CN1654641A

CN1654641A - Fungamyl样α－淀粉酶变体

Info

Publication number: CN1654641A
Application number: CNA2004100819476A
Authority: CN
Inventors: 亨里克·比斯加德-弗兰岑; 阿伦·斯文德森; 斯文·佩德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-11-10
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2005-08-17
Also published as: AU1269601A; JP2003513666A; EP1230351A1; AR026433A1; CN1390252A; EP1980614A3; EP1980614A2; WO2001034784A1

Abstract

本发明涉及亲本Fungamyl样真菌α－淀粉酶的变体，其在适于例如淀粉加工的酸性pH下表现出热稳定性增强。

Description

Fungamyl样α-淀粉酶变体

本发明申请是基于申请日为2000年11月10日，申请号为00815549.6、发明名称为：“Fungamyl样α-淀粉酶变体”的分案申请。

发明领域

本发明涉及Fungamyl^TM样α-淀粉酶的α-淀粉酶变体(突变体)，具体是改进了在酸性pH值下的热稳定性。本发明也涉及这样的变体的应用。

发明背景

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)组成一组酶，其可以催化淀粉和其它直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖水解。

有大量的专利和科学文献涉及此类在工业上很重要的酶。被称为“Termamyl^_样α-淀粉酶”的α-淀粉酶及其变体可从例如WO 90/11352，WO95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873，和WO 96/23874中了解。Termamyl样α-淀粉酶热稳定性很高，因此适于高温下的处理过程，如葡萄糖生产过程中的淀粉液化。

还有一组称为“Fungamyl^TM样α-淀粉酶”的α-淀粉酶，它们与得自米曲霉的α-淀粉酶(表示为SEQ ID NO：1)相关。这些Fungamyl样α-淀粉酶热稳定性相对较低(Novo Nordisk，丹麦，的商品名为FUNGAMYL^_的市售产品，最适温度约为55℃)，因此不适于在高温下进行处理。目前Fungamyl样α-淀粉酶用于制造，例如酿造工业所用糖浆。这样的处理在约60℃下进行，导致由于其热稳定性较低而加入的酶量必需加倍。此外，在55℃下可能会出现污染问题。

还由于目前这样的处理在pH5.5下，而不是，例如pH4.5进行，故必需调整pH并向糖浆中加入钠。

因此，提供优选在酸性pH条件下热稳定性提高的Fungamyl样α-淀粉酶是有利的。

发明简述

本发明目的是提供Fungamyl样α-淀粉酶变体，具体是改进了特别是在酸性pH下的热稳定性。

术语“改进了热稳定性的α-淀粉酶变体”在本文中指比相应的亲本α-淀粉酶有较高热稳定性的α-淀粉酶变体。热稳定性如下文在材料和方法部分所述进行确定。

如下所述，本发明人提供了改良的Fungamyl样α-淀粉酶变体。

发明详述

本发明目的是改进Fungamyl样α-淀粉酶的热稳定性，尤其在酸性pH下。

鉴定为改进热稳定性而要突变的位点和/或区

分子动力学(MD)模拟指示蛋白质结构中氨基酸的可变性(mobility)(参见McCammon，JA和Harvey，SC.，(1987)，“Dynamics of proteins and nucleicacids”.Cambridge University Press.)。这样的蛋白质动力学经常与晶体学B-因子(参见Stout，GH和Jensen，LH，(1989)，“X-ray structuredetermination”，Wiley)或B-因子自身对比。通过在可滴定残基的不同质子化状态进行MD模拟，模拟了残基的pH相关可变性。选择具有最高可变性或灵活性(flexibility)(在此为各向同性的波动)的区进行随机诱变。在此应理解地是在蛋白特定区发现的高流动性可通过在这些残基进行替换而改进热稳定性。所述替换针对具有较大的侧链和/或能改进与周围残基的接触的残基。得自米曲霉表示为SEQ ID NO：2的亲本Fungamylα-淀粉酶骨架用于所述MD模拟。

通过分子动力学(MD)模拟或B因子检查(如收入Protein DataBase(PDB)( www.rcsb.org)file 6TAA(Swift，H.J.，Brady，L.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.J.，Dodson，G.G.，Turkenburg，J.P.，Wilkingson，A.J.：Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae(TAKA)alpha-amylase：an application of the simulated-annealing method.Acta CrystallogrB47 pp.535(1991))发现的适合进行突变，以获得具体是改进的热稳定性的区如下所列：

98-110区，

150-160区，

161-167区，

280-288区，

448-455区，

468-475区。

上述区表现出是可变的。使这些区更稳定会使该分子热稳定性更高。

相应地，本发明的第一个方面涉及在下述的区和位置包含一或多个突变的亲本Fungamyl样α-淀粉酶。

命名法

在本说明书和权利要求中，使用传统的一个和三个字母表示氨基酸残基。为便于引用，本发明的α-淀粉酶变体采用下述的命名法：

原氨基酸：位置：用于取代的氨基酸

依照此命名法，举例说明，比如在位置30天冬酰胺对丙氨酸的取代表示为：

Ala30Asn或A30N

在同样位置丙氨酸的缺失表示为：

Ala30^*或A30^*

一个额外氨基酸残基，例如赖氨酸的插入，表示为：

Ala30AlaLys或A30AK

一段连续氨基酸残基的缺失，例如氨基酸残基30-33，表示为(30-33)^*或Δ(A30-N33)。

与其它α-淀粉酶相比，特定α-淀粉酶包含一个“缺失”并在此位置有一个插入，这表示为：

^*36Asp或^*36D

它用于表示在位置36插入天冬氨酸

多个突变由加号分隔，即：

Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S

代表在位置30和34的突变，由天冬酰胺和丝氨酸分别取代丙氨酸和谷氨酸。

多个突变也可如下分隔表示，意义与加号相同：

Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S

当有一个或多个备选氨基酸可以插入一个特定位置时，可以指示为：

A30N，E或

A30N或A30E

此外，当本文中鉴定出一个适于修饰的位点而没有提示任何特定的修饰时，这应理解为此位点的氨基酸残基可以为任一氨基酸残基取代。这样，例如，当提到在位点30的丙氨酸的修饰，而没有特别指明，或者表示为“A30X”时，应理解为丙氨酸可以缺失或为任一其它氨基酸，即R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V中的任一个取代。

Fungamyl样α-淀粉酶

本发明的具有α-淀粉酶活性的亲本Fungamyl样α-淀粉酶与SEQ IDNO：1所示编码α-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ ID NO：2所示α-淀粉酶蛋白序列的成熟部分有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少93％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少99％的同一性，和/或结构类似于SEQ ID NOS：1和2所示Fungamylα-淀粉酶的三维结构，还公开在Protein Data Base(PDB)( www.rcsb.org)file 6TAA(Swift，H.J.，Brady，L.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.J.，Dodson，G.G.，Turkenburg，J.P.，Wilkingson，A.J.：Structure and moleculare model refinement of Aspergillus oryzae(TAKA)alpha-amylase：an application of the simulated-annealing method.Acta CrystallogrB 47 pp.535(1991)和/或由能与SEQ ID NO：1所示DNA序列中编码本说明书SEQ ID NO：2所示α-淀粉酶成熟部分的DNA杂交的DNA序列编码。

定义“Fungamyl样α-淀粉酶”包括的这类α-淀粉酶的具体例子有米曲霉TAKAα-淀粉酶(EP 238 023)，见SEQ ID NO：2，在EP383779 B2([0037]部分)披露的黑曲霉α-淀粉酶(还参见实施例1的黑曲霉基因的克隆)。

在一个实施方案中，Fungamyl样α-淀粉酶得自一种真菌，具体是曲霉属，具体是米曲霉或黑曲霉。

市售亲本Fungamyl样α-淀粉酶

市售亲本Fungamyl样α-淀粉酶包括Fungamyl^_(Novo Nordisk，丹麦)。Fungamyl^_是得自米曲霉特定菌株的真菌α-淀粉酶。在淀粉工业中，Fungamyl^_用于高麦芽糖糖浆，45-60％麦芽糖(2-7％葡萄糖)或高转化糖浆，DE 60-70，35-43％葡萄糖，30-37％麦芽糖，的生产。其它市售真菌α-淀粉酶包括得自米曲霉的Clarase^TM(Genencor Int.，美国)；和得自黑曲霉的Maltamyl^TM(Enzyme Biosystems)。

在酿造工业中，在发酵期间加入FUNGAMYL^_(和类似产品)以提高麦芽汁的发酵能力。

在乙醇工业中，如果现有设备可以进行低温液化(55-60℃)，则FUNGAMYL^_可用于蒸馏醪液(distillery mash)的淀粉液化。FUNGAMYL^_(及类似产品)还可用于烘烤，可用于所有类型的面包和焙烤产品。例如FUNGAMYL^_改进了生面团稳定性，导致更大的面包体积，改进了面包屑松软程度，使外皮颜色更深。

本发明的α-淀粉酶变体

本发明的第一个方面涉及亲本Fungamyl样α-淀粉酶的变体，其在NO：2所示氨基酸序列中下列位置或区包含一或多个突变：

98-110区，

150-160区，

161-167区，

280-288区，

448-455区，

468-475区，和/或在与表示为SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少60％同一性的同源Fungamyl样α-淀粉酶中对应的位置或区内包含一或多个突变。

在一个实施方案中突变的区是98-110区。

在一个实施方案中突变的区是98-110区，更具体地是一或多个下列位置：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110。

具体地替换是

98X，优选T；

99X，优选T；

100F，Y，W，I，M；优选Y；

101R；

102S，T，V；

103I，F，V，优选I；

104T，V，I；

105X，优选A；

106V，L，N，D，Q，E，优选V；

107V，I，M；

108Y，R，K；

109D，N，Q；

110Q。

在一个实施方案中突变区是150-160区，更具体地是一或多个下列位置：150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160。

具体的替换是

151 Y，Q，L，I，R，优选Y；

152V，L；

153T，N，S，优选S；

154L，Y，V，T，S，优选L；

155F，N，L；

156X，优选D，N，S，T；

157S，T，N；

158E，Y

159X，优选S，A；

160X，优选N；

在一个实施方案中突变区是161-167区，更具体地是一或多个下列位置：161，162，163，164，165，166，167。

具体的替换是

1611，S，T；

162D，N，Q，Y；

163E，Q，N；

166V，F，Y，I，S，T，优选V，F，Y；

167A；

在一个实施方案中突变区是280-288区，更具体地是一或多个下列位置：280，281，282，283，284，285，286，287，288。

具体的替换是

280Q，Y，R；

281X，优选T，A；

282X，优选S，T；

285L，N；

286X，优选D；

287V，S，A；

288N，F，Y，E，D，优选N；

在一个实施方案中突变区是448-455区，更具体地是一或多个下列位置：448，449，450，451，452，453，454，455。

具体的替换是：

448X，优选A，L，Y，S，T；

449X，优选L，V，S，T；

450I，T，L；

452I，L；

454I，L；

455D，E，S，T。

在一个实施方案中突变区是468-475区，更具体地是一或多个下列位置：468，469，470，471，472，473，474，475。

具体的替换是：

468F，Y，H；

469E，D，Q，N；

470X，优选A，S，T；

471N，T，K，R，F，Y优选N，T，Y；

472R；

473L，N，Y；

475X，优选T，R。

在酸性pH下改进的稳定性

本发明的一个目的是使Fungamyl样α-淀粉酶对比其亲本α-淀粉酶(即，对应的未突变α-淀粉酶)更耐酸性。

Fungamyl样α-淀粉酶变体比其亲本Fungamyl样α-淀粉酶更耐酸性意味着其在酸性pH下的稳定性比其对应的亲本α-淀粉酶更高。可按照“材料和方法”部分所述确定所述淀粉酶更耐酸。

术语“酸性pH”至少在本文中意指pH范围为4-6，比如4-5，尤其4.2-4.7。

需要更耐酸的真菌α-淀粉酶，因为这可以使真菌α-淀粉酶变体与合适的葡糖淀粉酶一起或同时在，例如淀粉加工中的(糊精化)糖化步骤中使用。

热稳定性

本发明的一个目的是提供更耐热的Fungamyl样α-淀粉酶。

Fungamyl样α-淀粉酶变体比亲本Fungamyl样α-淀粉酶更耐热意味着其最适温度更高。所述淀粉酶更耐热可按照“材料和方法”部分所述来确定。

需要更耐热的真菌α-淀粉酶，因为它使液化步骤更有效和/或更快。此外，其对液化温度更不敏感，甚至可以提高温度(即，对冷却要求的更少)。此外，也降低了污染的风险。

应该理解地是本发明的变体可以同时为酸性pH更稳定和热更稳定，尤其在酸性pH下热稳定性更高。

同源性(同一性)

上述亲本α-淀粉酶的同源性(同一性)表示两种蛋白质或DNA序列间相互偏差的程度。可通过本领域已知的计算机程序，如GCG软件包的GAP程序(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，1994年8月，遗传学计算机组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美国53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，p.443-453)适当确定同源性(同一性)。进行核酸序列对比时，使用(缺省的)GAP产生罚分5.0，GAP延伸罚分0.3；进行蛋白质对比时，使用(缺省的)GAP产生罚分3.0，缺口延伸罚分0.1。GAP采用Needleman和Wusch，(1970)，J.Mol.Biol.48，p.443-453，的方法进行比对并计算同一性。

采用多肽或DNA序列对比时所用的GAP及上述设置，亲本Fungamyl样α-淀粉酶与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟部分和SEQ ID NO：1所示DNA序列的编码部分有优选至少60％的同一性，如70％，至少80％，至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少99％。

在一个优选实施方案中，本发明变体改进了热稳定性，尤其在酸性pH下。

杂交

鉴定Fungamyl样α-淀粉酶所用寡核苷酸探针可基于目的α-淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列来制备。

杂交的合适条件包括在5×SSC中预浸，在20％甲酰胺，5×Denhardt溶液，50mM磷酸钠，pH6.8，和50mg超声变性的牛胸腺DNA溶液中在～40℃下预杂交1小时，然后在补充有100mM ATP的相同溶液中40℃下杂交18小时，然后将杂交膜在2×SSC，0.2％SDS中，40℃下(低严谨度)洗30分钟，共三遍，优选在50℃下(中等严谨度)，更优选在65℃下(高严谨度)，更为优选75℃(极高严谨度)。有关杂交方法的细节可参照Sambrook等，Molecular_Cloning：A Laboratory Manual，第2版，冷泉港，1989。

在本文中，“得自”不仅指α-淀粉酶由或可由目的生物的菌株产生，也指由分离自这类菌株的DNA序列编码的α-淀粉酶和在用该DNA序列转化的宿主生物中产生的α-淀粉酶。最后，该术语指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有目的α-淀粉酶的鉴定特征的α-淀粉酶。该术语也指亲本α-淀粉酶可以是自然存在的α-淀粉酶的变体，即，自然存在的α-淀粉酶经一或多个氨基酸残基修饰(插入，替换，缺失)而产生的变体。

克隆编码Fungamyl样α-淀粉酶的DNA序列，克隆编码α-淀粉酶的DNA序列，克隆编码a-淀粉酶的DNA序列

可采用本领域各种已知方法，从生产α-淀粉酶的任何细胞或微生物分离编码亲本Fungamyl样α-淀粉酶的DNA序列。首先，采用染色体DNA或信使RNA从产生待研究α-淀粉酶的生物构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果所述α-淀粉酶的氨基酸序列已知，可合成标记的寡核苷酸探针并用于鉴定目的生物基因组文库中编码α-淀粉酶的克隆。备选地，包含与另一已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用作探针经较低严谨度的杂交和冲洗条件鉴定α-淀粉酶编码克隆。

鉴定α-淀粉酶编码克隆的另一方法包括将基因组DNA片段插入一表达载体，如质粒，用所得基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性细菌，然后将转化细菌铺板在含有α-淀粉酶底物(即，麦芽糖)的琼脂上，使表达目标α-淀粉酶的克隆生长。

备选地，所述酶的DNA序列可通过现有标准方法合成，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，Tetrahedron Letters 22，p.1859-1869，或Matthes等，(1984)，EMBO J.3，p.801-805所述亚磷酰胺(phosphoroamidite)方法。在亚磷酰胺方法中，在例如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并克隆在合适的载体中。

最后，可根据标准技术，将合成的、基因组来源的或cDNA来源的片段(根据需要，所述片段对应于完整DNA序列的各个部分)连接在一起，从而将DNA序列制备成基因组片段与合成片段的混合物，合成片段与cDNA片段的混合物或基因组片段与cDNA片段的混合物。DNA序列还可用特异性引物经聚合酶链式反应(PCR)来制备。如US 4683202或R.K.Saiki等，(1988)，Science 239，pp.487-491中所述。

定点诱变

一旦分离出编码α-淀粉酶的DNA序列，并鉴定出合乎需要的突变位点，可使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有侧翼于所需突变位点的核苷酸序列。在特定的方法中，在携有α-淀粉酶基因的载体中产生桥连α-淀粉酶-编码序列的单链DNA缺口。然后，使携有所需突变的合成核苷酸与该单链DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)补平其余缺口，使用T4连接酶连接构建体。该方法的特例描述于Morinaga等(1984)，Biotechnology 2，p.646-639。US 4,760,025公开了通过对盒(cassette)进行微小的改变而导入编码多个突变的寡核苷酸。然而，由于Morinaga法可以导入多种长度的多个寡核苷酸，因此可在任何一次导入甚至更多个突变。

Nelson和Long(1989)，Ahalytical Biochemistry 180，p.147-151描述了另一种将突变导入编码α-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3个步骤产生含有所需突变的PCR片段，所述突变是通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应的一个引物而导入的。通过用限制性内切核酸酶裂解，可从PCR-产生的片段中分离出携有突变的DNA片段，并将该片段重新插入表达质粒。

随机诱变

可在翻译成本文所示氨基酸序列的基因的至少3个部分中，或在整个基因内适当地进行随机诱变，所述诱变可以是定域的或区域-特异性的随机诱变。

利用本领域已知的任何方法，可以方便地对编码亲本α-淀粉酶的DNA序列进行随机诱变。

与上文相关，本发明的另一方面涉及产生亲本Fungamyl样α-淀粉酶的变体的方法，例如，其中变体相对于亲本而言，表现出经改变的或增加的热稳定性，所述方法包括：

(a)对编码亲本Fungamyl样α-淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，

(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中得到的突变DNA序列，和

(c)筛选表达α-淀粉酶变体的宿主细胞，所述变体相对于亲本Fungamyl样α-淀粉酶而言具有经改变的特性(如热稳定性)。

优选使用添加(doped)引物进行本发明上述方法中的步骤(a)，如在工作实施例中所述(参见下文)。

例如，可使用适当的物理或化学诱变剂，使用适当的寡核苷酸，或通过对DNA序列进行PCR以产生诱变来进行随机诱变。另外，可使用这些诱变剂的任何组合进行随机诱变。诱变剂可以是例如诱导碱基转换，颠换，倒位，倒频，缺失和/或插入的试剂。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用这些诱变剂时，一般通过在适于发生诱变的条件下，在选定诱变剂的存在下保温待诱变的编码亲本酶的DNA序列来进行诱变，然后筛选具有所需特性的突变DNA。

当利用寡核苷酸进行诱变时，在合成待改变位置处的寡核苷酸的过程中，可同时添加寡核苷酸和3个非-亲本核苷酸。添加的目的是避免不必要氨基酸的密码子。可通过任何公开的技术如使用PCR，LCR或适当时使用任何DNA聚合酶和连接酶，将添加的寡核苷酸掺入编码α-淀粉酶的DNA。

优选使用“恒随机的添加”进行添加，其中各个位置的野生型和突变的百分比是预先确定好的。另外，添加可以导致优先导入某些核苷酸，从而优先导入一个或多个特定的氨基酸残基。例如，进行添加后可在每个位置导入90％野生型和10％突变。选择添加方案的其它考虑基于遗传学以及蛋白质-结构的限制。可使用DOPE程序制订添加方案，所述程序可特别地确保不导入终止密码子。

当使用PCR-产生的诱变时，可在增加核苷酸错误掺入的条件下，对经化学处理或未经处理的编码亲本α-淀粉酶的基因进行PCR(Deshler 1992；Leung等，技术，Vol.1，1989，pp.11-15)。

可使用大肠杆菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet，133，1974，pp.179-191)，酿酒酵母或任何其它微生物的增变株对编码α-淀粉酶的DNA进行随机诱变，诱变方法包括例如：将含有亲本葡糖淀粉酶的质粒转化至增变株，培养含有质粒的增变株，从增变株中分离突变的质粒。随后，将突变的质粒转化至表达生物。

待诱变的DNA序列可以方便地存在于基因组或cDNA文库中，所述文库生产自表达亲本α-淀粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在于适当的载体，如质粒或噬菌体上，再与诱变剂一起保温或要不然暴露于诱变剂中。待诱变的DNA也可存在于宿主细胞中，或者整合于所述细胞的基因组中，或者存在于细胞所携带的载体上。最后，待诱变的DNA也可以是分离的形式。应理解接受随机诱变的DNA序列优选为cDNA或基因组DNA序列。

在某些情况下可于实施表达步骤b)或筛选步骤c)前方便地扩增突变的DNA序列。可根据本领域已知的方法进行扩增，本发明优选的方法是：使用根据亲本酶的DNA或氨基酸序列生产的寡核苷酸引物进行PCR扩增。

与诱变剂保温或暴露于诱变剂之后，通过在允许发生表达的条件下培养携有突变DNA序列的适当宿主细胞来表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可以是被突变的DNA序列(任选其存在于载体上)转化的宿主细胞，或者是在诱变处理的过程中携有编码亲本酶的DNA序列的宿主细胞。适当宿主细胞的例子如下：革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。

突变的DNA序列可进一步含有能使突变的DNA序列表达的DNA序列。

定域随机诱变

随机诱变可有利地定域于所述亲本α-淀粉酶的一部分。例如，当酶的某些区域被鉴定为对酶的给定特性特别重要时，以及当预期修饰能导致具有改良特性的变体时，定域随机诱变较为有利。当亲本酶的三级结构已被阐明，且所述结构与酶的功能相关时，一般可鉴定出所述区域。

通过使用上述的PCR产生的诱变技术或本领域已知的任何其它适当的技术，可以方便地进行定域的或区域-特异性的随机诱变。或者，通过例如插入适当的载体来分离编码待修饰的DNA序列部分的DNA序列，随后可使用上述任何诱变方法对所述部分进行诱变。

提供本发明的变体的备选方法包括基因改组，例如WO95/22625(Affymax Technologies N.V)所述，或如WO 96/00343(Novo NordiskA/S)，或其它产生含有所述突变，如替换和/或缺失的杂交酶的技术。

α-淀粉酶变体的表达

根据本发明，可使用表达载体，以酶的形式表达通过上述方法，或通过本领域已知的任何其它方法产生的编码变体的DNA序列，所述表达载体一般包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号的控制序列，并任选包括阻抑基因或多种激活子基因。

表达载体

携有编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能对其方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于导入该载体的宿主细胞。载体可以是当导入宿主细胞时可以整合至宿主细胞基因组，并与整合了该载体的染色体一起复制的载体。合适的表达载体例如有pMT838。

启动子

在所述载体中，DNA序列应该与适当的启动子序列可操作相连。启动子可以是在选定宿主细胞中显示出转录活性的任何DNA序列，启动子可以得自编码与宿主细胞同源或异源之蛋白质的基因。

介导编码本发明α-淀粉酶变体之DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子的例子是：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amvL)启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子的例子是得自编码下列酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶，酿酒酵母TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。

表达载体

本发明的表达载体也含有适当的转录终止子，在真核生物中，还含有与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连的聚-腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可适当地得自与启动子相同的来源。

载体可进一步含有能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可含有选择标记，例如其产物可以补偿宿主细胞缺陷的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。另外，载体可含有曲霉属选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或者可通过WO 91/17243中所述的共-转化来完成选择。

分别连接编码葡糖淀粉酶变体的本发明DNA构建体，启动子，终止子和其它元件，并将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。

宿主细胞

含有上文所定义的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞可以有利地用作宿主细胞，以重组产生本发明的α-淀粉酶变体。可以方便地通过将编码变体的本发明DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，用所述DNA构建体转化细胞。一般认为整合是有利的，因为整合后DNA序列可以在细胞中更加稳定地维持。根据常规方法，例如通过同源或异源重组可以将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。

本发明的细胞可以是高等生物，如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选其为微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

适合的细菌为革兰氏阳性菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性菌如大肠杆菌。细菌的转化可以通过，例如原生质转化或利用感受态细胞以其本身已知的方式而实施。

酵母可优选糖酵母属或裂殖酵母属，例如酿酒酵母。

宿主细胞可以是丝状真菌，例如属于曲霉属的菌株，最优选米曲霉或黑曲霉，或镰孢属菌株，如尖孢镰孢，禾谷镰孢(完整状态即Gribberella zeae，以前为Sphaeria zeae，又名Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis)，或硫色镰孢(完整状态即Gribberella puricaris，又名三隔镰孢，杆孢状镰孢，接骨木镰孢，玫瑰色镰孢，玫瑰色镰孢的禾谷镰孢变种)，Fusariumcerealis(又名Fusarium crookwellnse)，或Fusarium venenatum。

在本发明优选实施方案中宿主细胞是蛋白酶缺陷型菌株或蛋白酶阴性菌株。例如可以是曲霉属蛋白酶缺陷型菌株，具体是米曲霉菌株，例如有着碱性蛋白酶基因即“alp”缺失的米曲霉JaL125。在WO 97/35956(NovoNordisk)，中有此菌株的描述。

丝状真菌细胞可用以下方法转化，该方法涉及原生质形成和原生质转化，然后细胞壁以其本身已知的方式再生。在EP238023(Novo Nordisk)中描述了曲霉作为宿主微生物的内容，其内容在此引作参考。

生产本发明α-淀粉酶变体的方法

更进一步的方面，本发明涉及生产本发明α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在利于所述变体生产的条件下培养宿主细胞和从细胞及/或培养液中回收所述变体。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于目的宿主细胞生长和本发明α-淀粉酶变体得以表达的常规培养基。可用的培养基可从销售商购得或按照出版物(例如按美国典型培养物保藏中心目录)制备。

通过已熟知的方法从培养液中可以方便地回收宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体，所述方法包括通过离心或过滤从培养液分离细胞，通过盐如硫酸铵沉淀蛋白类成分，然后使用层析的方法，如离子交换层析，亲和层析，等。淀粉转化

本发明提供利用本发明的α-淀粉酶变体从淀粉生产葡萄糖或麦芽糖或其类似物的方法。

通常，该方法包括在α-淀粉酶存在下部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶存在下通过裂解α-(1→4)和α-(1→6)糖苷键从淀粉或相关的寡-和多糖分子的非还原末端水解释放D-葡萄糖。

利用α-淀粉酶对前体淀粉进行部分水解使淀粉分子因内部的α-(1→4)键水解而初步降解。在商业应用中，利用α-淀粉酶初步水解在约105℃下进行。处理的淀粉浓度很高，通常30％-40％固含量。初步水解在这样高的温度下一般进行5分钟。然后将部分水解的淀粉转移到第二个罐，85-90℃温育约1小时，得到10-15的葡萄糖当量值(D.E.)。

通常在一个单独的罐中使温度降低到30-60℃之间进行进一步的水解，这是在葡糖淀粉酶的参与下从淀粉或相关的寡-和多糖分子的非还原末端释放出D-葡萄糖。底物液体温度优选降至55-60℃之间。溶液pH值从6-6.5降至3-5.5。优选溶液pH为4-4.5。将葡糖淀粉酶加入该溶液中，反应24-72小时，优选36-48小时。

通过按照本发明改进Fungamyl样α-淀粉酶变体的热稳定性，该α-淀粉酶可用于淀粉液化过程。

本发明的一个方面涉及在淀粉转化加工中使用本发明的α-淀粉酶变体。

酿造

本发明的α-淀粉酶变体可用于酿造加工。

生产高麦芽糖糖浆(55％麦芽糖)

本发明的变体可用于麦芽糖的生产。高麦芽糖糖浆一般如下产生：

高麦芽糖糖浆(含有50％-55％麦芽糖)的生产

为生产“高麦芽糖糖浆”，将淀粉液化为DE10-20。将液化淀粉的pH和温度分别调整为65℃和pH约5.0，使其接受产麦芽糖的α-淀粉酶(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶，如Maltogenase^TM4000L，0.4l/t DS(NovoNordisk))，支链淀粉酶(例如，芽孢杆菌支链淀粉酶，如Promozyme^TM600L，0.3l/t DS)(Novo Nordisk))和α-淀粉酶(例如，BAN 240L或Termamyl^TM 120L，LS型，0.4Kg/t DS)(Novo Nordisk))处理24-41小时。具体的处理时间取决于所需的糖混合物组成。通过提高产麦芽糖的α-淀粉酶和支链淀粉酶用量，可提高麦芽糖含量。

备选地，“高麦芽糖糖浆”可如下产生，首先将淀粉液化为DE 10-20，然后将液化淀粉的pH和温度分别调整为55℃和pH约5.5，使其接受真菌α-淀粉酶(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶，如Fungamyl^TM 800L(Novo Nordisk))处理22-44小时。真菌α-淀粉酶用量有赖于预计的糖化时间，例如200g/t DS处理44小时，400g/t DS处理22小时。

麦芽糖含量为55-65％的“高麦芽糖糖浆”可如下产生，首先将淀粉液化为DE 10-20，然后将液化淀粉的pH和温度分别调整为60℃和pH约6，再使该液化淀粉接受产麦芽糖的(Maltogenic)α-淀粉酶(例如，Maltogenase^TM 4000L，0.25-1.0l/t DS(Novo Nordisk))，真菌α-淀粉酶(例如，曲霉菌淀粉酶，如Fungamyl^TM 800L，0.4-1.0kg/t DS(Novo Nordisk))处理24-48小时。

备选地，可将液化淀粉调整为温度65℃，pH约5.0，然后用产麦芽糖的α-淀粉酶(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶，如Maltogenase^TM 4000L，0.5-1.0l/t DS)，支链淀粉酶(例如，芽孢杆菌支链淀粉酶，如Promozyme^TM 600L，0.5-1.0l/t DS)处理18-42小时。

依照本发明，本发明的一或多个Fungamyl样变体可用于替代上述真菌α-淀粉酶或与之一起作用。

烘烤

本发明的α-淀粉酶变体可用于烘烤处理。

应用

本发明的一个方面涉及本发明变体应用于淀粉转化，乙醇生产，酿造，烘烤。

本发明的加工方法

本发明也涉及生产麦芽糖糖浆的方法，其包括如下步骤：

1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉；

2)在本发明的真菌α-淀粉酶变体存在下进行糊精化；

3)回收糖浆；可选择纯化糖浆。

步骤1)所用于液化的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，如Termamyl样α-淀粉酶，其包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(以商品名Termamyl^TM(Novo Nordisk)出售)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(以商品名BAN(Novo Nordisk)出售)，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(以Termamyl^TM120L S型的名义出售)。所述α-淀粉酶得自芽孢杆菌菌株NCIB 12289，NCIB12512，NCIB12513或DSM 9375，所有这些在WO 95/26397中都有详述，所述α-淀粉酶记述在Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31中。“Termamyl样α-淀粉酶”定义中的α-淀粉酶在如WO 96/23874(Novo Nordisk)中有记述。

本发明的另一方面涉及生产麦芽糖的加工过程，其包括如下步骤：

1)在pH4-6，140-160℃下液化淀粉；

2)在本发明的真菌α-淀粉酶变体存在下，在60-95℃的温度范围内，尤其在65-85℃，如70-80℃，pH4-6，进行糊精化；

3)回收糖浆；可选择纯化糖浆。

本发明的一个实施方案中，在步骤2)中加入有效量的葡糖淀粉酶。在此实施方案(包括用葡糖淀粉酶进行的处理)中所述糖浆将不是麦芽糖糖浆，而是具有不同糖组分的糖浆。

葡糖淀粉酶可以是曲霉菌葡糖淀粉酶，具体是黑曲霉葡糖淀粉酶。

备选地，此过程包括如下步骤：

1)在95-110℃，pH4-6，芽孢杆菌α-淀粉酶存在下，液化淀粉；

2)本发明真菌α-淀粉酶变体存在下，70-95℃，pH4-6下液化，然后回收和/或任选纯化所得产品。

固定化的本发明真菌α-淀粉酶变体

本发明的一个方面涉及固定化的本发明真菌α-淀粉酶变体。所述α-淀粉酶变体可通过任何本领域已知方法固定，如US 4687742用于葡萄糖异构酶的方法。

材料和方法

材料：

酶：

FUNGAMYL：得自米曲霉的真菌α-淀粉酶(得自Novo Nordisk)并表示为SEQ ID NO：2。

宿主细胞：

米曲霉JaL125：米曲霉IFO4177，得自Institute for Fermention，Osaka；17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本，其中被称为“alp”的碱性蛋白酶基因(参见Murakami K等，(1991)，Agric.Biol.Chem.55，p.2807-2811)通过一步基因取代方法而缺失(参见G.May，“Applied MolecularGenetics of Filamentous Fungi”(1992)，p.1-25.J.R.Kinghorn和G.Turner编；Blackie Academic and Professional)，采用米曲霉pyrG基因作标记。菌株JaL125还公开在WO 97/35956(Novo Nordisk)中。

微生物：

菌株：酿酒酵母YNG318：MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir+]

方法：

米曲霉的转化(一般步骤)

在100ml YPD(Sherman等，(1981)，Methods in Yeast Genetics，冷泉港实验室)中接种米曲霉孢子，振荡培育约24小时。通过微孔布过滤收获菌丝体，用200ml 0.6M MgSO₄冲洗。将菌丝体悬浮在15ml 1.2M MgSO₄，10mMNaH₂PO₄，pH5.8中。将该悬浮液冰上冷却，加入1ml含有120mgNovozym^TM234的缓冲液。5分钟后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，37℃下轻微搅拌培育1.5-2.5小时，直到镜检观察样品可见大量原生质体。

微孔布过滤悬浮液，滤过液移入无菌试管，用5ml 0.6M山梨糖醇，100mM Tris-HCl，pH7.0覆盖。1000g离心15分钟，从MgSO₄层顶部收集原生质体。将2倍体积STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mMCaCl₂)加入到原生质体悬浮液中，将该混合物1000g下离心5分钟。将原生质体沉淀重悬于3ml STC中，重新沉淀。重复。最终，将原生质体重悬于0.2-1ml STC中。

将100μL原生质体悬浮液与5-25μg p3SR2(带有构巢曲霉amdS基因的质粒，记述在Hynes等，Mol.and Cel.Biol.，Vol.3，No.8，1430-1439，1983年8月)混合在10μL STC中。混合物室温下放置25分钟，加入0.2ml 60％PEG4000(BDH 29576)，10mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH7.5，仔细混合(两次)，最终加入0.85ml相同溶液，仔细混合。混合物室温下放置25分钟，2500g旋转15分钟，所得沉淀重悬于2ml 1.2M山梨糖醇中。再次沉淀后，将原生质体铺板在基本培养基(Cove，(1966)上，Biochem.Biophys.Acta 113，51-56)，该培养基中含有1.0M蔗糖，pH7.0，以10mM乙酰胺作氮源，用20mM CsCl抑制背景生长。37℃下培育4-7天后，采集孢子，悬于无菌水中，分散为单个菌落。重复此步骤，从二次分离后的单菌落获得的孢子作为定义的转化体保存。

补料分批发酵

进行补料分批发酵，所用培养基含有麦芽糖糊精(maltodextrin)作碳源，含有尿素作为氮源，并含有酵母浸膏。补料分批发酵如下进行：将所需米曲霉宿主细胞摇瓶培养物接种到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中。pH5.0，34℃培养24小时后，开始连续流加额外的碳和氮源。以碳源为限制性因素，要保证氧气过量。培养持续4天，然后经过离心，超滤，澄清过滤和除菌过滤回收所述酶。可通过本领域已知的阴离子交换层析方法进一步纯化。

纯化

将培养液过滤，加入硫酸铵(AMS)使之浓度到1.7MAMS，调pH为5。离心去除沉淀的物质，含α-淀粉酶活性的溶液上样到预先用1.7M AMS，20mM乙酸钠，pH5平衡的Toyo Pearl Butyl柱。用平衡缓冲液洗去未结合的物质。用10mM乙酸钠，pH4.5以在10倍柱体积中1.7-0M AMS的线性梯度洗脱被结合的物质。收集含有葡糖淀粉酶的级分，对20mM乙酸钠，pH4.5透析。

筛选耐热的α-淀粉酶变体

在下述的耐热滤膜分析中筛选文库。

耐热性的滤膜分析

将酵母文库铺板在含有100μg/ml氨苄青霉素的SC ura^-琼脂板上的醋酸纤维素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)-硝酸纤维素(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)滤膜夹层上，30℃下至少72小时。将菌落影印到已用甲醇活化了1分钟的PVDF滤膜(Immobilon-P，Millipore，Bedford)上，随后在0.1M NaAc中清洗，再在室温下培育2小时。用自来水洗下PVDF滤膜上的菌落。在培育前用针对每一滤膜夹层和PVDF滤膜特别标记以便在筛选后定位滤膜上的阳性变体。将结合有变体的PVDF滤膜转移到有0.1M NaAc，pH4.5的容器上，47℃下温育15分钟。SC ura-琼脂板上的醋酸纤维素和硝酸纤维素滤膜夹层在室温下保存备用。温育后，在含有5％麦芽糖，1％琼脂糖，50mM NaAc，pH4.5的平板上检测残余活性。带有PVDF滤膜的分析平板以与滤膜夹层相同的方法标记，并在50℃下温育2小时。除去PVDF滤膜后，用Glucose GOD perid(BoehringerMannheim GmbH，德国)对分析平板染色。有残余活性的变体在分析平板上检测为白色背景上的深绿色斑点。改进的变体位于保存平板上。在与第一次筛选相同的条件下重新筛选改进的变体两次。

FAU活性的测定

一个真菌α-淀粉酶单位(FAU)确定为以基于下列标准条件的确定α-淀粉酶的Novo Nordisk标准方法测定的每小时分解5.26g淀粉(MerckAmylum可溶性Erg.B.6，批号9947275)的酶量：

底物.....................可溶性淀粉

温度.....................37℃

pH.....................4.7

反应时间.....................7-20分钟

有对Novo Nordisk标准方法的详述以备查询。

测定酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

测定酸性α-淀粉酶活性为AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)，其相对于酶标准品来测定。

所用标准品是AMG 300L(得自Novo Nordisk)。在此AMG中的中性α-淀粉酶在室温下保藏3周后从约1FAU/mL降至0.05FAU/mL。

此AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性按照A/F 9 1/3(Novo测定真菌α-淀粉酶的方法)测定。此方法中，1FAU定义为，在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

碘与淀粉形成蓝色复合物，而不能与淀粉的降解产物形成复合物。因此颜色的强度正比于淀粉浓度。采用反比色法(reverse colorimetry)将淀粉酶活性测定为在特定的分析条件下淀粉浓度的降低。

α-淀粉酶

淀粉+碘 → 糊精+寡糖

40℃，pH 2.5

蓝/紫 t＝23秒脱色

标准条件/反应条件：(每分钟)

底物：淀粉，约0.17g/L

缓冲液：柠檬酸盐，约0.03M

碘(I₂)： 0.03g/L

CaCl₂： 1.85mM

pH： 2.50±0.05

温育温度： 40℃

反应时间： 23秒

波长： λ＝590nm

酶浓度： 0.025 AFAU/mL

酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL

可从Novo Nordisk索取EB-SM-0259.02/01查询细节，该文献在此引入作为参考。

本发明变体的热/pH稳定性测定

采用下列方法测试本发明变体的热稳定性：950μL 0.1M柠檬酸+4.3mM Ca²⁺缓冲液60℃下温育1小时。加入50μL含酶缓冲液(4 AFAU/ml)。在0和60分钟取样2×40μL，冰上冷却。温育前测定的活性(AFAU/ml)用作参考(100％)。计算降低百分率相对温育时间的函数。

为确定热稳定性，在不同温度，例如50，60，70，80和90℃下重复上述试验。

为确定pH稳定性，该实验在不同pH下重复进行，例如pH2.5；3；3.5；4；4.5；5。

采用DOPE程序进行随机诱变的通用方法

可如下进行随机诱变：

1.在亲本酶中挑选要改变的目的区，

2.确定所挑选区中的突变位点和非突变位点，

3.根据所要构建的变体的所需稳定性和/或性能决定进行何种突变，

4.挑选结构合理的突变，

5.根据步骤4调整步骤3所选残基，

6.通过使用合适的dope算法分析核苷酸分布，

7.如果需要，调整目标残基为基因编码实用性，例如考虑基因编码的限制，例如避免导入终止密码子；本领域一般技术人员了解一些密码组合不能实际应用应予以调整

8.制备引物

9.用所述引物进行随机诱变

10.通过筛选所要改进的性质挑选所得葡糖淀粉酶

Dope算法

本领域人员熟知步骤6所用的合适的dope算法。例如Tomandl，D.等，1997，Joumal of Computer-Aided Molecular Design 11：29-38所述的。另一算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A，和Kretzschmar，T(1998)Nucleic Acids Research 26：697-702)。

实施例

实施例1

变体Q153S的构建

为构建TAKA-淀粉酶(以SEQ ID NO：1和2表示的Fungamyl^TM)的变体，按照生产商的指示使用市售Chameleon双链定点诱变试剂盒。

编码目的淀粉酶的基因是在质粒pTAKA17(EP 238023，图2和实施例2)中。按照生产商指示通过使用下列引物将pTAKA17中氨苄青霉素基因的ScaI位点改变为Mlul位点：

引物7258：

5’p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO：3)

采用所述引物除去在Amylase基因的内显子中的ScaI位点。

引物1：

5’p ATG GTT CAT TTC AGA ACT GAC ATT GAG TAA(SEQ ID NO：4)

通过添加合适的含有所需突变的寡核苷酸将所需突变导入目的淀粉酶基因中。

为导入突变如Q153S，设计寡核苷酸：

引物2：

5’p TTC TGT TTC ATT TCG AAC TAT GAA GAT(SEQ ID NO：5)

含有目的淀粉酶基因的pTAKA17载体用作DNA聚合酶，DNA连接酶(用于连接到寡核苷酸5’磷酸端(5’P))，和寡核苷酸7258，引物1和引物2的模板。

制备DNA的制品，经测序证实已导入突变。

如“材料&方法”部分所述将DNA制品转化到米曲霉宿主细胞中，筛选转化体的淀粉酶活性。

实施例2

提高的热稳定性

按照“材料&方法”部分公开的热稳定性测定实验来检验实施例1中构建的变体的热稳定性。

实施例3

提高的耐酸性

按照“材料&方法”部分公开的pH稳定性测定试验来检测实施例1中构建的变体在酸性pH下稳定性的增高。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>Fungamyl样α-淀粉酶变体

<130>5835.204-WO

<160>5

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>1734

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<220>

<221>CDS

<222>(54)..(1547)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(114)..()

<400>1

tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat aaaccccaca gaaggcattt atg atg 56

Met

-20

gtc gcg tgg tgg tct cta ttt ctg tac ggc ctt cag gtc gcg gca cct 104

Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala Pro

-15 -10 -5

gct ttg gct gca acg cct gcg gac tgg cga tcg caa tcc att tat ttc 152

Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe

-1 1 5 10

ctt ctc acg gat cga ttt gca agg acg gat ggg tcg acg act gcg act 200

Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Thr

15 20 25

tgt aat act gcg gat cag aaa tac tgt ggt gga aca tgg cag ggc atc 248

Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile

30 35 40 45

atc gac aag ttg gac tat atc cag gga atg ggc ttc aca gcc atc tgg 296

Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp

50 55 60

atc acc ccc gtt aca gcc cag ctg ccc cag acc acc gca tat gga gat 344

Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly Asp

65 70 75

gcc tac cat ggc tac tgg cag cag gat ata tac tct ctg aac gaa aac 392

Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu Asn

80 85 90

tac ggc act gca gat gac ttg aag gcg ctc tct tcg gcc ctt cat gag 440

Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His Glu

95 100 105

agg ggg atg tat ctt atg gtc gat gtg gtt gct aac cat atg ggc tat 488

Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr

110 115 120 125

gat gga gcg ggt agc tca gtc gat tac agt gtg ttt aaa ccg ttc agt 536

Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe Ser

130 135 140

tcc caa gac tac ttc cac ccg ttc tgt ttc att caa aac tat gaa gat 584

Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu Asp

145 150 155

cag act cag gtt gag gat tgc tgg cta gga gat aac act gtc tcc ttg 632

Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser Leu

160 165 170

cct gat ctc gat acc acc aag gat gtg gtc aag aat gaa tgg tac gac 680

Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr Asp

175 180 185

tgg gtg gga tca ttg gta tcg aac tac tcc att gac ggc ctc cgt atc 728

Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile

190 195 200 205

gac aca gta aaa cac gtc cag aag gac ttc tgg ccc ggg tac aac aaa 776

Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Lys

210 215 220

gcc gca ggc gtg tac tgt atc ggc gag gtg ctc gac ggt gat ccg gcc 824

Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ala

225 230 235

tac act tgt ccc tac cag aac gtc atg gac ggc gta ctg aac tat ccc 872

Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro

240 245 250

att tac tat cca ctc ctc aac gcc ttc aag tca acc tcc ggc agc atg 920

Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser Met

255 260 265

gac gac ctc tac aac atg atc aac acc gtc aaa tcc gac tgt cca gac 968

Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro Asp

270 275 280 285

tca aca ctc ctg ggc aca ttc gtc gag aac cac gac aac cca cgg ttc 1016

Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe

290 295 300

gct tct tac acc aac gac ata gcc ctc gcc aag aac gtc gca gca ttc 1064

Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala Phe

305 310 315

atc atc ctc aac gac gga atc ccc atc atc tac gcc ggc caa gaa cag 1112

Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln

320 325 330

cac tac gcc ggc gga aac gac ccc gcg aac cgc gaa gca acc tgg ctc 1160

His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu

335 340 345

tcg ggc tac ccg acc gac agc gag ctg tac aag tta att gcc tcc gcg 1208

Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser Ala

350 355 360 365

aac gca atc cgg aac tat gcc att agc aaa gat aca gga ttc gtg acc 1256

Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val Thr

370 375 380

tac aag aac tgg ccc atc tac aaa gac gac aca acg atc gcc atg cgc 1304

Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met Arg

385 390 395

aag ggc aca gat ggg tcg cag atc gtg act atc ttg tcc aac aag ggt 1352

Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys Gly

400 405 410

gct tcg ggt gat tcg tat acc ctc tcc ttg agt ggt gcg ggt tac aca 1400

Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Thr

415 420 425

gcc ggc cag caa ttg acg gag gtc att ggc tgc acg acc gtg acg gtt 1448

Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr Val

430 435 440 445

ggt tcg gat gga aat gtg cct gtt cct atg gca ggt ggg cta cct agg 1496

Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro Arg

450 455 460

gta ttg tat ccg act gag aag ttg gca ggt agc aag atc tgt agt agc 1544

Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser Ser

465 470 475

tcg tgaagggtgg agagtatatg atggtactgc tattcaatct ggcattggac 1597

Ser

agtgagtttg agtttgatgt acagttggag tcgttactgc tgtcatcccc ttatactctt 1657

cgattgtttt tcgaacccta atgccaagca cgctagtcta ttataggaaa aaaaaaaaaa 1717

aaaaaaaaaa aaaaaaa 1734

<210>2

<211>498

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>2

Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala

-20 -15 -10 -5

Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr

-1 1 5 10

Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala

15 20 25

Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly

30 35 40

Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile

45 50 55 60

Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly

65 70 75

Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu

80 85 90

Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His

95 100 105

Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly

110 115 120

Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe

125 130 135 140

Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu

145 150 155

Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser

160 165 170

Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr

175 180 185

Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg

190 195 200

Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn

205 210 215 220

Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro

225 230 235

Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr

240 245 250

Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser

255 260 265

Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro

270 275 280

Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg

285 290 295 300

Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala

305 310 315

Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu

320 325 330

Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp

335 340 345

Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser

350 355 360

Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val

365 370 375 380

Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met

385 390 395

Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys

400 405 410

Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr

415 420 425

Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr

430 435 440

Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro

445 450 455 460

Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser

465 470 475

Ser Ser

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工/未知

<220>

<221>misc_feature

<222>()..()

<223>引物

<400>3

gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工/未知

<220>

<221>mi sc_feature

<222>()..()

<223>引物

<400>4

atggttcatt tcagaactga cattgagtaa 30

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工/未知

<220>

<221>mi sc_feature

<222>()..()

<223>引物

<400>5

ttctgtttca tttcgaacta tgaagat 27

Claims

1.一种用于产生亲本Fungamyl样α-淀粉酶的α-淀粉酶变体的方法，所述变体相对于其亲本提高了热稳定性，尤其在酸性pH下的热稳定性，该方法包括：

(a)对编码亲本Fungamyl样α-淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，

(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中得到的突变的DNA序列，

(c)筛选表达突变α-淀粉酶的宿主细胞，所述突变α-淀粉酶相对于亲本Fungamyl样α-淀粉酶提高了在酸性pH下的热稳定性。

2.亲本Fungamyl样α-淀粉酶的变体，在选自下组的一或多个区包含改变：

98-110区，

150-160区，

161-167区，

280-288区，

448-455区，

468-475区，

其中(a)所述改变分别是

(i)在占据此位置的氨基酸下游插入氨基酸，

(ii)占据此位置的氨基酸的缺失，或

(iii)占据此位置的氨基酸用另一不同的氨基酸取代，

(b)所述变体具有α-淀粉酶活性且(c)每一区或位置对应于具有SEQ IDNO：2之氨基酸序列的亲本Fungamyl样α-淀粉酶氨基酸序列的区或位置。

3.权利要求2的变体，其中所述变体是一或多个下述取代：Q153S。

4.权利要求2的变体，其中所述变体改进了热稳定性和/或提高了在酸性pH下的稳定性。

5.一种DNA构建体，其包含编码权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体的DNA序列。

6.携有权利要求5的DNA构建体的重组表达载体。

7.用权利要求5的DNA构建体或权利要求6的载体转化的细胞。

8.权利要求7的细胞，其中所述细胞是微生物，如细菌或真菌。

9.权利要求8的细胞，其是曲霉属尤其米曲霉的蛋白酶缺陷型菌株。

10.用于生产高麦芽糖糖浆的组合物，其含有权利要求2-4任一项的Fungamyl样α-淀粉酶。

11.权利要求10的组合物，其还含有β-淀粉酶活性。

12.面团改良组合物，其含有权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体。

13.酿造组合物，其含有权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体。

14.权利要求13的酿造组合物，其还含有一或多种选自β-淀粉酶和异淀粉酶的酶。

15.一种生产乙醇的组合物，其含有权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体。

16.一种液化淀粉的方法，其中使用权利要求2-4的α-淀粉酶变体处理淀粉。

17.一种生产高麦芽糖糖浆的方法，其中用权利要求2-4的α-淀粉酶变体液化淀粉。

18.一种酿造方法，其中在麦芽汁发酵过程中加入了权利要求2-4的α-淀粉酶变体。

19.一种生产乙醇的方法，其中用权利要求2-4的α-淀粉酶变体在蒸馏醪液中液化淀粉。

20.一种方法，其中对含有权利要求2-4的α-淀粉酶变体的面团产物进行烘烤。

21.权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体或权利要求10的组合物用于淀粉液化的应用。

22.权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体或权利要求10的组合物用于生产乙醇的应用。

23.权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体或权利要求10的组合物用于酿造的应用。

24.权利要求2-4任一项的α-淀粉酶变体或权利要求10的组合物用于烘烤的应用。

25.生产麦芽糖糖浆的方法，其包括如下步骤：

1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉，然后

2)在权利要求2-4的真菌α-淀粉酶变体存在下进行糊精化；

3)回收糖浆；并任选进行纯化。

26.生产糖浆，具体是麦芽糖糖浆的方法，其包括如下步骤：

1)在140-160℃，pH4-6下液化淀粉，然后

2)在权利要求2-4的真菌α-淀粉酶变体存在下，于60-95℃，pH4-6进行糊精化；和

3)回收糖浆；并任选进行纯化。

27.权利要求26的方法，其中所述淀粉液化的温度为65-85℃，尤其70-80℃。

28.权利要求27的方法，其中在步骤2)加入有效量的葡糖淀粉酶。

29.生产麦芽糖糖浆的方法，其中包含如下步骤：

1)在芽孢杆菌α-淀粉酶存在下，在95-110℃和pH4-6下进行淀粉液化，然后，

3)回收糖浆；并任选进行纯化。

30.固定化了的权利要求2-4的变体。