KR970004802B1 - 올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절 - Google Patents

올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절 Download PDF

Info

Publication number
KR970004802B1
KR970004802B1 KR1019920702702A KR920702702A KR970004802B1 KR 970004802 B1 KR970004802 B1 KR 970004802B1 KR 1019920702702 A KR1019920702702 A KR 1019920702702A KR 920702702 A KR920702702 A KR 920702702A KR 970004802 B1 KR970004802 B1 KR 970004802B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
seq
lipooxygenase
sequence
protein
Prior art date
Application number
KR1019920702702A
Other languages
English (en)
Inventor
프랭크 베네트 클레어런스
제이. 엑커 데이비드
티. 크룩 스탠리
케이. 미라벨리 크리스토퍼
Original Assignee
아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드
케이. 미라벨리 크리스토퍼
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드, 케이. 미라벨리 크리스토퍼 filed Critical 아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Application granted granted Critical
Publication of KR970004802B1 publication Critical patent/KR970004802B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y303/00—Hydrolases acting on ether bonds (3.3)
    • C12Y303/02—Ether hydrolases (3.3.2)
    • C12Y303/02006—Leukotriene-A4 hydrolase (3.3.2.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절
[도면의 간단한 설명]
제1도는 아라키돈산 합성 및 대사에 관한 개략도.
제2도는 혈소판 활성화 인자 합성 경로에 관한 개략도.
제3도는 인간의 5-리포옥시게나제 mRNA 서열.
제4도는 인간의 활액 PLA2mRNA 서열.
제5도는 인간의 5-리포옥시게나제 활성화 단백질 서열.
제6도는 인간의 LTA 가수분해효소 mRNA 서열.
제7도는 인간의 포스포이노시티드-특이적 포스포리파제 CmRNA 서열.
제8도는 HL-60 세포내에서 5-리포옥시게나제 유도의 동력학을 나타낸 그래프.
제9도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 HL-60 세포내에서의 5-리포옥시게나제 발현을 억제하는 것을 나타낸 그래프.
제10도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 쥐의 호염기구 백혈병 세포내에서 5-리포옥시게나제의 발현을 억제하는 것을 나타낸 그래프.
제11도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 비타민 D3차동 HL-60 세포 내에서 5-리포옥시게나제 발현을 억제하는 것을 나타낸 그래프.
제12도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RBL-1 쥐세포 내에서 5-리포옥시게나제 발현을 억제하는 것을 나타낸 그래프.
제13도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RBL-1 쥐세포 내에서 5-리포옥시게나제 mRNA의 특정 부위를 억제하는 것을 나타낸 그래프.
제14도는 A431 세포에서 분비되는 PLA2의 HPL C분석을 보여주는 그래프.
제15도는 인간의 주요 표피세포에 의해서 PLA2분비가 증가되는 것을 보여주는 그래프.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
발명은 아라키돈산 합성 또는 대사의 조절에 반응하는 질병 상태의 치료법, 진단법 및 검색약에 관한 것이다. 특히 본 발명은 아라키돈산 합성 또는 대사를 조절하는 단백질의 합성에 관여된 특정 메신저 리보핵산 또는 DNA와의 안티센스 올리고뉴클레오티드 상호작용에 관한 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 RAN 또는 DNA 활성의 조절을 유도하고, 그에 따라 아라키돈산 합성 및 대사의 조절을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이로 인해 질병 완화효과 및 치료 효과가 생기게 된다.
[발명의 배경]
아이코사노이드
아라키돈산 및 관련 지방산들의 대사산물은 광범위한 생물학적 활성을 나타내어 체내 모든 유기 시스템에 영향을 미친다. 생물학적 활성을 나타내는 아라키돈산 대사산물의 수는 30가지가 넘는다. 이러한 대사산물들은 집합적으로 아이코사노이드라 불리운다.
아라키돈산은 막 지방과 에스테르화된 상태로 세포내에 저장된다. 아라키돈산이 일단 막 지방에서 분비되면 막지방으로 되돌아가 다시 에스테화되든지, 혹은 각종 산화효소에 의하여 대사된다. 치료적 관점에서 중요한 두가지 산화 경로는 프로스타글란딘, 트롬복산 및 프로스타시클린을 발생시키는 시클로옥시게나제 경로와 류코트리엔, 리폭신, 히드로퍼옥시아이코테트라엔산 및 모노- 및 디-히드록시아이코사테트라엔산(모노- 및 디-HETE)을 발생시키는 리포옥시게나제 경로이다(제1도 참조). 혈소판 활성화 인자(PAF)는 아라키돈산의 직접적인 대사산물은 아니지만 유리 아라키돈산을 발생시키는 경로 중 어느 한 경로를 통해 만들어진다. 따라서 어떤 경우에는 유리 아라키돈산의 발생으로 말미암아 PAF에 대한 직접적인 전구체인 리조(lyso)-PAF가 생기게 된다.
E계열 프로스타글란딘(PGE1, PGE2)은 유력한 혈관 확장제 및 평활근 이완제이다. 따라서, PGE2는 저혈압증을 촉진시키고 기관지, 호흡관 및 자궁평활근을 이완시킨다. 이같은 프로스타글란딘의 다른 효과로는 혈소판 응집 억제, 유세포로부터의 매개물(mediator) 분비 억제, 신장내 혈류량 증가, 이뇨, ACTH 순환 농도 증가 및 위산 분비 억제가 포함된다. PGE는 피하 주사시 통증을 유발하며 화학물질이나 기계적인 자극으로 말미암아 구심성 신경 종말을 민감하게 만든다.
프로스타글란딘 D2는 PGE1과 마찬가지로 혈소판 응집 억제제이다. PGD2는 호염기구로부터의 히스타민 분비를 증진시키고 화학운동성을 촉진시키며 다형핵 백혈구내 다른 매개물의 주화성 반응을 향상시킨다. 프로스타시클린(PGI2)는 유력한 기관지 확장 물질이며 일반적인 평활근 이완제이다.
PGI2는 혈소판 응집을 억제하는데 있어서 PGE2및 PGD2보다 30배 내지 50배 더 효능이 있다. PGI2는 위산 분비를 억제하고 기관지 및 자공 평활근을 이완시키며 신장내 혈류량을 증가시킨다. 따라서 PGE2와 PGI2, 그리고 정도가 약간 떨어지지만 PGD2는 정상 지혈을 유지시키는데 있어서, 중요하며 많은 임상학적 상태에서 이로운 효과를 발휘한다.
F계열 프로스타글란딘, 즉 PGF2α는 평활근 조직에 대하여 일반적으로 PGE와 반대되는 생물학적 활성을 나타낸다. PGF2α는 기관지 및 호흡관 평활근을 수축시키고 임신한 자궁 및 임신하지 않은 자궁의 평활근을 수축시키며 위장 평활근을 수축시킨다. 아(亞)영장류에 있어서 PGF2α는 로이톨리틱 호르몬이다.
트롬복산 A2(TXA2)는 유력한 평활근 수축제로서, 혈관대, 기관지 및 호흡관대를 비롯한 모든 시험 평활근대를 수축시켜준다. TXA2는 혈소판 응집을 촉진시키고 신장내 혈류량을 감소시킨다.
일반적으로 펩티도류코트리엔(류코츠리엔 C4, D4및 E4)은 유력한 평활근 수축제인 반면, 류코트리엔 B4(LTB4)는 호중구 및 단구 순환을 위한 주화성 인자이다. 또한 LTB4는 호중구로부터의 과산화물 음이온 발생과 리소솜 효소분비를 촉진시키는데, 이러한 현상들은 국부 조직 손상을 야기한다(Ford-Hutchinson, A. W., Crit. Rev. in Immuno1., 10 : 1-12, 1989), 리폭신은 기니아 피그 실질대(Parenchymal Strips)를 수축시키고 천연 킬러 세포를 억제하며 호중구내에서 과산화물 발생을 자극하는 것으로 밝혀졌다.
혈소판 활성화 인자(PAF)는 혈소판 응집을 유도하고, 혈관 투과성을 증가시키고, 기관지 수축제로 작용하고, 신장내 혈류량을 감소시키고, 장간막 순환을 감소시키며 이제껏 보고되었던 가장 유력한 위궤양 발생원이다(Rosam 일행, Nature, 319 : 54-56, 1986). PAF는 염증세포를 활성화시켜서 호중구와 호산구 주화성 및 과립감소를 촉진시킨다.(Braguet 일행, ISI Atlas of Science : Pharmacology, 187-198, 1987)
아이코사노이드의 병리생리학
호흡계
류코트리엔이 천식과 같은 즉각형 과감각 반응에 참여한다고 제안됨에 따라 호흡계에 미치는 류코트리엔의 영향이 광범위하게 연구되어 왔다. 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 및 만성 기관지염을 앓고 있는 환자의 코 분비물과 폐 세척액 속에서 다량의 펩티도류코트리엔이 검출되었다.(Dahlen 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 : 1712-1716, 1983)
류코트리엔 C4및 D4는 인간을 비롯한 각종 종(種)에서 기관지 수축을 촉진시키는 유력한 평활근 수축제이다(Dahlen 일행, Nature, 288 : 484-486, 1980).
류코트리엔 C4및 D4(LTC4및 LTD4)는 기관지 수축을 촉진시킴에 있어서 효력이 거의 동일하고 히스타민보다는 약 1000배 이상의 효능을 나타낸다(Dahlen 일행, Nature, 288 : 484-486, 1980; Sirois 일행, Prost. Leuk. Med., 7 : 327-340, 1981).
일반적으로 LTC4와 LTD4는 중앙 기도(airway)보다 말초 기도의 수축을 촉진시키는데 있어서 더 큰 활성을 나타낸다. 기니아 피그 호흡관대에서 LTE4는 LTC4및 LTD4보다 10배 정도 효능이 덜하다. LTC4및 LTD4에 의해 생긴 기관지수축은 특정 세포 표면 수용체와의 상호작용으로 말미암은 것이다(Mong 일행, Eur, J. Pharmacol., 102 : 1-11, 1984). LTC4및 LTD에 대한 별개의 수용체가 존재하는지에 관해서는 아직 의견이 분분하다. 류코트리엔 E4는 LTD4수용체와의 상호작용에 의하여 기관지 수축제로 작용하는 것으로 보인다. 류코트리엔 B4는 분리된 호흡관 및 폐 실질을 비교적 약하게 수축시킨다. LTB에 의하여 유도된 수축은 시클로-옥시게나제의 억제제에 의하여 부분적으로 방해를 받는데, 이같은 사실은 수축이 프로스타글란딘 분비에 부수적인 것임을 시사해준다.
펩티도류코트리엔과 마찬가지로 혈소판 활성화 인자는 유력한 기관지수축제이다. 또한 PAF는 인간의 경우 다른 작용인자에 대한 기도 반응성 증가를 유도하는데, 이러한 효과는 흡입 후 7일까지 지속될 수도 있다(Cuss 일행, Lancet, 2 : 189, 1986). 프로스타노이드 PGE2α와 TXA2도 기도 평활근을 수축시키며, 천식 반응에 기여하는 것으로 알려져왔다.
심장혈관계
류코트리엔도 혈관수축제로 작용하지만 상이한 혈관 베드에 대하여 현저한 차이가 있다. LTC4및 LTD4는 각종 종에서 관상 동맥의 수축제로서 유력한 것이다(Roth 및 Leffer, Prostaglandins, 26 : 573-581, 1983; Burke 일행, J. Pharmacol. Exper. Therap., 221 : 235-241, 1982; Letts 및 Piper, Br. J. Pharmacol., 76 : 169-176, 1982). 폐에서는 LTE4가 LTC4및 LTD4보다 10배 정도 효력이 덜하지만 LTB4는 활성이 없다. 인간의 경우 LTC4와 LTD4는 폐정맥에 대해서 유력한 수축제이며, 폐동맥에 대해서는 약한 수축제이다(Schellenberh 및 Foster, Prostaglandins, 27 : 475-482, 1984). 2 나노몰의 LTC4를 정상적이고 건강한 인간 자원자에게 정맥 주사를 한 결과, 평균 동맥압이 떨어졌고, 심장박동수가 증가했으며 관상 혈류량은 감소했고 관상혈관저항은 증가하였다(Marone 일행, Biology of the Leukotrienes, ed. by R. Levi 및 R. D. Krell, Ann New York Acad. Sci. 524, New York Academy of Sciences, New York, pp.1 : 321-333, 1988). LTD4의 경우에도 유사한 효과가 기록되어 있다. LTC4및 LTD4는 아마도 모세관 내피 세포의 수축을 촉진시킴으로써 혈관 투과성을 직접적으로 증가시키는 것으로 보인다.
류코트리엔이 심근 허혈증에 따른 심장 재관류손상에 기여한다는 증거가 점점 늘고 있다(Barse 및 Mullane, Euu. J. Pharmacol., 114 : 383-387, 1985; Sasaki 일행 및 Cardiovasc. Res., 22 : 142-148, 1988). 심장 재관류 손상에 관한 실험 모델에서 시클로옥시게나제/리포옥시게나제 이원(二元) 억제제는 심근 경색의 크기를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 유용한 증거는 이원 억제제의 이로운 효과가 LTB4생합성 억제에 의한 것임을 시사해준다. 그러나 연구에 사용된 화합물들이 고유한 산화방지 성질을 갖는 것 외에도 시클로-옥시게나제와 리포옥시게나제를 둘다 억제하였기 때문에 이러한 자료들은 조심스럽게 해석되어야 한다. 이러한 발견을 입증하기 위해서는 5-LO는 LTB4길항물질이 특이적인 억제제가 필요하다. 선택적 LTD4수용체 길항물질이 동물 모델에서 생존률을 상당히 증가시킨다는 점에서 류코리엔은 내독성 쇼크의 병원성 매개물로도 알려져 있다(Smith 일행, Circ. Shock, 25 : 21-31, 1988). 내독성 쇼크 모델에서 LTD4길항물질의 이로운 효과는 LTD4에 의해 야기되는 증가되는 모세관 투과성을 역전시킬 수 있는 그 능력에 어느 정도 기인한 것일 수 있다.
혈소판 활성화 인자와 트롬복산 A2는 관상 혈관을 수축시켜서 관상 관류를 감소시키며, 그 결과 심장출력 손상, 혈압 강하 및 급성 순환기 붕괴가 일어나게 된다. PAF는 ST-세르먼트 강하를 촉진시키기도 한다. 쇼크의 동물 실험 모델에서는 내독소-유도 저혈압증과 PAF의 양 사이에 어떤 관계가 나타난다. 내독성 쇼크에 있어서 PAF의 역할은 PAF 길항물질이 동물 쇼크 모델에서 관찰된 저혈압증을 감소시킨다는 발견에 의해 더욱 지지되었다(Braguet 일행, ISI Atlas of Science : Pharmacology : 187-1898, 1987).
위장계
기니아 피그 회장은 펩티도류코트리엔에 의한 평활근 수축을 측정하기 위한 고전적인 조직이다(SRS-A). 또한, LTC4및 LTD4는 기니아 피그의 위를 수축시킨다. LTB4는 두 조직 모두에게 아무런 영향도 미치지 않는다. 류코트리엔에 대한 반응성에 있어서 종과 근육층 사이에는 현저한 차이가 존재한다. 인간의 위장 점막은 류코트리엔을 합성하고 분비하여 염증 반응 또는 손상에 대한 반응을 증가시킨다. 동물 실험 모델에서 류코트리엔 수용체 길항물질은 에탄올, 인도메타신 및 아스피린에 의해 야기된 위장 손상을 감소시키는 것으로 보고되었다. 류코트리엔에 의해 야기된 위장 손상은 이들이 유력한 혈관수축 성질을 갖고 있어서 혈액 흐름을 점막에서 비켜가게 만들기 때문에 일어난 것일 수도 있다. 염증성 창자질환을 앓고 있는 환자에게서 LTB4및 펩티도류코트리엔 상승을 입증한 몇가지 연구가 있었다. 염증성 창자 질환에 관한 동물 모델에서 5-LO 억제제는 염증 및 손상 정도를 감소시킨다.
앞서 언급한 바와 같은 상태가 PAF는 이제껏 보고된 것 중에서 가장 유력한 쥐의 궤양원이다. PAF는 대장균을 희사시키는데에 관여하는 것으로도 제안되었다(Wallace 일행, Gastroenterology, 1987 in Press).
중추신경계
류코트리엔은 칼슘 이오노포아로 자극시킨 정상 뇌조직에 합성되어 분비되는데, 이같은 사실은 이들이 신경조절제로서 작용할 수 있음을 시사해준다. LTC4및 LTD4는 대뇌 루르키니에 세포를 장기간 흥분시킨다(Palmer 일행, Pharmacol. Exp. Ther., 219 : 91-96, 1981). 신경조절제로서 가능한 역할 외에도 류코트리엔은 대뇌 혈관의 유력한 수축제인 까닭에 대뇌 국소 빈혈과 같은 손상에 따른 신경조직 병원론에 기여할 수 있다. LTB4, LTC4및 LTD4는 혈관 투과성을 증가시킴으로써 혈액뇌관문을 감소시키는데, 이중에서 LTB4가 가장 유력하다(Black, Prostaglandins Leukotriene Med., 14 : 339-340, 1984). 프로스타글란딘은 상처, 염증 및 두통과 관련된 통증에 기여하는데, 이러한 사실은 비스테로이드성 소염제가 상기 질병에 치료효과가 있음을 설명해 주는 것이다. 프로스타글란딘 E2및 PGF2-를 저용량 투여하면 기계적, 화학적 자극에 대한 고통 수용체를 감작시켜서 통각과민을 일으킨다.
피부계
류코트리엔은 인간의 피부에서 현저한 염증 반응을 일으킨다. 0.15 내지 1.5 나노물의 LTB4를 인간의 피부에 주사하였을 때 돌출된 부종 부위가 생겼는데, 이 부위는 주사 후 30분째에 나타나고 4시간 이상 지속되었다.
다형핵 백혈구가 진피 속으로 현저하게 침투하였다는 것이 조직학에 의해 입증되었다(Camp 일행, Br. J. Pharmacol., 80 : 497-502, 1983). LTB4를 5mg 정도로 소량 국소 투여했을 때 지연된 염증 반응이 일어났는데, 이 경우엔 12시간째에 처음으로 염증 반응이 나타나서 몇일동안 지속되었다.
처음엔 침윤 병소가 다형핵 백혈구로 구성되었지만, 염증 반응 후기 단계에서는 단핵 백혈구가 주를 이루었다. LTB4를 반복적으로 국소 투여하면, 이에 반응하여 과내성이 일어난다(Dowd 일행, 1987).
LTB4와는 대조적으로 펩티도류코트리엔은 피하주사시 즉각적인 제6감반응을 일으키고, 후유증은 뒤따르지 않는다. 류코트리엔이 인간의 질병에 관여한다는 가장 좋은 증거 중 하나가 건선이다. 류코트리엔은 건선 병소에서 발견되어 왔다. 5-리포옥시게나제 억제제인 베녹사프로펜은 표준 치료에 반응이 없는 심한 건선 환자에게 효과적인 것으로 밝혀졌다(Kragballe 및 Herlin, Arch. Dermatol., 119 : 548-552, 1983). 그러나 베녹사프로펜은 허용될 수 없는 부작용으로 인해 시장에서 철수되었다.
프로스타글라딘 E1과 E2는 피부에 주사할 경우 혈과확장 및 부르틈을 야기한다(Crunkhorn 및 Willis, Br. J. Pharmacol., 41 : 49-56, 1971).
프로스타시클린(PGI2)은 다른 매개물로 말미암아 혈관 투과성을 증가시킨다. 프로스타글라딘 D2는 피하주사에 뒤이은 홍반 생성 및 부르틈을 촉진시킴에 있어서 PGE 보다 훨씬 더 약하다.
PAF는 인간의 피부에서 유력한 전(pro)-염증발생제이다. 피코몰 단위의 PAF를 인간의 피부에 주사하면서 2상성(二相性) 반응이 촉진되는데, 이때 초기 반응은 주사 후 5분 째에 일어나고, 3 내지 6시간 후에 후기상 반응이 뒤따른다(Archer 일행, Br. J. Dermatol., 112 : 285-290, 1985). PAF는 건선 환자 병해 피부의 비늘 및 소실액으로부터 분리해 왔다(Mallet 일행, Adv. in Prostaglandins, Thromboxanes, Leukotrienes 및 Related Compounds, Vol 17B : 640-642, 1987).
근육-골격계
류마티스성 관절염, 척추 관절염 및 통풍을 앓고 있는 환자의 활액에서 다량의 류코트리엔과 아라키돈산의 모노히드록시 유도체가 검출되었다(Klickstein 일행, J. Clin. Invest., 66 : 1166-1170, 1980; Davidson 일행, Ann, Rheum. Dis., 42 : 677-679, 1983). 활액내 다량의 리포옥시게나제 생성물은 호중구 침투 및 활성화 호중구로부터 활액강으로의 효소분비 증강에 기여할 수 있다. 5-리포옥시게나제의 억제제는 설치류에서 콜라겐-유도 관절염의 조직 손상을 감소시키는 것으로 밝혀졌었다. 류코트리엔 생합성을 억제하면 호중구와 단구 침투를 활액 공간으로 축소시키고 이들 세포에 의해 야기된 조직 손상을 줄여준다.
지방 대사를 조절하는 현행 치료제
아이코사노이드가 신체의 주요 기관계에 미치는 광범위한 영향 및 이들이 각종 질병 상태에 관련되어 있다는 사실로부터 알 수 있듯이, 아라키돈산 대사산물의 억제제는 막대한 치료 용도를 가질 것이다. 현재 아라키돈산 대사를 조절하는 몇가지 유형의 약이 시판되고 있다. 하지만 이들은 각각 특이성 부족으로 말미암아 여러 가지 성가신 효과를 낳는다. 또한 현재 시판되고 있는 대부분의 약은 리포옥시게나제 경로나 혈소판 활성인자 중 어느 하나를 억제하는데 실패하였다.
아스피린, 이부프로펜, 나프로겐, 인도메타신 및 이와 관련된 비스테로이드성 진통제에 의해 효소 시클로-옥시게나제를 억제하면 각종 질병 상태에서 유익한 효과를 발휘하게 된다는 것이 잘 알려져 있다. 비스테로이드성 소염제는 류마티스성 관절염 치료에 있어서 버팀목 역할을 한다. 이러한 약들은 류마티스성 관절염에 관련된 통증 및 부종과 같은 증상을 경감시키는데 매우 효과적인 것으로 입증되었지만 그 질병의 진행을 변경시키는데는 거의 도움이 되지 않는다. 또한 시클로-옥시게나제의 억제제는 유익한 효과가 있는 프로스타글란딘을 비롯한 모든 프로스타글란딘의 생산을 무차별적으로 차단한다. 이러한 현상은 이 약들의 궤양 활성과 같은 많은 부작용의 기작이 될 수도 있다. 시클로-옥시게나제 억제제는 류코트리엔 생산 또는 혈소판 활성화 인자에 아무런 영향을 미치지 않으며, 따라서 여러가지 질병의 치료에 있어 부족한 점이 있다.
글루코코르티코이드 활성을 나타내는 스테로이드도 소염 활성을 나타내는데, 이는 아마도 세포막으로부터의 아라키돈산 분비를 억제함으로써 유도된 것이다. 스테로이드류는 현재 이용되고 있는 가장 광범위하게 규정된 유형의 약 중 하나이다. 이들은 각종 염증, 알레르기 및 비면역 매개 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 낭창, 과민증, 두드러기, 접촉성 피부염, 천식, 건선, 만성 궤양성 대장염, 대뇌부종, 패혈병성 쇼크, 악성 종양 및 간염을 치료하는데 사용된다. 신장 부전증 치료의 대체 치료법을 제외하고 글루코코르티코이드 요법은 치료효과가 없다. 또한 글루코코르티코이드로 장기 치료를 하면 실질적으로 때로는 생명을 위협하기도 하는 부작용이 일어난다. 글루코코르티코이드의 대다수의 용도는 만성 질병 치료를 위한 것이므로 이들의 부작용은 유용성을 제한하게 된다.
아라키돈산으로 가는 필수 지방산 전구체의 식이 섭취를 변화시키면 염증 및 심혈관 질환에 어느 정도의 활성을 나타낸다는 것이 입증되었다(Bonaa 일행, New Eng. J. Med., 322 : 795-801, 1990; Rang 일행, J. Allergy Clin. Immunol., 85 : 484-489, 1990). 어유에는 아이코사펜타엔산(EPA)이 들어있는데, 이것은 시클로-옥시게나제에 대해 불량한 기질이며 시클로-옥시게나제의 경쟁적 억제제로서 작용한다. EPA는 리포옥시게나제에 의하여 아라키돈산과 유사하게 대사되지만, 활성이 훨씬 적은 대사산물을 생성한다(Terano 일행, Biochem. Pharmacol., 33 : 3071-3076, 1984).
EPA는 세포막에 통합된 후 리포옥시게나제에 의해 대사됨에 있어 아라키돈산과 경합하게 된다. 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산이 들어 있는 천연 식이를 완전하게 제한하기란 힘든 일이므로 어유 요법의 유용성에는 한계가 있다.
철 착화제인 히드록사마미드산 유도체에 의한 5-리포옥시게나제의 억제제에 관하여 현재 임상 실험이 진행중이다. 사실, 이러한 접근법은 유망한 결과를 낳지 못하였었다. 지금까지, 세포막으로부터의 아라키돈산 분비 또는 저장, 혹은 리포옥시게나제 경로를 통한 대사작용을 조절하는 현재의 약들 중에서 치료제로서 유용하다고 입증된 것은 하나도 없었다. 아라키돈산 합성 또는 대사를 조절하기 위한 안전하고 효험있는 방법이 절실히 필요시되고 있지만 아직까지 개발된 바는 없다. 특정 효소를 직접적으로 억제하려 하기보다는 아라키돈산 경로의 주요 지점에서 단백질 생산을 조절하는 것이 선행 기술의 문제점을 극복할 수 있는 수단이 될 것이다.
[발명의 목적]
본 발명의 주된 목적은 아라키돈산 및 관련 화합물들의 합성 또는 대사를 교란시킴으로써 면역 질환, 심혈관 질환 및 기타 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아라키돈산 및 관련된 화합물들의 합성 및 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 RNA의 기능을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 아라키돈산 합성 또는 대사의 기능장애를 진단하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 이같은 목적들과 그밖의 다른 목적은 본 명세서를 읽어봄으로써 잘 알게 될 것이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따르면, 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질(FLAP), 포스포리파제 A2, 포스포리파제 C, LTA4가수분해효소 및 그밖의 지방대사조절 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 교잡하는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체가 제공된다. 이러한 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체 mRNA와 직접 결합하거나 3중 가닥 구조를 형성하는 선택된 유전자와 결합하여 그 유전자로부터 만들어진 일정량의 mRNA를 조절하도록 설계된 것이다.
위와 같은 관계를 통상 안티센스라고 부른다. 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체 RNA 또는 DNA의 기능, 즉 그의 단백질 해독 기능, 세포질 속으로의 이동기능 또는 그의 전반적인 생물학적 기능에 필요한 다른 활성을 억제할 수 있다. RNA 또는 DNA가 그 기능 모두 또는 일부를 수행하는데 실패하게 되면 아라키돈산 대사가 적절하게 발현되도록 조절하는 게놈의 일부가 파손되어 상기 대사를 조절할 수 있게 된다.
안티센스 공격에 특이적인 유전자를 표적으로 선택하는 것이 바람직하다. 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가수분해효소, 포스포리파제 C 및 조효소 A-비의존형 트란스아실라제를 암호화하는 유전자가 이러한 접근법에 특히 유용한 것이라고 밝혀졌다.
아라키돈산 합성 또는 대사를 조절할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산과 교잡가능한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 동물과 접촉시키는 아라키돈산 대사 조절 방법이 제공된다. 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가수분해효소, 포스포리파제 C, 트롬복산 합성효소 및 조효소 A-비의존형 트란스아실라제를 암호화하는 RNA 또는 DNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 바람직하다.
[발명의 상세한 설명]
안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간의 많은 질병을 치료하기 위한 치료제로서 매우 큰 전망을 갖고 있다. 개념적으로, 효소의 활성 자리와 상호 작용하는 분자를 설계하는 것 보다는 염기 짝짓기에 의해서 RNA 분자와 같은 1차 구조와 상호 작용하는 화합물을 설계하는 것이 훨씬 더 쉬운 일이다.
올리고뉴클레오티드는 왓슨-크리크 염기 짝짓기에 의해 정의된 바와 같이 예비-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 상보 서열과 특이적으로 결합함으로써, DNA의 유전정보가 단백질로 유입되는 것을 억제하게 된다. 표적 서열에 대해 특이적으로 되게 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 성질은 또한 그들 자신을 비상하게 다능하게 만들어 준다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단량체 단위 4개로 된 긴 사슬이므로 어떠한 표적 RNA 서열에 대해서라도 쉽게 합성될 수 있다. 표적 단백질 연구를 위한 생화학적 수단으로서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유용성이 최근 많이 연구되어 학계에 보고되었다(Rothenberg 일행, J, Natl. Cancer Inst., 81 : 1539-1544, 1989; Zon, G., Pharmaceutical Res., 5 : 539-549). 올리고뉴클레오티드 화학, 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드의 합성 및 개선된 세포 흡수율을 나타내는 올리고뉴클레오티드 유사체에 최근 많은 진전이 있었으므로 이제는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 새로운 형태의 치료책으로 고려할 수 있게 되었다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 선행기술의 접근법에서 부딪쳤던 문제에 대해 이상적으로 해결책을 제공한다. 이들은 주어진 이성효소를 선택적으로 억제하도록 설계될 수 있으며, 효소 생산을 억제하고, 유리라디칼 청소와 같은 비-특이적인 기작을 없애준다. 특이적 억제제를 고안함에 있어서 효소 기작에 관한 완전한 이해는 필요없다.
아라키돈산의 기작을 조절하는 현재의 약들은 특이성의 결여로 말미암아서 좋지 않은 많은 부작용을 나타내거나, 질병 치료에 단지 제한된 효력만을 나타낼 뿐이다. 본 발명은 효소를 직접 억제하기 보다는 효소의 생산을 억제함으로써 선행 기술의 문제점을 우회시켜서 치료 효과를 달성하는 것이다. 아라키돈산의 합성 또는 대사에 관여하는 효소가 많이 있다. 이같은 많은 효소 중에서 여섯가지가 가장 중요한 표적으로 선택되었는데, 그것은 이 효소들이 아라키돈산 합성에 중요한 역할을 하거나 특정 아라키돈산 대사 산물을 생성시키는데 선택성을 갖기 때문이다. 제1도에서 볼 수 있듯이 본 발명자들은 아라키돈산 경로의 주요 지점에 있는 많은 단백질을 동정하였다. 본 발명에서 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 mRNA와 직접 결합하거나, 혹은 3중가닥 구조를 형성하는 유전자와 결합하여 그 유전자로 부터 만들어지는 일정량의 mRNA를 조절하도록 설계된다.
아라키돈산은 음식물로부터 직접 섭취하거나, 포유동물 조직내에서 아라키돈산으로 대사될 수 있는 리놀레산 또는 리놀렌산을 음식물로 섭취함으로써 얻어야 하는 필수 지방산이다. 아라키돈산은 막 지방에 에스테르화된 상태로 저장된다. 이러한 지방의 예는 트리글리세리드 및 디글리세리드와 같은 중성 지방; 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜세린과 같은 인지질; 및 콜레스테롤 에스테르이다. 에스테르화된 아라키돈산은 시클로-옥시게나제 및 리포옥시게나제 경로에 의한 대사에 이용될 수 없다. 따라서 프로스타글란딘과 류코트리엔 합성을 위한 속도 제한 단계가 세포막에서 생기게 된다. 대부분의 포유동물 세포에서 프로스타글란딘과 류코트리엔 합성을 위한 아라키돈산의 주요 공급원은 인지질인 것으로 생각된다. 특성 아고니스트로 자극을 받은 세포는 막 인지질로부터 여러 개의 별개의 경로를 거쳐 아라키돈산을 분비한다(제1도). 주어진 조직 형태에서 모든 경로가 작동할 수 있지만, 유리 아라키돈산을 발생시키기 위한 가장 직접적인 경로, 즉 포스포리파제 A2가 가장 많은 양의 아라키돈산을 분비하게 되는 것으로 생각된다. 어떤 세포 유형에서는 포스포리파제 C/글리세리드 리파제 경로가 다량의 아라키돈산을 막 지방으로부터 분비해 내는데 상당한 기여를 할 수 있다(Bell 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 76 : 3238-324l; Mahadevappa 및 Holub, Biochem. Biophys. Res. Comm., 134 : 1327-1333, 1986).
최근의 몇가지 연구에서는 아라키돈산이 분비되어 나오는 인지질 푸울(pool)이 시클로-옥시게나제 및 리포옥시게나제 경로의 경우 상이하다는 제안을 하고 있다(Humes 일행, J. Bio1. Chem., 257 : 1591-1594; Chilcon 및 Connell, J. Biol. Chem., 263 : 5260-5265, 1988 : Skerrett 일행, J. Immunol., 144 : 1592-1061,1990). 따라서 별개의 지방 푸울을 조절하는 것이 프로스타글란딘 및 류코트리엔 합성에 서로 상이한 영향을 미칠 수 있다.
특히 1위치에 에테르 결합을 갖고 있는 포스파티딜콜린의 별개 아종(1-0-알킬, 2-아라키도닐 포스파티딜콜린)은 인간의 호중구에서 LTB4합성에 사용되는 아라키돈산의 주요 공급원인 것으로 보인다(Chilton 및 Connel, J. Biol. Chem., 263 : 5260-5265). 포스포리파제에 의하여 이러한 지방종을 가수분해시키면 유리 아라키돈산 및 1-0-알킬 리조포스파티딜콜린(혈소판 활성화 인자의 직접적인 전구체)이 생성된다(제2도). 조효소 A-비의존형 트란스아실라제를 억제함으로써 이러한 지방종의 합성을 억제하거나 포스포리파제 A2를 억제함으로써 이 지방의 가수분해를 억제하면 류코트리엔과 혈소판 활성화 인자의 생산이 억제될 것이다.
막 지방으로부터 분비된 아라키돈산은 아실트란스퍼라제에 의하여 막 지방으로 되돌아가 다시 에스테르화되거나 각종 옥시게나제에 의하여 더 대사될 수 있다. 치료학상 가장 중요한 주가지 유형의 옥시게나제는 시를로-옥시게나제 및 리포옥시게나제이다. 시클로-옥시게나제는 아라키돈산을 산화시키고 고리화시켜서 고리형 엔도과산화물 중간체 PGH2를 형성시키는데, 이것이 프로스타글란딘 생합성의 첫번째 단계이다(제1도). 포유동물의 세포속에는 분자 산소를 삽입하는 이중결합의 위치에 따라 분류되는 여러 개의 리포옥시게나제 효소가 있다(즉, 5-리포옥시게나제, 12-리포옥시게나제 및 15-리포옥시게나제). 12- 및 I5-리포옥시게나제 생성물이 약간의 생물학적 활성을 갖고 있기는 하나, 가장 잘 특성화된 리포옥시게나제 생성물은 5-리포옥시게나제로부터 유도된 것들이다. 5-리포옥시게나제 생성물인 류코트리엔은 유력한 생물학적 활성을 가지며, 각종 질병 상태의 병원론에 기여하는 것으로 생각된다. 5-리포옥시게나제에 대한 활성화 기작의 일부로서, 이 효소는 세포질졸 분회로부터 막으로의 칼슘-유도 이동을 겪게 되며, 이 막에서 효소는 5-리포옥시게나제 활성화 단백질(FLAP)이라 불리우는 특정 막 단백질과 상호작용하게 된다. 5-리포옥시게나제와 FLAP의 상호작용 세포내에서의 류코트리엔 합성에 필수적인 것으로 보인다(Rouzer
일행, J. Biol. Chem., 265 : 1436-1442; Dixon 일행, Nature, 343 : 282-284).
동정된 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적은 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 C의 특이적 이성효소, 포스포리파제 A2의 특이적 이성효소, LTA4가수분해효소 및 조효소 A-비의존형 트란스아실라제이다. 이들 표적은 아라키돈산 대사로 향하는 몇 가지 중요한 부경로 접근을 대표한다. 리포옥시게나제 경로와 혈소판 활성화 인자 생합성인 전구체 인지질 1-0-알킬, 2-아라키도닐포스파티딜콜린의 합성을 억제하거나(조효소 A-비의존형 트란스아실라제), 막 인지질로부터 아라키돈산이 분비되는 것을 억제함으로써(포스포리파제 A2및 포스포리파제 C) 접근된다.
리포옥시게나제 경로는 아라키돈산이 류코트리엔으로 대사되는 것을 방해하거나(5-리포옥시게나제 및 LTA4가수분해효소), 5-리포옥시게나제의 활성화를 방해함으로써(5-리포옥시게나제 활성화 단백질) 특이적으로 차단될 수도 있다. 표적 지점의 선택에 의해 볼 수 있듯이 아라키돈산 대사를 조절하는 수단은 선택된 단백질에 따라 좌우된다.
표적에 관한 기재 :
리포옥시게나제는 산소 분자 한개를 불포화 지방산에 통합시키는 일종의 디옥시게나제이다. 리포옥시게나제는 기질 분자내의 산소화 자리에 의하여 분류될 수 있다. 5-리포옥시게나제(5-LO)는 아라키돈산의 C5-이중결합에서 산소 분자 한 개를 통합시켜서 5-히드로퍼옥시-6, 8, 11, 14-아이코사테트라엔산(5-HPETE)을 형성시키는 디옥시게나제이다. 정제된 5-LO는 5-HPETE를 공역 트리엔 에폭시드 5,6-류코트리엔 A4로 전환시키기도 한다. 따라서 류코트리엔 B4및 펩티도류코트리엔(류코트리엔 C4, 류코트리엔 D4및 류고트리엔 E4) 생합성 경로에서의 처음 두 효소 단계는 한가지 효소에 의하여 수행된다.
5-리포옥시게나제(5-LO)는 수많은 세포 유형의 세포질졸 분획물로부터 균질하게 정제되었다(Rouzer 및 Samuelsson, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82 : 6040-6044, 1985 : Hogaboom 일행, Mol. Pharmacol., 30 510-519, 1986; Ueda 일행, J. Biol. Chem., 261 : 7982-7988, 1986).
정제된 효소는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 측정시 74 내지 80kDa의 분자량을 나타낸다. 5-리포옥시게나제는 효소반응 진행 도중 비가역적인 방식으로 그 자신을 불활성화시킨다는 점에서 자살 효소이다.
5-LO가 그 자신을 불활성화시키게 되는 정확한 기작은 규명되지 못하였다 5-LO는 LTA4를 합성하기 위하여 기질로서 아라키돈산과 5-HEPTE를 둘다 사용할 수 있다. 쥐의 호염기구 5-LO를 사용하는 경우 외래 5-HPETE는 5-리포옥시게나제 반응으로부터의 효소에 의해 공급된 5-HPETE 보다 LTA4합성을 위한 기질로서 약 50배 정도 활성이 덜하다.
정제된 효소는 칼슘 및 ATP 뿐만 아니라, 정제 도중 효소로부터 제거되는 몇가지 알려지지 않은 세포인자에 의하여 활성화된다(Rouzer 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 7505-7509, 1985; Hogaboom 일행, Mol. Pharm., 30 510-519, 1986). ATP 및 자극 인자들은 효소를 향해 안정화 효과를 발휘하지 않은 채 효소의 초기 속도를 증가시킨다. ATP에 의한 자극은 단백질 포스포릴화를 수반하는 것으로 보이지 않으며 포스포디에스테르 결합의 가수분해가 필수요건인 것도 아닌 것으로 보인다(ADP 및 AMP도 자극을 하기 때문). 칼슘이 5-LO를 활성화 시키게 되는 한가지 기작은 5-LO의 세포막 결합을 촉진시키는 것이다(Rouzer 및 Samuelsson, Proc. Natl. Acead. Sci. USA, 84 : 7393-7397, 1987; Wong 일행, Biochemistry, 27 : 6763-6769, 1988).
류코트리엔 생합성을 촉진시키는 대부분의 아고니스트들은 세포 내 칼슘 증가를 야기한다. 따라서 5-LO를 세포질졸로부터 세포막으로 이동시키는 것은 류코트리엔 생합성에 있어 중요한 조절 인자가 될 수 있다. 이러한 가설은 세포를 칼슘 이오노포아로 처리할 때 5-LO가 막으로 이동하고 이와 동시에 류코트리엔이 생산된다는 관찰에 의하여 더욱 지지된다(Fouzer 및 Kargman, J. Biol. Chem. 263 : 10980-10988, 1988).
인간의 5-리포옥시게나제에 대한 cDNA와 게놈 클론(Dixon 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 416-420, 1988; Matsumoto 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 26-30, 1988; Funk 일행, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 76 : 86 : 2587-2591, 1989) 및 쥐의 5-LO에 대한 cDNA 서열과 예측되는 단백질 서열이 문헌에 나와 있다(Balcarek 일행, J. Biol. Chem.,263 13937-1394l, 1988). 본 발명자들은 5-LO에 대한 쥐의 게놈 클론을 분리하여 부분적으로 서열화하였다. 5-LO에 대한 유전정보는 길이가 약 2700개의 염기에 해당한다. 인간의 5-LO의 길이가 674개의 아미노산에 해당되며 계산된 분자량이 77,839인 한편 쥐의 5-LO는 그 길이가 670개의 아미노산에 해당된다. 인간과 쥐의 5-LO에 대한 단백질 서열은 93%가 동일하고 cDNA 서열은 80% 이상이 동일하다. 주요 전사 개시 출발자리는 AVG 해독 개시 콜론으로부터 65bp 상류이다. 인간의 5-LO mRNA는 폴리아데닐화 자리 앞에 3'-비해독 서열의 434bp를 함유한다. 5-LO는 리포코르틴과 상태는 칼슘-의존성 막결합 단백질에 대한 17 아미노산 콘센서스 서열과 50 내지 60% 상동성을 보이는 두개의 영역을 함유한다. 5-LO와 칼슘-의존성 막결합 단백질간의 유사성은 5-LO가 세포질졸로부터 막으로 칼슘-의존성 이동을 한다는 것을 설명해줄 수 있다.
인간의 5-LO 유전자는 그 길이가 80,000 이상의 염기에 해당한다. 이 유전자는 크기는 192 염기쌍(bp) 으로부터 26kb(이것은 공지된 가장 큰 유전자 중 하나임)에 이르는 13개의 인트론과 14개의 엑손을 함유한다. 5-LO 유전자는 단일 복사 유전자인 것으로 보인다. 5-LO 유전자는 전사 개시 출발 자리와 아주 근접한 자리에서 TATA 또는 CCAAT 서열을 함유하지 않는데, 이는 몇 가지 가계 유전자에 의해 공유되는 특색이다. 추정상의 프로모터 영역은 Spl 전사 인자에 결합하는 8개의 자리를 함유한다.
앞서 거론했던 바와 같이 5-LO는 류코트리엔 A4, 류코트리엔 B4및 펩티도류코트리엔으로 이끄는 생합성 경로에 관여하므로 5-LO를 억제하는 것은 아라키돈산 대사를 조절하는데 유용할 수 있다. 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체가 이러한 목적에 유용한 것으로 확인될 것이다.
전술한 바와 같이 5-리포옥시게나제는 류코트리엔 생합성을 위하여 막인자를 필요로 한다(Rouzer 및 Samuelsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 6040-6044). 5-리포옥시게나제에 직접적인 영향을 미치지 않은 신규한 류코트리엔 생합성 억제제 MK886의 동정으로 말미암아 5-리포옥시게나제 활성화 단백질(FLAP)이라 불리우는 18KDa의 5-리포옥시게나제 활성화 막 단백질을 동정하게 되었다(miller 일행, Nature, 343 : 276-281, 1990; rouzer 일행, J. Biol. Chem., 265 : 1436-1442, 1990). FLAP에 대한 cDNA는 소수성 아미노산의 함량이 높은 161 아미노산 단백질을 암호화한다(제3도)(Dixon 일행, Nature. 343 : 282-284, 1990). FLAP에 대한 mRNA의 길이는 1kb이다.
FLAP는 천연상태의 세포내에서 류코트리엔 생합성에 필수적이라는 것이 몇가지 실험결과 입증되었다. 5-리포옥시게나제 cDNA로 인해 형질 전환된 골육종 세포는 5-리포옥시게나제 효소 활성을 발현시키지만 칼슘 이오노포아로 자극시킬 경우 류코트리엔을 합성하지 못한다. 그러나 5-리포옥시게나제 및 FLAP cDNA로 인해 형질전환된 세포는 5-리포옥시게나제 효소활성을 발현시키며 칼슘 이오노포아 자극후 류코트리엔을 생산한다(Dixon 일행, Nature, 343 : 282-284), 둘째로, MK 886은 칼슘 이오노포아 처리 후 세포질 졸로부터 막으로의 5-리포옥시게나제 이동 및 뒤이은 류코트리엔의 생산을 방해할 수 있다는 것이 입증되었다 MK 886 유사체의 순위서열 효력은 류코트리엔 생합성 억제와 5-리포옥시게나제 이동 억제사이에서 매우 좋은 상관관계를 가졌다(Rouzer 일행. J. Biol. Chem., 265 : 1436-1442). 이러한 자료는 FLAP에 대항하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 류코트리엔 생산 억제를 위한 대안적인 전략책임을 시사해준다.
포스포리파제 A2(EC 3.1.1.4)는 막 인기질의 sn-2 지방산 에스테르를 가수분해하여 리조인지질 및 아라키돈산 같은 유리 지방산을 생산하는 다양한 효소족을 형성한다. 포스포리파제 A2(PLA2)는 각종 뱀 및 벌의 독에서 발견되며 지방분해 효소로서 포유동물의 췌액으로 분비된다. PLA2효소는 대부분의 포유동물 조직에서도 발견되며 활성화된 혈소판 및 염증 세포로 부터 세포의 배지로 분비된다. PLA2는 포유동물내에서 세포막의 재모델화, 계면활성제 생합성, 췌액내에서의 소화효소, 염증 반웅의 일부로서 염증 세포 및 혈소판으로부터의 분비 및 세포 인지질에 에스테르화된 아라키돈산의 분비를 비롯한 여러가지의 역할을 담당한다. PLA2에 의한 유리 아라키돈산의 분비는 프로스타글란딘 생합성에 대한 속도 제한 단계이며, 류코트리엔 및 혈소판 활성화 인자 생합성 시 중요한 첫번째 단계인 것으로 제안되었다. 고농도의 PLA2는 염증 매개물 전구체를 유리(遊離)시키는 것 외에도, 세포 용균화를 촉진시킴으로써 세포에 대해 직접적으로 세포 독성을 일으킬 수 있다. 세포내에서 PLA2가 발휘하는 다중 기능은 다중 PLA2효소가 필요하다는 사실을 설명해 줄 수 있다. 염증 삼출물에서 발견되는 PLA2이성효소(Pruzanski 및 Vadas, J. Rheumatol., 15 : 1601-1603, 1988)는 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적으로서 특히 중요한 것이다 이 효소는 아이코사노이드 생합성을 위하여 세포막으로부터 아라키돈산을 분비시키는 역할을 할 뿐만 아니라 분비 자리에서 직접적인 세포독성 효과를 나타낼 수도 있다.
최근에 Seilhamer 일행(J. Biol. Chem., 264 : 5335-5338, 1989)과 Kramer 일행(J. Biol. Chem., ?64 : 5768-5775, 1989)은 류마티스성 관절염 환자의 활액에 존재하는 인간 PLA2의 cDNA 및 게놈 클로닝에 대해서 각각 보고하였다. 인간의 활액으로부터 분리해낸 PLA2(SF-PLA2)에 대한 유전자는 길이가 4.5kb이며, 길이가 800 염기에 상당하는 mRNA로 가공된다. cDNA클론은 세포로부터의 분비를 위하여 처음 20개의 아미노산을 시그날 펩티드로서 가공처리한 길이 144 아미노산와 단백질을 암호화한다. SF-PLA2의 아미노산 서열은 방울뱀 독속에 들어있는 것과 같은 그룹 Ⅱ PLA2효소와 보다 더 긴밀한 췌장 PLA2와는 다르다.
PLA2는 비(非)-췌장 조직 및 액속의 저함량 단백질로서, 0.01 내지 0.001%의 총 단백질 함량을 갖는다. SF-PLA2에 대한 mRNA도 제한된 조직 분포도를 갖는 저함량 mRNA이다. 제한된 조직 분포도, mRNA의 낮은 빈도, 효소 활성과 염증성 질환의 심간성간의 상호관계는 이러한 SF-PLA2를 안티센스 올리고뉴클레오티드 욧법을 위한 매력적인 표적이 되게끔 만든다.
안티센스 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 유사체의 특정 용도는 분명히 알 수 있다. 예컨대, 감마 인터페론은 5'-비전사 부위에서 인터페론 조절 요소 존재하에 PLA2합성을 증가시키므로 감마 인터페론으로 처리된 인간의 표피세포로부터 PLA2의 분비를 억제하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
SF-PLA2는 인간의 표피암 세포주 및 인간의 주요 표피세포로부터 분비되기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오티드 욧법은 염증성 피부 질환의 치료에도 유용하다. 또한 감마 인터페론이 인간의 표피세포로부터 PLA 분부를 유도하였기 때문에 PLA2는 피부내 감마 인터페론의 염증 활성에 매개적인 역할을 할 수 있다.
류코트리엔 A4는 가수분해효소(LTA4가수분해효소)는 5-리포옥시게나제에 의하여 형성된 류코트리엔 A4가 유력한 염증 매개물인 류코트리엔 B4로 가수분해되는 것을 촉매화한다. LTA4가수분해효소는 인간의 폐(Ohishi 일행, J. Biol. Chem., 262 : 10300-10205, 1987), 인간의 백혈구(Radmark 일행, J. Biol. Chem, 259 : 12339-12345, 1984) 및 인간의 적혈구(mcGee 일행, Fitzpatrick, J. Biol. Chem, 260: 12832-12837)로부터 균질하게 정제된 바 있는 세포질졸 단백질이다. 폐와 백혈구로부터 정제된 효소들은 분자량, 동력학적 성질 및 기질 선호도라는 점에서 적혈구 LTA4가수분해효소와는 달랐다. 인간의 안티센스 올리고뉴클레오티드 욧법이라는 관점에서 볼 때 백혈구 효소가 적혈구 LTA4가수분해효소보다 더욱 관심을 끈다. 적혈구에는 LTA4합성시 필요한 5-리포옥시게나제가 결여되어 있어서 이 세포들은 활성화된 호중구에서 분비된 LTA4에 의존해야만 한다.
인간의 LTA4가수분해효소에 대한 cDNA 서열은 공지되어 있다(Funk 일행, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84 : 6677-6681, 1987; Minami 일행, J. Biol. Chem., 262 13873, 13876, 1987). 2250 뉴클레오티드 mRNA는 다른 에폭시드 가수분해효소와의 서열 유사성이 없는 610 아미노산 단백질을 암호화 한다(제5도). 그러므로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 LTA4가수분해 효소의 억제는 소포체의 에폭시드 가수분해효소에 아무런 영향을 미치지 않을 것이다.
포스포리파제 C(EC 3.1.4.3)는 막 인지질의 sn-3의 포스포디에스테르 결합을 가수분해시켜서 디아실글리세롤 및 포스포릴화 극성 혜드기(head group)를 생산하게 되는 일종의 효소이다. 포유동물의 포스포리파제 C(PLC) 효소는 가수분해되는 극성 헤드기, 즉 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 등에 대하여 특이성을 나타낸다. 최근, 아고니스트에 의한 수용체 점령에 반응하여 포스포이노시티드 지방을 선택적으로 가수분해시키는 PLC 효소에 대하여서 많은 관심이 기울여져 왔었다. 포스파티딜아노시톨 4,5-비스포스페이트를 가수분해시키면 두개의 제2메신저 분자, 즉 단백질 카이나제 C를 활성화시키는데 필요한 보조인자인 디아실글리세를 및 세포내 비(非) 미토콘트리아성 칼슘 저장물의 분비를 촉진시키는 제2의 가용성 메신저 분자인 이노시톨 1, 4, 5-트리포스페이트가 생성된다(Berridge, Ann. Rev. Biochem., 56 : 159-193; 1987). 분비된 디아실글리세롤은 디글리세롤 리파제 및 모노글리세롤 리파제의 연속 작용에 의하여 유리 아라키돈산으로 더 대사될 수 있다. 따라서 포스포리파제 C는 제2의 메신저 분자를 생성시키는데 중요한 효소일 뿐만 아니라 선택된 조직내에서 아이코사노이드 생합성에 유용한 아라키돈산을 만드는데 중요한 역할을 할 수도 있다
포유동물의 조직속에는 여러가지 별개 형태의 포스포이노시티드-특이적 PLC가 들어있다(Crooke 및 Bennett, Cell Calcium, 10P309-323, 1989; Rhee 일행, Science, 244 : 546-550, 1989). 각 효소는 별개 유형의 세포 표면 수용체와 결합한다고 제의되었다. 예컨대 PLC- α른 바조프레신 수용체와 결합하고 PLC- δ는 성장 인자 수용체와 결합한다(Aiyar 일행, Biochem. J., 261 : 63-70, 1989; Crooke 및 Bennett, Cell Calcium, 10 : 309-323 1989; Margolis 일행, Cell, 57 : 1101-1107, 1989; Wahl 일행, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86 : 1568-1572, 1989). PI-PLC 효소의 이질성으로 인하여 비염증성 아고니스트의 시그날 변환 경로에 영향을 미치지 않으면서 전염증성 아고니스트의 시그날 변환 경로를 선택적으로 억제할 수 있다.
지금까지 6개의 서로 다른 PI-PLC 효소에 대한 cDNA가 클로닝되었다.
이들 효소의 크기는 504 아미노산 내지 1250 아미노산의 범위이며 유사한 생화학적 성질을 나타낸다는 것을 고려해 볼 때 현저한 차이가 나는 것이다.
다섯 효소 중 네개(PLC-β, PLC-δ1, PLC-δ2 및 PLC-α)는 50 내지 80%의 서열 유사성을 나타내는 길이 약 250 아미노산의 영역 두개를 갖는다.
PLC-α는 첫번째 영역하고만 35%의 유사성을 갖는 서열을 함유한다(Crooke 및 Bennett, Cell Calcium, 10 : 309-323, 1989). 다른 PI-PLC 효소에 대한 DNA 서열에 있어서의 현저한 차이는 안티센스 기술을 사용하는 다른 효소에 영향을 미치지 않으면서 PI-PLC 효소의 선택적 표적화를 가능케 해준다.
인간의 cDNA 클론은 PLC- δ2에 대해서만 보고되었다(제6도)(Ohta 일행, FEBS Lett, 242 : 31-35, 1988). 그 나머지는 쥐의 cDNA 클론이다. 게놈 클론은 어떠한 PI-PLC 효소에 대해서도 보고된 바 없다.
이제껏 연구되어온 모든 포유동물 조직은 한개 또는 그 이상의 PI-PLC 효소를 갖고 있다. 일반적으로, 하나의 포유동물 세포 유형에는 한가지 이상의 효소가 존재한다. PI-PLC 효소는 그 분포에 있어 조직 선택성을 나타낸다. PLC-β는 주로 신경조직에서 발견되며 뇌의 주된 효소이다.
PLC-δ1은 뇌와 많은 말초 조직에서 발견된다. PLC-δ2는 면역 세포에서 발견되며, PLC-α는 말초 조직에서 우세적인 것으로 보인다. 염증 세포에서만 발견된 PI-PLC 효소는 이제껏 보고된 바 없다. 그러나 PI-PLC-2는 면역경쟁 세포내에서 중요한 효소인 것으로 보인다(Emori 일행, J. Biol. Chem., 264 : 218 85-21890). 이 단백질은 0.1 내지 0.05%의 총 세포질 졸 단백질 함량을 갖는 비교적 고함량의 단백질이다. PI-PLC 효소, mRNA 또는 단백질 안정성의 유전적 조절에 관한 정보는 입수할 수 없는 실정이다.
조효소 A-비의존형 트란스아실라제는 C20및 C22다중불포화 지방산이 디아실-인지질로부터 리조인지질로 트란스퍼되는 것은 촉매화한다(제7도). 아라키돈산은 5, 8, 11 및 14 위치에 4개의 이중결합을 갖는 탄소수 20의 지방산이다. 조효소 A-비의존형 트란스아실라제는 류코트리엔 및 혈소판 활성화 인자의 전구체로 작용하는 아라키도닐-함유 에테르 인지질을 생성시킴에 있어서 중요한 효소이다(제7도). 조효소 A-비의존형 트란스아실라제는 소포체 막에 국한되어 있는 일채성 막 단백질로서, 그의 겉보기 분량은 겔여과 크로마토그래피에 의한 측정시 50 내지 60kDa이다(C. F. Bennett, 미간행 자료). 이 효소는 다른 지방산 트란스아실라제 또는 아실트란스퍼라제와는 달리 그 활성을 위해 조효소 A를 필요로하지 않는다는 점에서 독특한 것이다. 또한 이 효소는 공여체(donor) 지방 종 및 수체(acceptor) 지방 양쪽에 대해 다소 엄격한 특이성을 나타낸다. 이 효소는 sn-2 위치에 C20또는 C22다중불포화 지방산을 갖는 디아실포스파티딜콜린종을 공여체 지방으로 선호한다(Sugiura 일행, J. Biol. Chem. 262 : 1199-1205, 1987), 포스파티딜-에탄올아민은 주게 지방 종으로서 포스파티딜콜린보다 효력이 덜하였으며 포스파티딜이노시톨은 지방산 공여체로서의 역할을 하지 못했다. 탄소수 20 미만의 지방산, 예컨대 팔미트산 및 리놀레산은 훨씬 덜 효율적으로 틀나스퍼 되었다. 또한 이 효소는 수체 리조인지질을 향한 특이성을 나타내었다. 극성 헤드기로서 이노시톨, 세린 및 포스페이트를 함유하는 리조인지질은 조효소 A-비의존형 트란스아실화를 위한 수체로서 작용하지 못하였다. 1-0-알킬 리조포스파티딜콜린은 바람직한 수체 지방 종이었으며, 1-알케닐리조포스파티딜콜린, 1-아실리조포스파티딜콜린, 1-알케닐리조포스파티딜에탄올아민, 1-알킬리조포스파티딜에탄올 아민 및 1-아실리조포스파티딜에탄올아민은 수체 지방으로서의 활성이 1-알킬리조포스파티딜콜린의 경우에 비해 각기 약 50%이었다.
치료 목적상, 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, SF-PLA2, Pl-PLC-2, 류코트리엔 A4가수분해효소 및 조효소 A-비의존형 트란스아실라제를 감소시킴으로써 조절될 수 있는 질병을 갖고 있는 것으로 의심되는 동물에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 투여한다. 당업자라면 최적의 용량, 투여 방법 및 반복 횟수를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 치료가 이루어지거나 질병 상태가 호전될 때까지 일반적으로 그러한 치료를 계속한다. 어떤 질병의 경우엔 장기 치료가 필요할 수도 있다.
본 발명에서는 아라키돈산 대사를 조절할 수 있는 단백질에 상응되는 RNA 및 DNA의 기능을 안티센스방식으로 억제하는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용한다. 본 발명에서 올리고뉴클레오티드라는 용어는 천연 포스포디에스테르 결합에 의하여 결합된 시클로푸라노실기와 천연 상태 염기로부터 형성되는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것이다.
이 용어는 천연 상태 소단위(subunit) 또는 그와 밀접한 동족체로 부터 형성되는 합성 종 또는 천연 상태 종을 효과적으로 가리키는 말이다.
본 명세서에서 사용된 올리고뉴클레오티드 유사체라는 용어는 올리고뉴클레오티드와 유사한 기능을 하기는 하나, 밀접한 동족성 없는 비(非)-천연상태 부위를 갖는 성분을 지칭한다. 따라서 올리고뉴클레오티드 유사체는 변형된 당 성분 또는 당 사이의 결합을 가질 수 있다. 이들의 예로는 포스포로티오에이트 및 당분야에 공지된 그밖의 다른 황 함유 종(種)이 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에 따라, 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합 중 최소한 일부를, 활성 조절이 필요한 RNA 또는 DNA가 위치하는 세포 부위속으로 조성물이 잘 침투해 들어갈 수 있도록 해주는 구조로 치환시킨다. 그러한 치환은 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포로티오에이트 결합 또는 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 구조를 포함하는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 실시형태에 따라, 포스포디에스테르 결합을 실질상 비이온성이며 비편광성인 다른 구조로 치환시킨다. 당업자들이라면 본 발명을 실시하는데 사용되기 위한 다른 결합들을 잘 선택할 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오티드 유사체는 최소한 약간 변형된 염기 형태를 갖는 종도 포함할 수 있다. 따라서 천연상태로 발견되는 것 이외의 푸린 및 피리미딘을 사용할 수가 있다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 필수적인 기술사상이 고수되는 한 뉴클레오티드 소단위의 시클로푸라노실 부위에 변형을 일으킬 수도 있다.
그러한 유사체들은 기능상 천연 올리고뉴클레오티드와(또는 천연주에서 합성된 올리고뉴클레오티드) 호환가능한 것이라고 할 수 있으나, 천연 구조와는 한가지 이상의 차이점을 갖는다. 아라키돈산 대사를 조절할 수 있는 단백질 중 어느 하나에 상응되는 유전자에서 유도되는 RNA 및 DHA와 효과적으로 교잡할 수 있는 한, 이러한 유사체들은 모두 다 본 발명에 포함되는 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 유사체는 약 3 내지 약 50개의 소단위를 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 올리고뉴클레오티드 및 유사체가 8 내지 25개의 소단위를 포함하는 것이 보다 더 바람직하며, 제12 내지 22개의 소단위를 갖는 것이 더욱 바람직하다. 잘 알수 있듯이 소단위는 포스포디에스테르 또는 다른 결합을 통하여 인접 소단위에 적절하게 결합된 염기-당 조합체이다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드 및 유사체는 공지된 고상 합성 기술에 의하여 편리하고 통상적으로 제조할 수 있다. 그러한 합성에 사용되는 장치는 Applied Biosystems를 비롯한 몇몇 판매회사에 의해 시판되고 있다. 다른 어떤 수단도 그러한 합성에 사용될 수 있지만 올리고뉴클레오티드의 실제 합성 과정은 그 분야 숙련자의 기술 범주내의 것이다.
또한, 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드 유사체를 제조하기 위한 비슷한 기술을 사용하는 것도 잘 알려져 있다.
본 발명에 따라, 전사용 DNA의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 의해 확인된 mRNA는 DNA의 ORF에서 나온 정보를 포함할 뿐만 아니라 5' 비해독 영역, 3' 비해독 영역 및 인트론/엑손 접합 리보뉴클레오티드로 알려진 영역을 형성하는 연합 리보뉴클레오티드로 알려진 영역을 형성하는 연합 리보뉴클레오티드로 포함한다는 것을 당업자라면 잘 알게 될 것이다. 그러므로 정보 리보뉴클레오티드뿐만 아니라 이같은 연합 리보뉴클레오티드를 전부 또는 부분적으로 표적화하는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 본 발명에 따라 배합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 유사체는 전사 개시 자리, 해독 개시 자리 또는 인트론/엑손 접합부와 특이적으로 교잡될 수 있다. 가장 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 5' 캡(cap) 자리에 서열과 특이적으로 교잡될 수 있다.
본 발명에 따라 올리고뉴클레오티드는 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 교잡될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 상기 단백질은 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가수분해효소, 포스포리파제 C 및 조효소 A-비의존형 트란스아실라제이다. 이에 상응되는 서열 또는 그 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 본 발명에 유용하다. 예컨대 제3도는 인간의 5-리포옥시게나제 mRNA 서열이고; 제4도는 인간의 활액 PLA2mRNA 서열이고; 제5도는 인간의 5-리포옥시게나제 활성화 단백질 서열이고; 제6도는 인간의 LTA4가수분해효소 mRNA서열이고; 제7도는 인간의 포스포이노시티드-특이적 포스포리파제 C mRNA 서열이다. 본 발명에서 유용한 올리고뉴클레오티드 혹은 유사체는 이러한 서열 중 어느 하나, 또는 그 일부를 포함한다. 따라서 전술한 바와 같은 이들 올리고뉴클레오티드(혹은 그의 유사체), 또는 당업자가 아라키돈산 합성 혹은 대사 조절을 위한 바람직한 안티센스 표적의 지식으로부터 제조할 수 있는 유사한 뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 몇가지 바람직한 실시형태를 하기 실시예에 따라 예증하고자 한다. 조절하기 위한 표적 mRNA 종은 5-리포옥시게나제에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이에 한정되는 것이 아니고 일반적인 응용이 가능하다는 사실을 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다. 효소 5-리포옥시게나제의 생산을 억제 혹은 조절하면 질병 치료에 상당한 치료 효과를 보일 것으로 기대된다. 조성물의 효력을 평가하기 위해서는 분석 혹은 일련의 분석이 필요하다.
[실시예]
[실시예 1]
5-리포옥시게나제에 대한 세포 측정법은 사람의 전골수세포 백혈병 세포주 HL-60을 사용한다. 이들 세포는 다양한 공지 약제에 의해 단세포성 세포 또는 호중구상 세포로 유도분화될 수 있다. 13% 디메틸 술폭사이드(DMSO)를 사용하여 상기 세포를 처리하면 세포의 호중구로의 분화를 촉진시킨다는 것이 공지되어 있다. HL-60 기저 세포는 현재의 검출 방법의 최저 한도로 5-리포옥시게나제 단백질을 합성하거나 또는 류코트리엔(5-리포옥시게나제의 하류 생성물)을 분비한다는 것이 최근 밝혀졌다. DMSO를 사용한 세포 분화는 DMSO를 첨가한지 48시간 후 5-리포옥시게나제 단백질의 출현과 류코트리엔 생합성을 유발한다. 칼슘 이오노포아로 자극된 HL-60 세포로 부터 5-리포옥시게나제 mRNA와 류코트리엔 B4가 분비되는 유도 동력학을 제8도에 도시한다. 세포 분화는 1,25-디히드록시비타민 D3를 사용하여 실행되며 1,25-디히드록시비타민 D3를 첨가한 지 적어도 24시간 후에는 5-리포옥시게나제 효소 활성을 8배 내지 10배 증가시킬 수 있다. 따라서 5-리포옥시게나제 단백질 합성 유도는 이들 세포에서 5-리포옥사게나제 합성을 방해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 분석하기 위한 시험계로서 사용될 수 있다.
5-리포옥시게나제 생합성의 억제효과는 자극된 세포로부터 분비되는 류코트리엔의 양을 감소시키는 것이다. DMSO-분화된 HL-60 세포는 칼슘이오노포아 A23187로써 자극되면 류코트리엔 B4를 분비한다. 세포 배지로 분비된 류코트리엔 B4는 시판되는 진단 키트(New England Nuclear, Boston, MA)를 사용하여 방사성 면역측정법에 의해 정량될 수 있다. 류코트리엔 B4생산은 세포를 호중구상 세포로 분화시키기 위해 DMSO를 첨가한 지 48시간 후 HL-60 세포에서 검출될 수 있다. 세포(2×105세포/mL)를 1.3% DMSO 존재하에서 증가된 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 48 내지 72시간 동안 처리시킨다. 1% 탈지 소혈청 알부민을 함유하는 듈베코의 인산염 완충 염수를 사용하여 상기 세포를 세척하고 5×1026세포/mL 농도로 재현탁시킨다. 10μM의 칼슘 이오노포아 A23187로써 세포를 15분간 자극시키고, 5×105세포로부터 생산된 LTB4의 양을 제조자가 기술한 바와 같이 방사성 면역측정법으로 측정한다.
[실시예 2]
안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험하기 위한 제2시험계는 5-리포옥시게나제가 기질과 반응하면 불활성인 자살(suicide) 효소라는 사실을 이용한다. 분화된 HL-60 또는 5-리포옥시게나제를 발현하는 다른 세포를 칼슘 이오노포아인 10μM A23187와 처리시키면 5-리포옥시게나제가 세포질졸로부터 막으로 이동되는 것을 촉진시켜 효소를 활성화시킨다. 활성화 및 수회의 촉매 반응 후 효소는 촉매적으로 불활성화된다. 따라서 세포를 칼슘 이오노포아로써 처리시키면 내인성 5-리포옥시게나제를 불활성화시킨다. 세포가 A23187 처리로부터 재생되는 데에는 세포의 류코트리엔 B4합성능에 의해 측정된 바와 같이 약 24시간 걸린다.
준비한 데이타는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 상기 모델계에서 효과를 갖는다는 것을 나타낸다(제9도). DMSO를 사용하여 HL-60 세포를 72시간 동안 분화시키고, 10μM A23187로 처리하고 또 인산염 완충 염수로 3회 세정하여 이오노포아를 제거한다. 10% 우태아 혈청을 1×106세포/ml 농도로 함유하는 RPM I-1640에 상기 세포를 재현탁시키고 최종 농도 25μM 또는 75μM로 올리고뉴클레오티드를 첨가한다. 사용한 올리고뉴클레오티드를 하기에 나타내며, 이에 N은 포스포디에스테르 결합을 나타내고 S는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
2N 2S : 5'- ACGGTGACCGTGTAGGAGGGCATGGCGCGG -3'
8N 8S : 5'- AATGGTGAATCTCACGTGTGCCACCAGCAG -3'
21N 21S : 5'- AGGTGTCCGCATCTA -3'
22H 22S : 5'- TCGGCGCGGCGGTCCAGGTGTCCGCATCTA -3'
결과는 포스포디에스테르 올리고뉴클레도티드가 본 측정법에서 불활성이지만, 그와 유사한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 다양한 정도의 활성을 나타내었다는 것을 제시한다(제9도). 가장 활성이 강한 올리고뉴클레오티드인 8S는 인트론 H에 대한 인트론/엑손 접합부의 3'측을 목표로 한다.
[실시예 3]
안티센스 올리고뉴클레오티드가 완전 세포상에서 발휘하는 용이하게 정량될 수 있는 가장 직접적인 효과는 5-리포옥시게나제 단백질 합성을 특이적으로 억제하는 것이다. 이 수법을 실행하기 위해, 37℃에서 35S-메티오닌(50μCi/mL)을 사용하여 세포를 2시간 동안 라벨링시켜 새로이 합성된 단백질을 라벨링시킨다. 세포를 추출하여 전체 세포 단백질을 용해시키고, 또 5-리포옥시게나제 항체를 사용하여 5-리포옥시게나제를 면역침강시킨다. 이 면역복합체는 단백질 A 세파로오스 비이드에 걸린다. 면역침강된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리해내어 방사성 자기 기록법에 노출시킨다. 면역침강된 5-리포옥시게나제의 양은 주사 농도계로써 측정한다.
이들 실험으로부터 예상되는 것은 다음과 같다. 대조용 세포로부터 면역침강된 5-리포옥시게나제 단백질의 양은 100%로 될 수 있다. 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 1μM, 10μM, 및 30μM를 사용하여 48시간 동안 세포를 처리하면 면역침강된 5-LO를 각각 대조용의 5%, 25% 및 75%로 감소시킨다.
[실시예 4]
세포 균질물에서 5-리포옥시게나제 효소 활성을 측정하는 것 또한 류코트리엔을 합성할 수 있는 효소량을 정량하는데 유용하다. 역상 HPLC를 이용하여 세포 균질물에서 5-리포옥시게나제 효소 활성을 정량하기 위한 방사성 측정법이 개발되었다. 포로테아제 억제제 및 EGTA를 함유하는 완충액 중에서 세포를 초음파로 부순다. 세포 균질물을 8,000×g으로 15분간 원심분리시키고 그 상충액을 5-리포옥시게나제 활성에 대해 분석한다. 세포질졸 단백질을 37℃에서 10μM14C-아라키돈산, 2mM ATP, 50μM 유리 칼슘 및 50mM비스-트리스 완충액(pH 7.0)과 10분간 배양한다. 동 부피량의 아세톤을 부가함으로써 반응을 중지시키고 또 아세트산 에틸을 사용하여 지방산을 추출한다. 역산 HPLC에 의해 Novapak Cl8 칼럼(Waters In c., Millford, MA) 상에서 기질과 반응 생성물을 분리시킨다. Beckman 모델 171 라디오-크로마토그래피 검출기로 방사성 활성 피이크를 검출한다. 디-HETE, 5-HPETE 및 5-HETE로 전환된 아라키돈산의 양은 5-리포옥시게나제 활성의 측도로 이용된다.
5-리포옥시게나제 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 검출하는 수단으로서 효소 활성의 정량 측정법을 이용한 데이타를 제10도에 나타낸다. 염기성 조건하에서 과량의 5-리포옥시게나제 활성을 나타내는 쥐의 호염기성 백혈병 세포주 RBL-1 세포를 측정에 사용하였다. 세포를 50μM 올리고뉴클레오티드와 48시간 동안 또는 50μM 올리고뉴클레오티드와 24시간 동안 처리시킨 다음 추가로 50μM 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 또 세포를 추가로 24시간 동안 배양한다. 세포를 수집하고 또 5,000×g 상충액의 10μg 단백질을 사용하여 5-리포옥시게나제 효소 활성의 양을 측정한다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합을 함유하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다;
r5LO- lS : 5'- AGGCATGGCTCTGGGAAGTG-3'
H5LO-27S : 5'-CGACTCCGTGCTGGCTCTGA-3'
올리고뉴클레오티드 r5LO-IS는 쥐의 5-리포옥시게나제 mRNA의 AUG 해독 개시 코돈에 교잘되는 서열에 해당되는 한편, H5LO-27S는 어떤 공지의 세포성 RNA에도 교잡되지 않는 임의의 서열을 갖는 대조용 올리고뉴클레오티드이다. 그 결과는 양쪽 처리 조건하에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 5-리포옥시게나제의 효소 활성을 각각 48% 및 56%로 감소시킨다는 것을 나타낸다. 대조용 올리고뉴클레오티드 H27S는 1회 투여시에는 5-리포옥시게나제 활성을 현저히 감소시키지 않으나, 2회 투여되면 활성을 17% 정도 억제하였다(제10도).
[실시예 5]
1,25-디히드록시비타민 D3분화된 HL-60 세포에서 5-리포옥시게나제 활성 억제기능에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험하었다. 올리고뉴클레오티드 처리를 위해, 세포를 혈청 유리 배지(Opti-MEM)로 3회 세척하고 또 4×106세포/ml 농도로 재현탁시킨다. 각 올리고뉴클레오티드 처리당 세포 현탁액 5ml를 25cm2조직 배양 플라스크에 넣는다. 각 플라스크에 올리고뉴클레오티드 흡수를 증가시키기 위한 시판되는 352μM DOTMA 및 각 안티센스 올리고뉴클레오티드 1μM를 첨가하였다. DOTMA와 올리고뉴클레오티드 존재하에, 37℃에서 세포를 4시간 동안 배양한 다음 400×g에서 10분 간 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 10% 우태아 혈청, 10μM 올리고뉴클레오티드 및 0.1μM 1,25-디히드록시비타민 D3를 함유하는 10ml RPMI 1640 배지에 상기 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 84시간 동안 분화시킨 후, 100μg의 세포 균질물을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 5-리포옥시게나제 효소 활성을 측정하였다.
상기한 일련의 실험에 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드였다 :
5-‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥-3'
ISIS 1820 CGGTCCAGGTGTCCGCATCT -5'-캡서열에 교잡됨
ISIS 1821 CATGGCGCGGGCCGCGGG -AUG 코돈에 교잡됨
ISIS 1822 GACCGTGTAGGAGGGCAT -AUG 코돈에 교잡됨
ISIS 1820, ISIS 1821 및 ISIS 1822는 비-올리고뉴클레오티드 처리세포와 비교하여 5-리포옥시게나제 효소 활성을 각각 60.9%, 67.9% 및 58.8%로 감소시켰다(제11도). 이들 데이타는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사람의 세포주에서 5-리포옥시게나제 발현을 억제하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
[실시예 6]
안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 쥐 세포에서 5-리포옥시게나제 발현을 억제하는데 효과적이다. 쥐의 호염기성 백혈병 세포(RBL-1)는 분화된 HL-60 세포보다 20배 더 많은 5-리포옥시게나제 효소 활성을 구성적으로 나타낸다. RBL-1 세포를 무혈청 배지중, 16μM DOTMA 존재하에서 1μM 올리고뉴클레오티드와 4시간 동안 처리시켰다. 이후 우태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지중에서 세포를 5μM 올리고 뉴클레오티드와 배양시켰다. 5-리포옥시게나제의 반감기는 약 24시간 이므로, 세포를 5일간 올리고뉴클레오티드와 처리시켰다. 5일간의 말기에 세포를 초음파로 처리시키고 세포 추출물에서 5-리포옥시게나제 활성을 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정하였다.
올리고뉴클레오티드 ISIS 2177, ISIS 1827, 및 ISIS 1831의 5-리포옥시게나제 효소 활성은 모두 35%로 감소된다(제12도). 올리고뉴클레오티드는 모두 포스포로티오에이트 결합을 가졌고 하기와 같은 서열을 가졌다.
5-‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥-3'
SEQ ID NO. 1(ISIS 2177) AAGGCATGGCTCTGGGAAGTG -AUG 코돈에 교잠됨
SEQ ID NO. 2(ISIS 1827) ACATGGGCTA CCAGCAGCTGGGTGG -인트론/엑손 접합부에 교잡됨
SEQ ID NO. 3(ISIS 1831) TTGACTCTGTCACTCAAGAG -인트론/엑손 접합부에 교잡됨
[실시예 7]
다른 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제 반응은 mRNA의 특정 영역이 안티센스 올리고뉴클레오티드와의 억제 반응에 대해 보다 더 민감하다는 사실을 보여준다. RBL-1 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드로 처리시키고, 또 5-리포옥시게나제 효소 활성에 대해 새포를 5일간 측정한 다음 올리고뉴클레오티드와 처리시켰다. 세포를 올리고뉴클레오티드 ISIS 2817, ISIS 2821, 및 ISIS 2822와처리시켰지만, 3'-미해독 서열에 교잡되는 ISIS 2821만이 5-리포옥시게나제 효소 활성을 나타내었다(제13도). 올리고뉴클레오티드는 모두 하기 서열을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이었다 :
5'-……………………………-3'
SEQ ID NO. 4(ISIS 2817) GGAAGGCATGGCTCTGGGAA-AUG 코돈에 교잡됨
SEQ ID NO. 5(ISIS 2821) GCCTGCCCAGAGAGCTGCTG -3'-미해독 서열에 교잡됨
SEQ ID NO. 6(ISIS 2822) GGAAGATCTACAGCCTGCCA -3'-미해독 서열에 교잡됨
[실시예 8]
생쥐에서 5-리포옥시게나제 생산 억제는 하기 실험 순서에 따라서 설명될 수 있다. 아라키돈산을 국부 투여하면 피부에서 류코트리엔 B4, 류코트리엔 C4및 프로스타글라딘 E2가 급격히 생산되어 부종과 세포침윤을 초래한다. 특정 종류의 5-리포옥시게나제 억제제가 본 실험에서 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 실험하기 위해, 2mg의 아라키돈산을 생쥐의 한쪽 귀에 투여하고, 반대측 귀를 대조용으로 하였다. 아라키돈산을 투여한지 1시간후 생검으로 부터 취한 균질물에서 미엘로퍼옥사다제 활성으로써 다형핵 세포 침윤을 측정한다. 귀 두께 및 펀치 생검의 습윤 중량을 측정함으로써 부종 반응을 측정하였다. 생검 시편에서 생산된 류코트리엔 B4의 측정은 조직내에서 5-리포옥시게나제 활성을 직접 측정함으로써 실행한다. 아라키돈산을 투여하기 12시간 내지 24시간 전에 양쪽 귀에 안티센스 뉴클레오티드를 국부적으로 투여하여 화합물의 광학 활성을 측정한다.
[실시예 9]
알레르기성 및 염증성 장애와 외상을 치료하기 위한 5-리포옥시게나제
발현의 억제
본 발명의 범위내에 드는 대표적인 분자를 다음에 설명한다. 본 실시예에 기재된 처음 3개의 부자는 바람직하게는 5-리포옥시게나제 mRNA에 결합된다. 4번째 분자는 5-리포옥시게나제 유전자에 결합되어 3중가닥 구조를 형성하여 5-리포옥시게나제 유전자로 부터 제조된 mRNA의 양을 조절한다.
1) 첫번째 대표적 분자에서, 염기 서열은 초기 코돈에서 부터 리딩 프레임에 이르기 까지 5-리포옥시게나제 mRNA와 상보적이어서 5-리포옥시게나제 mRNA의 총 15개 리보뉴클레오티드 단위체에 교잡된다 :
MetProSer…
5'-…CGCCATGCCCTCCTACACGGTCACCGTGGCCACT…3'
3'-TACGGGAAGGATGTGC-5'
2) 두번째 대표적 분자는 5-리포옥시게나제 mRNA의 해독 종결 시그널 앞의 12개의 인접 리보뉴클레오티드와 상보적이다.
SerValAlalle
5'-…CCGAACAGTGTGGCCATCTGAGCACAC…-3'
3'-TCACACCGGTAG-5'
3) 세번째 대표적 분자는 5-리포옥시게나제 mRNA의 5'-말단 근처의 30개의 인접 리보뉴클레오티드와 상보적이고, 또한 5-리포옥시게나제에 관한 첫번째 대표적 분자에 기재된 서열을 포함한다 :
5'-… CCCCGGCCCGCGCCATGCCCTCCTACACGGT…-3'
3'-GGGGCCGGGCGCGGTACGGGAGGATGTGCCA…-5'
4) 네번째 대표적 분자는 5-리포옥시게나제 유전자에 결합된어 유전자의 발현을 조절할 3중가닥 구조를 형성한다.
5'-GGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCAGCCGGGAGCCTGGA-3'
3'-CCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGTCGGCCCTCGGACCT-5'
PYYYYYPYYYYYPYYYYYPYYYYYPYYPP
다수의 특수 구체예를 설명하지만, 본 발명은 하기한 특허청구 범위에 의해서만 한정된다.
[실시예 10]
포유류 세포에서 발현되는 PLA2이성효소는 여러개 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 활액 PLA2억제에 대해 시험하기 전에, 적합한 이성효소를 발현하는 사람의 세포주를 검색할 필요가 있다. 20개를 상회하는 사람의 세포주를 노던 블럿 분석법과 중합효소 사슬 반응에 의해 SF-PLA2존재 여부에 대해 스크리닝하였다.
2개의 세포주, 즉 A43l 세포와 사람의 일차 표피세포가 SF-PLA2를 발현하는 것으로 밝혀졌다. SF-PLA2의 cDNA 서열로 부터 예상되는 바와 같이(제4도), 양쪽 세포주는 PLA2 효소를 배지로 분비한다. PLA2 효소 활성은 실시예 11에 설명되어 있는 바와 같이, 대장균 측정법 또는 1-팔미토일, 2-l4C-아라키돈일 포스파티딜에탄올아민에 의해 측정될 수 있다. pH 적합성, 칼슘 요구 및 분비된 효소에 대한 기질 특이성은 SF-PLA2에 대한 종래의 보고(Kramer 일행, J. Biol. Chem., 264 : 5768-5775)에서와 동일하였다.
조직 배양 상층액을 역상 HPLC 분석하면 오직 PLA2이성효소 하나만이 A43l 세포로 부터 분비된다는 것을 알 수 있다. 세포 배양 상층액을 14,000×g에서 10분간 원심분리에 의해 정화시켰다. 정화된 상층액(2ml)을 0.1% TFA로 균등화된 C4실리카 매트릭스 칼럼에 부가하였다. 일정한 60ml 0% 내지 100% 아세토니트릴 구배의 칼럼으로 부터 1ml/분으로 단백질을 용출시켰다. 분획을 수집(1ml)하고 실시예 11에 기재된 바와 같이 PLA2효소 활성을 측정하였다. 그 결과는 PLA2 효소 1개만의 A43l 세포로부터 분비된다는 것을 나타낸다(제14도). 그러므로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 SF-PLA2합성반응 억제반응을 시험하는 데 사용될 수 있는 측정법은 성장한 A43l 세포를, 무혈청 배지중의 1μM 올리고뉴클레오티드와 40μM DOTMA가 든 24개 웰 플레이트에 넣어 6시간 동안 처리시키는 것이다. 배지를 1mg/ml 소혈청 알부민과 10μM 올리고뉴클레오티드를 함유하는 DMEM 배지로 교체한다.
1mg/ml BSA를 함유하는 DMEM을 첨가한 지 24시간 후 조직 배양배지로 분비된 PLA2의 양을 실시예 11에 기재된 바와 같이 측정하였다.
본 발명자들은 인터루킨 1β, 종양 괴사인자-α 또는 포르스콜린 및 이소부틸 메틸크산티닌이 아니라 인터페론-γ가 SF-PLA2의 배지로의 분비를, cpm(count per minute)로 측정된 비율로, 증가시킨다는 사실을 밝혀내었다(제15도). 인터페론-γ가 SF-PLA2의 합성을 향상시킨다는 본 발명자들의 발견을 지지하는 것은 SF-PLA2유전자의 5'-미해독 영역에 인터페론 조절 성분이 존재하는 점이다. 따라서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인터페론-γ 처리된 사람의 표피세포로 부터 PLA2의 분비를 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 24-웰 플레이트에서 성장한 세포를 무혈청 배지중의 1μM 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 32μM DOTMA와 4시간 동안 처리시킨다. 무혈청 배지에서 4시간동안 처리한 후, 배지를 KGM(Clonetics, San Diego, CA) 및 5μM 올리고뉴클레오티드로 대체하고 추가로 3시간 동안 배양한다. 인터페론-γ를 세포(300 단위체/ml)에 첨가하고 또 인터페론-γ를 첨가한지 24시간 후 세포로 부터 분비된 PLA2효소 활성의 양을 측정하였다.
사람의 표피세포 종양 세포주(A43l세포) 및 사람의 일차 표피세포로부터 SF-PLA2분비를 검출할 수 있었던 사실은 SF-PLA2발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 피부의 염증성 장애틀 치료하는데 유용하다는 사실을 제시한다. 또한 본 발명자들은 인터페론-γ가 사람의 표피세포로 부터 PLA2분비를 유도하고, 피부에서 인터페론-γ의 염증 활성을 일부 조정한다는 것을 밝혀 내었다.
하기한 올리고뉴클레오티드는 또는 올리고뉴클레오티드 유사물은 SF-PLA2발현 억제에 효과적이다.
5'……………………………………3'
TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG (SEQ ID NO. 7)
TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC (SEQ ID NO. 8)
CAAAGATCATGATCACTGCCA (SEQ ID NO.9)
TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC (SEQ ID NO.10)
CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA (SEQ ID NO.11)
GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG (SEQ ID NO. 12)
CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT (SEQ ID NO.13)
GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC (SEQ ID NO. 14)
[실시예 11]
생화학적 PLA2효소활성 생체외 측정법은 비교적 실행하기 쉽고 처리량이 많은 측정법이다. 가장 일반적인 측정법은14C-지방산으로 예비라벨링된 대장균(Franson 일행, J. Lipid Res., 19 : 18-23, 1978) 또는 순수 인지질 기질(Bennett 일행, Biochem, Pharm., 36 : 733-740, 1987)으로 부터 방사성 라벨링된 지방산 분비를 측정한다. PLA2의 세포 측정법은 방사성 라벨링된 아라키돈산으로 미리 라벨링된 세포로 부터의 지방산 분비를 측정한다. 이와 다르게는, 세포의 배지로 PLA2를 분비하는 세포계에서는 상술한 바와 같이 배양 배지의 직접적 효소 측정법으로 PLA2를 검출할 수 있다. 본 발명자들은 사람의 표피세포의 종량 세포주에서 사람의 활액 PLA2(사람의 SF-PLA2)의 발현을 확인하였다.
A43l 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하는 실험으로 예상된 결과를 다음에 나타낸다. A43l 세포를 100mm 페트리 접시기 접종하여 합류를 수득한다. 이 세포를 5'-GGTCTTCATGGTAAGAGTTCTTGG-3' 서열을 함유하는 1,10 및 50μM 안티센스 올리고뉴클레오티드와 37℃에서 36시간 동안 처리시킨다. 1-아실-2-((1-l4C))아라키돈일 포스파티딜에탄올아민(1mg/ml 데옥시콜레이트중 최종 농도 25μM)으로 부터 아라키돈산의 분비로써 조 세포 균질물에서 포스포리파제 A2효소 활성을 측정한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 1μM, 10μM 및 50μM과 처리된 후 포스포리파제 A2효소 활성을 각각 대조용의 3%, 60% 및 95%로 감소시킨다.
[실시예 12]
PLA2의 체내 측정법은 잘 규정되어 있지 않다. PLA2억제제 검색법으로 인기를 얻고 있는 1기지 측정법은 정제된 PLA2를 쥐의 발에 직접 주사하는 방법이다. 그 결과로 생긴 부종을 PLA2활성의 측도로 본다. 이 측정법은 안티센스 측정법으로서는 부적합하다. PLA2의 합성을 억제하는 인티센스 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 유용한 다른 측정법은 토끼에서 글리코겐 유도 복수, 쥐에서 카제인-유도 복막염 및 토끼에서 그람 네가티브 패혈증쇼크를 포함한다. 각 모델계에서, 체외액중에서 PLA2의 증가가 확인되었다.
[실시예 13]
5-리포옥시게나제 활성화 단백질은 ELISA 측정법을 이용하여 면역반응성 단백질의 양을 측정함으로써 직접적으로 측정할 수 있다. 대장균에서 발현된 FLAP에 대하여 제조된 항체를 상기 측정법에 사용한다. 대장균 발현된 FLAP는 또한 이 측정을 정량하기 위한 표준으로 사용된다. 측정하기 위해, HL-60을 안티센스 올리고뉴클레오티드와 24 내지 72시간 동안 처리시킨다 이 세포를 초음파 처리로써 파괴하고 5000×g에서 15분간 원심분리시킨다. 상충액 분획을 100,000×g에서 1시간 원심분리시키고 또 100,000×g 펠릿을 50mM 트리스-HC1, 140mM NaCl, 0.5mM TBS(TBST)로 웰을 세척하고 또 비오틴일화된 조합 염소 항-토끼 IgG 1 : 1000 희석물과 함께 1시간 동안 배양 한다. 플레이트를 TBST로 세척하고 또 과산화 효소 결합된 스트렙트아비딘 1 : 1000 희석물과 함께 1시간 동안 배양한다. 이 플레이트를 TBST로 다시 세척하고 또 플레이트에 결합된 과산화 효소 라벨링된 스트렙트아비딘의 양을 테트라메틸벤지딘을 사용하여 측정한다
[실시예 14]
안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 5-리포옥시게나제 활성화 단백질(FLAP) 활성 억제는 칼슘 이오노포아-유도된 5-리포옥시게나제가 세포질 졸에서 부터 세포막 분획으로 이동하는 것이 억제되는 것과 뒤이은 류코트리엔 형성 억제에 의해 확인될 수 있다. 측정하기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 HL-60세포 모델의 분화를 이용한다. 세포를 분화시키기 위해 DMSO를 첨가함과 동시에 FLAP mRNA에 교잡 되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 HL-60 세포 배양물에 첨가한다. DMSO를 배양 배지에 첨가한 지 48 내지 72시간 후 세포를 FLAP 활성에 대해 측정한다. 이 세포를 37℃에서 10μM 칼슘 이오노포아와 15분간 자극시킨다. 1000×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수집한다. 세포에 의해 합성되어 상층액으로 분비된 류코트리엔 B4의 양은 실시예 1에 기재된 바와 같이 방사성 면역측정법으로 측정한다. 세포 펠릿을 인삼염 완충 염수로 1회 세척하고 또 실시예 4에 기재된 바와 같이 초음파 처리에 의해 세포를 파괴시킨다. 5000×g 상층액을 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리시키고 또 막 분획(100,000×g 펠릿)과 결합된 5-리포옥시게나제의 양을 웨스턴 블럿팅법으로 측정한다. 세포질졸 및 막 단백질(각 100μg)을 SDS-폴리 아크릴아미드 겔상에서 분리시켜 니트로셀룰로오스지로 옮기며 또 5-리포옥시게나제 항체, 이어125I-단백질 A(Bennett and Crooke, J Biol. Chem., 262 : 18789-13797,1987)와 배양한다. 이 니트로셀룰로오스지를 방사성 자기 측정법에 노출시키고 또 레이저 농도계에 의해 방사성 자기 기록을 주사함으로써 각 세포 분획중에 있는 5-리포옥시게나제의 양을 측정한다.
[실시예 15]
류코트리엔 A2가수분해 효소는 Ohishi 일행(J. Biol. Chem., 262 : 10200-10205, 1987)에 의해 기재된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포의 세포질졸 분획을 직접적으로 효소 측정함으로써 확인된다. 요컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드로써 처리된 HL-60 세포를 초음파 처리에 의해 파괴시키고 또 100,000×g에서 1시간동안 원심분리시켜 세포질졸 분획을 단리한다. 이 반응 혼합물은 100mM 트리스-HCI 완충액(pH=7.8) 및 총 5μL 부피의 효소를 함유한다. 이 효소를 37℃에서 3 내지 4분간 예비배양한 후, 수산화 리튬을 함유하는 에탄올중의 류코트리엔 A4를 최종농도 75μM 및 최종 에탄을 농도 2%로 첨가한다. 이 효소를 37℃에서 1분간 배양하고 또 내부 기준으로 0.3nmol 프로스타글란딘 B2를 함유하는 150 : 50 : 3(v/v/v)의 아세토니트릴/메탄올/아세트산 100μL을 첨가하여 반응을 중지시켰다. -2O℃에서 30분간 배양한 다음 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 단백질을 침강시킨다. 상층액중 120μL를 빼내고 0.35% 이나트륨 EDTA 20μL를 첨가한다. 생성한 용액중 일정량 50μL에서 형성된 류코트리엔 B4의 양은 C18칼럼을 이용한 역상 HPLC에 의해 측정한다. 아세토니트릴/메탄올/물/아세트산(3 : 1 : 3 : 0.006, v/v/v/v, 0.05% 이나트륨 EDTA)을 함유하는 용매를 사용하여 시료를 균일하게 용출시킨다. 270nm에서의 흡수를 조정하여 형성된 류코트리엔 B4의 양을 정량한다.
류코트리엔 A4가수분해 효소에 대한 해독 개시에 상응하는 서열에 교잡되는 서열 5'-TATCTCGGGCATGGCTCTGGG-3'을 갖는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로 HL6O 세포를 처리하여 얻은 결과를 설명한다. 세포를 10μM, 30μM 및 75μM 올리고뉴클레오티드를 사용하여 36시간 동안 처리시킨다. 세포를 수집하고 LTA4가수분해 효소의 양을 전술한 바와 값이 측정한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드로 처리하면 LTA4가수분해 효소 활성을 각각 0%, 15% 및 45%로 감소시킨다.
[실시예 16]
세포 추출물에 있는 PI-PLC 효소 활성 측정법은 시판되고 있는 기질인 방사성 라벨링된 포스포이노시타이드를 사용한다(Hoffman and Majerus, J. Biol., Chem., 257 : 6461-6469, 1982), PI-PLC에 대한 효소측정법은 처리량이 많은 측정법이랄 수 있다. 그러나 효소적 측정법은 특수한 PI-PLC 이성 효소에 대한 화합물의 효과를 판별하지 못하는 대신, 세포 추출액 중에서 총 PI-PLC 활성을 측정한다. 특정 PI-PLC 이성 효소에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 측정하기 위해서는 면역화학적 측정법을 이용할 필요가 있다. 토끼를 NH2-SKRKSTPERRTVQVT-COOH와 같은 펩티드 또는 키홀 꽃양산 조개 헤모시아닌에 결합된 PI-PLC-δ2에 특이적인 유사 펩티드로 면역화시킴으로써 PI-PLC-δ2 특이적 항체를 제조한다. 이 항체는 실시예 9에 기재된 바와 같이 경쟁적 ELISA 측정법에 사용된다.
[실시예 17]
완전 세포에서의 PI-PLC 효소 활성은 3H-이노시톨로 예비라벨링된 세포에서 3H-이노시톨 포스페이트의 형성과 작용물질 자극을 측정하는 것에 의해 직접적으로 측정한다. PI-PLC-δ2 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 스크리닝하기 위해, HL-60 세포를 사용한다. 세포를 37℃에서 20μCi/ml3H-미오이노시톨로써 36시간 동안 라벨링한다. 5-GTGGTGGACATTGTGGCCGCT-3'와 같은 PI- PLC-δ2 mRNA에 특이적으로 교잡되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 부가하고 36시간 동안3H-미오이노시톨로 라벨링한 세포를 헹크스 염 용액(HBSS)으로 세척하여 혼입되지 않은3H-미오이노시톨을 제거하고, 5×106세포/ml 최종 농도로 재현탁시킨다. 세포(0.3ml)를 37℃에서 적합한 작용물질(fMet-Leu-Phe, 표피성장인자, GM-CSF, 감마-인터페론, 혈소판 유도된 성장인자, 류코트리엔 D4등)과 2분간 자극시킨다. 수용성 이노시톨 포스페이트를 0.93ml의 클로로포름/메탄을(1 : 2, v/v)로, 이어 0.3ml 클로로포름 및 0.3ml 물로써 추출한다. 상술한 바와 같이, Dowex AGI×8상에서 크로마토그래피에 의해 이노시톨 포스페이트를 분리한다(Berridge 일행, Biochem. J., 212 : 473-482, 1983).
세포를 기본한 측정법에서 활성 화합물은 생쥐 귀에서 카라게난 유도된 복막염, 아라키돈산 유도된 염증과 같은 다양한 표준 약물학적 측정법으로 활성시험될 수 있다.
[실시예 18]
조효소 A-비의존형 트란스아실라게 효소 활성은3H-1-알킬리조포스파티딜콜린을 기질로 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포로부터 얻은 소포체 분획에서 측정할 수 있다. 본 발명자들은 사람의 전단 구성 백혈병 세포주 U937이 조효소 A-비의존형 트란스아실라제 활성을 측정하는데 좋은 공급원이라는 것을 밝혀내었다. 다양한 기간 동안 처리한 다음 세포를 인산염 완충염수로 세척한 후 10mM 비스 트리스; pH=7.0, 10mM NaCl, 2mM EGTA, ImM MgCl2, 0.1mM 류펩틴 및 10μg/ml 아프로티닌에 107세포/ml 농도로 현탁시킨다. 30% 전력으로 초음파 처리하여 세포를 파괴시키고 또 분별 원심분리에 의해 소포체 분획을 수득한다. 조 균질물을 10,000×g에서 20분간 원심분리시키고, 그 상층액을 100,000×g에서 60분간 원심분리시킨다. 100,000×g 펠릿을 10mM 포스페이트, 150mM NaCL; pH=7.4에 재현탁시키고 측정법에 사용한다. 10 내지 50μg 사이의 단백질을 1μM3H-1-0-알킬 리조포스파티딜콜린, 1mg/ml 소 혈청 알부민과 함께 총 부피 100μL로 37℃에서 10분간 배양한다. 100μL 클로로포름 : 메탄을 : (1 : 2), 100μL 클로로포름 및 100μL IM KCl을 연속해서 부가하여 반응을 중지시킨다. 시료를 진동시키고 10,000×g에서 4분간 원심분리시킨다. 유기상중의 물질을 실리카겔 G 플레이트에 점으로 찍고 클로로포름 : 메탄올 : 아세트산 :물(100 : 60 : 16 : 8)을 함유하는 용액을 사용하여 크로마토그래피시킨다. 플레이트를 요오드 증기로 염색하고, 1-알킬, 2-아라키돈일 포스파티딜콜린에 해당하는 밴드를 모으며, 방사성 활성 물질의 양을 액체 섬광 계수기로 측정한다.
조효소 A-비의존형 트란스아실라제에 대한 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로써 U937 세포를 처리함으로써 예상되는 결과를 다음에 기술한다. U937 세포를 길이 20 염기이고 해독 개시에 해당되는 10 내지 12위치에 CAT 서열을 함유하는 1,10 및 50μM 안티센스 올리고뉴클레오티드를 37℃에서 72시간 동안 처리시킨다. 세포를 수집하고 또 상술한 바와 같이 조효소 A-비의존형 트란스아실라제 활성에 대해 분석한다. 1, 10 및 50μM 농도의 약물로 처리하면 조효소 A-비의존형 트란스아실라제 활성을 각각 4%, 22% 및 72% 감소시킨다
서열목록
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : ISIS 파마슈티칼즈
(ii) 발명의 명칭 :올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절
(iii) 서열의 수 : 14
(iv)주 소:
(A) 받는이 :우드콕 워시번 쿠르쯔 매키빅쯔 노리스
(B) 거리명 : 원 리버티 플레이스-제46층
(C) 도시명 : 필라델피아
(D) 주 명 : 팬실베니아
(E) 국 명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 19103
(v) 컴퓨터 해독 형태 :
(A) 중간형 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동 시스템 : PC-DOS
(D) 소프트웨어 :워드퍼펙트 5.0
(vii) 선행 출원 자료 :
(A) 출원번호 516,969호
(B) 출 원 일 : 1990. 4. 30.
(viii) 대리인 정보
(A) 성 명 :죤 더블유, 칼드웰
(B) 등록번호 : 28,937
(C) 참조/서류번호 : ISIS-182
(ix) 통신 연락처
(A) 전화번호 : (2l5) 568-3100
(B) TELEFAX : (215) 568-3439
(2) 서열 ID NO : 1에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 1 :
AAGGCATGGC TCTGGGAAGT G
(2) 서열 ID NO : 2에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 25
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 2 :
ACATGGGCTA CCAGCAGCTG GGTGG
(2) 서열 ID NO : 3에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 3 :
TTGACTCTGT CACTCAAGAG
(2) 서열 ID NO : 4에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 4 :
GGAAGGCATG GCTCTGGGAA
(2) 서열 ID NO : 5에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 5 :
GCCTGCCCAG AGAGCTGCTG
(2) 서열 ID NO : 6에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 6 :
GGAAGATCTA CAGCCTGCCA
(2) 서열 ID NO : 7에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 7 :
TTCATGGTAA GAGTTCTTGG G
(2) 서열 ID NO : 8에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 8 '
TCTGCCCCGG CCGTCGCTCC C
(2) 서열 ID NO : 9에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(b) 안티센스 여부 :안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 9 :
CAAAGATCAT GATCACTGCC A
(2) 서열 ID NO : 10에 관한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 10 :
TCCCATGGGC CTGCAGTAGG C
(2) 서열 ID NO : 11에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 11 :
CCTGCAGTAG GCCTGGAAGG A
(2) 서열 ID NO : 12에 관한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 12 :
GGAAGGTTTC CAGGGAAGAG G
(2) 서열 ID NO : 13에 관한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 SEQ ID NO : 13 :
CAGAGGACTC CAGAGTTGTA T
(2) 서열 ID NO : 14에 관한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO : 14 :
GGGTGGGTAT AGAAGGGCTC C

Claims (25)

  1. 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA와 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자와 특이적으로 교잡하여 상기 유전자로부터 만들어지는 mRNA의 양을 조절하기 위한 삼중 가닥 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자의 전사 개시 자리, 해독 개시 자리 또는 인트론/엑손 접합부와 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 mRNA의 5' 캡 자리 및 이에 인접하는 서열과 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가스분해효소, 포스포리파제 C 또는 조효소 A-비의존형 트란스아실라제인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  7. 제1항에 있어서, 약 3 내지 약 50개의 소단위로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  8. 제1항에 있어서, 제약학상 허용되는 담체내의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  9. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위들 사이의 연결기중 최소한 일부가 황-함유 종(種)을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  10. 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 하기 서열 중 어느 하나 또는 그 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 을리고뉴클레오티드 유사체 :
    5' 3'
    5- 리포옥시게나제 서열
    TCGGCGCGGCGGTCCAGGTGTCCGCATCTA
    ACGGTGACCGTGTAGGAGGGCATGGCGCGG
    AATGGTGAATCTCACGTGTGCCACCAGCAG
    ATTTGCTGTTGCTGCTTGGTGTGGAAATGC
    CTTGAAAATGGGGTGCACAGCAGGCAGCTG
    CGGTCCAGGTGTCCGCATCT
    CATGGCGCGGGCCGCGGG
    GACCGTGTAGGAGGGCAT
    CTCACGTGTGCCACCAGCAG
    AAGGCATGGCTCTGGGAAGTG (SEQ ID NO. 1)
    ACATGGGCTACCAGCAGCTGGGTGG (SEQ ID NO. 2)
    TTGACTCTGTCACTCAAGAG (SEQ ID NO. 3)
    GCCTGCCCAGAGAGCTGCTG (SEQ ID NO. 5)
    5-리포옥시게나제 활성화 단백질 서열
    TCCAGGAACCCCCAAACGCA
    TTGATCCATGATTGATACTCC
    GGGTGACGATGGCCAACAGG
    GAGTTAGGAAATGAGAAGTG
    SF-PLA2 서열 :
    GCTCCTCCTTGGTGGCTCTC
    AGGGTCTTCATGGTAAGAGT
    CTCTTACCAAAGATCATGATCA
    TTCTGCAGGAGTCCTGTTTTG
    TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG (SEQ ID NO. 7)
    TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC (SEG ID NO. 8)
    CAAAGATCATGATCACTGCCA (SEG ID NO. 9)
    TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC (SEQ ID NO. 10)
    CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA (SEQ ID NO. 11)
    GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG (SEQ ID NO. 12)
    CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT (SEG IN NO.13)
    GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC (SEQ ID NO. 14)
    LTA4가수분해효소 서열 :
    TATCTCGGGCATGGCTCTGG
    CCCAGAAGTCTGTTCAGGAG
    AGCCCTTCTCATAGGGAACT
    CGCAGGTCTTTAATCCACTT
    PI-PLC-δ2 서열 :
    TCGGGTCACTCAGCGCCGAA
    GTGGTGGACATTGTGGCCGCT
    CGCTCTCCCGAACCAGGAAG
    GAACATGAGAGGCCAAAAATG
  11. 제10항에 있어서, 제약학상 허용되는 담체내의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  12. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위를 사이의 연결기중 최소한 일부가 황-함유 종(種)을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  13. 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 인간을 제외한 동물에 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 인간을 제외한 동물내에서 아라키돈산 대사를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 상기 유전자의 전자 개시 자리, 해독 개시 자리 또는 인트론/엑손 접합부와 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA의 5'캡 자리 및 이에 인접하는 서열과 특이적으로 교접할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 단백질이 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가수분해효소, 포스포리파제 C 또는 조효소 A-비의존형 트리스아실라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 올리키고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 하기 서열중 어느 하나 또는 그 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 :
    5' 3'
    5-리포옥시게나제 서열
    TCGGCGCGGCGGTCCAGGTGTCCGCATCTA
    ACGGTGACCGTGTAGGAGGGCATGGCGCGG
    AATGGTGAATCTCACGTGTGCCACCAGCAG
    ATTTGCTGTTGCTGCTTGGTGTGGAAATGC
    CTTGAAAATGGGGTGCACAGCAGGCAGCTG
    CGGTCCAGGTGTCCGCATCT
    CATGGCGCGGGCCGCGGG
    GACCGTGTAGGAGGGCAT
    CTCACGTGTGCCACCAGCAG
    AAGGCATGGCTCTGGGAAGTG (SEQ ID NO. 1)
    ACATGGGCTACCAGCAGCTGGGTGG (SEQ ID NO. 2)
    TTGACTCTGTCACTCAAGAG (520 ID NO.3)
    GCCTGCCCAGAGAGCTGCTG (SEQ ID NO. 5)
    5-리포옥시게나제 활성화 단백질 서열
    TCCAGGAACCCCCAAACGCA
    TTGATCCATGATTGATACTCC
    GGGTGACGATGGCCAACAGG
    GAGTTAGGAAATGAGAAGTG
    SF-PLA2서열
    GCTCCTCCTTGGTGGCTCTC
    AGGGTCTTCATGGTAAGAGT
    CTCTTACCAAAGATCATGATCA
    TTCTGCAGGAGTCCTGTTTTG
    TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG (SEQ ID NO. 7)
    TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC (SEQ ID NO. 8)
    CAAAGATCATGATCACTGCCA (SEQ ID NO. 9)
    TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC (SEQ ID NO. 10)
    CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA (SEQ ID NO. 11)
    GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG (SEQ ID NO. 12)
    CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT (SEQ IN NO. 13)
    GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC (SEQ ID NO. 14)
    LTA4가수분해효소 서열 :
    TATCTCGGGCATGGCTCTGG
    CCCAGAAGTCTGTTCAGGAG
    AGCCCTTCTCATAGGGAACT
    CGCAGGTCTTTAATCCACTT
    PI-PLC-δ2 서열 :
    TCGGGTCACTCAGCGCCGAA
    GTGGTGGACATTGTGGCCGCT
    CGCTCTCCCGAACCAGGAAG
    GAACATGAGAGGCCAAAAATG
  18. 제13항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 뉴클레오티드 단위들 사이의 연결기 중 최소한 일부가 황-함유 종(種)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 아라키돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 아라키돈산 합성 또는 대사의 변화에 의해 조절될 수 있는 질병을 갖고 있는 것으로 의심되는 인간을 제외한 동물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 인간을 제외한 동물의 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 상기 유전자의 전자 개시 자리, 해독 개시 자리 또는 인트론/엑손 접합부와 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 을리고뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 5' 캡 자리 및 이에 인접하는 서열과 특이적으로 교잡할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 단백질이 5-리포옥시게나제, 5-리포옥시게나제 활성화 단백질, 포스포리파제 A2, LTA4가수분해효소, 포스포리파제 C 또는 조효소 A-비의존형 트란스아실라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 제약학상 허용되는 담체내에 있는 방법.
  24. 제19항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 아라카돈산의 합성 또는 대사를 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산과 특이적으로 교잡할 수 있는 하기 서열중 어느 하나 또는 그 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    5' 3'
    5- 리포옥시게나제 서열
    TCGGCGCGGCGGTCCAGGTGTCCGCATCTA
    ACGGTGACCGTGTAGGAGGGCATGGCGCGG
    AATGGTGAATCTCACGTGTGCCACCAGCAG
    ATTTGCTGTTGCTGCTTGGTGTGGAAATGC
    CTTGAAAATGGGGTGCACAGCAGGCAGCTG
    CGGTCCAGGTGTCCGCATCT
    CATGGCGCGGGCCGCGGG
    GACCGTGTAGGAGGGCAT
    CTCACGTGTGCCACCAGCAG
    AAGGCATGGCTCTGGGAAGTG (SEQ ID NO. 1)
    ACATGGGCTACCAGCAGCTGGGTGG (SEQ ID NO.2)
    TTGACTCTGTCACTCAAGAG (SEQ ID NO. 3)
    GCCTGCCCAGAGAGCTGCTG (SEQ ID NO. 5)
    5-리포옥시게나제 활성화 단백질 서열
    TCCAGGAACCCCCAAACGCA
    TTGATCCATGATTGATACTCC
    GGGTGACGATGGCCAACAGG
    GAGTTAGGAAATGAGAAGTG
    SF-PLA2서열 :
    GCTCCTCCTTGGTGGCTCTC
    AGGGTCTTCATGGTAAGAGT
    CTCTTACCAAAGATCATGATCA
    TTCTGCAGGAGTCCTGTTTTG
    TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG (SEQ ID NO. 7)
    TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC (SEQ ID NO. 8)
    CAAAGATCATGATCACTGCCA (SEQ ID NO. 9)
    TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC (SEQ ID NO. 10)
    CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA (SEQ ID NO. 11)
    GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG (SEQ ID NO. 12)
    CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT (SEQ ID NO. 13)
    GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC (SEQ ID NO. 14)
    LTA4가수분해효소 서열 :
    TATCTCGGGCATGGCTCTGG
    CCCAGAAGTCTGTTCAGGAG
    AGCCCTTCTCATAGGGAACT
    CGCAGGTCTTTAATCCACTT
    PI-PLC-δ2 서열 :
    TCGGGTCACTCAGCGCCGAA
    GTGGTGGACATTGTGGCCGCT
    CGCTCTCCCGAACCAGGAAG
    GAACATGAGAGGCCAAAAATG
  25. 제19항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 뉴클레오티드 단위들 사이의 연결기 중 최소한 일부가 황-함유 종(種)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019920702702A 1990-04-30 1991-04-17 올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절 KR970004802B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51696990A 1990-04-30 1990-04-30
US516,969 1990-04-30
PCT/US1991/002628 WO1991016901A1 (en) 1990-04-30 1991-04-17 Oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR970004802B1 true KR970004802B1 (ko) 1997-04-04

Family

ID=24057818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019920702702A KR970004802B1 (ko) 1990-04-30 1991-04-17 올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5530114A (ko)
EP (1) EP0527818A4 (ko)
JP (1) JP2635212B2 (ko)
KR (1) KR970004802B1 (ko)
AU (1) AU649673B2 (ko)
BR (1) BR9106391A (ko)
CA (1) CA2081769A1 (ko)
HU (1) HUT65614A (ko)
WO (1) WO1991016901A1 (ko)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL107150A0 (en) * 1992-09-29 1993-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
US20030045487A1 (en) * 2001-05-25 2003-03-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipase A2, group llA (synovial) expression
WO1995016466A1 (en) * 1993-12-17 1995-06-22 The Ohio State University Antisense oligonucleotides to suppress eicosanoid formation
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US5955496A (en) * 1996-08-13 1999-09-21 The Regents Of The University Of California Dihydroxy-oxy-eicosadienoates
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
EP0986572B2 (en) 1997-06-06 2007-06-13 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US5874235A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 The Johns Hopkins University Screening assays for cancer chemopreventative agents
US6174695B1 (en) 1997-08-12 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Epoxide hydrolase inhibitor methods
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6103496A (en) * 1998-05-29 2000-08-15 Vanderbilt University Isolated and purified 12R-lipoxygenase protein and nucleic acids
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
EP1251181A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-23 Warner-Lambert Company Non-recombinant cell lines capable of expressing predominantly cyclic nucleotide phosphodiesterase 4 (PDE4) subtype B and their use for the screening of PDE4 subtype-specific modulators
KR100496603B1 (ko) * 2001-12-13 2005-06-22 전길자 Ｎ-아실라이소포스파티딜콜린 화합물의 제조 방법
US7105657B2 (en) * 2002-11-08 2006-09-12 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for inhibiting pancreatic cancer metastasis
US20070243632A1 (en) 2003-07-08 2007-10-18 Coller Barry S Methods for measuring platelet reactivity of patients that have received drug eluting stents
WO2005007868A2 (en) * 2003-07-08 2005-01-27 Accumetrics, Inc. Controlled platelet activation to monitor therapy of adp antagonists
JP2007502293A (ja) 2003-08-12 2007-02-08 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー ヒドロキシルアミン置換イミダゾ含有化合物
RU2006105101A (ru) 2003-08-27 2007-10-10 3М Инновейтив Пропертиз Компани (US) Арилокси и арилалкиленокси замещенные имидазохинолины
CA2537763A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 3M Innovative Properties Company Treatment for cd5+ b cell lymphoma
AU2004278014B2 (en) 2003-10-03 2011-04-28 3M Innovative Properties Company Alkoxy substituted imidazoquinolines
US7544697B2 (en) 2003-10-03 2009-06-09 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridines and analogs thereof
JP2007511527A (ja) 2003-11-14 2007-05-10 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー オキシム置換イミダゾ環化合物
US8598192B2 (en) 2003-11-14 2013-12-03 3M Innovative Properties Company Hydroxylamine substituted imidazoquinolines
WO2005051317A2 (en) 2003-11-25 2005-06-09 3M Innovative Properties Company Substituted imidazo ring systems and methods
WO2005066170A1 (en) 2003-12-29 2005-07-21 3M Innovative Properties Company Arylalkenyl and arylalkynyl substituted imidazoquinolines
CA2551399A1 (en) 2003-12-30 2005-07-21 3M Innovative Properties Company Imidazoquinolinyl, imidazopyridinyl, and imidazonaphthyridinyl sulfonamides
US8697873B2 (en) 2004-03-24 2014-04-15 3M Innovative Properties Company Amide substituted imidazopyridines, imidazoquinolines, and imidazonaphthyridines
US20050267145A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-01 Merrill Bryon A Treatment for lung cancer
US8017779B2 (en) 2004-06-15 2011-09-13 3M Innovative Properties Company Nitrogen containing heterocyclyl substituted imidazoquinolines and imidazonaphthyridines
US8026366B2 (en) 2004-06-18 2011-09-27 3M Innovative Properties Company Aryloxy and arylalkyleneoxy substituted thiazoloquinolines and thiazolonaphthyridines
US7897609B2 (en) 2004-06-18 2011-03-01 3M Innovative Properties Company Aryl substituted imidazonaphthyridines
US7915281B2 (en) 2004-06-18 2011-03-29 3M Innovative Properties Company Isoxazole, dihydroisoxazole, and oxadiazole substituted imidazo ring compounds and method
JP5543068B2 (ja) 2004-12-30 2014-07-09 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー キラル縮合［１，２］イミダゾ［４，５−ｃ］環状化合物
JP5313502B2 (ja) 2004-12-30 2013-10-09 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 置換キラル縮合［１，２］イミダゾ［４，５−ｃ］環状化合物
JP2008530022A (ja) 2005-02-04 2008-08-07 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫反応調節物質を含む水性ゲル処方物
AU2006213746A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Oxime and hydroxylamine substituted imidazo(4,5-c) ring compounds and methods
AU2006232375A1 (en) 2005-04-01 2006-10-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 1-substituted pyrazolo (3,4-c) ring compounds as modulators of cytokine biosynthesis for the treatment of viral infections and neoplastic diseases
WO2006107853A2 (en) 2005-04-01 2006-10-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridine-1,4-diamines and analogs thereof
WO2007021735A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-22 William Llewellyn Use of phospholipid arachidonic acids for increasing muscle mass in humans
EP1947942B1 (en) * 2005-08-18 2015-07-29 Accelalox, Inc. Methods for bone treatment by modulating an arachidonic acid metabolic or signaling pathway
WO2007050271A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Wyeth 5-lipoxygenase modulators
WO2008008432A2 (en) 2006-07-12 2008-01-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Substituted chiral fused( 1,2) imidazo (4,5-c) ring compounds and methods
EP2424521A4 (en) 2009-04-29 2015-03-04 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING EPA AND CARDIOVASCULAR AGENT AND METHODS OF USE
CA2868096C (en) 2012-03-28 2019-12-31 Somalogic, Inc. Aptamers to pdgf and vegf and their use in treating pdgf and vegf mediated conditions
CA3221709A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Somalogic Operating Co., Inc. Pdgf and vegf aptamers having improved stability and their use in treating pdgf and vegf mediated diseases and disorders

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
BR9105935A (pt) * 1990-01-11 1992-11-17 Isis Pharmaceuticals Inc Composicao,analogo de oligonucleotideo,oligonucleotideo sequenciado misto,processo para a preparacao de nucleosideos 2'-substituidos,composicao para modular a atividade de rna,processos para modular a producao de uma proteina por um organismo,para tratar um animal,para detectar a presenca ou ausencia de rna,oligonucleotideo ou analogo de analogo de oligonucleotideo resistente a nuclease e processo para tratar um organismo tendo uma doenca

Also Published As

Publication number Publication date
JP2635212B2 (ja) 1997-07-30
EP0527818A4 (en) 1993-09-15
HU9203422D0 (en) 1993-01-28
EP0527818A1 (en) 1993-02-24
US5530114A (en) 1996-06-25
AU7760091A (en) 1991-11-27
AU649673B2 (en) 1994-06-02
HUT65614A (en) 1994-07-28
CA2081769A1 (en) 1991-10-31
WO1991016901A1 (en) 1991-11-14
BR9106391A (pt) 1993-04-27
JPH06501377A (ja) 1994-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR970004802B1 (ko) 올리고뉴클레오티드를 이용한 아라키돈산 대사조절
Sigal The molecular biology of mammalian arachidonic acid metabolism
Haeggstrom et al. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease
Rådmark et al. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease
Yang et al. The role of free fatty acids, pancreatic lipase and Ca2+ signalling in injury of isolated acinar cells and pancreatitis model in lipoprotein lipase‐deficient mice
US7348173B2 (en) Fatty-acid amide hydrolase
Ostrom et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms
ES2258955T3 (es) Acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas.
US5585233A (en) PTP-S31: A novel protein tyrosine phosphatase
US5840511A (en) Methods comprising calcium independent cytosolic phospholipase A/B enzymes
US6232110B1 (en) Coding sequence for protein phosphatase methylesterase, recombinant DNA molecules and methods
Biringer The rise and fall of anandamide: processes that control synthesis, degradation, and storage
US7569669B2 (en) Calcium independent cytosolic phospholipase A2/B enzymes
Popa‐Nita et al. Crystal‐induced neutrophil activation: X. Proinflammatory role of the tyrosine kinase Tec
Cherry et al. Diazepam and rolipram differentially inhibit cyclic AMP-specific phosphodiesterases PDE4A1 and PDE4B3 in the mouse
US7473541B2 (en) Identification, cloning, expression, and purification of three novel human calcium-independent phospholipase A2 family members possessing triacylglycerol lipase and acylglycerol transacylase activities
Lee et al. Partial purification of a diacylglycerol lipase from bovine aorta
Ueda et al. Metabolic enzymes for endocannabinoids and endocannabinoid-like mediators
US5925536A (en) Receptor-type phosphotyrosine phosphatase-β
Rice Secretory type II phospholipase A2 and the generation of intrauterine signals
Zyglewska et al. Quantitative analysis of vascular prostaglandin H synthase mRNA levels by competitive polymerase chain reaction
Zhou et al. Multiple cyclic nucleotide phosphodiesterases in human trabecular meshwork cells
Bosron et al. Human liver cocaine carboxylesterases
Bartle et al. Regulation of Plasma Low Density Lipoprotein Levels Biopharmacological Regulation of Protein Phosphorylation Calcium-Activated Neutral Protease Microbial Iron Transport Pharmacokinetic Drug Interactions
Mueller Leukotriene A4 hydrolase: identification of amino acid residues involved in catalyses and substrate-mediated inactivation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee