JPH07509609A

JPH07509609A - ラスタンパク質活性を阻害するペプチド，その製造及び利用

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Publication number: JPH07509609A
Application number: JP6505053A
Authority: JP
Inventors: デユシエヌ，　マルク; シユベイグホフアー，　フアビヤン; トク，　ブルノ
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1995-10-26
Also published as: CA2141061A1; US6180362B1; FR2694296A1; EP0652952A1; FR2694296B1; WO1994003597A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ラスタンバク賀活性を阻害するペプチド、その製造及び利用本発明は新規ペプチド及びヌクレオチド配列、ならびにその製薬学的利用に関する。さらに特定すると、本発明はラスタンパク質（ｒａｓ　ｐｒａｔｅｉｎ）の形質転換活性を少なくとも部分的に阻害することができる新規ペプチドに関する。

がん遺伝子及びサプレッサー遺伝子と呼ばれる種々の遺伝子が細胞分裂の制御に関与する。これらの中でラス遺伝子、及び一般にｐ２１タンパク質と呼ばれるその産物は、研究されたすべての真核生物における細胞増殖の制御において重要な役割を果している。特にこれらのタンパク質のある特定の変性はその正常な制御を失わせ、それらを発がん性とすることが示された。かくして多数のヒト腫瘍が変性されたラス遺伝子の存在を伴っていた。さらにこれらのｐ２１タンパク質の過剰発現は細胞増殖における調節不良を生じ得る。か（して細胞におけるこれらのｐ２１タンパク質の正確な役割、それらの機能の仕方、及びこれらの特性の理解は発がんの理解及びそれへの治療的アプローチの主要な部分を成す。

生体内におけるｐ２１タンパク質の活性化及びそれらが担うシグナルの形質導入に対応する事象の正確な性質はまだ未知である。それらは、ＧＤＰに結合した不活性形態及びＧＴＰに結合した活性形態の２つの状態のコンホーメーンヨンの間を変動することによりその機能を果すことが知られている。かくしてこれらのタンパク質の活性はこれらの２つの形態の間の平衡、すなわちｐ２１−ＧＤＰ−４ｐ２１−ＧＴＰの遷移及びその逆を支配する因子により制御される。

ｐ２１−ＧＤＰ複合体の活性化に関し、最近の研究により細胞においてＧＴＰに結合したラスタンパク質の割合が増加する生理学的状況が報告されている。これらはＥＧＦ及びＰＤＧＦなどの成長因子によるＴリンパ球の活性化及び３Ｔ３繊維芽細胞の刺激である。このｐ２１−ｃ’ｒＰの割合の増加は、Ｇ形質導入タンパク質のレセプターと類似した役割を果すタンパク質の作用により少なくとも部分的に説明することができる。これに関し、ｐ２１タンパク質上のＧＤＰの交換を促進することがンパク買が同定された。これらの因子の異なる細胞位置、及びそれらが得られた非常に異なる実験条件はタンパク質が異なることを示唆している。それらは正常なラスタンパク質及び発がん性であるラスタンパク質の両方において活性である。これらの活性はＧＥＦ　ニゲアニドヌクレオチド交換因子（Ｇｕａｎｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ）という名前で分類された。

ｐ２１−ＧＴＰ複合体の不活性化に関し、ｐ２１タンパク質に結合したＧＴＰの加水分解を非常に加速する力を有する細胞質ゾルタンパク質が見いだされた（Ｔｒａｈｅｙ　ａｎｄ　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　（１９８７）５４２）　。ＧＡＰと呼ばれるこのタンパク質は触媒的方法でｐ２１タンパク質と相互作用し、ＧＴＰの加水分解速度を１００〜２００倍にすることが正常なｐ２１タンパク質に関して試験管内で測定された。種々の研究により、このタンパク質の約１０４４アミノ酸の触媒ドメインがカルボキシ−末端領域（残基７０２〜１０４４）において刺激され、この領域がＧＡＰタンパク質とｐ２１タンパク質の相互作用に対応することが示された（ＷＯ９１１０２７４９を参照）。

しかしこのＧＡＰタンパク質の役割はまだ明確に説明されてはいない。

特にｐ２１タンパク質の活性化シグナルを細胞に形質導入させる要素及び因子は未知である。本発明はＧＡＰタンパク質がｐ２１の不活性化を唯一の役割として有し、ＧＴＰの加水分解の結果としてｐ２１をその不活性状態とする単なるレギュレーターではな（、細胞応答の引金を引くｐ２１タンパク質のエフェクターでもあるという、出願人の発見から生まれている。さらに具体的には、本発明はｐ２１タンパク質の活性化シグナルの形質導入に伴うＧＡＰタンパク質の特定の領域（いわゆるエフェクター領域）の同定及び特性化から生まれている。そのような領域の存在の発見及びその特性化により、製薬学的に用いることができる新規ペプチドの製造が可能になる。

か（して本発明は第１に活性化ｐ２１タンパク質の形質転換活性を少なくとも部分的に阻害することができるペプチドに関する。ｐ２１タンパク質という用語は正常な、又は発がん性ラス遺伝子のいずれの発現産物をも示すと理解される。

さらに特定すると、本発明はｐ２１−ＧＴＰ−ＧＡＰ複合体の形質転換活性を少なくとも部分的に阻害することができるペプチドに関する。

さらにｐ２１タンパク質はｓｒｃ、ＨＥＲＩ、ＨＥＲ２などの上流で作用するがん遺伝子の形質転換力の発現に必要であることが知られている。

その結果、本発明のペプチド及びそれらを含むいずれの製薬学的組成物もこれらの活性化遺伝子を有する腫瘍の処置に用いることができる。

本発明のペプチドはＧＡＰタンパク質の誘導体であることが好ましい。

本発明の文脈上誘導体という用語は、遺伝的及び／又は化学的性質の変性によって得られ、必要な阻害能力が保存されているいずれの分子をも示す。遺伝的及び／又は化学的性質の変性は、１つ又はそれ以上の残基のいずれの突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾をも意味すると理解することができる。そのような誘導体は、例えば特にペプチドのその相互作用部位への親和性の向上の目的、その生産量の増加の目的、プロテアーゼへの耐性の向上又は細胞膜の通過の促進の目的、その治療効率の向上又はその二次効果の減少の目的、あるいは新しい薬物動態学的及び／又は生物学的性質をそれに与える目的などの種々の目的で生成することができる。

タンパク質ＧＡＰから誘導されたペプチドとして特に、適宜ＧＴＰと複合化したｐ２１タンパク質に結合することができるが、非機能性とされたエフェクター領域を有するいずれのペプチドも挙げることができる。

そのようなペプチドはタンパク質ＧＡＰ上のこのエフェクター領域の欠失、突然変異又は分裂により得ることができる。

本発明のペプチドは配列番号：２のペプチド又はその誘導体の全体又は一部を含むのがさらに好ましい。

誘導体という用語は上記と同一の意味を有する。

かくして本発明のペプチドは配列番号＝２のペプチド又はそのフラグメントの構造、あるいはそれから誘導された構造（例えば配列番号；２のペプチドを挿入したペプチド）を有することができる。そのようなペプチドは種々の方法で生成することができる。特にそれらは配列番号：２の配列に基づき、熟練者に既知のペプチド合成機を用いて化学的経路により合成することができる。それらは又、必要なペプチドをコードするヌクレオチド配列の細胞宿主における発現により、おそらくその後化学的又は酵素的修飾を行って遺伝的経路で合成することもできる。遺伝的経路による合成の場合、ヌクレオチド配列は、本出願に示すペプチド配列及び遺伝コードに基づき、オリゴヌクレオチド合成機を用Ｌ）て化学的に製造することができる。ヌクレオチド配列は、本出願で開示するヌクレオチド配列から（配列番号・１）、熟練者に既知の方法に従って酵素的切断、連結、クローニングなどにより製造することもできる。これらのペプチドを、細胞においてそれらを正確に位置させるために修飾することもできる。特にペプチドが細胞ファルネシル（ｆａｒｎｅｓｙｌ）トランスフェラーゼによる形質導入の後にペプチドが修飾されて（する力）否かの決定を可能にする、Ｃがシスティンであり、八が脂肪族アミノ酸であり、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＣＡＡＸ型の配列を付加することができる（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｖｏｌ、３　（９）　１９９１゜３３１）。

かくして本発明はタンパク質ＧＡＰから、さらに具体的には、配列番号・２の配列から誘導され、製薬学的利用に関して生物学的に興味のある性質を有するペプチドの生成を可能にする。本発明のこれらの種々のペプチドの生物学的活性は、実施例に記載の種々の試験に従って、特１こ卵母細胞の突然変異に関する試験により評価することができる。

本発明の他のペプチドは、上記で定義したペプチドとそれらの細胞標的との相互作用に関して競争することができるペプチドである。そのようなペプチドは特に問題のペプチドの配列に基づいて合成すること力（でき、上記で定義したペプチドとその細胞標的との相互作用に関して競争することができるその能力は実施例に記載の要領で測定することができる。

挙げることができる本発明のペプチドの例は以下のアミノ酸配列を有するペプチドであるニー配列番号：２の配列を有するペプチド、−ペプチＦＰＶＥＤＲＲＲＶＲＡＩ　（配列番号；２の配列上の位置５−１５）、一ペプチドＥＩＳＦ（配列番号：２の配列上の位置２６−２９）、−ペプチドＥＤＧＷＭ（配列番号：２の配列上の位置４２−４６）、−非機能性とされたエフェクター領域を有するタンパク質ＧＡＰ、一実施例２に記載のポリペプチドＰ４ −Ｐ９　（配列番号：３〜８）、−上記のペプチドと競争するペプチド。

本発明は製薬学的に用いることができる非ペプチド化合物、又はペプチド化合物のみに限定されない化合物も提供する。実際にタンパク質ＧＡＰに依存するシグナル経路を阻害し、ペプチド分子のみに限定されず、製薬学的利用に関して同等である分子を本出願により開示される活性タンパク貫パターンから実現することができる。

本発明は又、本発明のペプチドをコードするいずれのヌクレオチド配列にも関する。特にそれは配列番号：１の配列又はそれから誘導された配列の全体又は一部を含む配列であることができる。本発明の範囲内で、誘導された配列は配列番号＝１の配列又はそのフラグメントとハイブリッド形成し、本発明のペプチドをコードする配列、ならびに遺伝コードの縮重により後者から生じた配列と理解される。配列番号：１の配列とハイブリッド形成する本発明の配列の例は配列番号；３の配列上に示す。

本発明の配列は本発明のペプチドの生産に用いることができる。この場合、該ペプチドをコードする部分は一般に、細胞宿主においてそれを発現させるシグナルの制御下に置かれる。これらのシグナル（プロモーター、ターミネータ−１分泌のための“リーダー“配列など）の選択は、用いられる細胞宿主に従って変えることができる。さらに本発明のヌクレオチド配列はベクターの一部を形成することができ、ベクターは自律復製性又は組込み複製性であることができる。さらに具体的には、自律複製性のベクターは選ばれた宿主における自律複製の配列を用いて製造することができる。組込みベクターに関し、これらは例えば宿主ゲノムのある領域と相同の配列を用いるこにより製造することができ、相同的組み換えによるベクターの組込みを可能にする。組み換え経路による本発明のペプチドの生産に用いることができる細胞宿主は真核宿主又は原核宿主である。適した真核宿主の中に動物細胞、酵母又は菌を挙げることができる。特に挙げることができる酵母はサツカロミセス（Ｓ　ａ　ｃ　ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、タルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ　ｃ　ｅ　ｓ）又はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母である。

挙げることができる動物細胞は細胞ＣＯ３，ＣＨＯ１Ｃ１２７などである。菌の中でさらに特定するとアスペルギルス　サブスピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｓｐ、）又はトリコデルマ　サブスピーシーズ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｓｐ、）を挙げることができる。原核宿主として以下のバクテリア−イー　コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）又はストレプトミセス（Ｓ　ｔ　ｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅＳ）−を用いるのが好ましい。

本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子療法又はハイブリッド形成実験による生物試料中のＧＡＰ遺伝子の発現の検出に関する製薬学的分野において、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造のために用いることができる。遺伝子療法に関し、本発明の配列をレトロウィルスベクター又はアデノウィルスベクターなどのベクター中に挿入し、それを生体内に投与できるようにすることができる（Ｍ６ｄｉｃｉｎｅ　ｅｔＳｃｉｅｎｃｅｓ　７　（１９９１）７０５）。

本発明の種々のヌクレオチド配列は人工起源のものであり得るか、あるいはそうであり得ない。それらはゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド配列あるいは合成又は半合成配列であることができる。これらの配列はＤＮＡバンク（ｃＤＮＡバンク、ゲノムＤＮＡバンク）のスクリーニングにより、又は化学合成により、あるいはバンクのスクリーニングによって得た配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合法により得ることができる。

本発明の生成物は治療的分野で用いることができ、特に本発明のペプチドはラスタンパク質の活性を調節することができるのでがんの発生の過程に介在でき、特にそれらは形質転換活性が機能性ｐ２１−ＧＡＰ相互作用により進行するがん遺伝子の活性を阻害することができる。実際に数種のがんが発がん性ラスタンパク質の存在を伴っていた。突然変異ラス遺伝子を最も多くの場合に含むがんの中に、その９０％が第２０コドン上で突然変異したＫｉ−ラスがん遺伝子を有する膵臓の腺がん（ＡＩｍｏｇｕｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１　５３（１９８８）５４９）、大腸の腺がん及び甲状腺のかん（５０％）、あるいは肺のかん及び骨髄性白血病（３０％、Ｂｏｓ、Ｊ、Ｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４９（１９８９）４６８２）を挙げることができる。

かくして本発明は、本発明の少なくとも１種のペプチド及び／又は少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は少なくとも１種の核酸配列を活性成分として含む製薬学的組成物に関する。本発明の製薬学的組成物は局所的、経口的、非経口的、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内などの投与のために調製することができる。製薬学的組成物は、製薬学的に注射用調剤に許容し得るビヒクルを含むのが好ましい。特にそれらは塩類溶液（リン酸−ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウムなど、ならびにそれらの塩の混合物）、無菌又は等張液、あるいは必要な場合に無菌水又は生理学的血清（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｅｒｕｍ）を加えることにより注射用溶液とすることができる乾燥組成物、特に凍結乾燥物であることができる。投与に用いられる活性成分（ペプチド、核酸配列又はベクター）の投薬量は種々のパラメーターの関数として、特に用いられる投与様式、問題の病理学、発現されるべき遺伝子、又他の場合は所望の処置の持続時間の関数として適応させることができる。一般に本発明の組み換えウィルスに関し、これらは１０４〜１０Ｉ４ｐ　ｆ　ｕ／ｍ１、好ましくは１０６〜１０　”ｐ　ｆ　ｕ／ｍ　Ｉの投薬量の形態で調製され、投与される。ｐｆｕ　（”プラーク形成単位”）という用語はウィルスの溶液の感染力に対応し、適した培養細胞に感染させ、一般に４８時間後に感染細胞プラークの数を測定することにより決定される。ウィルス溶液のｐｆｕ量の決定法は文献に十分に示されている。

特に製薬学的組成物はがんの処置において用いることを目的とする。

さらに特定すると製薬学的組成物は少なくとも１種の上記のヌクレオチド配列が挿入された少なくとも１種のウィルスを含む。本発明の他の利点は下記の実施例を読んで明らかになるであろう。実施例は例示であり、制限ではないと考えるべきである。

図の説明図１：タンパク質ＧＡＰのエフェクター領域の明示。

図２：抗体Ａｃ２００を用い、逐次重複によりスクリーニングした配列番号・２のペプチドの抗原プロファイル。

図３：ｐ２１　Ｒａｓ　Ｌｙｓ１２、インスリン又はプロゲステロンにより誘導したキセノブス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵の成熟への本発明のペプチドの効果。

一般的クローニング法プラスミドＤＮＡの調製的抽出（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、塩化セシウムの勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースゲル又はアクリルアミドゲル上の電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノール又はフェノール／クロロホルムを用いたタンパク質の抽出、エタノール又はイソプロパツールを用いた生理食塩媒体中でのＤＮＡの沈澱、エシェリキア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などにおける形質転換などの分子生物学において従来用いられてきた方法は熟練者に周知であり、文献に豊富に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａじ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、、１９８２：Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、（ｅｄｉｔｏｒｓ）、”Ｃｏｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７］。

制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ）又はＡｍｅｒｓｈａｍにより供給され、供給者の勧告に従って用いる。

ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ，Ｉｇｔｌｌ、ｐＧＥＸ　２Ｔの型のプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市販起源のものである。

連結の場合、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル又はアクリルアミドゲル中の電気泳動によりそのサイズにより分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、エタノールを用いて沈澱させ、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（１３ｉｏ１ａｂｓ）の存在下で供給者の勧告に従ってインキュベートする。

前置（ｐ　ｒｏｅｍｉ　ｎｅｎ　ｔ）５°末端のフィリングイン（ｆ　ｉ　Ｉ　ｌｉｎｇ−ｉｎ）はＥ、コリのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）により、供給者の仕様書に従って行う。前置３゜末端の破壊はファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、それを製造者の勧告に従って用いて行う。前置５°末端の破壊はヌクレアーゼＳ１を用いて制御された処理により行う。

合成オリゴデオキシヌクレオチドにより試験管内で行う突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、により開発された方法に従い［ＮｕｃＩｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３（１９８５）８７４９−８７６４１、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されているキットを用いて行う。

いわゆるＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、５ａｉｋｉ　Ｒ，に、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ、Ｂ、ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ　Ｆ、Ａ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

１旦５　（１９８７）３３５−３５０１によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、“ＤＮＡ熱サイクラ−（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）”　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の仕様書に従って行う。

ヌクレオチド配列の確認はＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、［Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Δｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されているキットを用いて行う。

ハイブリッド形成実験の場合、通常の緊縮の条件は一般に以下の通りである：ハイブリッド形成二６５℃で５Ｘデンハート溶液の存在下における３ｘＳＣＣ；洗浄：６５℃における０、５ｘＳＳＣ。

実施例１：エフェクター領域の明示抗−ＧＡＰ抗体はラスの形質転換活性を阻害することができるが（Ｅ。

１．１．）、これらの同抗体がＧＡＰ−ラスの相互作用を改変しない（Ｅ、１．　２．　）ことを示すことによりタンパク質ＧＡＰ内のエフェクター領域の存在を明示した。

Ｅ、１．　１．抗−ＧＡＰ抗体によるラス機能の阻害タンパク質ＧＡＰに対するネズミモノクローナル抗体はＭ、Ｔｈａｎｇ（Ｉｎｓｅｒｍ　Ｕ２４５．ＨＱｐｉｔａｌ　ＳＬ、Ａｎｔｏｔｎｅ。

Ｐａｒｉｓ）から得た。これらの抗体を用いてＧＡＰ−ｐ２１相互作用の役割を示し、さらに正確に言うとラスにより誘導されるキセノブス卵の成熟へのその相互作用の阻害の影響を示した。

アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ　ｆｒｏｇ）はＣＮＲ３（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。カエルを氷−水中で麻酔し、卵巣のフラグメントを外科手術により取り出し、修正パース培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂａｒｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ）に移す（Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ、　ｌ３ｉｏ１．　ｌ（則（１９８４）２１４）。卵母細胞集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を２ｒｎｇ／ｍ＋のコラ−ゲナーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の存在下において周囲温度で２時間撹拌して第Ｖ１期の卵母細胞を回収する。ラスにより誘導される成熟の分析の場合、修正パース培地中の４０ｎｌのタンパク質を微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔ　１ｏｎ）により卵母細胞の細胞質中に単独で、又は種々のａ度の抗−ＧへＰ抗体の存在下で導入する。ホルモンにより誘導される成熟の分析の場合、卵母細胞をインスリン（１ｏｎｇ／ｍｌ）と塩化亜鉛（１ｏｎＭ）（ウシ膵臓インスリン、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　、又はプロゲステロン（１μＭ）の存在下でインキュベートする。卵母細胞を修正パース培地中で２０℃ に保ち、１８時間のインキュベーションの後にあらかじめ５％の三塩化酢酸の存在下で固定した卵母細胞を切開することにより１％卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を決定する。結果を卵母細胞の群についての％ＧＶＢＤにより表す。

得られた結果は、ある種の抗−ＧＡＰ抗体がラスタンバク買の形質転換活性を阻害できることを示している。続いて抗体Ａｃ２００を研究に用いた。

Ｅ、１．２．ＧＡＰ−ｐ２１相互作用へのＡｃ２００抗体の効果の不在ＧＡＰと複合体ｐ２１−ＧＴＰの間の相互作用を、以下の案に従って決定する。

正常なタンパク質Ｈａ−ｒａｓ　ｐ２１　（Ｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、旦（１９８９）３９０４）をＴｒｉｓ−ＩＣ１２０ｍＭ（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　（ＮＨ４）霊ＳＯ４、ｌＱｍＭ　ジチオトレイトール、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ及び５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの緩衝液中で過剰の（γ−３１Ｐ）ＧＴＰ　（３０００Ｃｉ／ミリモル、Ｄｕｐｏｎｔ、ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ、）と３０℃ において３０分間平衡化する。冷却した溶液をＴｒ　１ｄ−ＨＣｌ　２０ｍＭ（ｐＨ７，５）、ｌＱｍＭ　ジチオトレイトール、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ及び１ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリドの緩衝液により平衡化したＰＤＩＯカラム（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）に適用し、遊離のヌクレオチドを除去することによりインキュベーションを停止する。ＧＴＰアーゼ反応はＣａ５ｓｅｌ　ａｎｄ　Ｓｅｌｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　４５２（１９７６）５３８）に記載の反応の変法である。ＧＡＰを発現するＥ、コリの株の音波処理により得た１０μｌ　（１５μｇ）の細胞質ゾル（ＧＡＰの生産に関する下記実施例Ｅ、２．　１．を参照）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　２０ｍＭ（ｐＨ７，５）、ＮａＣｌ　１００ｍＭ。

ジチオトレイトール　１０ｍＭ５ＭｇＣ１ｓ　５ｍＭ、ＧＴＰ　１００ｍＭ及びＢＳＡ　５０μｇ／ｍｌの緩衝液中の１ピコモルのＨａ−ｒａｓｐ２１−　（ｒ ”ｐ）ＧＴＰに加えて最終体積を５０μｍとすることにより反応を開始する。反応は３０℃で３分間行い、氷上で５％（ｗ／Ｖ）の活性炭を含む２０ｍＭのリン酸（ｐＨ２，３）を９５０ｕ　１加えることにより停止する。１８００ｇにおける遠心の後、２００μｌの上澄み液の試料において放射性を測定する。結果を下記に示す。

Ａｃ２００　１００［２７５−３５１］　ＧＡＰ　１００ ΔｃＹ１３−２５９５結果は、Ａｃ２００抗体がＧＡＰ−ｐ２１相互作用を改変しないことを示している。ＧＡＰのフラグメント２７３−３５１　（配列番号：１）を用いて同様に行った試験もこのポリペプチドがＧＡＰ−ｐ２１の機能的相互作用を改変しないことを示している。

実施例２：エフェクター領域の特性化Ｅ、２．　１．　ＧＡＰのフラグメント化による約８０ａａの領域の決定、ＧＳＴ融合体の形態のこれらのＧＡＰフラグメントの生産、及び抗体Ａｃ２００の中和に向かう反応性タンパク質ＧＡＰをコードするＤＮＡ配列を酵素的消化によりフラグメント化し、得られたフラグメントを電気溶出により分離してＢａｍＨｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントの形態とした。続いてこれらのフラグメントをＳｍｉ　ｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ　（Ｇｅｎｅ　６’乙（１９８８）３１）により記載された方法に従い、Ｅ、コリ株ＴＧＩにおいてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）との融合タンノぐり質の形態で発現した。このために、得られたＤＮＡの種々のフラグメントをベクターｐＧＥＸ　２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に３′において、及びＣＲＴをコードするｃＤＮＡの相（ｐｈａｓｅ）で挿入した。かくして得られたベクターを続いてＥ、コリ株ＴＧ１の形質転換に用いる。かくして形質転換された細胞を３７℃で１夜予備培養し、ＬＢ培地中で１／１０に希釈し、ＩＰＴＧを加えて発現を誘導しく２時間、２５℃）、続いて細胞を約２５℃で２１時間培養する。続いて細胞を溶解し、生産された融合タンパク質をアガロース−ＧＳＨのカラムへの親和性により精製する。このためにバクテリアの溶解物をゲル（溶菌緩衝液で調製し、そして平衡化した）の存在下において４℃で１５分間インキュベートする。Ｔｒ　ｉ　５−Ｈｅ　ｌ　ｐＨ７，４の緩衝液を用いて３回洗浄した後、過剰のＧＳＨを含むＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７の緩衝液の存在下でタンパク質を溶出させる。上澄み液を集め、遠心する。

かくして得られたフラグメントをＡｃ２００抗体によるそれらの認識に関して調べる。得られた結果を図１に示す。結果は、タンパク質ＧＡＰのエフェクター領域が大体残基２７５及び３５０の間に位置することを示している。

Ｅ、２．　２．　”エピトープ走査”　（ｅｐｉｔｏｐｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ）によるさらに厳密な同定 “エピトープ走査”の方法は、ある与えられた抗体は５〜１５アミノ酸のペプチドと反応することができるという原理に基づいている。その結果、考慮下にある抗原の完全配列に対応する、５〜１５アミノ酸の重複するペプチドの完全な１組を調製することにより、連続したエピトープの同定を達成することができる。この方法を用い、上記実施例Ｅ、２゜１、に示されたＧＡＰフラグメントの機能性エピトープを決定した。このために、各２アミノ酸のためのデカペプチドの合成による逐次重複によりフラグメント全体を探索した。

ａ）重複ペプチドの合成配列番号：１の配列全体にわたる３５ペプチドを化学的に合成した。

合成は固相上のＦｍｏｃ／ｌ−ブチルの方法により（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのキット）、２つの独立した支持体上で二重に行った。

ｂ）機能性エピトープの明示Ａｃ２００抗体により認識される機能性エピトープを、パーオキシダーゼにカップリングさせた抗−ネズミウサギ抗体によりＥＬＩＳＡ試験において明らかにした。用いた酵素の発色性基質はアミノ−ジー（３−エチルベンゾチアジンンスルホネー１−）（ＡＢＴＳ）である。

得られた結果を図２に示す。この抗体により認識されるエピトープは以下の通りである。

−ＰＶＥＤＲＲＲＶＲＡ　Ｉ　（Ｐｌ）−ＥＩＳＦ　（Ｐ２） −ＥＤＧＷＭ　（Ｐ３）配列番号：１の配列の他の機能性領域は池の抗−ＧＡＰ抗体を用いて明示することができると思われる。

これらの結果に基づき、及び化学合成の同一の方法を用い、以下のペプチドを合成した。

−ＡＰＰＥＰＶＥＤＲＲＲＶＲＡＩ　ＬＰＹＴＫＶＰＤＴＤＥＩＳＦＬＫＧＤ　（Ｐ４） −ＷＭＷＶＴＮＬＲＴＤ　（Ｐ５） −Ｉ　ＳＦＬＫＧＤＭＦ　ＩＶＨＮＥＬＥＤＧＷＭＷＶＴＮＬＲＴＤ（Ｐ６） −ＶＴＮＬＲＴＤＥＱＧＬ　ＩＶＥＤＬＶＥＥ・ＶＧＲＥＥＤＰＨＥＧＫｌ　（Ｐ　７） −ＰＩ”Ｅｒ’ＶＥＤＲＲＲＶＲＡ　Ｉ　Ｌｒ’ＹＴＫＶｒ’ＤＴＤＥ　Ｉ　ＳＦＬＫＧＤＭＦ　Ｉ　ＶＨＮＥＬＥＤＧＷＭＷＶＴＮＬＲＴＤ（Ｐ８）一配列番号＝３のペプチド　（Ｐ９）実施例３：生物学的特性化Ｅ、３．　１．本発明のペプチドの生物学的活性を、ｐ２１　ｒａＳＬｙｓ１２により、インスリンにより、又はプロゲステロンにより誘導されたキセノブス卵の成熟へのその効果を測定することにより研究した。

用いたプロトコールは上記実施例Ｅ、１．　１．に記載のプロトコールと同様である。修正パース培地中の４００１のラスｐ２１タンパク質を単独で、又は濃度を変化させた本発明の種々のペプチドの存在下で卵母細胞の細胞質中に微量注入することにより活性を測定した。結果は卵母細胞の群全体に関するＧＶＢＤの％により表す。結果を図３に示す。

これらの結果は本発明のペプチド、特に配列番号＝１のペプチド及びペプチド（Ｐ５）がラスタンパク質の形質転換活性を阻害することができることを明白に示している。γ型ヒトホスホリパーゼＣから同一の方法で調製した同一の長さのフラグメント（［７６８−８６０］　ＰＬＣγ）は本発明のペプチドの活性を有していない。

Ｅ、３２　ペプチドＰ９を実施例Ｅ、２．　１．　に記載のプロトコールに従ってＧＳＴとの融合タンパク質の形態で精製し、続いてそれをトロンビンを用いたタンパク質分解による開裂の後にＧＳＴから分離した。

かくして得たペプチドＰ９を、続いて実施例Ｅ、３．　１．の条件下でキセノブス卵の成熟に関して調べた。得られた結果はＰ９ペプチドが卵細胞（ｏｖｏｃｙｔｅｓ）の成熟を完全に阻害することを示している。

続いてＰ９の活性を、形質転換細胞の病巣（ｆｏｃｉ）の形成に関する試験において評価した。実際にがん細胞は形質転換病巣、特に発がん性ラスを発現する繊維芽細胞Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３を形成する性質を有する。

細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地）において、５％の００２を含む加湿環境における３７ ℃で培養した。ＧＡＰ及びＰ９（配列番号：３）をコードするヌクレオチド配列をベクターＳＶ２中に挿入することによりプラスミドｐＳＶ２−ＧＡＰ及びｐＳＶ２−Ｐ９を構築した。細胞Ｎ１１１　３７３を、発がん性ラスであるＨａ−ｒａｓ　Ｖａｌ１２、表に示すプラスミド、及びネオマイシンに対する耐性を有する１０倍過剰の遺伝子と、カチオン性脂質を用いたトランスフェクションの方法により（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５６　（１９９２）８２５）コトランスフエクトした。容器に関し、同一の量の合計ＤＮＡをトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、各ベトリ皿（１００ｍｍ）を起源とするトランスフェクト細胞を１＝１０の比率に分け、同培地中だが培地１ｍｌ当たり０．４ｍｇの量のＧ４１８　（Ｇｊｂｃｏ／ＢＲＬ）の存在下で培養する。１４日間培養した後にトランスフェクトＤＮＡ１μｇ当たりに得られた形質転換病巣の数を適合化させる（ｃｏｍｐａｔ　ｉｂｉ　Ｉ　１ｚｅｄ）。得られた結果を下表に示す。結果は４回の独立した試験の平均を示す。

これらの結果は、本発明のペプチド（特にペプチドＰ９）が発がん性ラス遺伝子の形質転換力を非常に減少させることができることを明白に示している。

Ｅ、３．　３．生体内抗腫瘍活性ａ）本発明の核酸配列を含む組み換えウィルスの製造欠陥ウィルス、及び中でも上記で定義した核酸配列を有するプラスミドの間の相同組み換えにより、本発明の欠陥組み換えウィルスを製造することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　１０１（１９９１）１９５：Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯＪ、３　（１２）（１９８４）２９１７）。相同組み換えは、適した細胞系における該ウィルス及びプラスミドのコトランスフエクションの後に起こる。用いられる細胞系は（ｉ）該要素により形質転換可能であり、（ｉ　ｉ）ゲノムの欠陥ウィルスの部分を補足することができる配列を好ましくは組み換えの危険を避けるために組込み形態で含むのが好ましい。欠陥組み換えアデノウィルスの製造に用いることができる系として上げることができる例はヒト胚腎臓系２９３　（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ。

３６　（１９７７）５９）であり、これは特にアデノウィルスＡｄ５　（１２％）のゲノムの左半分をそのゲノム中に組込んで含む。欠陥組み換えレトロウィルスの製造に用いることができる系の例として上げることができるのは系ＣＲＩＰである（Ｄａｎｏｓ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

ＰＮＡＳ　８５　（１９８８）６４６０）。

続いて増殖したウィルスを分子生物学の従来の方法に従って回収し、精製する。

ペプチドＰ９をコードする配列番号：３の配列をＳＶ４０の初期プロモーターの制御下でネオ−プラスミド（ｎｅｏ−ｐｌａｓｍｉｄ）にクローニングした。続いてカセットプロモーター５Ｖ４０−配列番号：３をＭｏｆｏｎｅｙ型（Ｐａｌｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ　８４　（１９８７）１０５５）のレトロウィルスベクターにクローニングした。フラグメントがアンチセンス配向で挿入された対照ベクターも構築した。

両種性（ａｍｐｈｏ　ｔ　ｒｏｐｈ　ｉ　ｃ）細胞Ｇｐ＋ｅｎｖＡｍ１２をリン酸カルシウムを用いた方法により上記のレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトした（ＭａｒｋｏｗｉＬｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６７（１９８８）４００＋Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　（１９７３）４５６）。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８　（Ｇｉｂｃｏ。

ＢＲＬ）を０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む培地において継代培養する。

２週間後、Ｇ・１１８に耐性のコロニーを大量に培養する。多量のウィルスを有するトランスフェクト細胞をエコトロピックＰｓｉ２パッケージング細胞と共培養し、ウィルスの員を増加させる（Ｐａｌｍｅｒ　ｅｔａｌ、、ＰＮＡＳ　８４　（１９８７）１０５５）。

かくして生産された組み換えウィルスを分子生物学の従来の方法により単離する。

ｂ）生体内抗腫瘍活性マウスにおける肺腫瘍のモデルをＭｃＬｅｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ。

（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７　（１９８７）５１３２）により記載されている方法に従って発現させた。このためにマウスに１０５細胞のＨ４６０ａを気管内に与える。４．５及び６日に、腫瘍を与えられたマウスを同様の気管内経路で５ μｇ／ｍｌのプロタミンを含む０．１ｍｌの上記で得たウィルス懸濁液（約５・１０’ｃｐｕ／ｍ＋）で処置する。腫瘍の接種後３０日に、マウスを腫瘍の存在に関して分析し、腫瘍の体積をＭｃＬｅｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、により記載されている上記の方法に従っておおまかに決定した。ウィルスＰ９で処置した動物は測定可能な腫瘍を持たないか、あるいは非常に小さい腫瘍を持つのみである。逆に同ウィルス量のアンチセンスウィルスＰ９で処置した動物は腫瘍のみを与えられた対照動物と区別できない。

これらの結果は本発明の配列を、特にウィルスベクターの形態でがんの処置のために生体内で用いることができることを明白に示している。

熟練者は生体内における本発明のペプチドの転移（ｔ　ｒａｎｓ　ｆ　ｅ　ｒ）のために他のウィルスを用いることができると理解される。特にこれらはアデノウィルス、アデノ伴生ウィルス、ヘルペスウィルスなどであることができる。これらのウィルスから誘導されるベクターは先行技術において記載されており、本発明のウィルスの構築は熟練者が彼の一般的知識に基づいて行うことができる（特にＡｋｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３　（１９９３）２２４；５ｔｒａｔｆ。

ｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｕｍａｎ　ＧｅｎｅＴｈｅｒａｌ）Ｙ　１（１９９０）２４１：ＥＰ　１８５　５７３、Ｌｅｖｒｅｒｏ　ｅｔ　ａｔ．．Ｇｅｎｅ　１０１　（１９９１）１９５；ＷＯ　９１／１８０８：ＥＰ　２４３２０４を参照）。

配列表配列番号：１配列の長さ＝２３４配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トボロジー二直鎖状配列の種類：他の核酸　ｃＤＮΔ ハイポセチカル配列＝Ｎｏアンチセンス二Ｎ○ フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ホモサピエンス配列の特徴特徴を表す記号：　ＣＤＳ存在位Ｗ：　１．．２３４配列の特徴他の情報：遺伝子ＧＡＰのフラグメント２７３−３５１配列配列番号＝２配列の長さ：７８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号＝３配列の長さ：１５４８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸　ｃ　ＤＮＡハイポセチカル配列：Ｎｏアンチセンス・Ｎｏフラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ホモサピエンス配列の特徴？徴を表す記号・ＣＤＳ存在位置：１．．１５４８配列の特徴池の憤報：遺伝子ＧΔＰのフラグメント３８５−１９３３配列丁＋ＴＦＴＴん一一ズシシ一Ｊ講＾＾テＴ−シｉ”τ＾ロＣε＾ｃｎｃＱＮ｝コ一ズシば−ａｚク二Ｔ＾ロ＾＾Ｇ＾▼＾ε＾＾ＣＣ寡Ｃ１λbＣｊｊＣＴ＾Ｔ▼ ６Ｔ＾ＯＣＴＴ＾ローシ一一講心Ｔ＾ｃＣλＬＬＫＣＣＫＬＬＹＦＶＡＰＰＣＩ！Ｖ（’＠−１１１鰐　Ｖｌ１’＆１Ｘｆｆ　▼　Ｔ’ｆｆｆｆｆｆＣ人１１ＪｅτＣＡ▼Ｃ＆＾＾τＡＡＣＴＴＴＣＴＴＡＪｊＪＧＣλｅａｙａｖｃｔｔｃｉｔｙｅＴＴｅ＾ＴＡλｒｃａ＾ｒｔ＾ｅ＾＾ｅＡ■bｔ＆ＩＧＣλ丁ｃｔｏｘｔＴａｉ＾＾＾Ｔｒ▼ＡＩＬｌｊＪＪＩＪｅＡＴｅＡＪＪ：編；ゴａｉｙｅｙｔω ユ一（心ｄばｉ■■■一一蟲蟲一心τｃａｉ−ｕｖ品コＴ品一以ｍ一顛藁ａ一＾ ▲ｉ人ＴＴｅ▲コＣ；人ｎＴン入入＾ＩＡＴＣ▼ＣｃノＪ１フ＝ｃｃメー（〜ｃＡノ，ＴＣＪＪ：ＴＴＴＡｔ（＋ＡＴｉ：ｅｅｊａｃ；スR；εＴＡＴＴＩＴ＾＾ｃ＾Ｃｅ＾Ｔ丁ｃｃｃｃ＾Ｃ＾τＣＡ丁ＡＣＡｔＣｊＪ：ＴＡＴＣＣＡλりＯｉｒＫＩＣＰＴＰ１１ＮＯＦＭｌｊＣＣｌｌ▼▼Ｎ＄ＩＣＯＩｌロＨＹＲＫＡＡＣ＾入こＡＣＡτＴＣＴＴＣ入ＡクニＡＴＡ’ｒｌＡＩＣ丁１λ一Ｊ．ＣＡノば＝；ｔｃｉＡｃｚ一（へｔｃｃノＪレ一〜ＴｃＡ−シー鼈黶|＾＾ｃｖａＣＴｃｉＴＣＡＬノば−九ｃＴ６《一（ｔｃｃ；一一一＝６ａａａｔｃＴｋｒｍ（ＯＩ　ＹＵＩ＋ＴＹＬＫ（ＰＶＰｌｊＯＤＯ（（ＩＶＬＮロ丁ｖＯｃＫ（ＩＹＮ配列番号：４配列の長さ：３３配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセチカル配列：ＮＯフラグメント型　中間部フラグメント起源クローン名・Ｐ４配列 λｌａ　Ｐ：ｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉ’ｒｏ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒ９　人ｒ９　＾ｒｇ　Ｖａｌ　人【９　へユａ　１１ｓ　Ｌｓ■ Ｓ　１０　ｌ５ＰｒｏＴｙｒＴｈｒＬＹ＊ＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｈｒＡ３ｐＧｌｕＸｌｅＳｅｒＰｈ＠ＬｅｕＬｙｓＧユｙ配列番号・５配列の長さ・１０配列の型・アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセチカル配列：ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント起源クローン名・Ｐ５配列配列番号＝６配列の長さ：２８配列の型・アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイボセチカル配列＝ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント起源クローン名：Ｐ６配列Ｌｉｅ　６ｅｒ　Ｐｈｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ｍｔ　Ｐｈｅ　１１ｅ　Ｖａｎ　Ｉｕｓ　Ａｓｎ　にｌｕ　Ｘａｕ　０１％１．５１０Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｍａｔ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ｌｊ！ｕ　八ｘｑ　Ｔｈｒ　八ｓｐｏ２５配列番号＝７配列の長さ、３１配列の型二アミノ酸トポロジー・直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセチカル配列二ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント起源クローン名：Ｐ７配列Ｖａｌ　Ｔｈｒ　入ｓｎ　Ｌ＜ｕ　ｋｘｇ　丁ｈ；　人ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｃｕ　エユｅＶａユ　ＧユＵ　Ａｓｐ　Ｌ＜ｕｓ　ｔｏ　ｔｓ配列番号二８配列の長さ：５３配列の型二アミノ酸トボロノー：直鎖状配列の種類・ペプチドハイポセチカル配列・ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント起源クローン名　Ｐ８配列ＰｒＯＰｒｏ　Ｇｌｕ　ｐｒｏ　ｖａＬｌ　（Ｊｕ　Ａｓｐ　ｒ　ＡｒｑｋｒＱ　ｖａｌ　Ａｒ９　ｕａ工１ｅ　ｖｕ　Ｐｒ。

Ｓ　１０　ＩｓＴ！／ｒ７ｈｘ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　碑τｈｒ　轡ＩＪｕ　ＨｅＩＩ、ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ１Ｅ１２　２７５〔〕込Ｆｉｇｕｒｅ　１４０５ｎｍにおけるｍＤ。

インスリンＩ　Ｍ　Ｉ　Ｍ　Ｈａ−ＲａｍＬｙ虐１２プロゲステロンＦｉｇｕｒｅ　３補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成７年１月２６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．タンパク質ＧＡＰから誘導され、活性化ｐ２１タンパク質の形質転換活性を少なくとも部分的に阻害することができるペプチド。
２．ｐ２１−ＧＴＰ−ＧＡＰ複合体の形質転換活性を少なくとも部分的に阻害することができる請求の範囲第１項に記載のペプチド。
３．適宜ＧＴＰと複合化したｐ２１タンパク質に結合することができ、非機能性とされたエフェクター領域を有することを特徴とする請求の範囲第２項に記載のペプチド。
４．配列番号：２の配列又はその誘導体の全体又は一部を含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のペプチド。
５．ペプチドＰ１〜Ｐ９から選ばれることを特徴とする請求の範囲第４項に記載のペプチド。
６．Ｃがシステインであり、Ａが脂肪族アミノ酸であり、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＣＡＡＸの型の向膜性（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）配列により修飾されている請求の範囲第１〜５項のいずれか１つに記載のペプチド。
７．請求の範囲第２〜６項のいずれか１つに記載のペプチドと、その細胞標的との相互作用に関して競争することができるペプチド。
８．ペプチド化合物でないか、又はペプチド化合物のみに限定されない化合物であり、そしてｐ２１タンパク質の形質転換活性を変性することができ、ペプチド構造ではないか、又はペプチド構造のみに限定されない構造により請求の範囲第１〜７項に記載のペプチドの活性パターンを再現することにより得られる化合物。
９．請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列。
１０．生体内におけるその発現を可能にするウィルスペクター中に導入された請求の範囲第９項に記載の配列。
１１．請求の範囲第９項に記載の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２．請求の範囲第９項に記載のヌクレオチド配列を宿種細胞中に導入し、この細胞を咳配列の発現の条件下で培養し、生産されたペプチドを回収することを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載のペプチドの製造法。
１３．少なくとも１種の請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載のペプチド、又は請求の範囲第９項に記載のヌクレオチド配列を活性成分として含む製薬学的組成物。
１４．請求の範囲第９項に記載のヌクレオチド配列が挿入された組み換えウィルスを含むことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の製薬学的組成物。
１５．ウィルスをレトロウイルス及びアデノウイルスから選ぶことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の製薬学的組成物。
１６．がんの処置のための請求の範囲第１３〜１５項のいずれか１つに記載の製薬学的組成物。
１７．請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む欠陥組み換えウィルス。
１８．アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ伴生ウィルス、又はヘルペスウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載のウイルス。