切断部位と適切な合成オリゴ
ヌクレオチドを連結させる等の方法により得られる。

本発明の発現ベクターは、上記のようにして得られたＳ
ｍｇ　　ｐ２１をコードするＤＮＡを転写制御できる位
置にプロモーターを含有する。

使用するプロモーターは、宿主中で発現可能ならば何で
もよいが、更には制御可能なものが望ましい。

例えば大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とするときは、
発現ベクターは、プロモーター、リポソーム結合配列、
Ｓｍｇ　　ｐ２１遺伝子、転写終結因子、及びプロモー
ターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。

プロモーターとしては、大腸菌、ファージ等由来のもの
、例えばトリブトファン合成酵素オペロン（工二ｌ）、
ラクトースオペロン（［　ａ　Ｃ）、リポプロテイン（
土ｚ且）　、ｒ　ｅ　ｃ　Ａ　．．ラムダファージＰＬ
　，ＰＲ　，Ｔ５初期遺伝子Ｐ　２５＋　　Ｐ　２６プ
ロモーター等が挙げられる。これらは化学合成により作
成されたものでもよい。また、ｔａｃ（ｔＬＬ：　ｌａ
ｃ）　、ｔｒｃ　（±工上：ｌａｃ）、■ａｃ（ファー
ジ：大腸菌）等のバイブリソドブロモーターでもよい。

リポソーム結合配列としては、大腸菌、ファージ等由来
のものでも良いが、合成により作成したコンセンサス配
列、例えば、Ｑ　Ｇ　Ｇ　ＴｊＤ配列ＴＴＡＡ等の配列を持ったものが好ましい。

Ｓｍｇ　　ｐ２１遺伝子は、そのまま使用しても良いが
、部位特異的変異〔バイオ　テクノロジー（Ｂ　Ｉ　Ｏ
　　ＴＥＣＨＮＯＲＯＧＹ）Ｊ　ｕ　ｌ　ｙ，６３６−
６３９，　　（１９８４））等により余分なＤＮＡ配列
（ｎ　ｏ　ｎ−ｃ　ｏ　ｄ　ｉ　ｎｇ碩域）を除いたも
のが好ましい。

転写終結因子は必ずしも必要ではないが、ρ非依存性の
もの、例えば±ＬＬターミネーター　±ＬＬオペロンタ
ーミネーター、リポソームＲＮＡ遺伝子のターミネータ
ー等を有している方が好ましい。

また発現ベクターは、通常のプラスミドを使用しても良
いが大腸菌または枯草菌で多コピー数になるプラスミド
、例えばｐＢＲ３２２系ブラスミド、ｐＵＢ１１０系ブ
ラスミド等を使用したものが好ましい。

さらに、これら発現に必要な因子の発現ブラスミド上で
の配列順序は、５′側上流から、プロモーター、ＳＤ配
列、Ｓｍｇ　　ｐ２１遺伝子、構造遺伝子、転写終結因
子の順に並ぶことが望ましい．また転写の制御に必要な
リプレッサー遺伝子、マーカー遺伝子（薬剤耐性等）及
びプラスミド複製開始等の順序はとくに限定はされない
。また、ＳＤ配列、Ｓｍｇ　　ｐ２１遺伝子を接続した
ものをプロモーター下流に縦に並べて連結させる事によ
り、転写効率を高める事ができる。その結果、生成量及
び品質の向上が望める。

酵母を宿主とする場合は、酵母由来のプロモーター、例
えばピノレヒ゛ン酸キナーゼ（ｐＹＫ）、ホスホグリセ
ロキナー゛ゼ（ｐＧＫ）等の配列の支配下にＳｍｇ　　
ｐ２１遺伝子を接続し、酵母内に導入することにより、
Ｓｍｇ　　ｐ２１を産生することができる。

宿主の形質転換方法としては、大腸菌ではＭｏＩｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ（モレキュラークローニング
）、２５０−２５３，（１９８２）記載の方法、また枯
草菌ではＭｏ　１　ｅ　ｃ，　Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（
モレキュラー　ジェネラル　ジェネティクス），１６８
，１１５−１１５，（１９７９）及びＰｒｏｃ，Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｕ，Ｓ，Ａ．（プロシーディング
　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス　ユーエ
スエー），↓↓，１０７２−１０７８．　　（１９５８
）記載の方法、また酵母ではＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　
　Ｙｅａｓｔ　　ＧｅｎｅＬｉｃｋｓ（メソッズ　イン
イースト　ジェネティックス）１２１−１２２ページ（
１９８６）に記載のリチウム　クロライド法等の常法を
用いることができる。

形質転換体の培養方法としては、大腸菌、枯草菌、酵母
とも通常の培養を行い得る培地（（ＭｏＩｅｃｕｌａｒ
　　Ｃｌｏｎｉｎｇ（モレキュラークローニング），６
Ｂ−７３，　　（１９７２））：Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆ
ｎ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｋｓ（メソッズ　
イン　イースト　ジエネティックス），１６３ページ（
１９８６））を用いることができる。また培養温度も１
５〜４２゜Ｃで行えばよいが、好ましくは大腸菌、枯草
菌等の場合は熱ショック蛋白質等の発現誘導の起らない
範囲（１５〜２５゜Ｃ）で行い、酵母の場合は３０゜Ｃ
前後で行うのがよい。

また、真核細胞、例えば動物細胞においては次のような
ものが好ましい。

プロモーターとしては、ＳＶ４　０初期プロモーター、
ＳＶ４　０後期プロモーター、アボリボプロテインＥ遺
伝子のプロモーター、アボリボプロテインＡ−１遺伝子
のプロモーター、熱ショック遺伝子のプロモーター（Ｐ
ｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ　ｉ，Ｕ，Ｓ，Ａ．
　　（プロシーディングナシ式ナル　アカデミー　オプ
　サイエンス　ユーエスエー），１エ，７０３８−７０
４２，　　（１９８１）），メタロチオネイン遺伝子の
プロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａ　ｔ　ｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃ　ｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７．６５１１−６５１５，　
　（１９　８　０）），ＨＳＶＴＫプロモーター、アデ
ノウイルスのプロモーター（Ａ　ｄ　　２　主要後％，
１１７’ロモーター（Ａｄ　　２ＭＬＰプロモーター）
）、レトロウイルスのＬＴＲ　（Ｌｏｎｇ　　Ｔｅｒｍ
ｉｎａＩ　　Ｒｅｐ’ｓａｔ）等が挙げられるが、ＳＶ
４０プロモーター及びメタロチオネイン遺伝子のプロモ
ーターが好ましい。

発現ベクターは５′スプライス部位（５’ｓｐｌｉｃｅ
　　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　　ｄｏｎｏｒ　　ｓｉｔｅ）、
イントロン及び３′スプライス部位（３′ｓｐｌｉｃｅ
　　ｊｕｎｃｔｉｏｎ　　ａｃｃｅｐｔｏｒ　　ｓｉｔ
ｅ）からなるスプライス配列ＤＮＡ（エキソンーイント
ロン接合部位、同接合部位周辺には共通の塩基配列が見
出されており、イントロン領域が常にＧＴの２塩基（ド
ナ一部位）で始まり、そしてＡＧの２塩基（アクセプタ
一部位）で終了するといういわゆるＧＴ／ＡＣ則が成立
する。

このようなスプライス配列ＤＮＡは、発現ベクター中に
１以上存在してもよく、またその位置は、Ｓｍｇ　　ｐ
２１遺伝子の上流であっても、また下流であってもよい
。

上記スプライス配列ＤＮＡの具体例としては、ウサギβ
−グロビン遺伝子のエクソン２及びエクソン３　　（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ　（サイエンス），２６，３　３　９．　
　（１　９　７　９）参照）、メタロチオネイン遺伝子
のプロモーター、エクソン１、２及び３並びにイントロ
ンＡ及びＢを含有するマウスメタロチオネインーＩ遺伝
子（Ｐｒ　ｏ　ｃ，　Ｎａ　ｔ　ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
，Ｕ．Ｓ．Ａ．　　（プロシーディング　ナショナル　
アカデミー　オプ　サイエンスユーエスエー），７７，
６５１３，　　（１９８０）参照）中に存在するスプラ
イス配列ＤＮＡが挙げられる。また、５′及び３′スプ
ライス部位は同一の遺伝子に由来する必要はなく、たと
えば、アデノウイルスＤＮＡ中に含まれる５′スプライ
ス部位とｒｇ可変領域遺伝子に由来する３′スプライス
部位を連結した配列を使用できる。

本発明の発現ベクターは、さらにポリアデニル化部位を
含有する。ポリアデニル化部位は、Ｓｍｇ　　ｐ２１遺
伝子の下流に存在する。ボリアデニ，ル化部位の具体例
としては、ＳＶ４０　　ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子又
はメタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる
。また、β−グロビン遺伝子のボリアデニル化部位及び
ＳＶ４０　　［）ＮＡのポリアデニル化部位が連結した
ものであってもよい。

本発明の発現ベクターは、形質転換体の選択を可能とす
る硬性な選択マーカを有していてもよい。

発現ベクター中に選択マーカがな《でも、二重形質転換
法（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、形質
転換された本発明の動物細胞を選択できる。

このような選択マーカとしては、ＭＴＸ　（メントレキ
セート）耐性を与えるＤＨ’ＦＲ遺伝子、ＨＡＴ媒地中
での形質転換ｔｋ一株の選択を可能とするヘルペス・シ
ンブレックスウイルス（ＨＳＶ）のｔｋ遺伝子、３′−
デオキシストレブタミン抗生物質Ｇ４１８に対する耐性
を付与する大腸菌のトランスポゾンＴｎ５からのアミノ
グリコシド３′ホスフォトランスフエラーゼ遺伝子、重
層増殖による形態的区別を可能にするウジバピローマウ
イルス遺伝子、土１工工遺伝子等が挙げられる。

また、二重形質転換法により、本発明の発現ベクターで
形質転換した動物細胞を選択するには、上記した選択マ
一カとなる遺伝子を含有するブラスミドその他のＤＮＡ
を発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択で
きる。

発現ベクターは、大腸菌等の細胞由来の複製起点を有す
るブラスミド断片を含有すると、細菌中でのクローニン
グが可能となり有利である。このようなブラスミドとし
てはｐＢＲ３　２　２、ｐＢＲ３２７、ｐＭＬ等が挙げ
られる．発現ベクターに使用されるプラスミドベクターの具体例
としては、ＳＶ４０初期プロモーターウサギのβ−グロ
ビン遺伝子に由来するスプライス配列ＤＮＡ、ウサギの
β−グロビン遺伝子からのポリアデニル化部位、ＳＶ４
０初期領域からのポリアデニル化部位並びにｐＢＲ３２
２からの復製起点及びアンピシリン耐性遺性子を含有す
るｐＫＣＲ　（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ　ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ
　ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（プロシーディング　ナショナルア
カデミー　オプ　サイエンス　ユーエスエー），ｔ主．
１５２Ｂ，　　（１９８１）参照）、ｐＫＣＲのｐＢＲ
３２２部分をｐＢＲ３２７部分で置換し、ウサギβ−グ
ロビン遺伝子のエクソン３中に存在するＥｃｏ　　Ｒ■
部位をｌ｛ｌｎｄｎ１部位に変えたｐＫＣＲ　　Ｈ２　
　（Ｎａｔｕｒｅ　　（ネイチャー），３０７，６０５
参照）、ＢＰ”／遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を
含有するｐＢＰＶ　　ＭＴＩ（Ｐｒｏｃ，Ｎａ　ｔ　１
．Ａｃａｄ．Ｓｃ　ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，３９８，
（１９８３）参照）等が挙げられる。

発現ベクターで形質転換される動物細胞としては、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細
胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。

本発明の発現ベクターの動物細胞への移入はトランスフ
エクション法、マイクロインジェクション法としては、
Ｃａ−ＰＯ，　　（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ヴアイロロジー
），５２，４５６−４６７（１９７３））が最も一般的
である。

移入により形質転換された動物細胞の培養は、常法によ
り浮遊培地又は固着培地中で行なうことができる。

培地としては、ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０等が一般的で
ある。

産生された蛋白の分離精製は、微生物により生産した場
合と同様にしてできる。

（発明の効果）本発明の分子量が約２２ＫダルトンのＧプロテインのＤ
ＮＡは、上述の通り、発ガン遺伝子であるｒａｓ遺伝子
と非常に高い相同性（５５％）を有するので、これらの
蛋白質は作用するエフエクターを共有する可能性がある
。従って、本発明のＧプロテインは発ガン蛋白質である
ＲＡＳを直接的に、もしくは間接的に制御していると考
えられ、ＲＡＳによる発ガンの抑制剤としての用途が朋
待される。

（実施例）以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は、その要旨を超えない限り以下の実施例によ
って限定されるものではない。

実施例１（１）分子量２，２万のＧプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２
１）の精製（第２表参照）（ａｌ　　Ｋ　ｉ　ｋ　ｕ　ｃ　ｈ　ｉらの方法〔ジャ
ーナル　オブザ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．），２６３．２８９７　　２９０
４１９８８）に従い、分子量（相対分子量：Ｍ「）２０
，０００〜２５，０００の粗Ｇプロテインを得た。

即ち、まず牛の脳から粗膜画分をコール酸ナトリウムに
より抽出し、これをＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ−４４カラ
ムクロマトグラフィーで分画して、ＧＴＰ結合活性を示
した２つのピークのうち２番目のピークの両分を分取し
た．これをフエニルーセファロースＣＬ−４Ｂカラムク
ロマトグラフィーで精製した後、ヒドロキシアバタイト
力ラムクロマトグラフィーで分画し、１番目のピークの
両分を分取した。次いで、これをＭｏｎ．ｏ　　ＱＨＲ
５／５カラムクロマトグラフィーで分画し、１番目のピ
ークの百分を分取して、Ｍｒ２０，０００〜２５，００
０の粗Ｇプロテインを得た。

ｆｂ）　　上記（ａ）で得た粗Ｇプロテインを、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化
マグネシウム及び０．　６％ＣＨＡＰＳ　（３−　（　
（３コラミドブ口ピル）ジメチルアンモニオ〕−１−ブ
ロバンスルホン酸塩：　３　　　（　（３−Ｃｈｏ　１
ａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎ
ｉｏ）−ｌ−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌ　ｆ　ｏｎａｔｅ）
を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液で
平衡化したＭｏｎｏ　　Ｓ　　ＨＲ５／５カラムにかけ
た。５ｍｌの同緩衝液で洗浄後、２０ｍｌの塩化ナトリ
ウム（０〜１．０Ｍ）の濃度勾配にて溶出した。溶出速
度は３．５　ｍ　１／　ｕｒで行ない、０．　５　ｍ　
ｌずつ分画した。各両分のＧＴＰ結合活性を調べたとこ
ろ、４つのピークが認め）れた。その内、４番目のピー
ク（５０〜６８両分）を集め、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，１
ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム及び
０．５％コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリスー塩
酸（ｐＨ　９．　０　）緩衝液９倍量にて希釈後、同緩
衝液で平衡化したＭｏｎｏ　　Ｑ　　ＨＲ５／５カラム
にかけた。５ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、’ｌ　Ｑｍ
ｊｌ！の塩化ナトリウム（０〜０．４Ｍ＞の濃度勾配に
て溶出した。溶出速度は０．　５　ｍ　１　／　ｌｊで
行ない、０６５ｍｌｌずつ分画した。その溶出パターン
を第２図に示した。分画数ｌＯ〜２０番目の両分を集め
、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（８〜１６％）ゲル電気
泳動にかけたところ、分子量が約２２Ｋダルトンの単一
バンドであった。かくして、精製されたＧプロテイン（
Ｓｍｇ　　ｐ２１）を得た。精製Ｇプロテイン（Ｓｍｇ
　　ｐ２１）の各種性質は第３表に示す通りであった。

（２）Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２１）のアミノ酸配
列の決定（δ）　ブローブの作製上記ｆｌ）で得た精製Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２ｌ
）２５μｇをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−
２５カラムクロマトグラフィーで脱塩した後、０．　１
％トリフルオロ酢酸で平衡化したＹＭＣ　　ｐａｃｋ　
　ＡＰ−８０２　　Ｃ４カラムにかけた．次いで、アセ
トニトリル／２−プロバノール（３／７）Ｏ〜１００％
の濃度勾配の０．　１％トリフルオロ酢酸４　９ｍｌに
て、１ｍＪ／ｍの流速で溶出した。得られた両分のＧプ
ロテインをＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　　ｌｙｔｉｃ
ｕｓプロテアーゼ■で消化し、それをＢａｋｅｒｂｏｎ
ｄ　　ＷＰＯｃ−ｔｙ１カラムで分画した。そのうちの
１つの画分をガス相シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　社製、Ｍｏｄｅｌ４７０Ａ
）にてアミノ酸配列を決めたところ、下記の通り１８ア
ミノ酸からなるベプチドであった。

Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−１　　１ｅ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ　− そのうち、Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　３ｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　
ｌ　）’　−Ｐｈｅ−Ａｌａの配列をもとに、下記塩基
配列のオリゴヌクレオチド混合物を化学合成（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｍｏｄｅｌ３８
０Ａ）Ｌてプローブを得た。

次いで、Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製
）及びｒ−”Ｐ−ＡＴＰにてその５′末端を３χＰで標
識した。

（ｂ）　　Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２　１）ｃＤＮ
Ａの調製牛の大脳よりチオシアン酸グアニジンー塩化リチウム法
〔カサラ（Ｃａ仁ｈａ　ｌａ）ら、ディーエヌエイ　（
ＤＮＡ），２，３２９．１９８３）に従い、ポリ　（Ａ
）を有するＲＮＡを下記の如く調製した。

即ち、牛大脳５ｇを、直ちに液体窒素にて凍結した。こ
のものを液体窒素とともにワーリングプレンダーに入れ
、３．　０　０　Ｏ　ｒ．ｐ，ｔｎ，で２分間粉砕した
。このものを５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ，５０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ７）及び８％
（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノールからなる溶液１　
０　０ｍ７！中でテフロンホモジェナイザー（５ｒ．ｐ
．ｍ．）にてさらに破砕し、可溶化した。この可溶化物
２　０ｍｌを遠心管に入っている５７Ｍ塩化セシウム溶
液１　０ｍｌ上に静かにのせ、Ｈｉｔａｃｈｉ　　（日
立）ＲＰ３２８−２ローターにて２　７．　０　０　Ｏ
　ｒ．ｐ，ｍ，で２０時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として
回収した。このＲＮＡの沈殿を０．　１％ラウリル硫酸
ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，１０ｍＭトリスー塩
酸（ｐＨ７．５）からなる溶液１０ｍｊ！に溶解し、フ
ェノールークロロホルムで抽出後、エタノール沈殿によ
り回収した。得られたＲＮＡ約３．９５ｎｖを１０ｍＭ
トリスー塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡか
らなる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃で５分間インキユ
ベートし、０．　１　ｍ　ｌの５Ｍ塩化ナトリウムを加
えた。

混合物をオリゴ（ｄ　Ｔ）セルロース・カラム〔ピー・
エル・バイオケミカル（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積０．　５　ｍ
　ｌ　）にかけた。吸着したポリ　（Ａ）を有するｍＲ
ＮＡを、１０ｍＭ｝リスー塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポリ　（Ａ）を
有するｍＲＮＡ約１００ｔｒｇを得た。

得られたポリ　（Ａ）ｍＲＮＡ約５μｇを用い、Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社のマニュアルｒｃＤＮＡ合成システム」第
１３〜２１頁及び同ｒｃＤＮＡクロニングシステムλｇ
ｔｌＯＪ第１１〜２８真に記載の方法に従い、牛脳ｃＤ
ＮＡライブラリー（λｇｔｌｏベクター）を作成した。

このｃＤＮＡライブラリーから上記（ａｌで得た標識プ
ローブを使用してハイブリダイズするブラークをニトロ
セルロースフィルター（ＳＡＳ社製）Ｄ，Ｈａｎａｈａ
ｎらの方法〔メソンズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），　１
００，．３３３−３４２．　１９８３）に従い、オート
ラジオグラフィーでイ食出し、Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　
　ｐ２１）をコードするｃＤＮＡが組み込まれたλｇｔ
ｌｏファージを１クローン取得した。

このファージＤＮＡをＥ．Ｃ．Ｑ．Ｒｌで消化し、約２
ＫＯのＥｃｏ　　Ｒｌフらグメントを得、これをプラス
ミドｐＵｃ１９（ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３−
１１９．１９８５）のＥｃｏ　　Ｒ１部位に導入して、
Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　ｐ２１）をコードするＤＮＡを
クローン化した。このプラスミドをｐ　Ｓｍｇ　２　１
とした。かくして得られたＤＮＡをＳａｎｇｅｒらのグ
イデオキシ法〔プロシーディング　オブ　ザ　ナショナ
ル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オプ　ザ　ユー
エスエー（Ｐｒｏｃ，Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ．Ｓｃｔ
．　ｕ．　ｓ．　Ａ．　），　　７１．５４６３−５４
６７，１９７７）によりその塩基配列を決定した。その
結果を第３図に示した。

上記塩基配列から、Ｇプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２１）
の全アミノ酸配列は第１図に示す通りであることが分っ
た。

実施例２Ａ　発現ベクター及び形質転換体の作成１）　　Ｎ末端
の変異 ■　ｐＳｍｇ２ｌを宝酒造社１９８８年カタログ（ｐ．
８２．８３）に記載の方法に従って処理して、ＩＯμｇ
の１本鎖ＤＮＡを得た。

■　変異をさせたい下記の部分のプライマーを、ＤＮＡ
合成機（日科機社製、Ａｐｐ　ｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ　　ＭＯＤＥＬ　　３８０Ａ）にて合成した。合
成したＤＮＡは濃アンモニア水と５５℃で一晩反応させ
、保護基をはずした後逆相ＨＰＬＣにより享青製して使
用した。

プライマー　５　’　−ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣ
ＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡ
ＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧ−３　’上記プライマ−１５０
ｐｍｏｌをキナーゼ緩衝液（５０ｍＭｌ−リスーＨｌ！
　（ｐＨ８．０）１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５ｍＭ
ジチオスレイトール）１０μｌの系で２０ｕのＴ４ボリ
ヌクレオチドキナーゼにより５′をリン酸化した。

■　■で５′リン酸化したプライマ−８ｐｍｏ＋及び■
で得た一本鎖ＤＮＡＩＯμｇをアマーシャム社のオリゴ
ヌクレオチドを用いた部位特異物ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ変
異体作製システムを用い、アマーシャム社のマニュアル
（１９８８年：ｐ．２５〜ｐ．３２）によって変異体を
作製した。

これにより、プライマーと一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａより生じた
二本鎖の環状ＤＮＡを得ることができた。

この環状ＤＮＡを含む水溶液２μｌを用い、常法に従い
大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、形質転換体を得た。

この形質転換体からプラスミドを常法に従い分離・精製
し、制限酵素Ｈ　ｉｎｄｍにより切断し、５％アクリル
アミドゲル電気泳動により２つのフラグメントに分れた
プラスミドを変異ブラスミドとして得た。

このようにしてブラスミドｐｓｍｇ２１−１を得た。

２）　　Ｓｍｇ　　ｐ２１　　ｃＤＮＡの発現ベクター
への導入 ■　ｐＳｍｇ２　１−１．　　１　０／Ｉｇ　（　〜３
ｐｍｏ　ｌ）を、緩衝液Ｈ（１０ｍＭ｝リスー塩酸（ｐ
Ｈ７．５），１００ｍＭ塩化ナトリウム及び６ｍＭ塩化
マグネシウム）１００ＩＪｌ中で、Ｈ　ｉ　ｎｄｌｌＩ
２０ｕ，旦■土ＩＩ２０ｕを用い、３７゜Ｃにて２時間
反応させ、切断した。このものを５％アクリルアミドゲ
ル電気泳勅にかけ、約７００ｂｐのＳｍｇ　　ｐ２１を
コードするＤＮＡ断片を分離、精製した。・・・・フラ
グメントＮ■　発現ベクターであるｐＵＳΔＨ　２μｇ
（〜ｌ　ｐｍｏ　１）を緩衝液Ｈ中にてＨ　ｉ　ｎ　ｄ
　ｇｌ　２ｕ　，１”　２　ｕを用い、２０μｌの系で
３７℃２時間反応させ切断した。このものを、同容の水
飽和フェノールにより抽出して除蛋白し、エーテルにて
フェノールを抽出した後、水に対して透析を行い、脱塩
し、バキュームポンプにより濃縮して、発現ヘククー断
片ＨＢを含む１０μｌの水溶液を得た。

■　フラグメントＮ０．５ｐｍｏｌと発現ベクター断片
ＨＢ０．１ｐｍｏｌとを混合し、１０ｍＭトリスー塩酸
（ｐＨ７．５）　、１ｍＭジチオスレイトール、６ｍＭ
塩化マグネシウム及び１ｍＭＡＴＰからなる緩衝液１０
μβ中にてＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕを加え、４℃で１６
時間反応させた。このものを３μｌ使用し、市販の大腸
菌ＪＭ１０９コンピテントセルを常法に従い、形質転換
した。形質転換体はアンピシリンを２０μｇ　／　ｍ　
１含むし培地（バタトペブトンＬｏｇ／Ｉ！、イースト
エキストラクト５ｇ／ｌ塩化ナトリウムｌＯｇ／Ｉ！、
寒天１５ｇ／ｌ＞にて選択し、特異抗原遺伝子の挿入さ
れている発現ベクターｐｓｍｇ２１−２を得た（第４図
）。

Ｂ　　Ｓｍｇ　　ｐ２１の発現ｐｓｍｇ２１−２を保持している大腸菌ＹＡ２１株をＬ
−ブロスにて、３０℃で一晩培養した。

このものを５０倍希釈となるようにＭ９培地（リン酸水
素２ナトリウム６ｇ／Ｉ！、リン酸２水素カリウム３ｇ
／１、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｉ！及び塩化アンモニ
ウムＩｇ／ｊ！でｐＨ　７．　４に調整後、ＩＭ硫酸マ
グネシウム２ｍｌ、２０％グリセロール１　０ｍｌ及び
ＩＭ塩化カルシウム０．１ｍｌ）に植菌し、２時間、３
０℃で振とう培養した。次に、ＩＰＴＧ（イソプロビル
ーβ一Ｄ−ガラクトピラノシド）を２ｍＭになるように
培地に加え、さらに１６時間３０℃にて振とう培養を行
った後に、６．　５　０　Ｏ　ｒ．ｐ．ｎ＋．で１０分
間の遠心分離により集菌した。このものを０．９％塩化
ナトリウム及び１０ｍＭ｝リスー塩酸（ｐＨ７．５）の
緩衝液に懸濁し、保存した。

Ｃ　　Ｓｍｇ　　ｐ２１の発現の確認上記Ｂで得られた菌体Ｑ，　３　ｍ　ｌ培養分を、１０
％ＳＯＳボリアクリルアミドゲル電気泳動（トリス３ｇ
／１、グリシン１４．４ｇ／ｊ２及び０．１％ＳＤＳか
らなる緩衝液、１２０■、１時間）にかけた後、ゲルを
取り出してクマジ・ブリリアント・ブルー（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）社製）染色を常法により行った。その結果、
ＩＰＴＧによる誘導をかけないで培養した菌体にはみら
れない新しいバンドが分子量約２２，０００の所に検出
され、Ｓｍｇｐ２１である事が予想された。そのバンド
を切り出し、再びそのゲルを同じ緩衝液中で電気泳動さ
せて、蛋白質を緩衝液中へ溶出させた。？容出させた蛋
白質をアミノ酸シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔ′ｅｍｓ社製）によりＮ末端より配列を決
定した所、２０番目までＳｍｇ１）２１と一致した。

また、得られた蛋白質をニトロセルロースフィルター上
で抗Ｓｒｎｇ　　ｐ２１マウスモノクローナル抗体と反
応させ、洗浄後、ヨードラヘルしたプロテインＡで標識
し、結合能を調べたところ、この蛋白質は抗３ｍｇｐ２
１マウスモノクローナル抗体と結合することが分った。

これらの結果から、得られた蛋白質はＳｍｇｐ２１であ
ることが確認された。

実施例３実施例２で得たブラスミドｐｓｍｇ２１−２１０μｇを
ＢａｍＨｒ及び旦エ工■それぞれ１０ユニットで３７℃
、２時間保温し、切断した。

反応物を４％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し
、ゲルから約７００ｂｌ）のＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ、且■
±■断片を切り出し、精製した。これらとは別に、プラ
スミドｐｓｍｇ２１−２　　１０ｐｇをＢａｍＨＩ　　
１０ユニソトで３７℃で２時間保温し、切断後アルカリ
性ホスファターゼ２ユニソトと共に６５゜Ｃで１時間保
温し、末端のリン酸基を除き、その後フェノール抽出し
、エタノール沈殿を行い、精製した。このブラスミド０
．１μｇを、先に精製した約７００ｂｐのＢａｍＨＩ，
Ｂｇｌ■断片とＴ４リガーゼにより結合させた。生成し
た種々のブラスミドの中からＳｍｇ　　ｐ２１の遺伝子
が２個入ったプラスミドｐｓｍｇ２１　　４を得た（第
５図）。

ｐｓｍｇ２１−３及びｐｓｍｇ２１−４でそれぞれ大腸
菌ＹＡ２１株を形質転換して、Ｓ　ｍ　ｇｐ２１を産生
ずる形質転換された大腸菌株を得た．これらの大腸菌株
を、１　０ｍｊ２のＬＢブロス（バタトートリプトン１
０ｇ／β、バクトーイーストエキストラクト５ｇ／ｌ及
び塩化ナトリウム１　０　ｇ／１２　：　ｐ　８７．５
）で３０℃一昼夜培養後、１ｌのＭ９培地に接種し、１
９℃で振とうしながら２時間培養後、２ｍＭとなるよう
ＩＰＴＧを加え１９℃で一昼夜振とう培養をする事で、
可溶性画分に回収されるＳｒｎｇ　　ｐ２１を産生ずる
事ができる。ここでいう可溶画分とは、培養後集菌し、
１０■／ｌのリソザイム濃度でリソザイム処理を行い、
ソニケーター（ブランソン社製）で２分間超音波破砕を
行った菌体をＱ．　１％トリトン×１００、１．５Ｍ塩
化ナトリウムの終濃度の液中にて１５．　０　０　Ｏｒ
．ｐ．ｏＩ．で１０分間遠心を行ったものの上清にくる
分画をいう。この可溶画分を実施例１と同様にして抗Ｓ
ｍｇ　　ｐ２１マウスモノクローナル抗体との結合能を
調べたところ、この抗体と結合する蛋白質が含まれてい
ることが分った。

実施例４Ａ．ベクターの作成１　（ｌｃｒｇのｐｓｍｇ２１をＥｃｏＲＩ　　１０ｊ
−ニソトで消化後、０．７％アガロー不ゲル電気泳動に
より分離し、約２．　５　Ｋ　ｂ　ｐのＤＮＡ断片に相
当する部分のアガロースゲルを切り出し、凍結融解によ
りＤＮＡをゲルから抽出した。

抽出したＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈殿を
繰返し行なって精製した。

このＤ　Ｎ　Ａ　０．　５μｇを、予めＥｃｏＲＩ消化
及びアルカリホスファターゼ処理したｐＫ．ＣＲベクタ
ー（特開昭６１−２８５９９０号公報）０．１μｇとＴ
４ＤＮＡリガーゼ５ユニソトの存在下に１６℃で一昼夜
反応させて、第６図に示す発現ベクターｐＫＣＲ　　Ｓ
ｍｇ２１を得た。

Ｂ．ＣＯＳ細胞でのＳｍｇ２１の発現上記Ａで得たｐＫＣＲ　　Ｓｍｇ２１　　２０＃ｇを、
セミコンフルエントな状態に培養したＣＯＳ細胞（約Ｉ
ＸＩＯｂｃｅ　ｌ　Ｉｓ）が入っているディソシュ（直
径６ｃｍ）に添加し、岡山（Ｏｋａｙａｍａ）らの方法
に従って、リン酸カルシウム法〔モレキュラー　アンド
　セルラー　ハイオロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ａ
ｎｄ　　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ），土ユ
，２７４５−２７５２．１９８７）によりｐＫＣＲ　　
Ｓｍｇ２１をＣＯＳ細胞に導入した。導入後、ＣＯ２雰
囲気下、３７℃で３昼夜培養し、約２Ｘ１０’　ｃｅｌ
ｌｓの細胞を得た。

得られた培養細胞から゛、ＧＴＣ一塩化セシウム法〔「
モレキュラー　クローニン／）’　（Ｍｏ　１　ｅ　ｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第１版」第１８８〜１９
６頁，１９８２年、コールド　スプリングハーバー　ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）によって、総ＲＮＡ
　（約１００μｇ）を得た。

このＲＮＡ２０μｇを使用し、トマス（Ｔ　ｏ　ｍａＳ
）の方法〔メソッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）．１００
，２．５５−２６６．１９８３、アカデミック　プレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　ＰｒｅｓＳ））に従い、ノーザ
ン　ブロッティングを行なった。その際、プローブとし
ては、ｐｓｍｇ２１１μｇを１ユニットのＥｃ　ｏＲ　
Ｉ及び．１ユニソトのＢａｌｎで消化して得られた約６
６０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｓｍｇ２１コーディングプロー
ブ。この断片中にＳｍｇ２１のコーディング領域が全て
含まれている。）を二ソクトランスレーション法によっ
て３２ｐで標識したものを使用した。

比較のために、ｐＫＣＲ　　Ｓｍｇ２１を導入していな
いＣＯＳ細胞を同様に培養し、得られた培養細胞から同
様にして調製した総ＲＮＡを使用して、ノーザンブロソ
ティングを行なった。

その結果、ｐＫＣＲ　　Ｓｍｇ２１を導入したＣＯＳ細
胞から得たＲＮＡには、該ベクターを導入していないＣ
ＯＳ細胞から得たＲＮＡでは検出されない、約２Ｋｂｐ
よりも長いエキストラ領域にＳｍｇ２１コーディングブ
ローブとハイプリダイズするＲＮＡが検出された。

従って、ｐＫＣＲ　　Ｓｍｇ２１からＳｍｇ２１の遺伝
子が発現されたことが確認された。

実施例５アミノ酸を置換したＳｍｇｐ２１遺伝子（Ｇｌ　ｙ　ｌ
　ｔ−Ｖ　ａ　ｌ　ｌ　２　）変異体の作成（１１　　
５　’　−ＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＴＣ，ＧＡＴＣＣＧ
ＴＡＣＧＣＧＴＧＣ；Ｃ；ＧＡＡＧ−３　’の塩基配列
を有するＤＮＡをＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＳ社製）
により作製し、この合成オリゴ・マー５０ｐｍｏｌを１
００ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８．０）　、１　０ｍＭ塩
化マグネシウム、７ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭ
　　ＡＴＰを含む溶液５０μｌに溶解させ、Ｔ４ボリヌ
クレオチドキナーゼ２ユニソトを加え、３７℃で１５分
間保温し、反応させる。その後７０゜ＣでｌＯ分間保温
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させる。

（２１　　ｐｓｍｇ２１で形質転換した大腸菌ＪＭＩＯ
９株を２０ｍｌの２倍濃度のＹＴ培地（バクトトリブト
ン１６ｇ／Ｉｌ、バクト　イースト　エキストラクトＬ
ｏｇ／ｊ！、塩化ナトリウム５ｇ／ｊＬ１００■／１ア
ンピシリン及び０．０１％チアミンの存在下、３７℃で
振とう培養する。

ＯＤ，。。が０６３に達した時に、ヘルパーファージＭ
１３　　ＫＯ７をマルチプリティス　オブインセクシャ
ス（ｍ，ｏ．ｉ，）が２〜１０で感染させる。その後３
０分間培養し、これに、カナマイシンを７０μｇ　／　
ｍ　ｌ！の濃度になるようにして添加した後、ｌＯ〜１
ａ時間３７℃で培養する。培養後、２０００ｒ，ｐ．ｍ
，で１０分間遠心分離をして、菌体を沈殿させ、上溝を
とる。この上清に４ｍｌの２０％ポリエチレングリコー
ル及び２．５Ｍ塩化ナトリウムを加え、４℃で１時間静
置した後、３０００ｒ，ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離を
して、沈殿を回収する。

得られた沈殿を５００μｌの水に溶かした後、１５００
０ｒ，ｐ，ｍ，で５分間遠心分離し、上清をとる。この
上清にフェノールを２００μｌ加え、攪拌後、１５００
０ｒ，ｐ．ｍ，で１０分間遠心し、上層を分取する。こ
の上層に、５０μ２の３Ｍ酢酸ナトリウム及び１２５０
μｌのエタノールを加え、１５０００ｒ．ｐ．ｍで１０
分間遠心分離し、沈殿を回収する。乾燥後５０ｔｔｌ．
の水に溶解し、ｐｓｍｇ２１シングルストランドＤＮＡ
溶液を得る。

（３）　　（１）で得たリン酸化オリゴＤＮＡと（２）
で得たｐＳｍｇ２１シングルストランドＤＮＡを用いて
、オリゴヌクレオチド　ディレクテッド　インビト口　
ミュータジエネシス　システム（０１ｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｉｎ　　ｖｉｔｒ．
ｏ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　ｓｙｓｔｅｍ）（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）で、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のマニュ
アルｐ２８〜３０に従い、Ｓｍｇ　　ｐ２１の１２番目
のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ）がバリン（Ｖａｌ
）でコードされるように変異したＳｍｇ　　ｐ２１変異
遺伝子が作製される。この変異遺伝子を持つプラスミド
（ｐｓｍｇ　　２１　　Ｖａｔ１２）を実施例２に示し
たｐｓｍｇ２１の場合と同様に処理することにより、大
腸菌や動物細胞中で変異Ｓｍｇ　　ｐ２１を発現させる
ことができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＧプロテイン（Ｓｍｇ　　ｐ２１）
のアミノ酸配列の１例を示す図面である。第２図は、実施例ｌにおけるＭｏｎｏ　　Ｑ　　ＨＲ５
／５カラムクロマトグラフィ−（２回目）の溶出パター
ンを示す図面である。第３図は８、実施例１でクローン化したＧプロテインの
ｃＤＮＡの塩基配列を示す図面である。第４図は、実施例２で作成したプラスミドｐＳｍｇ２１
−１及びｐｓｍｇ２１−２の概略図及び作成法の概略を
示す図面である。第５図は、実施例３で作成したブラスミドｐＳｍｇ２１
−３及びｐｓｍｇ２１−４の概略図及び作成法の概略を
示す図面である。第６図は、実施例４で作成した発現ベクターｐＫＣＲ　
　Ｓｍｇ２１の構造の概略を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】（１）ＧＴＰ結合活性及びＧＴＰ加水分解活性を有し、
該ＧＴＰ結合活性がＮ−エチルマレイミドで阻害される
性質を有する下記アミノ酸配列を含み、分子量が約２２
Ｋダルトンであることを特徴とするＧＴＰ結合蛋白質。Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（２
）下記アミノ酸配列で表わされることを特徴とするＧＴ
Ｐ結合蛋白質。【アミノ酸配列があります】（３）請求項２に記載のＧＴＰ結合蛋白質をコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を、発現用ベクターのプロ
モーターの下流に存在するクローニング部位に導入し、
ついで該ＤＮＡ断片を導入した発現ベクタ−を宿主に導
入して同宿主を培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、これ
を取得することを特徴とするＧＴＰ結合蛋白質の産生方
法。