FR2694296A1 - Peptides inhibant l'activité des protéines ras, préparation et utilisation. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des peptides capables d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines p21 activées, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant.
Description
La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines ras.
Différents gênes, appelés oncogènes et gênes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi deux, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, jouent un rôle dé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogénique. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines ont été associées à la présence de gênes ras modifiés.De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération oellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.
In vivo, on ne connait pas encore la nature précise des événements responsables de l'activation des protéines p21, et de la transduction du signal qu'elles portent. On sait qu'elles exercent leur fonction en oscillant entre deux états conformationnels: une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. L'activité de ces protéines est donc contrôlée par les facteurs qui régissent l'équilibre entre ces deux formes, ctest-à-dire la transition p21-GDP - > p21-GTP et inversement.
Concernant l'activation des complexes p21-GDP, des travaux récents rapportent des situations physiologiques au cours desquelles la proportion de protéines ras liées au GTP augmente dans la cellule. I1 s'agit de l'activation des lymphocytes T et de la stimulation des fibroblastes 3T3 par des facteurs de croissance dont L'EGO et le PDGF. Cette augmentation de la proportion de p21
GTP peut s'expliquer au moins en partie par l'action d'une protéine jouant un rôle analogue à celui d'un récepteur pour les protéines G de transduction.A cet égard, certaines protéines capables de promouvoir l'échange du GDP sur les protéines p21 ont été identifiées, à partir de cerveau de boeuf (West et oeil.,
FEBS Let. 259 (1990) 245) et de rat (Wolfman et Macara, Science 248 (1990) 67).
GTP peut s'expliquer au moins en partie par l'action d'une protéine jouant un rôle analogue à celui d'un récepteur pour les protéines G de transduction.A cet égard, certaines protéines capables de promouvoir l'échange du GDP sur les protéines p21 ont été identifiées, à partir de cerveau de boeuf (West et oeil.,
FEBS Let. 259 (1990) 245) et de rat (Wolfman et Macara, Science 248 (1990) 67).
La localisation cellulaire distincte de ces facteurs et les conditions expérimentales très différentes dans lesquelles ils ont été obtenus laissent supposer qu il s'agit de protéines différentes. Elles sont aussi actives sur les protéines ras normales que sur celles qui sont oncogéniques. Ces activités ont été regroupées sous le terme de GEF : Facteur d'Echange des nucléotides
Guanidiques.
Guanidiques.
Concernant l'inactivation des complexes p21-GTP, une protéine cytosolique ayant le pouvoir d'accélérer très fortement l'hydrolyse du GTP lié à la protéine p21 a été mise en évidence (Trahey et Mc Cormick, Science 238 (1987) 542). Cette protéine, dénommée GAP, interagit avec les protéines p21 de manière catalytique et multiplie par 100 à 200 la vitesse d'hydrolyse du GTP mesurée in vitro pour la protéine p21 normale. Différents travaux ont montré que le domaine catalytique de cette protéine de 1044 acides aminés environ était situé dans la région carboxy-terminale (résidus 702-1044), et que cette région était responsable de l'interaction de la protéine GAP avec les protéines p21 (Cf
W091/02749).
W091/02749).
Cependant, le rôle de cette protéine GAP n'a pas été jusqu'à présent clairement élucidé. En particulier, les éléments et les facteurs permettant la transduction des signaux d'activation des protéines p21 à la cellule ne sont pas connus. La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse que la protéine GAP ne constitue pas simplement un régulateur ayant pour seul rôle de désactiver la p21 en la faisant repasser à l'etat inactif par suite de l'hydrolyse du GTP, mais qu'elle constitue également I'effecteur des protéines p21 déclenchant la réponse cellulaire. La présente invention résulte plus particulièrement de l'identification et de la caractérisation de régions particulières (dites régions effectrices) de la protéine GAP impliquées dans la transduction des signaux d'activation des protéines p21.La mise en évidence de l'existence d'une telle région et sa caractérisation permettent de préparer de nouveaux peptides utilisables phannaceutiquement.
Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides capables d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines p21 activées. I1 est entendu que le terme protéine p21 désigne tout produit d'expression d'un gène ras normal ou oncogénique.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet les peptides capables d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des complexes p21
GTP-GAP. On sait de plus que les protéines p21 sont nécessaires à l'expression du pouvoir transformant d'oncogènes agissant en amont, comme src, HER1,
HER2, hEGF-1, hEGF-2, etc. De ce fait, les peptides de l'invention et toute composition pharmaceutique les contenant sont également utiles pour traiter les tumeurs présentant ces gènes activés.
GTP-GAP. On sait de plus que les protéines p21 sont nécessaires à l'expression du pouvoir transformant d'oncogènes agissant en amont, comme src, HER1,
HER2, hEGF-1, hEGF-2, etc. De ce fait, les peptides de l'invention et toute composition pharmaceutique les contenant sont également utiles pour traiter les tumeurs présentant ces gènes activés.
Préférentiellement, les peptides de l'invention sont des dérivés de la protéine GAP.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique et conservant la capacité d'inhibition recherchée. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
En tant que peptide dérivé de la protéine GAP, on peut citer notamment tout peptide capable de lier la protéine p21, éventuellement complexée au GTP, mais portant une région effectrice rendue non fonctionnelle. De tels peptides peuvent être obtenus par délétion, mutation ou disruption de cette région effectrice sur la protéine GAP.
Plus préférentiellement, les peptides de l'invention comprennent tout ou partie de la séquence peptidique présentée sur la figure 1 ou d'un dérivé de celle-ci.
Le terme dérivé a la même signification que précédemment.
Les peptides de l'invention peuvent ainsi avoir la structure du peptide donné sur la figure 1, d'un fragment de celuisi, ou une structure dérivée de oeufs De tels peptides peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base de la séquence donnée dans la figure 1, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de l'homme du métier. ns peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché, éventuellement suivie de modifications chimiques ou enzymatiques.Dans le cas d'une synthèse par voie génétique, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonuciéotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir de la séquence nucléotidique donnée dans la présente demande (figure 1), par coupures enzymatiques, ligature, donage, etc, selon les techniques connues de l'homme du métier. Ces peptides peuvent également être modifiés par l'ajout de séquences leur permettant une localisation cellulaire précise.En particulier, des séquences de type CAAX où C est une cystéine, A un acide aminé aliphatique et X un acide aminé quelconque, permettant de déterminer si un peptide est ou non modifié posttraductionnellement par une farnésyl transférase cellulaire peuvent être ajoutées (Cancer Cells vol3(91 1991 331).
La présente invention permet donc de générer des peptides dérivés de la protéine GAP et, plus particulièrement, de la séquence présentée sur la figure 1 présentant des propriétés biologiques interessantes en vue d'une utilisation pharmaceutique. L'activité biologique de ces différents peptides de l'invention peut être évaluée selon différents tests décrits dans les exemples, et notamment par un test de maturation d'oocytes.
D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en compétition avec les peptides ciaessus définis pour l'interaction avec leur cible cellulaire. De tels peptides peuvent être synthétisés notamment sur la base de la séquence du peptide considéré, et leur capacité à entrer en compétition avec les peptides ciilessus définis pour l'interaction avec leur cible cellulaire peut être déterminée comme décrit dans les exemples.
A titre d'exemples de peptides selon l'invention, on peut citer les peptides ayant la séquence d'acides aminés suivantes:
- peptide ayant la structure présentée sur la figure 1
- peptide PVEDRRRVRAI (positions S15 sur la séquence de la figure 1)
- peptide EISF (positions 2629 sur la séquence de la figure 1) - peptide EDGWM (positions 42 46 sur la séquence de la figure 1)
- protéine GAP portant une région effectnce rendue non fonctionnelle,
- peptides compétiteurs des peptides cidessus.
- peptide ayant la structure présentée sur la figure 1
- peptide PVEDRRRVRAI (positions S15 sur la séquence de la figure 1)
- peptide EISF (positions 2629 sur la séquence de la figure 1) - peptide EDGWM (positions 42 46 sur la séquence de la figure 1)
- protéine GAP portant une région effectnce rendue non fonctionnelle,
- peptides compétiteurs des peptides cidessus.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmautiquement. ll est en effet possible, à partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de la voie de signalisation dépendante de la protéine GAP non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'invention. I1 peut s'agir en particulier d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence présentée sur la figure 1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci. Par séquence dérivée, on entend au sens de la présente invention toute séquence hybridant avec la séquence présentée sur la figure 1 ou avec un fragment de celle-ci et codant pour un peptide selon l'invention, ainsi que les séquences résultant de ces dernières par dégénérescence du code génétique. De telles séquences nucléotidiques peuvent être utilisées pour la production des peptides de l'invention.Dans ce cas, la partie codant pour ledit peptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, sequence "leader" de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceuxsi peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, SEhwanniomyces, ou Hansenula.
S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc.
Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Tnchodema ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes Ecoli, Bacillus, ou Streptomyces.
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit dans le cadre d'une thérapie génique, soit pour la détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de gènes GAP dans des échantillons biologiques, soit pour préparer des oligonucléotides antisens. Concernant la thérapie génique, les séquences de l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs tels que des vecteurs rétroviraux de type adénovirus, permettant leur administration in vivo (Médecine et Sciences 7(1991) 705).
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique), soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Les produits de la présente invention peuvent être utilisés dans le domaine thérapeutique : en particulier, les peptides de l'invention étant capables de moduler l'activité des protéines ras, ils permettent d'intervenir dans le processus de développement des cancers, et notamment, ils peuvent inhiber l'activité des oncogènes dont l'activité transformante passe par une interaction p21-GAP fonctionnelle. De nombreux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques. Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gênes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du pancréas, dont 90% ont un oncogène Ki-ras muté sur le douzième codon (Almoguera et coll., Cell 53 (1988) 549), les adénocarcinomes du colon et les cancers de la thyroïde (50%), ou les carcinomes du poumon et les leucémies myéloïdes (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49(1989)4682).
L'invention a donc également pour objet toute composition phrmnaoeutique comprenant comme principe actif au moins un peptide et/ou un oligonucléotide antisens selon la présente invention. De telles compositions pharmaceutiques sont plus particulièrement destinées à une utilisation dans le traitements des cancers.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Séquences peptidique et nucléotidique de la région effectrice fragment 27S351 de GAP.
Figure 1 : Séquences peptidique et nucléotidique de la région effectrice fragment 27S351 de GAP.
Figure 2: Mise en évidence de la région effectrice de la protéine GAP.
Figure 3 : Profil antigénique du peptide de la figure I criblé en recouvrement séquentiel par l'anticorps Ac200.
Figure 4: Effet des peptides de l'invention sur la maturation des oeufs de xénope induite par p21 Ras Lys2, l'insuline ou la progestérone.
Techniques générales de clonage
Les méthodes dassiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénolkhloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escheiidzm coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular
Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les méthodes dassiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénolkhloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escheiidzm coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular
Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs.
Les plasmides de type pBR322, pUC, lgtll, pGEX 2T et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de RADON ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. oeil (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nudeic Acids Res.
13(1985)8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR Lolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cyder" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977)54635467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence normales sont généralement les suivantes: hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x
Denhart's à 65"C; lavage 05 x SSC à 65 "C.
Denhart's à 65"C; lavage 05 x SSC à 65 "C.
Exemple 1: Mise en évidence des régions effectrices
L'existence de régions effectrices au sein de la protéine GAP a été démontrée par la mise en évidence que des anticorps anti-GAP étaient capables de bloquer l'activité transformante de ras (E.1.1.) alors que ces mêmes anticorps ne modifiaient pas l'interaction GAP-ras (E.1.2.).
L'existence de régions effectrices au sein de la protéine GAP a été démontrée par la mise en évidence que des anticorps anti-GAP étaient capables de bloquer l'activité transformante de ras (E.1.1.) alors que ces mêmes anticorps ne modifiaient pas l'interaction GAP-ras (E.1.2.).
E.1.1. Inhibition de la fonction ras par des anticorps anti-GAP.
Les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la protéine GAP ont été obtenus auprès de M. Thang (Inserm U245, Hopital St Antoine, Paris). Ces anticorps ont été utilisés pour mettre en évidence le role de l'interaction GAPp21 et, plus précisément, pour montrer l'influenoe d'une inhibition de cette interaction sur la maturation d'oeufs de xénopes induite par ras.
Des grenouilles Xenopus Dis ont été obtenues auprès du CNRS (Montpellier, Frange). Les grenouilles sont anesthésiées dans l'eau glacée, et des fragments d'ovaires sont prélevés chlIzrrgicalement et transférés dans un milieu
Barth modifié (Hirai et al., Dev. Biol. 100 (1984) 214). Les oocytes au stade VI sont récupérés en agitant les agrégats d'oocytes pendant 2 heures à température ambiante en présence de 2 mg/ml de collagénase (Sigma). Pour l'analyse de la maturation induite par ras, 40 nl de la protéine dans du milieu Barth modifié sont introduits dans le cytoplasme des oocytes par microinjection, soit seuls, soit en présence des anticorps anti-GAP à différentes concentrations.Pour l'analyse de la maturation induite par les hormones, les oocytes sont incubés en présence d'insuline (10 pg/ml) et de chlorure de zinc (10 pM) (insuline pancréatique bovine, Sigma) ou de progestérone (1 pM). Les oocytes sont conservés à 20"C dans du milieu Barth modifié, et le % de rupture de vésicule germinale (GVBD) est déterminé après 18 heures d'incubation, par dissection des oocytes préalablement fixés en présence de 5% d'acide trichloroacétique. Les résultats sont exprimés par le % de GVBD sur des groupes d'oocytes.
Barth modifié (Hirai et al., Dev. Biol. 100 (1984) 214). Les oocytes au stade VI sont récupérés en agitant les agrégats d'oocytes pendant 2 heures à température ambiante en présence de 2 mg/ml de collagénase (Sigma). Pour l'analyse de la maturation induite par ras, 40 nl de la protéine dans du milieu Barth modifié sont introduits dans le cytoplasme des oocytes par microinjection, soit seuls, soit en présence des anticorps anti-GAP à différentes concentrations.Pour l'analyse de la maturation induite par les hormones, les oocytes sont incubés en présence d'insuline (10 pg/ml) et de chlorure de zinc (10 pM) (insuline pancréatique bovine, Sigma) ou de progestérone (1 pM). Les oocytes sont conservés à 20"C dans du milieu Barth modifié, et le % de rupture de vésicule germinale (GVBD) est déterminé après 18 heures d'incubation, par dissection des oocytes préalablement fixés en présence de 5% d'acide trichloroacétique. Les résultats sont exprimés par le % de GVBD sur des groupes d'oocytes.
Les résultats obtenus montrent que certains anticorps anti-GAP sont capables d'inhiber l'activité transformante de la protéine ras. L'anticorps Ac200 a été utilisé dans la suite de l'étude.
E.1.2. Absence d'effet de l'anticorps Ac200 sur l'interaction GAP-p21
L'interaction entre GAP et le complexe p21-GTP est déterminée selon le protocole suivant. La proteine Ha-ras p21 normale (Rey et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 3904) est équilibrée avec un excès de (y,32p) GTP (3000 Ci/mmol,
Dupont, NEN Research Products, Boston, Mass) dans un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 100 mM (NH4)2SO4, 10 mM dithiothréitol, 1 mM MgCl2 et 50 mg/ml de sérum-albumine bovine, pendant 30 minutes à 30 "C. L'incubation est arrétée en appliquant la solution refroidie sur une colonne PD10 (Pharmacia) équilibrée par un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 10 mM dithiothréitol, 10 mM MgCl2, 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyl, pour éliminer les nucléotides libres.La réaction GTPase est une variante de celle décrite par
Cassel et Selinger (Biochim. Biophys. Acta 452 (1976) 538). La réaction est commencée par ajout de 10 p1 (15 pg) du cytosol obtenu par sonication de souches d'Ecoli exprimant le GAP (Cf exemple E.2.1. ci-dessous pour la production de GAP), à 1 pmol de Ha-ras p21-(g32P) GTP dans du tampon Tris Ha 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, dithiothréitol 10 mM, MgC12 5mM, GTP 100 pM, BSA 50 pg/ml, pour obtenir un volume final de 50 p1. La réaction est réalisée pendant 3 minutes à 30"C et arrétée sur la glace par addition de 950pu d'acide phosphorique 20 mM (pH 2,3) contenant 5% (w/v) de charbon activé.
L'interaction entre GAP et le complexe p21-GTP est déterminée selon le protocole suivant. La proteine Ha-ras p21 normale (Rey et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 3904) est équilibrée avec un excès de (y,32p) GTP (3000 Ci/mmol,
Dupont, NEN Research Products, Boston, Mass) dans un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 100 mM (NH4)2SO4, 10 mM dithiothréitol, 1 mM MgCl2 et 50 mg/ml de sérum-albumine bovine, pendant 30 minutes à 30 "C. L'incubation est arrétée en appliquant la solution refroidie sur une colonne PD10 (Pharmacia) équilibrée par un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 10 mM dithiothréitol, 10 mM MgCl2, 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyl, pour éliminer les nucléotides libres.La réaction GTPase est une variante de celle décrite par
Cassel et Selinger (Biochim. Biophys. Acta 452 (1976) 538). La réaction est commencée par ajout de 10 p1 (15 pg) du cytosol obtenu par sonication de souches d'Ecoli exprimant le GAP (Cf exemple E.2.1. ci-dessous pour la production de GAP), à 1 pmol de Ha-ras p21-(g32P) GTP dans du tampon Tris Ha 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, dithiothréitol 10 mM, MgC12 5mM, GTP 100 pM, BSA 50 pg/ml, pour obtenir un volume final de 50 p1. La réaction est réalisée pendant 3 minutes à 30"C et arrétée sur la glace par addition de 950pu d'acide phosphorique 20 mM (pH 2,3) contenant 5% (w/v) de charbon activé.
Après centrifugation à 1800 g, la radioactivité est mesurée dans des échantillons de 200 pl du surnageant. Les résultats sont présentés ci-dessous.
Produit testé Activité relative GAP
Aucun 100 Ac200 100 [275-351]GAP 100
Ac Y13259 5
Ils montrent que l'anticorps Ac200 ne modifie pas l'interaction GAP-p21.
Aucun 100 Ac200 100 [275-351]GAP 100
Ac Y13259 5
Ils montrent que l'anticorps Ac200 ne modifie pas l'interaction GAP-p21.
Le même essai réalisé avec le fragment 275-351 de GAP (figure 1) démontre également que ce polypeptide ne modifie pas l'interaction fonctionnelle GAPp21.
Exemple 2: Caractérisation de la région effectrice
E.2.1. Mise en évidence d'une région de 80 aa environ par fragmentation de GAP, production de ces fragments de GAP sous forme de fusion GST, et réactivité vis-à-vis de l'anticorps Ac200 neutralisant.
E.2.1. Mise en évidence d'une région de 80 aa environ par fragmentation de GAP, production de ces fragments de GAP sous forme de fusion GST, et réactivité vis-à-vis de l'anticorps Ac200 neutralisant.
La séquence d'ADN codant pour la protéine GAP a été fragmentée par digestion enzymatique, et les fragments obtenus ont été séparés par électroêlution et mis sous forme de fragments BamHI-EcoRI. Ces fragments ont ensuite été exprimées dans la souche d'E. coli TGl sous forme de protéines de fusion avec la glutathion S-transférase (GST) selon la technique décrite par
Smith et Johnson (Gene 67(1988)31). Pour cela, les differents fragments d'ADN obtenus ont été insérés dans les sites BamHI-EcoRI du vecteur pGEX 2T (Phnrmacia), en 3' et en phase d'un ADNc codant pour la GST. Les vecteurs ainsi obtenus sont ensuite utilisés pour transformer la souche Ecoli TG1.Les cellules ainsi transformées sont précultivées une nuit à 370C, diluées au 1/10e dans du milieu LB, ajoutées d'IPTG pour induire l'expression (2 heures, 25"C), puis cultivées 21 heures environ à 25"C. Les cellules sont ensuite lysées, et les proteines de fusions produites sont purifiées par affinité sur colonne Agarose
GSH. Pour cela, le lysat bactérien est incubé en présence du gel (préparé et équilibré avec le tampon de lyse) pendant 15 min à 4"C. Après 3 lavages avec un tampon Tris-HCl pH 7,4, les protéines sont éluées en présence d'un tampon Tris-HCl pH 7,7 contenant un excès de GSH. Le surnageant est récolté et centrifugé.
Smith et Johnson (Gene 67(1988)31). Pour cela, les differents fragments d'ADN obtenus ont été insérés dans les sites BamHI-EcoRI du vecteur pGEX 2T (Phnrmacia), en 3' et en phase d'un ADNc codant pour la GST. Les vecteurs ainsi obtenus sont ensuite utilisés pour transformer la souche Ecoli TG1.Les cellules ainsi transformées sont précultivées une nuit à 370C, diluées au 1/10e dans du milieu LB, ajoutées d'IPTG pour induire l'expression (2 heures, 25"C), puis cultivées 21 heures environ à 25"C. Les cellules sont ensuite lysées, et les proteines de fusions produites sont purifiées par affinité sur colonne Agarose
GSH. Pour cela, le lysat bactérien est incubé en présence du gel (préparé et équilibré avec le tampon de lyse) pendant 15 min à 4"C. Après 3 lavages avec un tampon Tris-HCl pH 7,4, les protéines sont éluées en présence d'un tampon Tris-HCl pH 7,7 contenant un excès de GSH. Le surnageant est récolté et centrifugé.
Les fragments ainsi obtenus sont testés en fonction de leur reconnaissance par l'anticorps Ac200. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. ns montrent que la région effectrice de la protéine GAP est située entre les résidus 275 et 350 environ.
E.2.2. Identification plus précise par "Epitope Scanning"
La technique "d'epitope scanning" est basée sur le principe qu'un anticorps donné peut réagir avec des peptides de 5 à 15 acides aminés. De ce fait, l'identification d'épitopes séquentiels peut être obtenue en préparant un jeu complet de peptides recouvrants, de 5-15 acides aminés, correspondants à la séquence complète de l'antigène considéré. Cette technique a été utilisée pour déterminer les épitopes fonctionnels du fragment de GAP mis en évidence à l'exemple E.2.1. ci-dessus. Pour cela, la totalité du fragment a été expIorée par recouvrements séquentiels, par synthèse d'un décapeptide tous les 2 acides aminés.
La technique "d'epitope scanning" est basée sur le principe qu'un anticorps donné peut réagir avec des peptides de 5 à 15 acides aminés. De ce fait, l'identification d'épitopes séquentiels peut être obtenue en préparant un jeu complet de peptides recouvrants, de 5-15 acides aminés, correspondants à la séquence complète de l'antigène considéré. Cette technique a été utilisée pour déterminer les épitopes fonctionnels du fragment de GAP mis en évidence à l'exemple E.2.1. ci-dessus. Pour cela, la totalité du fragment a été expIorée par recouvrements séquentiels, par synthèse d'un décapeptide tous les 2 acides aminés.
a) Synthèse des peptides recouvrants.
35 peptides couvrant la totalité du fragment de la figure 1 ont été synthétisés chimiquement. La synthèse a été effectuée en double, sur 2 supports indépendants, par la méthode Fmoc/t-butyl sur phase solide (kit Cambridge
Research Biochemicals).
Research Biochemicals).
b) Mise en évidence des épitopes fonctionnels.
Les épitopes fonctionnels reconnus par l'anticorps Ac200 ont été révélés en test ELISA par un anticorps de lapin anti-souris couplé à la peroxydase. Le substrat chromogénique de l'enzyme utilisé est l'amino-di-(S ethylbenzothiazodine sulfonate) (ABTS).
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3. Les épitopes reconnus par cet anticorps sont les suivants:
- PVEDRRRVRAI
- EISF
- EDGWM
1l est entendu que d'autres régions fonctionnelles du fragment de la figure 1 peuvent être mises en évidence en utilisant d'autres anticorps anti-GAP.
- PVEDRRRVRAI
- EISF
- EDGWM
1l est entendu que d'autres régions fonctionnelles du fragment de la figure 1 peuvent être mises en évidence en utilisant d'autres anticorps anti-GAP.
Sur la base de ces résultats et en utilisant la même technique de synthèse chimique, les peptides suivants ont été synthétisés:
- APPEPVED RRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGD
-WMWVTNLRTD
- ISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTD
- VTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKI
- PPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELED GWMw
VTNLRTD 3) Caractérisation biologique
L'activité biologique des peptides de l'invention a été étudiée en mesurant leur effet sur la maturation d'oeufs de xénopes induite par p21 ras Lys2, par l'insuline ou par la progestérone.
- APPEPVED RRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGD
-WMWVTNLRTD
- ISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTD
- VTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKI
- PPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELED GWMw
VTNLRTD 3) Caractérisation biologique
L'activité biologique des peptides de l'invention a été étudiée en mesurant leur effet sur la maturation d'oeufs de xénopes induite par p21 ras Lys2, par l'insuline ou par la progestérone.
Le protocole utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple E.1.1. cidessus. L'activité est mesurée par microinjection dans le cytoplasme des oocytes de 40 nl le la protéine p21 ras dans du milieu Barth modifié, soit seuls, soit en présence des différents peptides de l'invention à des concentrations variables.
Les résultats sont exprimés par le % de GVBD sur des groupes d'oocytes. Les résultats sont présentés sur la figure 4.
Ces résultats montrent clairement que les peptides de l'invention, notamment le fragment de la figure 1, sont capables d'inhiber l'activité transformante de la protéine ras. Un fragment de longueur identique ([76S86O]
PLCy) préparé par les mêmes techniques à partir de la phospholipase C type y humaine ne présente pas l'activité du peptide de l'invention.
PLCy) préparé par les mêmes techniques à partir de la phospholipase C type y humaine ne présente pas l'activité du peptide de l'invention.
Claims (15)
1. Peptide capable d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines p21 activées.
2. Peptide selon la revendication 1 capable d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des complexes p21-GTP-GAP.
3. Peptide selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé de la protéine GAP.
4. Peptide selon la revendication 3 caractérisé en oe qu'il est capable de lier la protéine p21, éventuellement complexée au GTP, et en oe qu'il porte une région effectrice rendue non fonctionnelle.
5. Peptide selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence peptidique présentée sur la figure 1 ou d'un dérivé de celles.
6. Peptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les peptides suivants:
- PVEDRRRVRAI
- EISF
-EDGWM
- APPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGD - WMwVTNLRTD
- ISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTD
- VTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKI
- PPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELEDGWMW
VTNLRTD
7. Peptide selon l'une des revendications précédentes modifié par une séquence d'adressage à la membrane de type CAAX où C est une cystéine, A un acide aminé aliphatique et X un acide aminé quelconque.
8. Peptide capable d'entrer en compétition avec un peptide selon l'une des revendications 3 à 7 pour l'interaction avec sa cible cellulaire.
9. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de moduler l'activité transformante des protéines p21 obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 8 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
10. Séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
11. Séquence selon la revendication 10 introduite dans un vecteur viral permettant son expression in vivo.
12. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 10.
13. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule hôte une séquence nucléotidique selon la revendication 10, on cultive cette cellule dans des conditions d'expression de ladite séquence, et on récupère le peptide produit.
14. Composition pharmaceutique ayant comme principe actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 8.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 pour le traitement de cancers.
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