JPH02167083A - δ―アミノＬブリン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡおよびそれを用いた形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はδ−アミノＬブリン酸合成酵素をコードする遺
伝子（以下、ＡＬＡ合成酵素遺伝子と記す）を含むＤＮ
Ａを高発現ベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡお
よびこれにより宿主微生物を形質転換して得られる形質
転換体に関する。

［従来の技術］ ＡＬＡ合成酵素（ＥＣ２・３・１・３７）はスクシニル
−ＣｏＡとグリシンからＡＬＡを生成する酵素（“酵素
ハンドブック”朝食書店ｐ２４８（１９８３））であり
、ビタミンＢ１□、ポリフィリン、ヘム等の合成にとっ
て重要な役割を果たしている。

従来ＡＬＡ合成酵素生産能を有する微生物としてＳａｃ
ｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（例え
ば、Ｃ，Ｖｏｌｌａｎｄａｎｄ　Ｆ、Ｆｅ１ｉｘ　　Ｈ
ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４２　、５５１−５５７
（１９８２）　）　、Ｒｈｙ薗硯弘動μ匪特　用匝聾可
競（飼犬ば、Ｎａｎｄｉ、Ｄ、Ｌ、ａｎｄ　Ｓｈｅｍｉ
ｎ、Ｄ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５２゜２２７８
２２８０　（１９７７）　）等が知られている。

ＡＬＡ合成酵素の生産性を向上させるのに遺伝子操作技
術を適用することはいまだなされていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

遺伝子操作技術によるＡＬＡ合成酵素の生産性の向上を
目的に、本発明者等は、ＡＬＡ合成酵素遺伝子を高発現
ベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡを作製し、該
組換え体ＤＮＡを有する形質転換体が該酵素を効率良く
生産することを認め、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち本発明は、ＡＬＡ合成酵素遺伝子を効率良く発
現する組換え体ＤＮＡと、それを用いた形質転換体を提
供するものである。

以下、本発明について説明する。

ＡＬＡ合成酵素遺伝子のＤＮＡ供与体としては、ＡＬＡ
合成酵素生産能を使用する宿主において発現できるもの
であれば何でも使用可能である。例えば、ＡＬＡ合成酵
素生産能を有する鎖匹匝ｇｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが使
用できる。

ＡＬＡ合成酵素遺伝子のクローニングは、例えば（ｉ）
　Ｍ、Ａｒｒｅｓｅ　ｅｔ　ａＬ、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ
ｔ、　７．１７５１８５　　（１９８３）、（ｉｉ）　
Ｄ、Ｕｒｂａｎ−Ｇｒｉｍａｌ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、　　８．３２７　３３１　（１
９８４）　、（ｉｊ）　ＭａｒｔｉｎＢａｒｄ　ａｎｄ
　Ｔｈｏｍａｓ　　Ｄ、Ｉｎｇｏｌｉｄ　Ｇｅｎｅ　２
８．　１９５１９９　（１９８４）、（ｉｖ）　Ｔｅｒ
ｅｓａ　　Ｋｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　６．３５５　３６
４　（１９８６）により報告されているような、該酵素
欠損株を宿主とし、宿主のＡＬＡ要求性の回復を指標と
するセルフクローニングの方法、または、ＡＬＡ合成酵
素のアミノ酸配列（Ｄ、ＬＩｒｂａｎ−Ｇｒｉｍａｌｅ
ｔ　ａｌ、Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５６　、　５１１−５１９　
（１９８６））を有するオリゴＤＮＡをプローブとして
用いたコロニーハイブリダイゼーション法（Ｍ、Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎａｎｄ　Ｊ、Ｗａｌｌｉｓ　Ｍｅｔｈｏｄ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　、３７９３８９
　（１９７７））などの方法が使用できる。

あるいは、該酵素遺伝子を含むプラスミド、例えばｐＨ
ＥＭｌを用いることができる。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
５（ｐＨＥＭｌ）は工業技術院微生物工業技術研究所に
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０３９４号として寄託されている。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、挿入した遺伝子を高発現させることが期待
される、ｆａｃＵＶ５プロモータｔｒｐプロモーター　
ｔｅｔプロモーター、ｐＬプロモーターおよびこれらを
組合わせて成るハイブリッドプロモーター等の強力なプ
ロモーターを含む高発現ベクターＤＮＡを使用する。と
くに、ｔａｃプロモーターはｔｒｐプロモーターの３５
領域と１ａｃＵＶ５プロモーターの一１０領域から成る
強力なハイブリッドプロモーターであり、発現効率の点
から好ましい（ｄｅ　Ｂａｅｌ　ｅｔ　ａｌ。

ＰｒｏＮＡＳ　　８０．　２１　２５　（１９８３））
。

ｔａｃプロモーターを含む高発現ベクターＤＮＡとして
は、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３が使用できる。

また、発現効率の向上にはＳＤ配列と開始コドンの間の
距離（塩基数）を適したものに調節することも効果があ
り、ＳＤ配列と開始フトンの間の距離は一般的に２〜１
０数個が好ましいとされている。

本発明の組換え体ＤＮＡの作製および形質転換体を得る
ための操作は、（ｉ）高木康敬編著、遺伝子操作マニュ
アル（講談社）、（ｉｉ　）　ＲｏｎａｌｄＷ、Ｄａｖ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＦＯＲＧＥＮ
ＥＴＩＣＥＮＧＩＮＥＶ！、ＲＩＮＧ　Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
、　１９８０　）、（ｉｉｉ）Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｇ、　
Ａしａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕｄｌ　　（同、１９
８２）等に記載の方法が使用できる。

本発明の組換え体ＤＮＡは例えば、ＡＬＡ合成酵素遺伝
子の供与体としてプラスミドｐＨＥＭ１を使用した場合
、次の方法によって作製することができる。

ＡＬＡ合成酵素遺伝子を含むプラスミドｐＨＥＭｌのｔ
ｌｉｎｄＩＩｌ　−Ａｖａ　　ｌ断片をベクターＤＮＡ
に組込める状態にするため、まず、プラスミドｐＢＲ３
２５ヘサブクローニングする。ＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ
末端側の１ＩｉｎｄＩＩ［ＨｉｎｄＩ［［断片（約１．
６ｋｂ）をｐＢＲ３２５の１ＩｉｎｄＩＩサイトに挿入
したプラスミドｐＹＡｓＨ１を作製し、次いで、ｐＹＡ
ＳＨｌの短い方のＳａｌ　　ｌ　−５ａｌ　　ｌ断片（
約０．８　ｋｂ）を欠失させたプラスミドｐＹＡｓＨ３
１を作製した。

ｐＹＡｓＨ３１の旧ｎｄＨ［サイトをＩＥｃｏ　Ｒ１サ
イトに変更すると同時に短い方のＥｃｏ　ＲＩ　　Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片（約１．２　ｋｂ）を欠失させたプラス
ミドｐＹＡＳＥＳ１を作製した。一方、ＡＬＡ合成酵素
遺伝子Ｃ末端側のＳａｌ　　Ｉ　−Ａｖａ　　ｌ断片（
約０．９　ｋｂ）をｐＢＲ３２５のＳａｌ　　Ｉ　　Ａ
ｖａ　　ｌ断片（約５．２　ｋｂ）に連結したプラスミ
ドｐＹＡｓｓＡ１を得た。

ｐＹＡｓＥｓｌのＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ末端側を含む
Ｅｃｏ　Ｒ１−３ａｔ　　ｌ断片（約１．４　ｋｂ）と
ｐＹＡＳＳＡＩのＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｃ末端側を含む
Ｓａｌ　　Ｉ　−ＩＥｃｏ　Ｒ１断片（約４．３　ｋｂ
）を連結して、該酵素遺伝子を完全に含むプラスミドｐ
ＹＡＳＥＡ１を得た。次に、ｐＹＡｓＥＡｌのＡｖａ　
　ＩサイトをＸｈｏ　　［サイトに変更したプラスミド
ｐ　ＹＡＳＥＸＩを得て、ＡＬＡ合成酵素遺伝子がｐＢ
Ｒ３２５ヘサブクローニングされた。ベクターＤＮＡと
してｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア社から購入）を
用いた。プラスミドｐＫＫ２２３−３のクローニングサ
イトのｌ１ｉｎｄＩＩＩサイトをＸｈｏ　　Ｉサイトに
変更したプラスミドｐＫＫ−ＥＸを作製した。

プラスミドｐＫＫ−ＥＸの長い方の［ｉｃｏ　ＲＩＸｈ
ｏ　　ｌ断片（約４．６　ｋｂ）とプラスミドｐＹＡＳ
Ｅ×１のＡＬＡ合成酵素遺伝子を含む［ｉｃｏ　ＲＩ−
Ｘｈ。

ｌ断片（約２．３　ｋｂ）とを連結したプラスミドｐｙ
ＡＳ２を作製した。この組換え体ＤＮＡでも該酵素遺伝
子を発現させることは可能であるが、さらに高い発現を
達成させるために、ＳＤ配列と開始コドン（ＡＴＧ）間
の距離を３６３ｂからｌｌｂへ変更したプラスミドｐＹ
ＡＳ３を以下の方法で作製した。

上流にＥｃｏ　Ｒ１配列を含むＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ
末端の開始コドン（ＡＴＧ）から最初のＭｎｌ　　Ｔ切
断部位（４５番目の塩基）までのＤＮＡを合成し、これ
とｐＢＲ３２５のＥｃｏ　Ｒ１−Ｐｓｔ　　ｌ断片（約
４．８　ｋｂ）とを結合させたものと、ｐＹＡＳ２のＡ
ＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ末端を含むＥｃｏ　ＲＩＰｓｔ　
　ｌ断片（約０．６　ｋｂ）のＭｎｌ　　Ｉ消化物とを
混合し、結合させてＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ末端部分が
正しく連結したプラスミドｐＹＡｓ２１を作製した。

プラスミドｐＹＡｓ２１のＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ末端
を含むＥｃｏ　Ｒ１−Ｐｓｔ　　ｌ断片（約０．３　ｋ
ｂ）をプラスミドｐＹＡＳ２のＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｃ
末端を含むＩＥｃｏ　Ｒ１−ＰｓＬ　ｌ断片（約６，３
　ｋｂ）と連結し、ｔａｃプロモーター下流にＳＤ配列
と開始コドン（ＡＴＧ）間の距離がｌｌｂでＡＬＡ合成
酵素遺伝子が連結されたプラスミドｐＹＡｓ３が作製で
きた。

作製した組換え体ＤＮＡの形質転換に用いる宿主微生物
としては大腸菌が好ましいが、特にこれに限定されない
。大腸菌は、例えば、ｌａｃレプレッサー過剰生産菌で
あるＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９等が利用でき
る。この形質転換体の場合、培養物にイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することで
、発現が誘導されＡＬＡ合成酵素の生成量を上げること
ができる。

［発明の効果〕 上述したことから明らかな如く、本発明の組換え体ＤＮ
Ａにより形質転換して得られる形質転換体は、効率良＜
ＡＬＡ合成酵素を生産できるので、ＡＬＡの合成および
プロトポルフィリン■等ポルフィリン環をもつ化合物の
合成に利用でき産業上回めで有用なものである。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

ここで使用する酵素類は宝酒造社より購入したものを使
用した。ただし、制限酵素Ｍｎｌ　　ＩはＮＥＷ　　Ｅ
ＮＣ；ＬＡＮＤ　　ＢＩＯＬＡＢＳ社より購入したもの
を使用した。反応はメーカーのマニュアルに従って実施
した。なお、操作のフローを第１図および第３図に示し
た。

〔実施例〕

Ｉ　　　ＹＡＳＨＩの　１ 酵母ＡＬＡ合成酵素遺伝子を含むプラスミドｐＨＥＭＩ
約１２μＢを制限酵素ｔｌｉｎｄｌｌで消化した後、１
％アガロースゲル電気泳動にかけ約１．６　ｋｂのＤＮ
Ａ断片を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　（フナコシ薬品から購
入）を用い、そのマニュアルに従って回収した。この断
片（約０．３μｇ）をプラスミドｐＢＲ３２５（ヘセス
ダリサーチ・ラボラトリ−社から購入）の旧ｎｄｌ［Ｉ
消化物（約１μｇ）に結合させるために７４−ＤＮＡリ
ガーゼを作用させた。

この反応物で、Ｄ、Ａ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　６８　、　３２
６　３３１　　（１９７９）の方法を用いて大腸菌ＪＭ
１０５株（ファルマシア社から購入）を形質転換し、２
０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む固体り培地
（ハクトドリプトン１０ｇ／ｊ！、バクトイ−ストエキ
ストラクト５　ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、寒
天１５　ｇ／１．　（ｐＨ７，５）　’）に拡げ一晩培
養した。生じたクローンのうち、クロラムフェニコール
耐性かつテトラサイクリン惑受性のものからプラスミド
をアルカリによる迅速分離法（遺伝子操作マニュアル、
ｐ８〜１０）を用いて取得し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後
電気泳動で約６ｋｂと約１．６　ｋｂのＤＮＡ断片の存
在を確認し、このプラスミドをｐＹＡｓＨｌと名づけた
。

２　　　ＹＡＳＥＳＩの　、＋１ ｐＹＡｓＨｌ　（約６μｇ）を制限酵素Ｓａｌ　　Ｉで
消化した後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６
．８　ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。この断片（約２．
５μｇ）にＴ４−ＤＮＡリガーゼを作用させて閉環させ
、大腸菌ＪＭＬＯ５株を形質転換した。

２０μｇ／ｍｌのクロラムフエニコールヲ含ム固体り培
地で培養し、生育してきたクローンのうち、クロラムフ
ェニコール耐性かつテトラサイクリン惑受性のものから
プラスミドを取得し、Ｓａｌ　　Ｉで消化し、電気泳動
で約６．８　ｋｂのＤＮＡ断片であることを確認して、
このプラスミドをｐ　ＹＡＳ　ＨＳｌと名づけだ。

３　　　ＹＡＳＥＳＩの　１ ｐＹＡｓＨ３１の旧ｎｄｌｌｌサイトをＥｃｏ　ＲＩサ
イトに変更し、Ｅｃｏ　Ｒ１−旧ｎｄｌＩＩ断片（約１
．２　ｋｂ）を欠失させるのを以下の方法で実施した。

ｐＹＡｓＨ３１（約５．２μｇ）を制限酵素１１ｉｎｄ
■で消化し、これに’ｒ４−ＤＮＡポリメラーゼを作用
させて末端を平滑化した。この断片とＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼで５′末端をリン酸化したＥｃｏ　Ｒ１リ
ンカ−（宝酒造社から購入）をＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合させ、Ｅｃｏ　Ｒ１で消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ約５．６　ｋｂ断片を単離した。この
断片（約１．２μｇ）を閉環させるためにＴ４−ＤＮＡ
リガーゼを作用させた。

これで大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換させ、５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含む固体り培地上に生育したクロ
ーンの中からプラスミドを取得しＢｃ。

ＲＩで消化した後、電気泳動で約５．６　ｋｂのＤＮＡ
断片であることを確認し、このプラスミドをｐＹＡＳＥ
Ｓ　１と名づけた。

４　　　ＹＡＳＳＡＩの■ プラスミドｐＨＥＭ１　（約８μｇ）を制限酵素Ａνａ
ｌで消化し、続いて制限酵素Ｓａｔ　　Ｉで消化した。

１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．９ｋｂのＤ
ＮＡ断片（約０．２　μｇ）した。同様にプラスミドｐ
ＢＲ３２５（約２μｇ）を＾ｖａ　　ｌと５ａｌＩで消
化した後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ約５．２
　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．４　μｇ）を単離した。単
離した２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ。

ＤＮＡリガーゼで結合させた。大腸菌ＪＭＩＯ５株を形
質転換して、２０μｇｏｗｌのクロラムフェニコールを
含む固体り培地に拡げ培養した。生じたクローンの中か
らプラスミドを取得し、５ａｌＩで消化し、電気泳動で
約６．１　ｋｂのＤＮＡ断片を確認し、このプラスミド
をｐＹＡｓｓＡｌと名づけだ。

ＹＡＳＥＡ　　　の　　１ プラスミドｐＹＡｓＥｓ１　（約４μｇ）を制限酵素Ｅ
ｃｏ　ＲＩ、　Ｓａｌ　　Ｉで消化した後、１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約１．４　ｋｂのＤＮＡ断片
（約０．３μｇ）を単離した。同様に、プラスミドｐＹ
ＡｓｓＡ１　（約２μｇ）をＥｃｏ　Ｒ１，Ｓａｌ　Ｉ
で消化した後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
４．３　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．４　μｇ）を単離し
た。

単離した２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ、−ＤＮＡリガ
ーゼで結合させた。大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換して
、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む固体り培地上に
拡げ培養した。生じたクローンからプラスミドを取得し
、Ｅｃｏ　Ｒ１で消化し、電気泳動で約５．７　ｋｂの
ＤＮＡ断片を確認し、このプラスミドをｐＹＡＳＥＡｌ
と名づけだ。

６　　　ＹＡＳＥＸＩの・１ プラスミドｐＹＡｓＥＡ１　（約５μｇ）を制限酵素Ａ
ｖａ　　Ｉで消化し、これにＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ
を作用させて末端を平滑化した。この断片とＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼで５′末端をリン酸化したＸｈｏ
　　Ｉリンカ−（宝酒造社から購入）をＴ、−ＤＮＡリ
ガーゼで結合させ、Ｘｈｏ　　Ｉで消化した後、１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約５．７　ｋｂのＤＮＡ
断片を単離した。この断片（約２μｇ）を閉環させるた
めにＴ４−ＤＮＡリガーゼを作用させた。これで大腸菌
ＪＭ１０５株を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む固体り培地上に生育したクローンの中から
プラスミドを取得し、Ｘｈｏ　　Ｉで消化した後、電気
泳動で約５．７　ｋｂのＤＮＡ断片を確認し、このプラ
スミドをｐＹＡｓＥＸｌと名づけだ。

７　　　ＫＫ−ＥＸの　「 ｔａｃプロモーターを含む高発現ベクターＤＮＡである
ｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア社から購入）の旧ｎ
ｄｌｌｌサイトをＸｈｏ　　Ｉサイトへ変更するのを以
下の方法で実施した。

ｐＫＫ２２３−３　（約２．５μｇ）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌｌで消化し、これにＴ、−ＤＮＡポリメラーゼを
作用させて末端を平滑化した。この断片とＴ４−ポリヌ
クレオチドキナーゼで５′末端をリン酸化したＸｈｏ　
　Ｉリンカ−（宝酒造社から購入）を′ｒ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合させ、Ｘｈｏ　　Ｉで消化した後、１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約４．６ｋｂのＤＮＡ断片
を単離した。この断片（約１μｇ）を閉環させるために
Ｔ、−ＤＮＡリガーゼを作用させた。これで大腸菌ＪＭ
１０５株を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む固体り培地上に生育したクローンの中からプラ
スミドを取得し、Ｘｈｏ　Ｉで消化した後、電気泳動で
約４．６　ｋｂのＤＮＡ断片を確認し、このプラスミド
をｐＫＫＥＸと名づけだ。

８　　　ＹＡＳ２の　１１ ブラスミＦｐＹＡＳＥＸ１　（約Ａｕｇ）を制限酵素Ｅ
ｃｏ　Ｒ１、Ｘｈｏ　　Ｉで消化した後、１％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約２．３　ｋｂのＤＮＡ断片（約
０．４　μｇ）を単離した。同様にプラスミドｐＫＫＥ
Ｘ（約４μｇ）をＥｃｏ　Ｒ１、Ｘｈｏ　Ｉで消化した
後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ約４．６　ｋｂ
のＤＮＡ断片（約１．２μｇ）を単離した。単離した２
つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで結合
させた。大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換して、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含む固体り培地上に拡げ培養し
た。生じたクローンからプラスミドを取得し、Ｅｃｏ　
Ｒ１，Ｘｈｏ　　Ｉで消化し、電気泳動で約２．３　ｋ
ｂ、約４．６　ｋｂの２つのＤＮＡ断片を確認し、この
プラスミドをｐＹＡＳ２と名づけだ。

（９ＹＡＳ２１の　１１ より高い発現を達成させるためにＳＤ配列と開始コドン
（ＡＴＧ）間の距離を３６３ｂから１１ｂに変更するの
に、以下の操作を行なった。

ｉ）合成りＮＡ鎖の作製 上流にＥｃｏ　Ｒ１配列を含むＡＬＡ合成酵素遺伝子Ｎ
末端の開始コドンから最初のＭｎｌ　　Ｉ切断部位（４
５番目の塩基）までの塩基配列をもつ合成りＮＡ鎖を作
製するのに、まず、第２図に示した２本の合成りＮＡを
アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ）社のり、Ｎ　Ａシンセサイザー・モデル３
８０−Ａを用いて合成した。２本の合成りＮＡをそれぞ
れＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを作用させて５′末
端をリン酸化し混合した。

鎖をアニーリングさせるために、約１５０ｍ１の水の入
った水浴中で、１００°Ｃ１１０分間インキュベートし
た。徐々に室温になるまで放冷した後、４°Ｃで一晩放
置することで合成りＮＡ鎖を作製した。

ｉｉ）合成りＮＡを含む断片の作製 プラスミドｐＢＲ３２５（約５μｇ）を制限酵素Ｅｃｏ
　Ｒ１、Ｐｓｔ　　Ｉで消化し、１％アガロースゲル電
気泳動で約４．８　ｋｂのＤＮＡ断片（約２μｇ）を単
離した。この断片と（ｉ）で作製した合成りＮＡ鎖（約
１μｇ）を混合し、Ｔ、−ＤＮＡリガーゼで結合させた
。

１ｉｉ）　ｐ　ＹＡＳ　２１の作製 プラスミドｐＹＡＳ２　（約６μｇ）を制限酵素Ｅｃｏ
　Ｒ１，Ｐｓｔ　　ｌで消化し、１％アガロースゲル電
気泳動で約０．６　ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。この
断片（約０．２μｇ）を制限酵素Ｍｎｌ　　Ｉで消化し
、これに（ｉｉ）で作製した合成りＮＡを含む断片（約
１μｇ）を混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを作用させた
。この反応物で大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換して、Ｉ
Ｏμｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む固体り培地に拡
げ培養した。生じたクローンからプラスミドを取得し、
Ｅｃｏ　Ｒ１，Ｐｓｔ　　Ｉで消化し、電気泳動で約４
．８　ｋｂと約０．３　ｋｂのＤＮＡ断片を確認し、こ
のプラスミドをｐＹＡｓ２１と名づけた。

１０　　　ＹＡＳ３の−１ プラスミドｐＹＡＳ２　（約２μｇ）を制限酵素Ｅｃｏ
　Ｒ１，Ｐｓｔ　　Ｉで消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約６．３　ｋｂのＤＮＡ断片（約１
．２　μｇ）を単離した。また、プラスミドｐＹＡＳ２
１　（約２４μｇ）を制限酵素Ｅｃｏ　Ｒｒ、Ｐｓｔ　
　１で消化した後、１０％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、約０．３　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１μ
ｇ）をエレクトロエリニージョン法により単離した。単
離した２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させた。大腸菌ＪＭＩＯ５株を形質転換して、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む固体り培地上に拡げ
培養した。生じたクローンからプラスミドを取得し、第
４図に示した制限地図をもつことを確認し、このプラス
ミドをｐＹＡＳ３と名づけた。

０ＡＬＡ人 り培地（バタトトリブトン１０　ｇ／１．、バクトイ−
ストエキストラクト５ｇ／！、塩化ナトリウムｌ　Ｏ、
ｇ　／　ｉ　（ｐＨ７，５）　）中３７°Ｃで一晩培養
した形質転換体ＪＭ１０５　（ｐＹＡＳ２）および３Ｍ
１０５　（ｐＹＡｓ３）を５００ｍ１容三角フラスコ内
１００ｍ１Ｌ培地に移植し、３７°Ｃで振とう培養し、
ＯＤ、、、＝０．７の時点でＩ　ＰＴＧを１ｍＭとなる
ように培地に添加し、さらに培養を続けた。

Ｉ　ＰＴＧ添加後５時間目に遠心分離法で培養物から菌
体を集め、０．ＩＭＦリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
−度洗浄し、同緩衝液５ｎ＋１に懸濁した。これを常法
により超音波処理したのち１２，００Ｏｒｐｍで２０分
間遠心分離し、その上澄液を粗酵素液とした。

第１表に示した組成の反応液中で、３２°Ｃ，１時間反
応させた後、７．５％トリクロロ酢酸０．５　ｍｌを加
え反応を停止させた。１２．ＯＯＯｒｐｍ　、５分間遠
心分離した上澄１ｍｌにアセト酢酸エチル０．２ｍｌを
加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で１０ｍ
１とし、１００°Ｃ，１０分間加熱し冷却後二〇液１ｍ
ｌに修正エールリッヒ試薬（Ｍａｕｚｅｒａｌｌ、Ｄ、
、ａｎｄＳ、Ｇｒａｎｉｋ；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２１９．４３５−４４６（１９５６））１ｍｌを加
え、よく混合し、１０分後に、５５３ｎｍの吸光度を測
定した。検量線からＡＬＡを定量し、ＡＬＡ合成酵素活
性値を算出した。対照として、大腸菌ＪＭ１０５株のＡ
ＬＡ合成酵素活性を同様の方法で測定した。

以下　余白 第　　１　　表 グリシン コハク酸ナトリウム ｏＡ ピリドキサールリン酸 ＴＰ ｇＣ１２ Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐｔｌ　７．８）ＤＴＡ β−メルカプトエタノール スクシニル−ＣｏＡシンターゼ＊ 粗酵素液 １００μｍｏ１ ０．５８ ０．２５ ７．５ １０単位 総液量 水生化学実験講座７　タンパク質の生合成（下）、東京
化学同人ｐ６３４　（１９７５）の方法により調整した
。

第 表 また、制限酵素サイトは、説明に必要な箇所のみを記載
した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）δ−アミノＬブリン酸合成酵素をコードする遺伝
   子を含むＤＮＡを高発現ベクターＤＮＡに挿入した組換
   え体ＤＮＡ
2. （２）δ−アミノＬブリン酸合成酵素をコードする遺伝
   子を含むＤＮＡを高発現ベクターＤＮＡに挿入した組換
   え体ＤＮＡにより、宿主微生物を形質転換して得られる
   形質転換体