KR0164235B1

KR0164235B1 - 신규한 세포 표층 단백질

Info

Publication number: KR0164235B1
Application number: KR1019940703193A
Authority: KR
Inventors: 히사시 가와사키; 마코토 쓰치야; 기요시 미와; 요시오 가와하라
Original assignee: 도바 다다스; 아지노모토가부시키가이샤
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1999-01-15
Also published as: JP3541385B2; ATE165606T1; DE69409895T2; CN1101208A; US5547864A; CN1124339C; KR950700329A; ES2115208T3; US5681717A; DE69409895D1; BR9403528A; EP0644200B1; EP0644200A1; CN1036850C; EP0644200A4; WO1994015963A1; CN1160081A

Abstract

을 갖고, 분자량이 약 63,000 달톤인 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로부터 유도되는 신규한 세포 표층 단백질의 암호화 유전자를 포함하는 DNA 단편을 코리네포름 세균에 도입시켜 형질전환체를 제조한다.

새로이 제조된, 신규한 세포 표층 단백질이 부족한 이러한 형질전환체 또는 균주는 L-아미노산 발효법에 의해 L-아미노산을 포함한 유용물질을 제조하는데 사용된다.

Description

[발명의 명칭]

신규한 세포 표층 단백질

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 발효 과정을 L-아미노산과 같은 유용물질의 생성에 유용한 미생물의 육종 및 상기한 미생물을 사용하여 발효과정으로 L-아미노산과 같은 유용물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로부터 유도된 신규한 세포 표층 단백질, 이 단백질의 암호화 유전자를 포함하는 DNA 절편 및 이의 적용 용도에 관한 것이다.

[배경 기술]

코리네포름(Coryneform) 세균은 L-글루탐산 또는 L-리신과 같은 L-아미노산을 대량으로 생성하는 미생물이며, L-아미노산의 생산성을 향상시키려는 목적으로 이들 미생물을 육종하였다. 지금까지 유전자 조작 기술을 이용하여 아미노산-생성세균을 육종하기 위한 많은 연구가 행해졌으며 보고되어 있다[참조: Biotechnology letters, 2 (1980) 525-530, Appln. Environ. Microbiol., 144 (1979) 181-190, Abstract of Lecture for the Meeting of the Society of Agricaltural Chemical of Japan (1981) 8]. 그러나, 이들은 모두가 재료로서 아미노산 생합성 시스템내 유전자를 이용함으로써 세포당 목적 아미노산의 생산성을 향상시키려는 것으로써 세포 표면 구조물의 작용을 분석함으로써 생산성을 향상시키려는 것이 아니었다.

아미노산을 발효과정으로 제조하는 경우, 생성된 아미노산을 정제하는 과정에서 통상 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였으나, 세균 세포가 발효 배지내에 잔류하는 경우, 발효 배지를 컬럼에 통과시킬때 이온 교환 수지 컬럼이 막히게 되므로, 발효 배지로 부터 세균 세포를 제거시키는 단계가 필요하다. 이 단계는 통상 원심분리, 여과등으로 수행되며, 이러한 세포 분리 조작이 면해지거나 단순화되는 경우 산업적으로 매우 유용할 것이다.

미생물 종류에 따라 배양후 미생물 세포가 응집등에 의해 배지내에 침전되면, 이러한 미생물에 대한 배양 배지로부터 세포의 분리가 극히 용이함이 공지되어 있다. 그러나, 이러한 특성을 가지면서 아미노산 생성에 사용되는 코리네포름 세균은 보고된바 없으며 응집 또는 침전 특성을 갖는 미생물 세포를 제공하는 방법이 아직까지는 널리 알려지지 않았었다.

제WO 93/03158호의 공개 공보에는, 본 발명의 K-단백질과는 유사하나 K-단백질과는 명백히 다른 신규한 세포 표층 단백질이 기술되어 있다. 또한, 이 공개 문헌에는, 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드를 이용하는 단백질 발현-분비 시스템이 기술되어 있으나, 아직까지 이러한 단백질이 코리네포름 세균의 영양소 삽입 및 세균 세포의 응집 특성에 기여하는지에 대해서는 알려져 있지 않다.

또한, 코리네포름 세균은 L-아미노산-생성 세균으로서 산업적으로 이용되고 있으나, 최근들어 이 세균이 고도의 분비성 세균이라는 것이 밝혀졌으며, 바실러스속 세균에 대에 이미 실용화된 이종 단백질의 생성에 이 세균을 이용하려는 시도가 있었다. 상술한 국제 공개 공보 제WO 93/03158호는 또한 이러한 종류의 기술을 기술하고 있다.

본 발명에 의해 해결하려는 주제는 코리네포름 세균의 영양소 삽입에 기여하는 신규한 세포 표층 단백질 및 이의 유전자를 수득하고, 코리네포름 세균의 세포에서 유전자 증폭에 의해 수득되는 형질전환체를 수득하는 것이다. 또한 본 발명의 주제는 형질전환용 숙주로서 L-아미노산과 같은 유용 물질을 생성하는 활성을 갖는 코리네포름 세균을 사용하고, 상술한 숙주 세균을 이용하여 발효 과정에 의해 L-아미노산과 같은 유용 물질을 제조하는 방법을 개선시키며, 아미노산 생성과정을 단순화시키기 위해 신규한 세포 표층 단백질이 부족한 응집 특성을 갖는 코리네포름 세균을 수득하는 것이다.

[발명의 개시]

진지한 연구의 결과, 본 발명자들은 세균의 영양소 삽입에 기여하는 신규한 세포 표층 단백질 및 이의 유전자를 얻는데 성공하였으며, 이로써 본 발명이 완성되었다.

구체적으로, 본 발명은 분자내 2개의 서열

을 갖고, 분자량이 약 63,000 달톤인, 브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유도되는 신규한 세포 표층 단백질, 이 단백질의 암호화 유전자를 포함하는 DNA 단편, 이 DNA단편을 코리네포름 세균의 세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터와 결합시켜 수득된 재조합 DNA, 코리네포름 세균의 세포에 이 DNA 단편을 도입시키고 증폭시켜 수득된 형질전환체 및 L-아미노산과 같은 유용 물질을 생성하는 활성을 갖는 형질 전환체를 배양 배지에서 배양하고 배양 배지에 유용 물질을 생성 및 축적시킨후, 배양 배지로부터 유용물질을 수집하는 단계를 포함하는 발효 과정에 의해 L-아미노산과 같은 유용물질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포 응집 특성을 지니며, 상술한 세포 표층 단백질 또는 코리네포름 세균의 세포 표면에 존재하는 상술한 단백질과 실질적으로 동일한 단백질이 결핍된 코리네포름 세균을 제공한다.

본 발명은, 또한, 세포 표층 단백질의 암호화 유전자 또는 상술한 단백질과 실질적으로 동일하고 코리네포름 세균의 세포 표면에 존재하는 단백질의 암호화 유전자가, 세포 표층 단백질의 암호화 유전자의 적어도 일부를 포함하는 DNA 단편과 이 DNA 단편과 동일하거나 상동성인 염색체상의 DNA 서열과의 상동 재조합에 의해 파괴되는, 세포 응집 특성을 갖고 세포 표층 단백질이 결핍된 코리네포름 세균을 제공한다.

본 발명은 또한 L-아미노산과 같은 유용 물질을 생성하는 활성을 가지며, 상술한 신규한 세포 표층 단백질이 결핍되고, 세포 응집 특성이 있는 코리네포름 세균을 배양하고, 유용물질을 배양 배지에 생성 및 축적시킨 후, 유용물질을 배양 배지로부터 수집하며, 추가로 배양 완료후 배양 배지를 정치시켜 코리네포름 세균의 세포를 침전시키는 단계를 포함하여, 유용물질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 언급되는 코리네포름 세균은, 하기에서 기술되는 바와 같이, 간상, 호기성, 그람-포지티브, 비-항산성 및 무포자성인[문헌(참조: Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, 599p (1974))에서 정의되는 바와 같음] 미생물 그룹이다. 이러한 코리네포름 세균에 속하는 특정 미생물도 또한 하기에서 간단히 코리네포름 세균으로 언급될 수있다. 또한, 본 발명에 따라 세포 표층 단백질이 결핍된 코리네포름 세균 및 세포 표층 단백질의 암호화 유전자가 파괴된 코리네포름 세균은 때때로 K-단백질-결핍 균주로 총체적으로 언급될 수 있다.

(1) 신규한 세포 표층 단백질, 이의 유전자, 이의 형질전환체 및 L-아미노산의 제조방법

본 발명의 신규한 세포 표층 단백질은 하기와 같이 수득된다. 브레비박테리움 락토페르멘툼의 세포, 예를 들어 균주 2256(ATCC 13869)를 예를 들어 강력 초음파기(OHTAKE 5202PZT)를 사용하여 붕괴시킨후, 세포 용해물을 4℃에서 5분동안 3,000xg의 조건 보다 강력한 조건, 바람직하게는, 4℃ 에서 1분동안 12,000xg의 조건하에 원심분리시켜 상등액을 회수한다. 이어서, 상등액을 4℃ 에서 20분동안 100,000xg의 조건보다 강력한 조건, 바람직하게는, 4℃ 에서 30분동안 100,000xg의 조건하에 원심분리시키고, 침전물을 세포 표층 분획으로서 회수한다. 이 분획내에서 분자량 63,000 주위에 다량 존재하는 단백질이 본 발명에 따른 신규한 세포 표층 단백질, 즉 K-단백질이다.

K-단백질은 하기와 같이 정제된다. 제조된 세포 표층 분획은 세포질막 및 세포 벽 모두를 포함한다. 표면 활성제를 사용하여 세포질막을 용해시켜 이들을 분리시킨다. 용해 정도는, 예를 들어 표면 활성제의 종류 및 농도, 용해 공정의 시간 및 온도, 및 부가 글리세롤 및/또는 NaCl의 농도에 따라 다르므로, 본 발명은 정제를 위한 최적 조건이 밝혀지는 경우에만 완성될 수 있다. 최적 조건의 결정은 본 발명에 따라 최초로 확립되었다. 즉, 세포 표층 분획 3.0㎍을 1.25%(w/v) SDS 를 포함하는 완충용액(50mM 인산칼륨, pH 8.0, 0.1mM 디티오트레이톨) 1㎖에 가하고, 4 내지 90℃, 바람직하게는 37℃에서 30분 이상, 바람직하게는 1 시간 동안 유지시킨 후, 145,000xg의 20분의 조건보다 강력한 조건, 바람직하게는 30분 동안 145,000xg의 조건하에 원심분리시키고, 침전물을 회수한다. 침전물을 0.1% SDS를 포함하는 50mM 인산칼륨(pH 8.0)에 현탁시켜 현탁액이 0.01 내지 10㎍ 단백질/㎕, 바람직하게는, 0.2㎍ 단백질/㎕을 포함하게 한 후, 약 3 분동안 비등시켜 용해시킨다.

K-단백질의 분자량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 에서의 이동성으로 부터 평가한다[참조: Gel Electrophoresis of Proteins, IRL Press (1981) B.D. Hammes, et al]. K-단백질의 분자량은 약 63,000으로 평가된다.

K-단백질의 아미노산 서열은 하기와 같이 결정한다. 정제된 K-단백질을 0.1% SDS를 포함하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.3)에 현탁시켜 현탁액이 10㎍ 단백질/㎖ 내지 2㎎ 단백질/㎖, 바람직하게는, 200㎍ 단백질/㎖을 포함하게 하고, 현탁액을 약 5분동안 비등시켜 K-단백질을 용해시킨다. 용액을 냉각시킨후, 용액을 엔도프로테나제 Lys-C(Boeringer Manhaim Co.)와 함께 가해 표면 활성제중 불용성인 단백질 분획 및 Lys-C의 비가 약 10:1 내지 200:1, 바람직하게는, 50:1(wt/wt) 이도록 하고, 30분 이상 동안 37℃에서, 바람직하게는, 3시간 동안 37℃에서 항온처리한다.

Lys-C로 부분적으로 분해된 K-단백질을 역상 크로마토 그래피로 분획화시킨다. 시판 컬럼을 크로마토그래피를 위해 적당히 선택할 수 있으며, 예를 들어 Senshu pac VP-318-1251 4.6Ψx250㎜이 사용될 수 있다. 용출은 CH₃CN-0.1% TFA와 같은 구배 용액으로 수행한다. 유속은 1㎖/분일 수 있다. 이렇게 수득된 분획중, 펩타이드 함량이 큰 분획을 사용하여 아미노산 서열을 결정한다. 결정 방법은 공지 방법[참조: P. Edman, Arch. Biochem. 22 475 (1949)]으로, 예를 들어, 업체[Applied Biosystems Co.]의 가스상 서열분석기 470-A를 사용하고 제조자의 안내서에 따른다.

K-단백질은 분자내에 다음 2개의 서열을 갖는다.

K-단백질 유전자는 다음과 같이 분리된다. 먼저, 염색체 DNA를 브레비박테리움 락토페르멘툼, 예를 들어 균주 2256(ATCC 13869)으로부터 추출하고, [예를 들어 문헌(참조: H. Saito and K. Miura. Biochem. Biophys. Acta 72, 610 (1963)에 기술된 방법을 이용할 수 있다], 적합한 제한 효소로 분해시킨다. 염색체 DNA의 분해 정도가 반응 조건(예: 반응시간)의 조절로 조절되는 경우, 각종 제한 효소를 사용할 수 있다.

DNA 단편 및 에스케리키아 속에 속하는 미생물 세포에서 복제할 수 있는 벡터 DNA를 결합시켜 재조합 DNA를 형성하고, 에스케리키아 세균, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 균주 JM109를 재조합 DNA로 형질전환시켜 게놈성 DNA 라이브러리를 제조한다. K-단백질 유전자는 탐침으로서 공지된 아미노산 서열로부터 유추된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 합성 DNA를 사용한 콜로니 하이브리드화로 라이브러리로 부터 분리시킬 수 있다.

구체적으로, 브레비박테리움 락토페르멘툼 균주 2256 (ATCC 13869)의 염색체 DNA를 제한 효소, 예를 들어 Sau3AI를 사용하여 30℃ 보다 높은 온도, 바람직하게는 37℃에서 1 내지 10단위/㎖의 효소 농도로 다양한 시간(1분 내지 2시간)동안 부분적으로 분해시켜 다양한 크기의 염색체 DNA 단편의 혼합물을 수득한다. 에스케리키아 세균의 세포내에서 복제할 수 있는 벡터 DNA를 염색체 DNA를 분해하는데 사용된 제한 효소 Sau3AI과 같이 동일한 말단 염기 서열을 생성하는 제한효소, 예를 들어 BamHI을 사용하여 30℃보다 높은 온도에서, 1 내지 100단위/㎖의 효소 농도로, 1시간 초과, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 완전히 절단시켜, 절단되고 선형화된 DNA를 수득한다. 이어서, 상술한 바와 같이 수득된 브레비박테리움 락토페르멘툼 균주 2256 (ATCC 13869)으로부터 유도되는 K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편 및 선형화된 벡터 DNA를 포함하는 혼합물을 혼합하고, DNA 리가제, 바람직하게는 T4 DNA 리가제를 사용하여 4 내지 16℃의 온도에서 1 내지 100 단위의 효소 농도로 1시간 초과, 바람직하게는 6 내지 24시간 동안 결합시켜 재조합 DNA를 수득한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 벡터 DNA로서, 플라스미드 벡터 DNA가 바람직하며, 예를 들어 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, 및 RSF1010을 언급할 수 있다. 또한, 파아지 DNA 벡터도 사용될 수 있다. K-단백질 유전자를 효과적으로 발현시키기 위해, 미생물내에서 작동하는 프로모터, 예를 들어 lac, trp, PL도 또한 사용할 수 있다. 본원에서 언급되는 재조합 DNA는 트랜스포존[참조: Berg. D.E. and Berg. C.M. Bio/Technol., 1 417 (1983)]을 사용하는 방법, Mu 파아지 [참조: 일본국 공개 특허 공보 제90-109985호], 또는 상동성 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]에 의해 K-단백질 유전자를 염색체에 통합시켜 수득된 재조합 DNA를 포함할 수 있다.

유전자 라이브러리는, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 K-12, 바람직하게는 JM109를 상술한 재조합 DNA로 형질전환시켜 제조한다. 유전자 라이브러리를 제조하는 방법은 몰리큘라 클로닝 제2판[참조: Cold Spring Harbor Press (1989) Maniatis, et al]에 상세히 기술되어 있다. 형질전환은 문헌[참조: D.M. Morrison, Methods in Enzymology 68, 326, 1979]의 방법에 의해서나 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA 투과성을 향상 시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)] 의해 수행할 수 있다.

계속해서, K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 콜로니 하이브리드화 방법에 의해 유전자 라이브러리로부터 분리한다. 콜로니 하이브리드화는 몰리큘라 클로닝 제2판[참조: Cold Spring Harbor Press (1989) Maniatis, et al]에 기술된 바와 같은 방법에 따라 수행할 수 있다.

콜로니 하이브리드화에 사용되는 DNA 탐침으로서, 정제된 K-단백질의 아미노산 서열로부터 유추된 염기 서열을 갖는 합성 DNA를 사용한다. 예를 들어, Applied Biosystems Co.에 의해 제조된 DNA 합성기를 사용하여 합성된 서열 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3'(서열 확인 번호 3)을 갖는 30mer 올리고뉴 클레오타이드가 바람직할 수 있다. 서열의 결정시, 한 종류의 아미노산 잔기에 상응하는 다수의 코돈이 뚜렷히 장애가 될 수 있다. 이에 비추어, 각각의 아미노산에 상응하는 코돈의 축퇴성 정도가 낮은 영역내에서 선별하거나 브레비박테리움속의 코돈 사용을 참조하여 서열을 결정한다. 올리고뉴클레오타이드는 업체[Applied Biosystems Co.]의 DNA 합성기(모델 380B)를 사용하고 포스포르아미다이드 방법[참조: Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)]으로 통상적으로 합성할 수 있다.

달리, K-단백질 유전자는 예를 들어 문헌[참조: H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)]의 방법에 의해 수득된 염색체 DNA로부 PCR(폴리머라제 연쇄 반응: White, T.J. et al: Trends Genet, 5, 185 (1989))에 의해서 K-단백질 유전자를 증폭시켜 수득할 수도 있다. PCR에 사용되는 DNA 프라이머는 K-단백질 유전자의 전체 또는 일부 영역을 포함하는 이본쇄 DNA의 양 3' 말단의 서열에 상보적이다. K-단백질 유전자의 일부 영역만을 증폭시키는 경우, 탐침으로서 상술한 DNA 단편을 사용하여 유전자 라이브러리로부터 전체 K-단백질 유전자를 포함한 DNA 단편을 스크리닝해야 한다. 전체 유전자를 증폭시키는 경우에, K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의한 PCR 반응 혼합물의 분리후 아가로즈 겔로부터 목적 DNA 단편을 포함하는 밴드를 절단하여 회수할 수 있다.

DNA 프라이머로서, 정제된 K-단백질 아미노산 서열로 부터 유추된 염기 서열을 갖는 합성 DNA를 사용한다. 서열 결정시, 일종의 아미노산 잔기에 상응하는 다수의 코돈이 존재하므로 뚜렷한 장애가 된다. 이에 비추어, 각각의 아미노산에 상응하는 코돈의 축퇴성 정도가 낮은 영역내에서 선별하거나 브레비박테리움속의 코돈 사용을 참조하여 서열을 결정한다. DNA는 업체[Applied Biosystems Co.]의 DNA 합성기 모델 380B를 사용하고 포스포르아미다이드 방법으로 통상적으로 합성할 수 있다. PCR 반응은 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 공급자에 의해 제시된 방법에 따라 Takara Shuzo Co. 의 DNA Thermal Cycler 모델 PJ 2000으로 수행할 수 있다.

전체 K-단백질 유전자 또는 PCR 반응에 의해 증폭된 K-단백질 유전자의 일부 영역을 포함하는 DNA 단편을 에스케리키아 속에 속하는 세균 세포에서 복제할 수 있는 벡터 DNA에 결합시켜 재조합 DNA를 형성한다. 이어서 재조합 DNA를 에스케리키아속에 속하는 세균의 세포에 도입한다. 벡터 DNA 및 본원에 이용된 형질 전환 방법은 전술한 바와 동일하다. K-단백질 유전자의 단지 일부 영역만을 증폭시키는 경우에, 전체 K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 절편을 탐침으로서 상술한 DNA 단편을 사용하여 유전자 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 분리 방법으로서, 전술한 콜로니 하이브리드화 방법이 이용될 수 있다.

K-단백질 유전자를 포함하는 분리된 DNA 단편이 K-단백질 유전자를 포함하는가의 여부는, 콜로니 하이브리드화 또는 PCR에 사용되는 합성 DNA를 프라이머로 사용하여 DNA 단편의 뉴클레오타이드를 서열분석하고 결정된 뉴클레오타이드 서열이 상술한 아미노산 서열을 암호화하는가를 확인함으로써 확인된다. 뉴클레오타이드 서열은 디데옥시 방법[참조: Molecular Cloning second edition(Cold Spring Harbor Press (1989), Maniatis et al)]에 의해 결정될 수 있다.

K-단백질이 코리네포름 세균의 영양소를 혼입하는데 기여하는 신규한 세포표층 단백질인가의 여부는, K-단백질-결핍 균주를 제조하고 K-단백질-결핍 균주가 암모늄 이온을 혼입시키는 활성을 측정하여 확인할 수 있다. 이때, 암모늄 이온 혼입 활성 활성 수치가 K-단백질이 충분한 균주의 암모늄 이온 혼입 활성시의 수치와 비교하여 현저히 감소됨을 확인하였다.

K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 코리네포름 세균 세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터와 결합시켜 수득하는 재조합 DNA, 세포에서 DNA 단편의 도입 및 증폭에 의해 수득된 코리네포름 세균의 형질전환체 및 L-아미노산 생산성을 갖는 상술한 형질전환체를 배양하고, 배양 배지에 L-아미노산을 생성 및 축적시킨후, 배양배지로부터 L-아미노산을 수집하는 단계를 포함하는 발효과정으로 L-아미노산을 제조하는 방법에 대해 설명할 것이다.

본 발명에서 언급되는 코리네포름 세균, 예를 들어 브레비박테리움 또는 코리네박테리움에 속하는 미생물은, 간상, 호기성, 그람-포지티브, 비-항산성 및 무포자성 미생물 그룹[문헌(참조: Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, 599p(1974))에서 정의되는 바와 같음]이다. 브레비박테리움 또는 코리네박테리움의 미생물중, 하기 기술되는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 L-글루탐산 생성 세균이 본 발명에 사용될 수 있다.

브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 글루탐산 생성 세균의 야생형 균주의 예로서 다음이 언급될 수 있다:

브레비박테리움 또는 코리네박테리움의 세포에서 복제할 수 있는 어떠한 벡터 DNA도 본 발명에 사용할 수 있다. 구체적으로 다음이 예시될 수 있다:

벡터 DNA는 유일한 부위에서 벡터 DNA를 절단하는 제한 효소로 절단되거나, 다수의 인지 부위에서 DNA를 절단하는 제한 효소로 부분적으로 절단된다.

벡터 DNA는 K-단백질 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 절단에 사용되는 제한효소로 절단된 후 DNA 단편에 결합된다. 벡터 DNA가 K-단백질을 암호화하는 DNA 단편의 말단부와 다른 말단부를 형성하는 제한 효소로 절단되는 경우, 선형화된 벡터의 말단부에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 링커가 DNA 단편의 양말단부에 결합되며, 이어서, 링커-테일링된 DNA 단편이 벡터 DNA와 결합된다.

벡터 DNA 및 L-단백질 유전자를 암호화하는 DNA 절편이 결합된 생성된 재조합 DNA는, 에스케리키아 콜라이 K-12에 대해 보고된 바와 같이 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA 투과성을 향상시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol., Biol., 53 159 (1970)]에 의하거나 바실러스 서브틸리스에 대해 보고된 바와 같이 세포가 DNA를 혼입할 수 있는 대수기의 세포(소위 컴피턴트 세포라 불림)에 DNA를 도입하는 방법[참조: Duncan, C.H. Wilson, G.A. and Young, F.E. Gene, 1, 153 (1977)]에 의해 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 수용체에 도입될 수 있다. 달리, 재조합 DNA는, 세포를 바실러스 서브틸리드, 악티노마이세테스(Actinomycetes) 및 효모에 대해 알려진 바와 같이 재조합 DNA를 용이하게 혼입할 수 있는 원형질체 또는 스페로플라스트로 전환시키킴으로써 세균 세포로 도입될 수 있다[참조: Chang, S. and Choen, s. N., Molec. Gen., Genet.,m 168 111 (1978); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).

원형질체 방법에서, 상술한 바실러스 서브틸리스에 이용된 방법에 의해 충분히 높은 빈도로 형질전환이 일어날 수 있으며, 일본국 공개 특허 공보 제82-183799호에 기술된 바와 같이 DNA를 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 알콜 및 이가 금속 이온의 존재하에 코리네박테리움 또는 브레비박테리움의 원형질체내로 삽입시키는 방법도 또한 이용될 수 있다. 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 알콜 대신에 카복시메틸 셀룰로주, 덱스트란, 피콜 또는 불로닉(Bulronic) F68 (Selba Co.제조)을 첨가하여 DNA 혼입을 촉진시키는 방법에 의해서도 유사한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 재조합 DNA는 전기 펄스 방법(또한 전기천공법 이라고도 불림)에 의해 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 수용체 세균에 도입할 수 있다[참조: Sugimoto, et al., 일본국 공개 특허 공보 제90-207791호].

K-단백질을 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA를 갖는 상술한 바와 같은 방법으로 수득되는 L-아미노산 생성 형질전환체를 배양하고, 목적 L-아미노산을 생성하며, 배양 배지에 축적시킨후, 수집한다.

본 발명에 사용된 L-아미노산 생성용 배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요한 경우 기타 유기 성분을 포함하는 유용한 배양 배지이다.

탄소원으로서, 당류(예: 글루코즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈, 또는 전분 가수분해물), 알콜(예: 글리세롤 또는 소르비톨), 및 유기산(예: 푸마르산, 시트르산 및 숙신산)이 사용될 수 있다.

질소원으로서, 무기 암모늄염(예: 황산암모늄, 염화 암모늄 및 인산암모늄), 유기 질소(예: 대두의 가수분해물), 암모니아 기체 및 수산화암모늄이 사용될 수 있다.

유기 마이크로-영양소로서, 배양 배지는 적당량의 비타민 B1 또는 효모 추출물과 같은 필요 물질을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 필요한 경우 소량의 인산칼슘, 황산 마그네슘,철이온, 망간 이온 등을 첨가한다.

배양은 배양하는 동안 30 내지 45℃의 온도 및 pH 5 내지 7로 조절하면서 16 내지 72시간동안 호기성 조건하에 수행하는 것이 바람직하다. pH 조절을 위해 무기 또는 유기 산성 또 알칼리성 물질 및 또한 암모니아 기체등을 사용할 수 있다.

L-아미노산은 통상의 이온 교환 수지 방법, 침전 방법 및 기타 공지 방법을 조합하여 발효 액체로부터 수집할 수 있다.

코리네포름 세균은 L-아미노산을 다량으로 생성하며 발효과정에 의해 L-아미노산을 생성하는데 일반적으로 사용되어온 미생물이다. 또한, 코리네포름 세균의 고분비 특성을 다양한 물질의 생성에도 이용하여 왔다.

K-단백질이 세포 표층에 존재하고 영양소를 세포질로 혼입시키는데 기여하는 것으로 간주되므로, K-단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 세포에 도입시키고 복제 시켜 수득된 코리네포름 세균의 형질전환체가 유용 물질의 생산성을 갖는 경우, 형질전환체를 배양 배지에서 배양하고, 유용물질을 배양 배지에 생성 및 축적시킨 후, 배양 배지로부터 유용물질을 수집하는 단계를 포함하는 발효 과정으로 유용물질을 제조하는 방법이 또한 개선될 수 있는 것으로 간주된다.

유용물질을 제조하기 위해 상술한 방법은 주요부에 대해 상술한 아미노산 제조 방법과 동일하다.

본원에서 언급되는 유용 물질은 조미료용 원료로서의 핵산을 포함한다. 핵산을 생성하는 코리네포름 세균은, 예를 들어 일본국 특허 공보 제82-22558호에 기술된 바와 같이 코리네박테리움 에퀴이(Corynebacterium equi) AJ 11347을 포함한다.

다른 한편으로, 유용 물질은 외래 단백질을 의미한다. 즉, 사람 인터페론, 사람 인터루킨 또는 사람 호르몬, 효소 또는 항체와 같은 생리학적 활성 물질을 언급할 수 있다. 미생물을 사용하여 외래 단백질을 생성하는 방법은 주로 에스케리키아 또는 바실러스에 대해서 공지되어 있으며, 유사한 기술이 또한 코리네포름 세균에 대해서도 개발되었다. 이 기술은 기본적으로 코리네포름 세균 세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터와 코리네포름 세균 세포에서 작용할 수 있는 프로모터 및 외래 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 결합시키고, 재조합 DNA를 코리네포름 세균으로 도입시키며, 재조합 DNA 상의 단백질 암호화 DNA의 발현을 통해 단백질을 생성하는 단계를 포함한다. 이 기술은, 예를 들어 일본국 공개 특허 공보 제87-151184호 또는 제87-244382호에 기술되어 있다.

(2) K-단백질-결핍 균주 및 이들을 사용하여 L-아미노산을 제조하는 방법

상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 처음으로 밝혀진 K-단백질이 코리네포름 세균의 영양소 혼입에 기여한다는 것이 확인되었으며, 또한 코리네포름 세균이 또한 세균 세포의 응집 특성에 기여하고 K-단백질이 결핍된 코리네포름 세균이 응집 특성을 나타낸다는 것이 본 발명에 의해 기술된다.

K-단백질-결핍 균주는 예를 들어 브레비박테리움 락토페르멘툼의 K-단백질 유전자에 K-단백질을 실질적으로 생성하지 않도록 하는 돌연변이를 일으켜 수득한다. 달리는, K-단백질을 실질적으로 생성하지 않는 돌연변이를 갖는 자연발생적 돌연변이 균주를 자연계로부터 선별할 수 있다.

또한, K-단백질-결핍 균주는, K-단백질을 암호화 하는 유전자 적어도 일부를 포함하는 DNA 단편과 염색체상의 K-단백질 유전자사이의 상동 재조합에 의해 K-단백질 유전자를 파괴시켜 수득할 수 있다.

또한, 브레비박테리움 락토페르멘툼이외의 코리네포름 세균 조차도 세포 표층내 K-단백질과 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질(이하 K-단백질형 단백질 이라 언급)을 갖는 것으로 예측된다. 예를들어 제WO 93/03158호의 공개 공보에는, 본 발명의 K-단백질과 유사하나 분명히 구분되는 신규한 세포 표층 단백질이 기술되어 있다.

이러한 K-단백질형 단백질이 영양소의 혼입 또는 세균 세포의 응집 특성에 기여하며 K-단백질형 단백질이 결핍된 코리네포름 세균도 또한 응집 특성을 갖는 것으로 예측된다.

K-단백질형 단백질이 결핍된 코리네포름 세균을, K-단백질-결핍된 균주에서와 같이, K-단백질형 단백질 유전자에 K-단백질형 단백질을 실질적으로 생성하지 않는 돌연변이를 일으켜 수득할 수 있다. 또한, K-단백질형 단백질을 실질적으로 생성하지 않는 돌연변이를 갖는 자연발생적 돌연변이 균주를 자연계에서 선별할 수 있다. 또한, K-단백질형 단백질이 결핍된 코리네포름 세균은, K-단백질 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편과 DNA 단편과 상동성인 염색체상의 K-단백질형 단백질의 암호화 유전자사이의 상동 재조합에 의해 K-단백질형 단백질의 암호화 유전자를 파괴시켜 수득할 수 있다.

K-단백질-결핍 균주를 수득하는 방법이 기술될 것이다. 하기 기술에서, K-단백질이 K-단백질형 단백질로 대체되는 경우, K-단백질형 단백질이 결핍된 균주가 동일한 방법으로 수득될 수 있다.

K-단백질을 실질적으로 생성하지 않는 돌연변이는, UV-선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로수고아니딘(NTG)와 같은 돌연변이 유발제로 처리하여 미생물에 인위적 돌연변이를 일으키는 통상의 방법을 적용시켜 K-단백질 유전자에 일으킬 수 있다.

돌연변이시킨 코리네포름 세균으로부터 K-단백질-결핍된 균주를 선별하는 방법으로서, 예를 들어 항-K-단백질 항체를 사용하는 방법, 예를 들어 웨스턴 블로팅 방법을 언급할 수 있다. 보다 구체적으로, 돌연변이된 코리네포름 세균의 콜로니를 한천 매질 평판상에 놓인 나일론 막과 같은 막상에 형성시켜 막사에 세포 단백질을 고정시킨다. 이러한 경우, 막상의 콜로니와 1:1 대응이 이루어지도록 별도의 한천 평판 상에 레플리카 평판을 제조한다. 각각 항-K-단백질 항체, 항-K-단백질 항체의 제조에 사용되는 면역화된 동물의 면역글로불린 분획에 대한 효소-표지된 제2 항체 및 표지 효소에 의해 야기되는 효소 반응을 통해 색상을 발현시키는 염료를 포함하는 용액에 막을 담그고 이어서 항온처리되는 경우, K-단백질이 풍부한 세균의 세포 단백질이 고정된 부위에 색상이 전개된다. 따라서, K-단백질 결핍 세균은, 염료의 색상을 발색시키지 않는 콜로니를 확인하고, 이 콜로니에 상응하는 레플리카 평판으로부터 콜로니를 분리하여 선별할 수 있다. 이렇게 선별된 K-단백질-결핍 균주의 세포 표층 분획의 단백질에 대해 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 수행하여 K-단백질이 실질적으로 발현되지 않는다는 것을 확인하는 것이 바람직하다.

항-K-단백질 항체는 면역화 및 혈액의 수집에 대한 통상의 제조방법과 동일한 방법으로, 상기 (1)에 나타낸 브레비박테리움 락토페르멘툼의 세포 표층 분획으로부터 제조된 K-단백질을 사용하여 마우스와 같은 동물을 면역화시켜 수득한다.

또한, K-단백질에 의해 면역화된 동물의 비장 세포를 마우스 흑색종 세포와 같은 연속 성장 활성을 갖는 배양 세포와 융합시키고 생성된 하이브리도마 세포를 배양 하여 수득된 항-K-단백질 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.

효소-표지된 제2 항체는 β-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소와 항-K-단백질 항체의 제조에 사용되는 면역화된 동물의 면역 글로불린 분획에 대한 항-면역글로불린 항체사이의 공유 결합 형성에 의해 수득한다. 각종 동물의 면역 글로불린에 대한 효소-표지된 항체가 시판되며 사용될 수 있다.

돌연변이된 코리네포름 세균으로부터 K-단백질-결핍된 균주를 선별하는 또다른 방법이 설명될 것이다. 세포 표층 분획은 단일 콜로니 분리된 각각의 세포에 대해 상기 (1)에 기술된 바와 같은 밥법으로 제조되며, 수득된 세포 표층 분획은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨다. K-단백질 밴드가 분쟈량 약 63,000 근처에서 검출되지 않는 균주가 K-단백질-결핍 균주이다. 이 방법이 매우 시간 소모적이기는 하지만, K-단백질-결핍 균주를 신뢰적으로 선별할 수 있으므로 제2 스크리닝 단계에 이를 채택하는 것이 바람직하다.

상술한 바와 동일한 방법으로, K-단백질을 실질적으로 생성하지 않는 돌연변이를 갖는 돌연변이 균주를 자연계로부터 선별할 수 있다.

이어서, K-단백질-결핍 균주 또는 K-단백질형 단백질-결핍 균주를 유전자 붕괴로 수득하는 방법을 설명할 것이다. K-단백질 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 DNA를 코리네포름 세균 세포에 도입시키고, K-단백질 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편과 DNA 단편과 동일하거나 상동성인 염색체상의 DNA 서열간에 상동 재조합을 야기시켜 염색체 DNA상의 K-단백질 유전자 또는 K-단백질형 단백질 유전자를 방해하여 K-단백질 또는 K-단백질형 단백질을 소모시킬 수 있다. 유전자 붕괴의 기작에 대한 도식도가 제1도에 나타나 있다.

보다 구체적으로, K-단백질 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편을 벡터 플라스미드 DNA에 결합시켜 유전자 붕괴용 플라스미드를 제조한다. 유전자 파괴용 플라스미드는 브레비 박테리움 락토페르멘툼과 같은 코리네포름 세균에 도입시켜 에스케리키아 K-12에 대해 보고된 바와 같이 수용체 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA 투과성을 향상시키는 방법

[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol., Biol., 53 159 (1970)], 바실러스 서브틸리스에 대해 보고된 바와 같이 세포가 DNA를 혼입시킬 수 있는 성장기 세포(소위 컴피턴트 세포)로 DNA를 도입시키는 방법[참조: Duncan, C.H. Wilson, G.A. and Young, F.E. Gene, 1, 153 (1977)]바실러스 서브틸리스에 대해 공지된 바와 같이 DNA 수용체를 DNA 혼입을 용이하게 할 수 있는 원형질체 또는 스페로플라스트로 전환시키고 재조합 플라스미드를 DNA 수용체로 도입시키는 방법[참조: Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen., Genet.,m 168, 111 (1979), Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).

또는 전기 펄스 방법[참조: Sugimoto 등의 일본국 공개 특허 공보 제90-207791호]에 의해 상술한 (1)에서와 동일한 방법으로 형질 전환체를 수득한다.

유전자 붕괴용 플라스미드의 제조에 사용되는 벡터 플라스미드에 대해서는, 감온성 복제 기원을 갖는 벡터, 예를 들어 pHSC4[참조: Sugimoto 등의 프랑스공화국 공개 특허 공보 제2667875/1992호]를 사용하고, 생성된 형질전환체를 복제 억제온도에서 배양하는 것이 바람직하다. 이는, 플라스미드가 세포내 염색체 밖에서 자가 복제하는 것을 막고 플라스미드가 염색체 DNA로 혼입된 형질전환체를 우선적으로 성장시키게 할 수 있다. 또한 형질전환체의 선별을 용이하게 하기 위해서, 마커 유전자(예: 약물 내성 유전자)를 갖는 벡터 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

유전자 붕괴용 플라스미드가 도입되는 코리네포름 세균을 마커 유전자에 상응하는 약물을 포함하는 배양 배지에서, 바람직하게는 복제-억제-온도에서 배양하는 경우, 플라스미드가 염색체내로 통합된 형질전환체만이 성장할 수 있다. 이러한 형질전환체 세포에서, 유전자 파괴용 플라스미드는 유전자 파괴용 플라스미드내의 K-단백질 유전자 일부를 포함하는 DNA 단편과 염색체상의 K-단백질 유전자 또는 K-단백질형 단백질 유전자 사이의 상동 재조합에 의해 염색체상에 K-단백질 유전자로 통합되며, 이결과로써, 염색체 K-단백질 유전자가 붕괴될 것이다. 이렇게 수득된 형질전환체가 K-단백질이 부족한가의 여부는, 형질전환체의 세포 표층 분획을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 확인할 수 있다. 또한 형질전환체 세포의 요구되는 응집 특성에 의해서도 확인될 수 있다.

K-단백질-결핍 균주를 수득하기 위해 돌연변이시키거나 K-단백질 유전자로 붕괴될 코리네포름 세균으로서, 상기(1)에서 언급된 브레비박테리움 또는 코리네박테리움의 미생물을 언급할 수 있다.

이어서, L-아미노산을 생성하는 활성이 있고 K-단백질 또는 K-단백질형 단백질이 결핍된 코리네포름 세균을 배양하고, 배양 배지에 L-아미노산을 생성 및 축적시킨후, 배양 배지로부터 L-아미노산을 수집하는 단계를 포함하고 추가로 배양완결 후 배양 배지를 정치시켜 코리네포름 세균 세포를 침전시키는 단계를 포함하는, L-아미노산 제조방법을 기술할 것이다.

L-아미노산을 생성하고 K-단백질 또는 K-단백질형 단백질이 결핍된 코리네포름 세균을 배양하고, 배양배지에 목적 L-아미노산을 생성 및 축적시킨다. L-아미노산의 생성에 사용되는 배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요한 경우 기타 유기 성분을 포함하는 통상의 배양 배지이다.

탄소원으로서, 예를 들어 당류(예: 비트 당밀, 케인 당밀, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈 및 전분의 가수분해물), 알콜(예: 글리세롤 및 소르비톨), 및 유기산(예: 푸마르산, 시트르산 및 숙신산)이 사용될 수 있다.

질소원으로서, 예를 들어, 무기 암모늄염(예: 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄), 유기 질소(예: 대두의 가수분해물), 암모니아 기체 및 수산화암모늄이 사용될 수 있다.

유기 마이크로-영양소원으로서, 배양 배지에 비타민 B1 또는 효모 추출물과 같은 필요 물질의 적당량을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 소량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 철이온 및 망간 이온을 필요한 경우 배양 배지에 가한다.

배양은 호기성 조건하에 16 내지 72시간동안 배양 온도를 30℃ 내지 45℃로 조절하고 pH를 5 내지 7로 조절하면서 수행하는 것이 바람직하다. pH 조절을 위해, 유기 또는 무기 산성 또는 알칼리성 물질 및 추가의 암모니아 기체를 사용할 수 있다.

배양 배지 조성 및 배양 조건은 세균 세포의 응집 특성에 효과를 나타내므로, 수득되는 K-단백질-결핍 균주에 적합한 조건을 선택할 수 있다.

이어서, 배양 완결후, 배양 배지를 정치시키고, 응집된 세균 세포를 침전시켜 배양 상등액으로부터 분리시킨다. 배양 상등액 및 세균 세포를 침전된 세균 세포가 들어오지 못하도록 상등액을 회수하여 분리시킬 수 있다. 또한, 세포 분리 과정을 통상의 원심분리 또는 여과로 수행할 수 있으며, 세균 세포가 응집되므로 분리과정이 용이해진다.

세균 세포의 분리후, L-아미노산을 통상의 이온 교환 크로마토그래피, 침전 방법 및 기타 공지 방법을 조합하여 발효 배지로부터 수집할 수 있다. L-리신과 같은 염기성 아미노산은 통상적으로 발효 용액의 pH값을 약 4로 조절한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 본 발명에 따른 K-단백질 결핍 균주는 약 pH4에서 응집하는 특성이 더욱 증가하므로, 세포 침전 단계를 pH 조절후 수행하는 경우, 보다 단기간내에 침전이 완결되므로 세균 세포를 보다 효율적으로 분리시킬 수 있다. 더우기, 세균 세포로부터 분리되는 배양 상등액을 이온 교환 수지 컬럼에 통과시킬 수 있다.

본 발명은 K-단백질이 세포의 응집 특성에 기여함을 나타내는데, 이러한 개념은 L-아미노산 생성이외의 발효산업에서 다운 스트림(downstream)의 세포 제거단계, 세포 재순환형 생물 반응기, 및 또한 L-아미노산 이외의 발효 산업에서 조차 활성 슬러지 세균의 침전 개선에 적용할 수 있다.

예를 들어, 유용 물질을 생성하는 활성을 가진 코리네포름 세균이 K-단백질 또는 K-단백질형 단백질이 부족하고 세포 응집 특성을 갖는 경우, 이로써, 세균을 발효 배지에서 배양하고 배양 배지에 유용물질을 생성 및 축적시킨 후 배양 배지로부터 유용물질을 수집하는 단계를 포함하는 발효 과정에 의해 유용물질을 제조하는 방법을 개선시킬 수 있다. 이는 세포 분리 조작이 이러한 제조과정에 필수적이기 때문이다.

즉, 세포 분리 조작이, 유용 물질을 생성하는 활성이 있고 K-단백질 또는 K-단백질형 단백질이 결핍되고 세포 응집 특성이 있는 코리네포름 세균을 배양하고, 배양배지에 유용물질을 생성 및 축적시킨후, 배양 배지로부터 유용물질을 수집하는 단계를 포함하고 추가로 배양완결후 배양 배지를 정치시켜 코리네포름 세균 세포를 침전시키는 단계를 포함하는 발효 과정으로 유용물질을 제조하는 방법에서 기술된 바와 같은 아미노산 제조방법과 동일한 방식으로 용이하게 된다.

본원에서 언급되는 유용물질은 조미료용 원료로서 핵산을 포함한다. 핵산을 생성하는 코리네포름 세균은, 예를 들어 일본국 특허 공보 제82-22558호에 기술되어 있는 바와 같은 코리네박테리움 에퀴이 AJ 11347을 포함한다.

또한, 유용 물질은 외래 단백질을 포함한다. 즉, 사람 인터페론 또는 사람 인터루킨, 효소 또는 항체와 같은 생리학적 활성 물질을 언급할 수 있다. 미생물을 사용하여 외래 단백질을 제조하는 방법은 주로 에스케리키아속 또는 바실러스속에 속하는 세균에 대해서 공지되어 있으며, 유사한 기술이 또한 코리네포름 세균에 대해서도 개발되었다. 이러한 기술은 기본적으로 코리네포름 세균세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터와 코리네포름 세균 세포에서 작동할 수 있는 프로모터 및 외래 단백질을 암호화하는 DNA를 결합시켜 재조합 DNA를 형성하고, 재조합 DNA를 코리네포름 세균으로 도입시키며, 재조합 DNA 상의 단백질 암호화 DNA의 발현을 통해 단백질을 생성하는 단계를 포함한다. 이 기술은, 예를 들어 일본국 공개 특허 공보 제87-15184호에 기술되어 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 상동 재조합에 의해 유전자를 붕괴시키기 위한 도식도.

제2도는 암모늄 이온의 혼입을 위한 K-단백질의 기여를 나타냄.

○... K-단백질-풍부 균주(AEC^r2256)

●... K-단백질-풍부 균주(AEC^r2256), CCCP

(카보닐시아나이드 m-클로로페닐 하이드라진) 첨가.

□... K-단백질-결핍 균주(AJ 12760)

■... K-단백질-결핍 균주(AJ 12760), CCCP 첨가

제3도는 K-단백질-결핍 균주 및 K-단백질-풍부 균주의 침전도를 나타내는 다이아그램(탄소원: 글루코즈, pH 4.0으로 조절된 배양 완결후의 배양 배지)

×... 2256 균주 (ATCC 13869)

+ ... YSR 균주

◇... AEC^r2256 균주

△... AJ 12760

▲... AJ 12956

상기한 부호는 제4도 내지 제6도에 사용된다.

제4도는 K-단백질-결핍 균주 및 K-단백질-풍부 균주의 침전도를 나타내는 다이아그램(탄소원: 글루코즈, pH 4.0으로 조절되지 않은 배양 완결후의 배양 배지).

제5도는 K-단백질-결핍 균주 및 K-단백질-풍부 균주의 침전도를 나타내는 다이아그램(탄소원: 글루코즈, pH 4.0으로 조절되지 않은 배양 완결후의 배양 배지).

제6도는 K-단백질-결핍 균주 및 K-단백질-풍부 균주의 침전도를 나타내는 다이아그램(탄소원: 슈크로즈, pH 4.0으로 조절되지 않은 배양 완결후의 배양 배지).

[본 발명을 실시하기 위한 최적 방법]

본 발명은 실시예로써 보다 구체적으로 기술된다.

[실시예 1]

[신규한 세포 표층 단백질 K-단백질]

(1) 신규한 세포 표층 단백질의 발견

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869를 CM2G 배양 배지(효모 추출물 10g, 박토 트립톤 10g, 글루코즈 5g, NaCl 5g; 물로 1ℓ로 충전)에서 30℃로 밤새 진탕 배양하고, 세포를 배양액 1㎖로 부터 수집한다. 완충액 A(50㎛ 인산칼륨, pH 8.0, 10mM 황산마그네슘)로 세척한 후, 세포를 완충액 A 1㎖에 현탁시키고, 동결시킨 후, 녹이고, 세포를 0℃로 유지시키면서 강력 초음파기(OHTAKE 5202PZT)로 부순다.이어서, 세포용해물을 4℃에서 1분동안 12,000xg에서 원심분리 시키고, 상등액을 회수한다. 수득된 상등액을 4℃에서 30분 동안 100,000xg에서 재-원심분리시키고, 침전물을 세포 표층 분획으로부터 회수한다. 분획중, 5x10⁹개 세포에 상응하는 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨다. 이 결과로서, 분자량 약 63,000 근처에 다량으로 존재하는 단백질 밴드를 발견하고, 이 단백질을 K-단백질로 명명하였다.

본 발명자들은 세포 표층 단백질이 세균 세포의 밖으로 부터 영양소 삽입에 기여하는 작용을 갖는다고 예측하고 다음 실험을 수행하였다.

(2) K-단백질의 정제

먼저, 세포 표층 분획을 (1)에서 전술한 바와 같은 방법으로 제조한다. 세포 표층 분획은 세포질막과 세포벽 모두를 포함한다. 이어서, 표면 활성제를 사용하여 세포질막을 용해시켜 이 단백질을 분리시키려고 시도하였다. 표면 활성제의 종류 및 농도, 용해 시간 및 온도, 글리코롤의 첨가 효과 및 NaCl의 첨가효과에 대해 상세히 연구한 결과, K-단백질이 하기 기술하는 방법으로 정제될 수 있었다.

단백질의 세포 표층 분획 3㎍(정량을 Bio Rad Co.,의 BC 단백질 검정 키트로 수행한다)을 1.25%(w/v) SES를 포함하는 완충용액(50㎜ 인산칼륨, pH8, 0.1㎜ 디티오트레이톨) 1㎖에 현탁시키고, 현탁액을 1시간동안 37℃에서 유지시킨다. 이어서, 이 현탁액을 30분동안 145,000xg에 원심분리시키고 침전물을 회수한다. 침전물을 0.2㎍ 단백질/㎕이 함유되도록 0.1% SDS를 포함하는 인산칼륨 (pH 8.0) 50mM에 현탁시키고 3분 동안 비등시켜 회수한다. 표면 활성제-불용성 분획으로서 단백질 15㎍을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키고, 분자량이 63,000인 균질 단백질이라는 것을 확인하였다.

(3) K-단백질의 특성

(3-1) 분자량

K-단백질의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 에서의 이동성에 기초하여 약 63,000으로 평가되어다.

(3-2) 부분적 아미노산 서열의 결정

상기(2)에 기술한 방법으로 정제된 K-단백질을 200㎍ 단백질/㎖의 농도가 되도록 50mM 트리스-HCl, pH 7.3, 0.1% SDS에 현탁시키고 5분 동안 비등시켜 용해한다. 냉각시킨후, 엔도프로테나제 Lys-C를, 표면활성제 불용성 분획으로서의 단백질 및 Lys-C의 비가 50:1(wt/wt)이도록 용액에 가하고, 3시간동안 37℃에서 배양한다.

Lys-C를 사용하여 제한 분해된 K-단백질 용액에 대해, K-단백질 500pmol에 상응하는 부분을 역상 크로마토 그래피로 분획화시킨다. 사용된 컬럼은 Senshu Pac VP-318-1251 4.6Ψx250㎜이다. 용출은 1㎖/분의 유속으로 CH₃CN 구배 (24% CH₃CN, 0.1% TFA-66% CH₃CN, 0.1% TFA)로 수행한다. 용출 분획중, 펩타이드 함량이 높은 2개의 분획(55.7-57.0%, CH₃CN 및 59.3-60.5% CH₃CN에 의해 용출되는 분획)에 대해 Applied Biosystems Co.의 가스상 서열분석기 470-A로 아미노산 서열을 결정한다. 아미노산 서열은 업체[Applied Biosystems Co.]의 안내서에 따른 방법으로 측정한다. 이로써, K-단백질이 분자내에 다음 2개의 서열을 갖는다는 것이 밝혀졌다: 즉,

[실시예 2]

[ K-단백질 유전자의 분리]

(1) 유전자 라이브러리의 제조

염색체 DNA를 문헌[참조: Saito and Miura, Biochem. Biophys. Acta, 8278 (1963) 619-629]의 방법에 의해 브레비 박테리움 락토페르멘툼 2256 (ATCC 13869) 으로부터 제조한다. Sau 3AI 2단위를 염색체 DNA 약 50㎍에 가하고, 40분동안 37℃로 유지시키면서 부분적으로 분해한다. 반응 혼합물을 26시간 동안 120,000에서 슈크로즈 밀도 구배(10% 내지 40%) 상에서 원심분리시켜 DNA 단편을 분획화시킨다.

약 1,500 내지 6,000 bp의 분획을 회수하고(1.5㎖ 용적), TE 완충액(10㎜ 트리스-HCl, 1㎜ EDTA, pH 8.0)에 대해 4℃에서 투석시킨다. Sanko Junyaku Co. 의 Seamless Cellulose Tubing Size 8/32를 투석튜브로써 사용한다. 완충액 2ℓ에 대해 4시간 동안 투석하고, 완충액 교체후 추가로 2시간동안 투석시킨다.

투석후, 1,500 내지 6,000bp의 염색체 DNA 단편을 문헌[참조: Maniatis, et al., Molecular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]의 방법에 따라 2-부탄올로 추출하고, DNA 단편을 BamHI(Takara Shuzo Co.)로 미리 절단시킨 벡터 pSTV 28과 T4DNA 리가제(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 결합시킨다. 에스케리키아 콜라이 JM 109 (Takara Shuzo Co.)를 Takara Shuzo Co.의 안내서에 따라 수득된 결합 혼합물로 형질전환시켜 약 5,000개 클론으로 이루어진 유전자 라이브러리를 제조한다. K-단백질 유전자 단편이 클로닝된 벡터를 갖는 숙주는 K-단백질 유전자가 고비율로 발현되는 경우 죽게되므로 낮은 복제 벡터 pSTV 28이 사용된다.

(2) K-단백질 유전자의 클로닝

실시예 1 (3-2)의 아미노산 서열에 근거하여, 서열 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3'(서열 확인 번호 3)의 30mer 올리고뉴클레오타이드를 콜로니 하이브리드화에 사용되는 탐침으로서 Applied Biosystems Co.의 DNA 합성기를 사용하여 합성한다. 서열 결정시, 일종의 아미노산 잔기에 상응하는 다수의 코돈이 존재하므로 상당한 장애가 되며 이것을 극복하는 방법이 본질적이다.

본 발명에서, 하기 2가지 항목을 고려하여 우수한 탐침을 제조할 수 있으며, 이것이 성공의 커다란 요소이다. 2가지 항목은 (1) 비교적 긴 영역의 아미노산 서열이 결정될 수 있으므로 각각의 아미노산에 상응하는 코돈의 축퇴 정도가 낮은 아미노산 영역을 선택할 수 있다는 것이고, (2) 브레비박테리움의 코돈 사용 빈도와 관련한 명확한 지식은 없으나, 리파제 클로닝시 Tsuchiya등이 지식(참조: 일본국 공개 특허 공보 제92-271780)이 참조된다는 것이다.

탐침과 하이브리드화 하는 콜로니는 콜로니 하이브리드화에 의해 제조된 유전자 라이브러리로부터 수득한다. Hybond-N(Amersham Co.)막을 코로니의 복제물을 만드는데 사용하고, 40시간동안 50℃에서 하이브리드화를 수행한후, 필터를 1시간 동안 40℃의 조건하에서 4회 세척한다. 이렇게 수득된 하이브리드화-양성 콜로니에 대해 콜로니 하이브리드화로 제2 스크리닝을 수행한다. 탐침으로서 상술한 올리고뉴클레오 타이드 및 복제물 제조용 막으로서 Hybond-N(Amersham Co.)을 사용하여 24시간동안 50℃에서 하이브리드화시키고, 1시간동안 40℃에서 3회 및 1시간동안 50℃에서 2회 세척한다. 제2 스크리닝에서 12개의 클론을 선별한다. 플라스미드 DNA를 제2 스크리닝에서 양성인 이들 12개 콜로니로부터 알칼리-SDS 방법으로 회수한다. EcoRI 및 Hind III(Takara Shuzo Co.)로 분해시킨 이들 플라스미드의 절단 양상을 조사한 결과, 각각의 플라스미드가 pSTV28의 BamHI 부위에 삽입된 DNA 단편을 갖는다는 것이 확인되었다.

이렇게 수득된 DNA 단편을 VacuGene (Pharmacia LKB Biotechnology Co.)를 사용하여 이의 안내서에 따라 Hybond-N 막상에 블롯팅하고, 상술한 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 서던 하이브리드화를 수행한다. 하이브리드화를 26시간동안 50℃의 조건하에 수행하고, 1시간동안 40℃에서 1회 및 1시간동안 50℃에서 1회 세척한다. 이결과, 제2 스크리닝에서 양성인 12개 클론중 6개 클론이 탐침과 하이브리드화되는 것으로 밝혀졌으며, 6개의 클론은 제한 효소 절단 양상에 기초하여 3가지 유형으로 분류될 수 있다.

이렇게 수득된 3가지 유형의 삽입된 DNA 단편에 대한 뉴클레오타이드 서열을 프라이머로서 상술한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 디데옥시 방법으로 결정하여, 서열 5'-AACAATGCAGATCAGGCTGCACGTGAGCTCTTCCTCGATTGGGACACC-3'(서열확인번호 4)를 포함하는 삽입된 DNA 단편이 한가지 유형으로 밝혀졌다. 이 서열은, Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr (서열확인번호 1의 아미노산 25 내지 40에 상응)의 이미 결정된 아미노산 서열내의 탐침 서열을 결정하기 위해 사용된 부분으로부터 카복시 말단측에 위치하는 아미노산 서열을 암호화하므로, 이로부터 DNA 단편이 목적 유전자의 일부분 이상을 포함한다는 것을 확인하였다.

이어서, 삽입된 DNA 단편의 전 길이에 대해 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 의해 결정한다. 결정된 염기 서열이 서열표, 서열확인번호 5에 나타나 있다. 이 단편이 K-단백질을 암호화한다는 것이 밝혀졌다. 뉴클레오타이드 서열로 부터 유추되는 K-단백질의 아미노산 서열이 또한 서열표, 서열확인번호 5에 기술되어 있다.

[실시예 3]

[ K-단백질-결핍된 균주의 제조]

(1) K-단백질-결핍된 균주의 제조

모균주로서 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256 균주 (ATCC 13869)를 사용하여, 전체 세포에 대해 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)를 사용하여 돌연변이 처리를 한다.

2256 균주 세포를 2xTY 배지(1.6% 박토-트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl)중에서 배양하고 배지의 흡광도가 660㎚에서 약 0.3에 도달하면 세포를 수집한다. 세포를 표1의 조성의 TM 완충용액으로 세척한후, NTG 용액(TM 완충액에 0.2㎎/㎖로 용해된 NTG)중에 현탁시키고, 0 내지 90분동안 37℃에서 배양한다.

NTG-처리된 세포를 TM 완충 용액 및 2xTY 배지로 세척하고, 2xTY 배지중에서 밤새 배양하여 돌연변이를 고정시킨다.

NaOH로 pH6.0으로 조절

상술한 바와 같이 NTG로 돌연변이시킨 세포에 대해 단일 콜로니 분리를 수행하고, 약 1,000개의 콜로니를 분리시킨다. 이들 콜로니를 형성하는 각각의 클론을, K-단백질 고갈여부에 대해 시험한다. 실시예 1(1)에 기술된 방법으로 각각의 클론에 대해 세포 표층 분획을 제조하고, 시료로써 이렇게 제조된 분획을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시험을 수행한다. 이 과정에서, K-단백질 밴드가 분자량 63,000 근처에서 검출되지 않는 균주, 즉 K-단백질-결핍 균주를 얻을 수 있다. 이 균주를 브레비박테리음 락토페르멘툼 YSR로 명명한다.

이렇게 수득된 YSR 균주의 염색체 DNA를 , 균주의 K-단백질 결핍 원인이 유전자로부터 유도되는가의 여부에 대해 시험한다. 즉, K-단백질 유전자를 YSR 균주로 부터 클로닝하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 구조를 분석한다.

염색체 DNA를 문헌[참조: Saito-Miura Biochem. Biophys. Acta. 8278 (1963) 619-629]의 방법에 따라 YSR 균주로부터 제조한다. DNA 약 50㎍에 Sau 3AI 2 단위를 가하고, 40분동안 37℃에서 항온처리하여 부분적으로 분해시킨다.

이어서, 분해된 DNA를 슈크로즈 밀도 구배(10% 내지 40%)상에서 원심분리(120,000xg, 26시간)시켜 분획화시킨다.

약 1,500 내지 6,000bp에 상응하는 분획을 수집(1.5㎖ 용적)하고, 4℃에서 TE 완충액(10㎜ 트리스/HCl, 1㎜ EDTA, pH 8.0)에 대해 투석시킨다. Sanko Junyaku Co. 의 Seamless Cellulose Tubing Size 8/32를 투석백으로 사용한다. 4시간 동안 완충액 2ℓ에 대해 투석시킨후, 완충액 교체후 추가로 2시간동안 투석시킨다.

이렇게 수득된 1,500 내지 6,000bp의 염색체 DNA 분획을 문헌[참조: Maniatis, et al., Molecular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]의 방법에 따라 2-부탄올로 추출하고, T4 DNA 리가제(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 BamHI (Takara Shuzo Co.)로 미리 절단된 벡터 pUC18과 결합시킨다. 이어서, 에스케리키아 콜라이 JM109 (Takara Shuzo Co.)를 Takara Shuzo Co.의 안내서에 따라 반응 혼합물로 형질전환시켜 유전자 라이브러리를 제조한다.

생성된 유전자 라이브러리로부터, K-단백질 유전자를 갖는 클론을 탐침으로서 실시예 2(2)에서 수득된 서열 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3'의 합성 DNA를 사용하여 콜로니 하이브리드화로 스크리닝한다. Hybond-N(Amersham Co.) 막을 콜로니 복제물로서 사용한다. 하이브리드화를 40시간 동안 50℃에서 수행하고, 1시간동안 40℃에서 4회 세척한다. 하이브리드화-양성 콜로니에 대해 콜로니 하이브리드화로 제2 스크리닝을 수행한다. 탐침으로서 상술한 DNA 및 복제물 제조용 막으로서 Hybond-N(Amersham Co.)를 사용하여, 24시간 동안 50℃에서 하이브리드화를 수행하고, 1시간동안 40℃에서 3회 및 1시간동안 50℃에서 2회 세척한다.

제2 스크리닝에서 양성인 이들 콜로니로부터 알칼리-SDS 방법으로 플라스미드 DNA를 회수한다. 제한 효소 절단에 의해 K-단백질 유전자의 전체 영역을 포함할 것으로 예측되는 클론의 삽입된 DNA 단편을 디데옥시 방법에 의해 뉴클레오타이드 서열로 결정한다. 이로부터, YSR 균주로부터 분리되는 K-단백질 유전자가 서열표, 서열확인번호 6에 나타난 서열을 갖는다는 것이 입증되었다. 이 서열을 서열표, 서열확인번호 5의 것과 비교하는 경우, YSR의 K-단백질 유전자가 하기한 돌연변이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 표2에서 뉴클레오타이드 번호는 서열확인 번호 6의 염기 번호에 상응한다.

YSR 균주의 염색체상의 K-단백질 유전자가 상술한 바와 같이 뉴클레오타이드의 결실 및 삽입에 의해 프레임 이동을 유발하며, 이 결과로써 YSR 균주는 K-단백질을 더이상 발현하지 않는다는 것이 밝혀졌다. K-단백질 유전자 단편을 포함하는 플라스미드를 pMAK701로 명명한다. 플라스미드 pMAK701을 포함하는 에스케리키아 콜라이 세균 AJ 12759는 National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology(일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고: 우편번호 305)에 1993년 1월 11일자로 기탁번호 FERM P-13364로 기탁되었고, 1994년 1월 11일에 원기탁으로 부터 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로 이관되었으며 기탁번호 FERM BP-4533로 기탁되었다.

그런데, 실시예 2에서 서열표, 서열확인번호 5에 기술된 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드는 기탁되지 않았다. 그러나, 당 분야의 전문가면 명백히, 예를 들어 PCR 방법 또는 U-포함 일본쇄 DNA를 사용하는 방법에 의해 유전자에 부위-지시된 돌연변이 유발을 도입시킬 수 있다. 따라서, 출발 물질로서 pMAK701을 사용하여 서열표, 서열확인번호 5에 기술된 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 용이하게 제조할 수 있다.

(2) K-단백질 유전자 붕괴된 균주의 제조

실시예 3(1)에서 수득된 K-단백질 돌연변이 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 부터, 약 650 염기쌍 길이의 BamHI-SalI 단편을 절단하고, 감온성 복제 개시점을 갖는 벡터 pHSC4의 BamHI-SalI 부위와 결합시켜 [참조: Sugimoto 등의 프랑스공화국 공개 특허 공보 제2667875/1992호] 유전자 붕괴용 플라스미드 pMAK705를 제조한다. pMAK705를 전기 펄스 방법[참조: Sugimoto 등의 일본국 공개 특허 공보 제90-207791호]에 의해 AEC(S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)내성을 갖는 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256(ATCC 13869)(본원에서는 AEC2256 균주로 언급)에 도입시킨다. 수득된 형질전환체를 플라스미드 복제 억제 온도에서 배양하여 염색체 K-단백질 유전자를 K-단백질 유전자의 BamHI-SalI 영역에서 상동 재조합에 의해 붕괴시킨다. 유전자 붕괴의 기작에 대한 도면이 제1도이다. 돌연변이체 K-단백질 유전자의 BamHI-SalI 단편은 서열확인번호 6의 BamHI 부위(서열확인번호 6내의 뉴클레오타이드 번호 1156 내지 1161)부터 SalI 부위(1704 내지 1709)에 상응하며, 이는 서열확인번호 5에 나타난 ORF(오픈 리딩 프레임)내에 존재한다. 따라서, 상동 재조합에 의해 생긴 붕괴된 K-단백질 유전자의 2개의 복사물중 1개는 ORF의 3'측 대부분이 고갈되고 다른 1개는 ORF의 5'측의 대부분이 고갈된다. 이 실험이 상세히 기술될 것이다.

pMAK705를 갖는 ACE2256 균주를 클로람페니콜 5㎍/㎖을 포함하는 CM2G에서 밤새 배양한다. 배양 브로쓰를 CM2G 배지로 10까지 희석시키고, 이중 100㎕을 클로람페니콜 5㎍/㎖을 포함하는 CM2G판에 펼친다. 밤새 34℃(복제 억제 온도)에서 배양하여 클로람페니콜 내성 균주를 선별한다. 이렇게 수득된 2개의 클로람페니콜 내성 균주중 세포 표층 분획을 실시예 1에 기술된 바와 같은 방법으로 제조하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜 K-단백질 결핍을 확인한다. 이렇게 제조된 2개의 K-단백질-결핍 균주를 각각 AJ 12760 및 AJ 12956으로 명명한다.

AJ 12760 및 AJ 12956의 성장 속도는 AEC2256 균주의 속도와 동일하다.

K-단백질-결핍 균주 AJ 12760은 National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology(일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고: 우편번호 305)에 1993년 1월 11일자로 기탁번호 FERM P-13365로 기탁되었고, 1994년 1월 11일에 원기탁으로부터 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로 이관되었으며 기탁번호 FERM BP-4534로 기탁되었다. 또한 K-단백질-결핍 균주 AJ 12956은 National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology(일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고: 우편번호 305)에 1994년 1월 11일자로 기탁번호 FERM BP-4532로 국제 기탁되었다.

(3) K-단백질-결핍 균주의 암모늄 혼입 활성

상기 (1)에서 제조된 K-단백질-결핍 균주 AJ 12760의 암모늄 혼입 활성을 측정하는 경우, 제2도에 나타낸 바와 같이 AEC2256 균주와 비교하여 현저한 감소가 관측되었다. 기질로서C 표지된 메틸 암모늄(암모늄 이온 동족체)를 사용하고 신속한 여과방법[참조: A. Jayakumar, et al., Analytical Biochemistry, 135 (1983) 475-478]에 따라 암모늄 혼입 측정을 수행한다. 이로써, K-단백질이 코리네포룸 세균에서 영양소 혼입에 기여하는 신규한 세포 표층 단백질이라는 것이 입증되었다.

K-단백직-결핍 균주 AJ 12760의 암모늄 혼입 활성을 측정하는 실험이 하기에 설명된다. 혼입 활성을 측정할 세균 세포를 CM2G 한천판으로부터 CM2G 액체 배지로 접종시키고 밤새 30℃에서 배양한다. 배양 브로쓰를 빙수에서 냉각시킨후, 세포를 수집하고 빙냉각된 완충액 B(50mM 트리스-HCl, pH6.8, 100mM NaCl)로 2회 세척하고 완충액 B에 현탁시켜 밀도를 2.0x10개 세포/㎖로 만든다. 세포 현탁액 100㎕를 글루코즈가 에너지원으로서 10mM의 최종 농도로 첨가된 Milipore Co.의 Multi-Screen HA의 웰에 가하고, 5분동안 30℃에서 유지시킨다. 이 과정에서, CCCP(카보닐시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존: Sigma Co.)가 경우에 따라 탈커플링제로서 함께 존재한다(최종 농도: 20μM).

각각의 웰에C-표지된 메틸 암모늄을 20μM의 최종 농도로 가해 암모니아 혼입 반응을 시작한다. 예정 시간동안 25℃에서 유지시킨후, 반응 용액을 흡입에 의해 각각의 웰로 부터 신속히 제거시켜 반응을 종결시킨다. 반응 용액을 흡입시킨후, Multi-Screen HA 막에 보유된 세포를 완충액 C (50mM 트리스-HCl, pH 6.8, 1M NaCl)로 세척하고, 막을 건조시킨 후, 세포로 삽입된C 방사능을 분석기[Bio-imaging Analyzer, (BAS-2000: Fuji Photographic Film Inc.)]로 측정한다.

[실시예 4]

[K-단백질-결핍 균주의 침전 특성]

배양 배지중 K-단백질 결핍 균주의 침전 특성을 평가한다. K-단백질 유전자가 붕괴된 균주로서 AJ 12760 및 AJ 12956 및 K-단백질-결핍 돌연변이 균주로서 YSR 균주를 사용한다. 또한, K-단백질-풍부 균주로서 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256 (ATCC 13869) 및 AEC2256을 대조군으로서 사용한다. AJ 12760, AJ 12956, YSR, 2256 및 ACE2256의 각각의 균주를 클로람페니콜 20㎍/㎖을 포함하는 CM2G판에서 밤새 배양하고, 각각의 세포의 1회 백금 루프양(평판의 1/40에 상응하는 양)을 주요 액체 배양 배지에 접종하고 24시간동안 31.5℃에서 배양한다. 주요 액체 배양 배지에 대해서, 하기 조성의 액체 배양 배지 20㎖을 500㎖ 용적의 Sakaguchi 플라스크에 넣고, KOH로 pH8.0으로 조절한 후, 10분 동안 115℃에서 열멸균시키고, 이어서 3시간동안 200℃에서 건조 가열하게 멸균된 CaCO을 추가로 가한다.

K-단백질 붕괴된 균주, K-단백질-결핍 돌연변이체 및 K-단백질-풍부 균주 각각에 대한 배양을 글루코즈가 첨가된 배지 및 슈크로즈가 첨가된 배지를 사용해 중복 시스템으로 수행한다.

표4는 배양 로트(시료 번호) 각각에 대한 배양후 측정된 pH 및 탄소원을 나타낸다.

글루코즈 첨가된 배양물 및 슈크로즈 첨가된 배양물 중에서 배양된 중복 배양 로트중, 하나의 시스템(시료번호 1 내지 10)에 대해서는 배양후 배양배지의 pH를 조절하지 않고 다른 하나의 시스템(시료 번호 11 내지 20)에 대해서는 배양후 배양 배지의 pH를 4.0으로 조절하면서 침전시험을 적용한다. pH 4.0은 이온 교환 크로마토그래피로 L-리신-HCl를 통상 정제하는 경우의 조건이다.

침전 시험은 하기 기술하는 바와 같이 수행한다. 배양후 배양 배지 각각 15㎖을 내경이 15㎜인 시험관에 옮기고, 정치시켜 자발적으로 세포를 침전시킨다.

예정시간이 경과한후, 세포의 침전후 생성된 상등액과 세포가 현탁된 침전부사이의 경계 위치를 측정하여 하기식으로 상대적 침전도를 계산하며, 이때 배지 표면으로부터 경계부로의 거리인 (b) 대 배지 표면의 높이 (a)의 비(%)를 상등액 비로 가정한다. 배양 배지를 26배 희석시키는 경우 562㎚(OD)에서의 흡광도를 기준으로 하여 세포 농도를 측정한다. 또한, 배지 15㎖을 시험관으로 옮기는 경우 배지 표면의 높이 (a)는 9㎝이다. 세포 건조 중량은 이미 준비된 전환식에 따라 OD로부터 전환에 의해 계산한다:

각각의 배양 로트에서의 총 세포 밀도(총 세포 OD), 배지 표면으로부터 경계부까지의 거리(b), 배지 표면의 높이(a) 및 상등액에서의 세포 밀도(상등액 OD)를, 배양 배지를 시험관으로 옮긴 직후, 10분후, 30분후, 60분후, 180분후, 및 23시간 후 즉시 측정하고, 그 결과를 표5 및 표6에 나타낸다. 각 시간에서의 상대적 침전도 값을 계산하고 그 결과를 표7 및 표8에 나타낸다. 또한, 시간 경과에 따른 상대적 침전도 변화가 시료 1,3,5,7 및 9에 대해서는 제3도에, 시료 2,4,6,8 및 10에 대해서는 제4도에, 시료 11,13,15,17 및 19에 대해서는 제5도에, 및 시료 12, 14, 16, 18 및 20에 대해서는 제6도에 나타나 있다.

상기한 결과로부터, 배양배지중의 탄소원의 종류 및 배양 배지의 pH값 조절 유무와 관계없이 K-단백질 유전자 파괴된 균주 AJ 12760 및 균주 AJ 12956의 배양 완결후 단시간(10 내지 30분)내에 세포가 침전된다는 것이 밝혀졌다. 또한, K-단백질 결실 돌연변이체 YSR이, 탄소원으로서 슈크로즈를 사용하여 배양하고 pH 조절이 없이 배양 완결후 정치시키는 경우 K-단백질 유전자 파괴된 균주와 동일한 방식으로 단시간내에 침전되는 것으로 밝혀졌다. 이와는 반대로, K-단백질-풍부 균주로서 AEC2256 및 2256의 세포는, 배양 배지를 배양 완결후 30분 정치시키는 경우에서 조차도 실질적으로 침전되지 않았다. 특히, 배양 배지의 pH를 조절하지 않고 정치시키는 경우 23시간 후 조차도 세포의 침전이 나타나지 않았다.

세포의 침전도에 대해, 세포 응집물의 침전 상수를 측정한 결과 상기한 바와 같이 측정된 상대적 침전도와 동일한 결과를 나타낸다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명은 코리네포름 세균에서 영양소 혼입에 기여하는 신규한 세포 표층 단백질 및 이의 유전자뿐만아니라, 코리네포름 세균 세포에 유전자를 도입시키고 증폭시켜 수득한 형질전환체를 제공한다. 또한, 형질전환체용 숙주로서 L-아미노산을 생성하는 활성이 있는 코리네포름 세균을 사용하고, 숙주 세균을 사용하는 발효 방법으로 L-아미노산 제조방법을 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 표층 단백질이 결실되고 응집 특성이 있어서 이들을 이용시 L-아미노산의 제조에 소요되는 에너지를 절약할 수 있는 신규한 코리네포름 세균을 제공한다.

서열표

(1) 일반정보

(i) 출원인 : 아지노모토가부시키가이샤

(ii) 발명의 명칭 : 신규한 세포 표층 단백질

(iii) 서열수 : 6개

(iv) 서신 주소 :

(A) 주소 :

(B) 거리 :

(C) 시 :

(D) 주 :

(E) 나라 :

(F) 우편번호 :

(v) 컴퓨터 판독형 :

(A) 매질유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : Patent In Release #1.0, Version #1.25

(vi) 현재의 출원정보 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(vii) 선행 출원 자료 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(viii) 변리사/대리인 정보 :

(A) 성명 :

(B) 등록번호 :

(C) 참조/문서번호 :

(ix) 통신정보 :

(A) 전화 :

(B) 팩스 :

(2) 서열확인번호 1 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 40개 아미노산 :

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256(ATCC 13 869)

(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 1:

(2) 서열확인번호 2 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 32개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256(ATCC 13869)

(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 2 :

(2) 서열확인번호 3 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 30개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 본쇄성 : 이본쇄

(D) 형태 : 선형

(vi) 서열 기술 : 서열확인번호 3:

(2) 서열확인번호 4:

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 48개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 본쇄성 : 이본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 형태 : DNA (게놈성)

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256(ATCC 13869)

(xi) 서열기술 : 서열확인번호 4:

(2) 서열확인번호 5:

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 2653개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 본쇄성 : 이본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 형태 : DNA (게놈성)

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : 브레비박테리움 락토페르멘툼 2256(ATCC 13869)

(xi) 서열기술 : 서열확인번호 5:

(2) 서열확인번호 6:

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 2693개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 본쇄성 : 이본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 형태 : DNA (게놈성)

(vi) 기원:

(A) 유기체 : 브레비박테리움 락토페르멘툼 YSR

(xi) 서열기술 : 서열확인번호 6:

Claims

서열확인번호 5에 도시된 아미노산 서열을 갖고, 분자량이 약 63,000 달톤인, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로부터 유도되는 세포 표층 단백질.
제1항에 따른 세포 표층 단백질의 암호화 유전자를 포함하는 DNA 단편.
제2항에 따른 DNA 단편을 코리네포름(Coryneform) 세균 세포에서 자동 복제할 수 있은 벡터와 결합시켜 수득된 재조합 DNA.
제2항에 따른 DNA 단편을 코리네포름 세균 세포에서 증폭시켜 수득된 형질전환체.
유용 물질 생성 활성을 갖는 제4항에 따른 형질전환체를 배양 배지에서 배양하고, 배양 배지에 유용물질을 생성 및 축적시킨 후, 배양 배지로부터 유용물질을 수집하는 단계를 포함하여 발효 과정에 의해 유용물질을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 유용물질이 L-아미노산인 방법.