BR112019015689A2

BR112019015689A2 - composições de limpeza compreendendo variantes de amilase

Info

Publication number: BR112019015689A2
Application number: BR112019015689A
Authority: BR
Inventors: Andersen Carsten; Ghadiyaram Chakshusmathi; Damager Iben; Venkatachalam Iyer Padma; Kulothungan SAINATHAN Rajendra
Original assignee: Procter & Gamble
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2020-04-14
Also published as: CN110234747B; CA3051426C; EP3357994B1; JP6899912B2; US20200339917A1; FI3357994T3; CN110234747A; JP2020510712A; MX2019009093A; US20180216039A1; RU2019123965A; CA3051426A1; WO2018144399A1; DK3357994T3; EP3357994A1; PL3357994T3

Abstract

a presente invenção se refere a composições de limpeza que compreendem variantes de uma alfa-amilase e métodos para tratamento de superfícies, como materiais têxteis, com um líquido aquoso compreendendo essas composições, especialmente em baixas temperaturas.

Description

COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO VARIANTES

DE AMILASE

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001]Este pedido	contém uma	Listagem	de
sequências em formato legível por computador. 0 formato
legível por computador está	aqui incorporado	a título	de
referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002]A presente	invenção se	refere	a
composições de limpeza que	compreendem vari	antes de	uma
alfa-amilase que tem desempenho de limpeza	otimizado	em

relação a sua amilase original em processos de tratamento de superfície em água fria.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003]As alfa-amilases (alfa-1,4-glucano-4-glucano hidrolases, E.C. 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas, as quais catalisam a hidrólise de amido e de outros oligo e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.

[0004]Dentre as primeiras alfa-amilases bacterianas a serem usadas, estava uma alfa-amilase proveniente de B. lícheníformís, também conhecida como Termamyl, a qual foi extensivamente caracterizada, tendo sido determinada a estrutura de cristal para essa enzima. As amilases alcalinas, como AA560, formam um grupo específico de alfa-amilases que encontraram uso em detergentes. Muitas dessas amilases bacterianas conhecidas foram modificadas a fim de aprimorar sua funcionalidade em uma aplicação específica. As amilases de Bacillus, como Termamyl, AA560 (WO 2000/060060) e SP707 (descrita por Tsukamoto et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 151: 25-31) formam um

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2/153 grupo específico de alfa-amilases que encontraram uso em detergentes. Essas amilases foram modificadas para aprimorar a estabilidade em detergentes. WO 96/23873, por exemplo, revela a deleção dos aminoácidos 181+182 ou dos aminoácidos 183+184 de SP707 (SEQ ID NO: 7 do WO 96/23873) para aprimorar a estabilidade dessa amilase. WO 96/23873 revela, adicionalmente, a modificação da amilase SP707 mediante a substituição de M202, por exemplo, por uma leucina para estabilizar a molécula quanto à oxidação. Dessa forma, sabese modificar amilases para aprimorar certas propriedades.

[0005]Por razões ambientais, tem sido cada vez mais importante baixar a temperatura em processos de lavagem, lavagem de louças e/ou limpeza. Entretanto, a maioria das enzimas, inclusive as amilases, têm um nível ótimo de temperatura que está acima das temperaturas comumente usadas em lavagem a baixa temperatura. A alfaamilase é uma enzima importante para uso em composições detergentes, e seu uso tem se tornado cada vez mais importante para a remoção de manchas amiláceas durante a lavagem de roupas ou de louças. Portanto, é importante encontrar variantes de alfa-amilase que mantenham seu desempenho de lavagem, seu efeito de remoção de manchas e/ou sua atividade quando a temperatura é diminuída. Entretanto, apesar da eficiência das composições de enzima detergente atuais, há muitas manchas que são difíceis de remover completamente. Esses problemas são agravados pelo maior uso de baixas temperaturas de lavagem (por exemplo, água fria) e ciclos de lavagem mais curtos. Dessa forma, é desejável obter enzimas amiloliticas que possam funcionar sob baixa temperatura e, ao mesmo tempo, preservar ou

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3/153 aumentar outras propriedades desejáveis, como a atividade específica (atividade amilolítica) , a estabilidade e/ou o desempenho de lavagem, a fim de possibilitar uma boa limpeza em ciclos de lavagem mais curtos.

[0006]Dessa forma, é um objetivo da presente invenção fornecer composições de limpeza compreendendo variantes de alfa-amilases que possam ser usadas em processos de lavagem, lavagem de louças e/ou limpeza sob baixa temperatura. É um objetivo adicional da presente invenção fornecer uma composição de limpeza compreendendo variantes de alfa-amilase que tenham desempenho de lavagem aprimorado em baixa temperatura, em comparação à alfaamilase parental ou em comparação a composições de limpeza compreendendo a alfa-amilase de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0007]A presente invenção fornece uma composição de limpeza que compreende:

(a) uma variante de uma alfa-amilase parental, sendo que a variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições selecionadas do grupo que consiste em 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições selecionadas do grupo que consiste em 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 1, (ii) a variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada nas

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SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (ill) a variante tem atividade de alfa-amilase;

(b) e um composto auxiliar de limpeza, de preferência, em uma quantidade de 0,01 a 99,9%, em peso.

[0008]A invenção também fornece um método para ο tratamento de uma superfície, de preferência, um material têxtil, que compreende (i) formar um líquido de lavagem aquoso que compreende água e esse tipo de composição de limpeza, (ii) tratar a superfície com o líquido de lavagem aquoso, de preferência, a uma temperatura de 5 ou 10 a 40°C ou de preferência 35 °C ou menos, com mais preferência a uma temperatura de 30°C ou menos ou a uma temperatura de 20°C ou menos; e (iii) enxaguar a superfície.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0009]A presente invenção fornece uma composição de limpeza que compreende:

(a) uma variante de uma alfa-amilase parental, sendo que a variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondentes a 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs:

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1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase; e (b) um composto auxiliar de limpeza, de preferência em uma quantidade de 0,01 a 99,9%, em peso.

Definições [0010]Variante alélica: O termo variante alélica significa qualquer dentre duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutações, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptideo codificado) ou podem codificar polipeptideos com sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptideo é um polipeptideo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0011]Alfa-amilase: O termo alfa-amilase (alfa-1,4-glucano-4-glucano hidrolases, E.C. 3.2.1.1), constitui um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e de outros oligo e polissacarideos 1,4-glicosidicos lineares e ramificados. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-amilase é determinada de acordo com o procedimento descrito na seção de Exemplos. Em um aspecto, as variantes da presente invenção têm ao menos 20%, por exemplo, ao menos 40%, ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80%, ao menos 90%, ao menos 95% ou ao menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 1.

[0012]Aminoácido: Como usado aqui, o termo aminoácido inclui os vinte aminoácidos padrão codificados geneticamente e seus estereoisômeros correspondentes na

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6/153 forma 'd' (em comparação à forma natural '1'), ômegaaminoácidostros aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não convencionais (por exemplo, aminoácidos, aminoácidos a,a-dissubstituidos, N-alquil aminoácidos etc.) e aminoácidos derivado ous quimicamente. Os derivados químicos de um ou mais aminoácidos podem ser obtidos mediante reação com um grupo lateral funcional. Essas moléculas derivatizadas incluem, por exemplo, aquelas moléculas nas quais os grupos amino livres foram derivatizados para formar cloridratos de amina, grupos ptolueno sulfonila, grupos carbóxi benzóxi, grupos tbutilóxi carbonila, grupos cloroacetila ou grupos formila. Os grupos carboxila livres podem ser derivatizados para formar sais, ésteres metílicos e etílicos ou outros tipos de ésteres e hidrazidas. Os grupos hidroxila livres podem ser derivatizados para formar derivados de O-acila ou 0alquila. Também são incluídos como derivados químicos aqueles peptídeos que contêm derivados de aminoácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos convencionais. Por exemplo: prolina pode ser substituída por 4-hidróxi prolina; lisina pode ser substituída por 5-hidróxi lisina; histidina pode ser substituída por 3-metil histidina; serina pode ser substituída por homoserina, e lisina pode ser substituída por ornitina. Os derivados incluem também peptídeos contendo uma ou mais adições ou deleções, contanto que a atividade necessária seja mantida. Outras modificações incluídas são amidação, acilação amino terminal (por exemplo, acetilação ou amidação com ácido tioglicólico), carboxiamidação terminal (por exemplo, com amônia ou metilamina), e modificações terminais similares.

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7/153 [0013]Quando um aminoácido está sendo especificamente enumerado, como 'alanina' ou 'Ala' ou Ά', o termo se refere tanto a 1-alanina como a d-alanina, exceto quando explicitamente declarado de outro modo. Outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para os polipeptideos da presente invenção, contanto que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipeptideo. Para os peptideos mostrados, cada resíduo de aminoácido codificado é, quando adequado, representado por uma designação de uma só letra, correspondente ao nome comum do aminoácido convencional. Em uma modalidade, os polipeptideos da invenção compreendem ou consistem em 1-aminoácidos.

[0014]cDNA: O termo cDNA significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por meio de transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura submetida a splicing, obtida de uma célula eucariótica. O cDNA não tem sequências de intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito inicial de RNA primário é um precursor do mRNA que é processado por meio de uma série de etapas, inclusive splicing, antes de aparecer como mRNA maduro submetido a splicing.

[0015]Sequência de____codificação: O termo sequência de codificação significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. Os limites da sequência de codificação são, em geral, determinados por um quadro de leitura aberto, que começa com um códon de início, como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de parada como TAA, TAG ou TGA. A

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8/153 sequência de codificação pode ser um polinucleotideo de DNA, de cDNA, sintético ou recombinante.

[0016]Sequências de controle: O termo sequências de controle significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotideo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, proveniente do mesmo gene) ou exógena (isto é, proveniente de um gene diferente) ao polinucleotideo que codifica a variante ou mutuamente nativa ou exógena. Essas sequências de controle incluem, mas não se limitam a, uma sequência de iniciação, uma sequência de poliadenilação, uma sequência de propeptideo, um promotor, uma sequência de peptideo de sinalização e um terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, bem como sinais de terminação transcricional e traducional. As sequências de controle podem ser dotadas de ligações com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com as regiões de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica uma variante.

[0017]Delta de intensidade: Os termos delta de intensidade ou delta do valor de intensidade são aqui definidos como o resultado de uma medição de intensidade de um material de teste, por exemplo, uma amostra CS-28 (Center For Testmaterials BV, Caixa Postal 120, 3133 KT Vlaardingen, Paises-Baixos) ou uma superfície dura. A amostra é medida com uma porção da amostra, lavada sob condições idênticas, como plano de fundo. O delta de intensidade é o valor de intensidade do material de teste

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9/153 lavado com amilase menos o valor de intensidade do material de teste lavado sem amilase.

[0018]Beneficio de detergência da enzima: O termo benefício de detergência da enzima, usado aqui, se refere ao efeito vantajoso que uma enzima pode adicionar a um detergente, em comparação ao mesmo detergente sem a enzima. Os benefícios de detergência importantes que podem ser fornecidos por enzimas são remoção de manchas com nenhuma ou muito pouca sujeira visível após a lavagem e/ou limpeza, prevenção ou redução da redeposição de sujeiras liberadas no processo de lavagem (um efeito que é também denominado antiredeposição) , restauração total ou parcial da brancura de produtos têxteis que eram originalmente brancos mas, após uso e lavagem repetidos adquiriram uma aparência acinzentada ou amarelada (um efeito que é também denominado branqueamento). Os benefícios de tratamento de material têxtil, que não estão diretamente relacionados à remoção catalítica de manchas ou à prevenção da redeposição de sujeiras, podem também ser importantes para os benefícios de detergência da enzima. Os exemplos desses benefícios de tratamento de material têxtil são prevenção ou redução da transferência de corantes de um tecido para outro tecido ou para outra parte do mesmo tecido (um efeito que é também chamado de inibição de transferência de corantes ou anti-

redeposição	de corante),	remoção	de	fibras salientes	ou
rompidas de	uma superfície	de tecido	a fim de	diminuir	a
tendência à	formação de bolinhas	ou	remover	bolinhas	ou
felpas já existentes, (um	efeito	que	é também	chamado	de

anti-formação de bolinhas), aprimoramento da maciez do tecido, clarificação da cor do tecido e remoção de sujeiras

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10/153 particuladas que são aprisionadas nas fibras do tecido ou da peça de vestuário. O alvejamento enzimático é um outro beneficio de detergência enzimática onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de um componente alvejante, como peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos.

[0019]Expressão: O termo expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção da variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação póstraducional e secreção.

	[ 0020]Vetor	de expressão: 0	termo vetor	de
expressão	significa	uma molécula de	DNA linear	ou
circular	compreendendo	um polinucleotídeo	que codifica	uma
variante	e que está	ligada de maneira funcional	a

nucleotídeos adicionais que possibilitam sua expressão.

[0021]Fragmento: O termo fragmento significa um polipeptideo tendo um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes da terminação amino e/ou carboxila do polipeptideo das SEQ ID NO: 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 ou 8; sendo que o fragmento tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, um fragmento contém ao menos 200 resíduos de aminoácido contíguos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, por exemplo, ao menos 300 resíduos de aminoácido contíguos ou ao menos 350 resíduos de aminoácido contíguos ou ao menos 400 resíduos de aminoácido contíguos ou ao menos 450 resíduos de aminoácido contíguos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0022] Célula____hospedeira: O termo célula hospedeira significa qualquer tipo de célula que seja

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11/153 suscetível a transformação, transfecção, transdução e similares com um construto de ácido nucléico ou um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo aqui descrito. 0 termo célula hospedeira abrange qualquer progênie de uma

célula progenitora	que não seja	idêntica	à célula
progenitora devido	a mutações que	ocorrem	durante a
replicação.
[0023]Valor	de intensidade:	Como usado aqui, o

termo valor de intensidade se refere à medição de desempenho de lavagem. Este é medido como o brilho expresso sob a forma de intensidade da luz refletida a partir da amostra, quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem, sendo que um valor de intensidade mais alto se correlaciona com um desempenho de lavagem mais alto. As medições de cor são feitas com um scanner de base plana profissional (Kodak iQsmart, da Kodak), usado para capturar uma imagem do material têxtil lavado. Para extrair um valor para a intensidade de luz a partir das imagens escaneadas, valores de pixel em 24 bits provenientes da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB Red, Green, Blue). 0 valor da intensidade (Int) é calculado mediante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o comprimento do vetor resultante:

Int =^r² + g² +b²

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12/153 [0024]Propriedade aprimorada: O termo propriedade aprimorada significa uma característica associada a uma variante, e que é aprimorada em comparação ao original. Essas propriedades aprimoradas incluem, mas não se limitam a, desempenho de lavagem, atividade térmica, termoestabilidade, estabilidade sob condições de armazenamento e estabilidade química.

[0025]Desempenho de lavagem aprimorado: Os termos desempenho de lavagem aprimorado ou desempenho de lavagem otimizado significam a capacidade da enzima variante para fornecer um efeito de limpeza (por exemplo, remoção de manchas) em um processo de lavagem, como lavagem de roupas ou de louças, que é aprimorado em comparação àquele da amilase parental ou em relação à atividade de uma alfa-amilase tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou 1, por exemplo, por aumento na remoção de manchas. O desempenho de lavagem pode ser determinado com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, como o uso de um teste de esforço mecânico automático (TEMA). Será reconhecido pelos versados na técnica que o desempenho de lavagem aprimorado pode ser obtido sob apenas algumas ou, talvez, sob todas as condições de lavagem, por exemplo, em temperaturas de lavagem de 20°C ou mais altas (como de 40°C). O desempenho de lavagem aprimorado pode ser indicado por um fator de aprimoramento (IF - Improvement Factor) acima de 1,0, de preferência acima de 1,05 em uma ou mais dentre as condições mencionadas no Exemplo 1, por exemplo, no modelo de detergente A a 20°C, onde a concentração de variante de alfa-amilase é de 0,2 mg/L ou no modelo de detergente A a 40°C, onde a concentração de variante de

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13/153 alfa-amilase é de 0,05 mg/L ou no modelo de detergente J a 20°C, onde a concentração de variante de alfa-amilase é de 0,2 mg/L ou no modelo de detergente J a 30°C, onde a concentração de variante de alfa-amilase é de 0,05 mg/L ou no Detergente K a 20°C, onde a concentração de variante de alfa-amilase é de 0,2 mg/L. As condições de lavagem são descritas na seção de Exemplos.

[0026]Isolado: O termo isolada significa uma substância em uma forma ou um ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitadores de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que esteja ao menos parcialmente separado de um ou mais ou de todos, os constituintes de ocorrência natural aos quais está associado na natureza;

(3) qualquer substância modificada pela mão humana em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação aos outros componentes com os quais ela está associada na natureza (por exemplo, cópias múltiplas de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação. Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma variante de alfa-amilase isolada.

[ 0 02 7 ] Polinucleotídeo_____isolado : O termo polinucleotídeo isolado significa um polinucleotideo que é modificado pela mão humana. Em um aspecto, o

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polinucleotídeo isolado é	ao	menos	1%	puro,	por	exemplo,
ao menos 5% puro, ao menos	10	% puro,	ao	menos	20%	puro, ao
menos 40% puro, ao menos	60%	puro,	ao	menos	80%	puro, ao

menos 90% puro, e ao menos 95% puro, conforme determinado por eletroforese em agarose. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, de cDNA, de RNA, semissintética, sintética ou qualquer combinação dos mesmos.

[0028]Variante isolada: O termo variante isolada

significa	uma variante que é modificada pela mão humana.	Em
um aspecto, a variante é	ao menos 1	% pura, por exemplo,	ao
menos	5%	pura,	ao menos	10% pura,	ao menos 20% pura,	ao
menos	40%	pura,	ao menos	60% pura,	ao menos 8 0% pura e	ao
menos	90%	pura,	conforme <	determinado	pelo teste SDS-PAGE.
		[0029	]Baixa temperatura:	Baixa temperatura	é

uma temperatura de 5 a 40°C, de preferência de 5 a 35°C, de preferência de 5 a 30°C, com mais preferência de 5 a 25°C, com mais preferência de 5 a 20°C, com a máxima preferência de 5 a 15°C e, em particular, de 5 a 10°C. Em uma modalidade preferencial, baixa temperatura é uma temperatura de 10 a 35°C, de preferência de 10 a 30°C ou de 10 a 25°C ou de 10 a 20°C ou de 10 a 15°C.

[0030]Polipeptideo maduro: O termo polipeptídeo maduro significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento do terminal amino, truncamento do terminal carboxila, glicosilação, fosforilação etc. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido tendo o terminal carboxila e/ou o terminal amino diferentes) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

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15/153 [ 0031]Sequência de codificação de polipeptideo maduro: O termo sequência de codificação de polipeptideo maduro significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo maduro tendo atividade de alfa-amilase.

[0032]Mutante: O termo mutante significa um polinucleotídeo que codifica uma variante.

[ 0033]Construto de ácido nucleico: O termo construto de ácido nucléico significa uma molécula de ácido nucléico, seja de filamento simples ou duplo, que é isolada a partir de um gene de ocorrência natural ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que, de outro modo, não existiríam na natureza ou que é sintética, a qual compreende uma ou mais sequências de controle. O termo constructo de ácido nucléico é sinônimo do termo cassete de expressão quando o constructo de ácido nucléico contém as sequências de controle requeridas para expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.

[ 0034 ] Operacionalmente_____ligado : O termo operacionalmente ligado significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição adequada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle dirija a expressão da sequência de codificação.

[0035]Alfa-amilase parental ou original: O termo alfa-amilase parental ou original significa uma alfaamilase na qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O polipeptideo parental pode ser um polipeptideo de ocorrência natural (de tipo selvagem) ou uma variante do mesmo. Por exemplo,

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16/153 a alfa-amilase parental pode ser a alfa-amilase da SEQ ID NO: 1 (conhecida como SP722). Alternativamente, pode significar a alfa-amilase da SEQ ID NO: 2 ou qualquer alfa-amilase adequada, como aquelas aqui mencionadas como SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7 e 8.

[0036]Identidade de sequência: O nível de relacionamento entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro identidade de sequência.

[0037]Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo NeedlemanWunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são a penalidade de abertura de espaço de 10, penalidade de ampliação de espaço de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A saída do programa Needle identificada como identidade mais longa (obtida com o uso da opção -nobrief) é usada como a porcentagem de identidade e é calculada da seguinte maneira:

(Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento) [0038]Alternativamente, os parâmetros usados podem ser penalidade por abertura de lacuna de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída do programa Needle identificada como identidade mais longa (obtida com

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17/153 o uso da opção -nobrief) é usada como a porcentagem de identidade e é calculada da seguinte maneira:

(Desoxirribonucleotideos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento) [0039]Processo de remoção de amido: A expressão processo de remoção de amido refere-se a qualquer tipo de processo por meio do qual o amido seja removido (ou convertido) , como nos processos de lavagem onde o amido é removido do material têxtil, por exemplo, na limpeza do material têxtil, como na lavagem de roupas. Um processo de remoção de amido pode ocorrer em uma limpeza em superfície dura como lavagem de louças ou pode constituir-se em processos de limpeza geral, como limpeza industrial ou institucional. A expressão compreende também outros processos de remoção de amido ou conversão de amido, produção de etanol, liquefação de amido, remoção da goma dos fios da trama de tecido, produção de papel e polpa, fabricação de cerveja e detergentes em geral.

[0040]Subsequência: O termo subsequência significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos deletados das extremidades 5' e/ou 3' de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro; sendo que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade de alfa-amilase.

[0041]Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo polinucleotídeo substancialmente puro significa uma preparação de polinucleotídeo isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados, e sob uma forma adequada ao uso em sistemas de produção de polipeptídeos

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18/153 geneticamente elaborados. Dessa forma, um polinucleotideo variante substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5%, em peso, de um material de polipeptideo que é nativamente ou recombinantemente associado. Um polinucleotideo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões não traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural, como promotores e terminadores. É preferencial que o polinucleotideo substancialmente puro seja ao menos 90% puro, por exemplo, ao menos 92% puro, ao menos 94% puro, ao menos 95% puro, ao menos 96% puro, ao menos 97% puro, ao menos 98% puro, ao menos 99% puro e ao menos 99,5% puro, em peso. Os polinucleotideos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura.

[0042]Variante substancialmente pura: 0 termo variante substancialmente pura significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5%, em peso, de outro material de polipeptideo, o qual é nativamente ou recombinantemente associado. De preferência, a variante é ao menos 92% pura, por exemplo, ao menos 94% pura, ao menos 95% pura, ao menos 96% pura, ao menos 97% pura, ao menos 98% pura, ao menos 99%, ao menos 99,5% pura, e 100% pura, em peso do material de polipeptideo total presente na preparação. As variantes da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Isso pode ser obtido, por exemplo, mediante o preparo da variante por meio de

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19/153 métodos recombinantes bem conhecidos ou por meio de métodos de purificação clássicos.

[0043]Benefícios de tratamento de material têxtil: Como usado aqui, o termo benefícios de tratamento de material têxtil é definido como não estando diretamente relacionado à remoção catalítica de manchas ou à prevenção da redeposição de sujeiras, que também são importantes para os benefícios de detergência da enzima. Os exemplos desses benefícios de tratamento de material têxtil são prevenção ou redução da transferência de corantes de um material têxtil para outro material têxtil ou para outra parte do mesmo material têxtil (um efeito que é também chamado de inibição de transferência de corantes ou anti-redeposição de corante), remoção de fibras salientes ou rompidas de uma superfície de material têxtil a fim de diminuir a tendência à formação de bolinhas ou remover bolinhas ou felpas já existentes, (um efeito que é também chamado de anti-formação de bolinhas), aprimoramento da maciez do material têxtil, clarificação da cor do material têxtil e remoção de sujeiras particuladas que são aprisionadas nas fibras do material têxtil. O alvejamento enzimático é um outro benefício de detergência enzimática onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de um componente alvejante, como peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos ou outras espécies alvejantes.

[0044]Variante: O termo variante significa um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase que compreende uma alteração/mutação, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (várias) posições em relação à

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20/153 alfa-amilase parental. Uma substituição significa a troca de um aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção de um aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de 1 a 3 aminoácidos adjacentes a, e imediatamente em seguida a, um aminoácido que ocupa uma posição.

[ 0045]Desempenho de lavagem: No presente contexto, o termo desempenho de lavagem é usado como a capacidade de uma enzima para remover amido ou manchas contendo amido presentes no objeto a ser limpo durante, por exemplo, a lavagem de roupas ou a limpeza de superfícies duras, como a lavagem de louças. O desempenho de lavagem pode ser quantificado calculando-se o assim chamado valor de intensidade (Int) definido na descrição do TEMA ou no teste de desempenho de lavagem em béquer na seção de Métodos, abaixo.

[0046]Enzima de tipo selvagem: O termo alfaamilase de tipo selvagem significa uma alfa-amilase expressa por um micro-organismo de ocorrência natural, como uma bactéria, uma levedura ou um fungo filamentoso encontrado na natureza.

[0047]O termo desempenho de lavagem inclui limpeza em geral, por exemplo, a limpeza de superfícies duras, como na lavagem de louças, mas também o desempenho de lavagem em produtos têxteis, como lavagem de roupas, e também na limpeza industrial e institucional. O desempenho de lavagem aprimorado pode ser medido comparando-se o delta de intensidades, conforme descrito na definição da presente invenção.

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21/153 [0048]0 termo desempenho de lavagem inclui limpeza em geral, por exemplo, a limpeza de superfícies duras, como na lavagem de louças, mas também o desempenho de lavagem em produtos têxteis, como lavagem de roupas, e também na limpeza industrial e institucional.

Convenções para designação de variantes [0049]Os polipeptídeos da invenção tendo atividade de alfa-amilase correspondem a variantes de uma alfa-amilase derivada de Bacillus, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

SEQ ID NO: 1

HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASNLRNRGITAIWIPPAW KGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVYGDVVMN HKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEISGDYTIEAWTKFDFPGRGNTYSDFKWRWYHFDG VDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMDHPEVVNELRRWGE WYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLTHVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALENYLN KTNWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAVTFVDNHDSQPGE SLESFVQEWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHSVPAMKAKIDPILEARQNF AYGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGEKWMYVGQNKAGQVWHDI TGNKPGTVTINADGWANFSVNGGSVSIWVKR [0050]Para os propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo de alfa-amilase. Entretanto, o versado na técnica reconhecerá que a sequência da SEQ ID NO: 2 pode também ser usada para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo de alfa-amilase. A sequência de aminoácidos de uma outra alfa-amilase está alinhada com o polipeptídeo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o

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22/153 número da posição do aminoácido correspondente a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptideo maduro revelado na SEQ ID NO: 1 é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276277), de preferência a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade por extensão da lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0051]A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em uma outra alfa-amilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation - comparação de múltiplas sequências por expectativa de log, versão 3.5 ou posterior, Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al. , 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior, Thompson et al. , 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros padrão.

[0052]Quando a outra alfa-amilase tiver divergido do polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 1 de modo

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23/153 que a comparação tradicional baseada em sequências não consiga detectar sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. mol. Bíol. 295; 613-615), podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequência por pares. Uma maior sensibilidade de busca com base em sequência pode ser alcançada com o uso de programas de busca que utilizam representações probabilisticas de famílias (perfis) de polipeptideos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterative de busca em uma base de dados, e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) . Uma sensibilidade ainda maior pode ser obtida se a família ou superfamília para o polipeptideo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Os programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815;

McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) usam informações provenientes de várias fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamento estrutural e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobra estrutural para uma sequência de consulta. De modo similar, o método de Gough et al., 2000, J. mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem, por sua vez, ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptideo, e estes modelos podem ser avaliados para verificar a exatidão com o uso de uma variedade de ferramentas desenvolvidas para este propósito.

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24/153 [0053]Para proteínas de estrutura desconhecida, várias ferramentas e recursos estão disponíveis para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamilias SCOP de proteínas foram estruturalmente alinhadas, e aqueles alinhamentos são acessíveis e podem ser descarregados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas com o uso de uma variedade de algoritmos, como a matriz de alinhamento por distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e a implementação desses algoritmos pode ser adicionalmente usada para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse, a fim de descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0054]Na descrição das variantes de alfa-amilase

da presente invenção, a nomenclatura	descrita	a seguir	é
adaptada para facilidade de referência	É	empregada	a
abreviação IUPAC para aminoácidos,	com	letra única	ou
tripla, comumente aceita.
[0055]Substituições . Para	uma	substituição	de
aminoácido, a nomenclatura a seguir	é	usada:	Aminoácido

original, posição, aminoácido substituído. Consequentemente, a substituição de por exemplo, treonina na posição 226 por alanina é designada como Thr226Ala ou T226A. Múltiplas mutações são separadas por sinais de adição (+), por exemplo, Gly205Arg + Ser411Phe ou G205R + S411F, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

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25/153 [0056]Deleções. Para uma deleção de um aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: Aminoácido original, posição, *. Consequentemente, a deleção de glicina na posição 181 é designada como Serl81* ou S181*. Múltiplas deleções são separadas por sinais de adição (+), por exemplo, Serl81* + Thrl82* ou S181* + T182*.

[0057]Inserções. Para uma inserção de um aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Consequentemente, a inserção de lisina após, por exemplo, glicina na posição 195 é designada como Glyl95GlyLys ou G195GK. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada como [aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido n° 1, aminoácido inserido n° 2 etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como Glyl95GlyLysAla ou G195GKA.

[0058]Nesses casos, os um ou mais resíduos de aminoácido inseridos são numerados mediante a adição de letras minúsculas ao número da posição do resíduo do aminoácido que precede os um ou mais resíduos do aminoácido inserido. No exemplo acima, a sequência seria, portanto:

Original:	Variante:
195	195 195a 195b
G	G - K - A

[ 0059]Modificações múltiplas. As variantes compreendendo múltiplas modificações são separadas por sinais de adição (+), por exemplo, Argl7OTyr+Glyl95Glu ou R170Y+G195E representando uma substituição de

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26/153 arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0060]Modificações diferentes. Onde diferentes alterações podem ser introduzidas em uma posição, as diferentes alterações são separadas por uma vírgula, por exemplo, Argl70Tyr,Glu representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Dessa forma, Tyrl67Gly,Ala + Argl70Gly,Ala designa as seguintes variantes:

Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala, Tyrl67Ala+Argl70Gly, e Tyrl67Ala+Argl7OAla.

Alfa-amilases parentais [0061]A alfa-amilase parental pode ser um polipeptídeo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 1.

[0062]Em um aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 de ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, por exemplo, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100%, o qual tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[0063]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

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27/153 [0064]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptideo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo apresentado na SEQ ID NO: 2.

[0065]Em um outro aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptideo

da SEQ	ID	NO:	2 de ao menos 80%,	como	ao	menos	85%,	ao
menos	90%,	por exemplo, ao menos	92%,	ao	menos	93%,	ao
menos	94%,	ao	menos 95%, ao menos	96%,	ao	menos	97%,	ao
menos	98%,	ao	menos 99% ou 100%, o	qual	tem atividade	de

alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptideo da SEQ ID NO: 2.

[0066]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptideo da SEQ ID NO: 2.

[0067]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptideo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo apresentado na SEQ ID NO: 3.

[0068]Em um aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptideo da SEQ ID NO: 3 de ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, por exemplo, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100%, o qual tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos,

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28/153 por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 3.

[0069]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3.

[0070]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptídeo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 4.

[0071]Em um aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4 de ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, por exemplo, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100%, o qual tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 4.

[0072]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptídeo da SEQ ID NO: 4.

[0073]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptídeo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 5.

[0074]Em um outro aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5 de ao menos 80%, como ao menos 85%, ao

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menos	90%,	por exemplo, ao	menos	92%,	ao	menos 93%,	ao
menos	94%,	ao	menos	95%, ao	menos 96%,	ao	menos 97%,	ao
menos	98%,	ao	menos	99% ou	100%,	o qual	tem atividade	de
alfa-	amilas	e.	Em um	aspecto,	a sequência	de	aminoácidos	da

alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptideo da SEQ ID NO: 5.

[0075]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptideo da SEQ ID NO: 5.

[0076]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptideo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo apresentado na SEQ ID NO: 6.

[0077]Em um outro aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptideo

da SEQ	ID	NO:	6 de ao menos 80%,	como	ao	menos	85%,	ao
menos	90%,	por exemplo, ao menos	92%,	ao	menos	93%,	ao
menos	94%,	ao	menos 95%, ao menos	96%,	ao	menos	97%,	ao
menos	98%,	ao	menos 99% ou 100%, o	qual	tem atividade	de

alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptideo da SEQ ID NO: 6.

[0078]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptideo da SEQ ID NO: 6.

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30/153 [0079]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptídeo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 7.

[0080]Em um outro aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo

da SEQ	ID	NO:	7 de ao menos 80%,	como	ao	menos	85%,	ao
menos	90%,	por exemplo, ao menos	92%,	ao	menos	93%,	ao
menos	94%,	ao	menos 95%, ao menos	96%,	ao	menos	97%,	ao
menos	98%,	ao	menos 99% ou 100%, o	qual	tem atividade	de

alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.

[0081]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.

[0082]A alfa-amilase parental pode também ser um polipeptídeo com ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 8.

[0083]Em um outro aspecto, a alfa-amilase parental tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo

da SEQ	ID	NO:	8 de ao menos 80%,	como	ao	menos	85%,	ao
menos	90%,	por exemplo, ao menos	92%,	ao	menos	93%,	ao
menos	94%,	ao	menos 95%, ao menos	96%,	ao	menos	97%,	ao
menos	98%,	ao	menos 99% ou 100%, o	qual	tem atividade	de

alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental difere por não mais que dez aminoácidos, por exemplo, por cinco aminoácidos, por quatro

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31/153 aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos e por um aminoácido quanto ao polipeptideo da SEQ ID NO: 8.

[0084]A alfa-amilase parental de preferência compreende a ou consiste na, sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, a alfa-amilase parental é uma variante alélica do polipeptideo da SEQ ID NO: 8.

[0085]A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma, pode ser usada para projetar sondas de ácido nucleico a fim de identificar e clonar DNA que codifica um original a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, essas sondas podem ser usadas para hibridização com a genômica ou o cDNA do gênero ou da espécie de interesse, seguindo os procedimentos convencionais de Southern Blot, de modo a identificar e isolar dentre os mesmos o gene correspondente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas precisam ter ao menos 14, por exemplo, ao menos 25, ao menos 35 ou ao menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de

ácido nucleico	tem	ao menos 100 nucleotídeos	de	comprimento,
por exemplo,	ao	menos	200	nucleotídeos,	ao	menos	300
nucleotídeos,	ao	menos	400	nucleotídeos,	ao	menos	500
nucleotídeos,	ao	menos	600	nucleotídeos,	ao	menos	700
nucleotídeos,	ao	menos	800	nucleotídeos ou	ao menos	900

nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA quanto de RNA. As sondas são, tipicamente, marcadas oo para detecção do gene correspondente (por exemplo, com P,

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Ο Ο C

Η, S, biotina ou avidina). Essas sondas são abrangidas pela presente invenção.

[0086]Uma biblioteca de

DNA ou cDNA genômico preparada a partir desses outros organismos pode ser examinada para encontrar DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica uma original. DNA genômico ou de outro tipo desses outros organismos pode ser separado por meio de eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou mediante outras técnicas de separação. 0 DNA proveniente de bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para nitrocelulose ou outro material carreador adequado e ali imobilizado, que é usado em um método de manchamento designado Southern blot.

[0087]Para fins da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotideo hibridiza com uma sonda de nucleotídeo marcada correspondente a um polinucleotideo que codifica SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou uma subsequência da mesma, sob condições de baixa a muito alta estringência. Moléculas às quais a sonda hibridiza podem ser detectadas usando, por exemplo, filme para raios X ou quaisquer outros meios de detecção conhecidos na técnica.

[0088]Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucléico é uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma.

[0089]Por longas sondas de ao menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência de

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33/153 muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25% de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35% de formamida para condições de estringência médias e de médias a elevadas, ou 50% de formamida para condições de estringência de altas a muito altas, após procedimentos de Southern blotting padrões por 12 a 24 horas de modo ótimo. O material carreador é finalmente lavado três vezes a cada durante 15 minutos com o uso de 2X de SSC, 0,2% de SDS a 45°C (muito baixa estringência), 50°C (baixa estringência), 55°C (média estringência) , 60°C (estringência média-alta) , 65°C (alta estringência), ou 70°C (estringência muito alta).

[0090]Para sondas curtas tendo de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como préhibridização e hibridização de cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo da T_m calculada, com o uso do cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl com pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg de RNA de levedura por ml, em seguida a procedimentos padrão de Southern Blot durante 12 a 24 horas, otimamente. 0 material carreador é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% de SDS durante 15 minutos, e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C abaixo da T_m calculada.

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34/153 [0091]A lipase parental pode ser obtida a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo obtido a partir de usado em conexão com uma determinada fonte significa que a original codificada por um polinucleotideo é produzida pela fonte ou por uma célula na qual foi inserida a sequência de polinucleotideos da fonte. Em um aspecto, a lipase parental é secretada extracelularmente.

[0092]A original pode ser uma alfa-amilase bacteriana. Por exemplo, o original pode ser um polipeptideo bacteriano gram-positivo, como uma alfa-amilase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces ou um polipeptideo bacteriano gram-negativo, como uma alfa-amilase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma.

[0093]Em um aspecto, o original é uma alfa-amilase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulars, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus lichen!formis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[0094]Em um outro aspecto, o original é uma alfa-amilase de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0095] Em um outro aspecto, o original é uma alfaamilase de Streptomyces achromogenes, Streptomyces

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35/153 avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

[0096]Em um outro aspecto, o original é uma alfa-amilase de Bacillus sp., por exemplo, a alfa-amilase da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[0097]Deve-se compreender que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção abrange tanto os estados perfeitos como os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome de espécie pelo qual são conhecidos. Os versados na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes adequados.

[0098]As cepas dessas espécies são prontamente acessíveis ao público em inúmeras coleções de culturas, como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0099]0 original pode ser identificado e obtido junto a outras fontes, inclusive micro-organismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostagem, água etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostagem, água etc,), com o uso das sondas acima mencionadas. As técnicas para o isolamento de microrganismos e DNA diretamente dos hábitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo que codifica a original pode, então, ser derivado por meio de um diagnóstico em uma biblioteca genômica ou cDNA de outro

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36/153 micro-organismo ou amostra de DNA misto. Quando um polinucleotideo que codifica um original tiver sido detectado com uma ou mais sondas, o polinucleotideo pode ser isolado ou clonado mediante o uso de técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, acima) .

[0100]0 original pode ser um polipeptídeo híbrido sendo que uma porção de um polipeptídeo é fundido no terminal amino ou no terminal carboxila de uma porção de um outro polipeptídeo.

[0101]O original pode também ser um polipeptídeo fundido ou um polipeptídeo de fusão clivável sendo que um polipeptídeo é fundido no terminal amino ou no terminal carboxila de um outro polipeptídeo. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo a um polinucleotideo que codifica um outro polipeptídeo. As técnicas para a produção dos polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem a ligação das sequências de codificação codificando os polipeptídeos, de modo que estejam no quadro e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controle dos mesmos promotores e terminador. Proteínas de fusão podem também ser construídas com o uso de tecnologias de inteína, na qual as fusões são criadas pós-traducionalmente (Cooper et al. , 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0102]Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de divagem entre os dois polipeptídeos. Durante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de divagem incluem, mas não se limitam a, os sites

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37/153 apresentados em Martin et al. , 2003, J. Appl. Ind. Biotechnol. 3. 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al. , 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378381; Eaton et al. , 1986, Biochemistry 25: 505-512; CollinsRacie et al. , 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al. , 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Preparação de variantes [0103]Um método adequado para obtenção de uma variante essencial à presente invenção, tendo atividade de alfa-amilase, compreende (a) introduzir, em uma alfa-amilase parental, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, sendo que cada modificação é independentemente uma substituição ou uma deleção, e a dita variante tem atividade de alfa-amilase; e (b) recuperar a dita variante.

[0104]Em um aspecto, o método para obtenção de uma variante tendo atividade de alfa-amilase compreende (a) introduzir, em uma alfa-amilase parental, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de

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38/153 aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que cada modificação é independentemente uma substituição ou uma deleção, e a dita variante tem atividade de alfa-amilase; e (b) recuperar a dita variante.

[0105]Em uma modalidade a modificação é uma substituição. Em uma modalidade, a modificação é uma deleção.

[0106]Em uma outra modalidade, o método para obtenção de uma variante tendo atividade de alfa-amilase compreende (a) introduzir, em uma alfa-amilase parental, uma substituição em uma ou mais posições, sendo que a substituição é selecionada dentre H1A, G7A, G109A, N280S, W284H, K320A, M323N e E391A do polipeptideo das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1 e (b) recuperar a variante.

[0107]O método pode compreender, adicionalmente introduzir na alfa-amilase parental uma deleção em uma ou mais posições, sendo que a deleção é selecionada dentre: Hl*, R181*, G182*, D183* e G184* do polipeptideo das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e recuperar a variante.

[0108]O método pode compreender adicionalmente introduzir na alfa-amilase parental uma substituição em uma ou mais posições, sendo que a substituição é selecionada dentre: W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G,

G304R, e G476K do polipeptideo das SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e recuperar a variante.

[0109]As variantes podem ser preparadas com o uso de qualquer procedimento de mutagênese conhecido na

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39/153 técnica, como mutagênese sitio-dirigida, construção de gene sintético, construção de gene semissintético, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[0110]A mutagênese sitio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (várias) mutações são criadas em um ou mais sítios definidos em um polinucleotideo que codifica o original.

[0111]A mutagênese sitio-dirigida pode ser executada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeo contendo a mutação desejada. A mutagênese sitio-dirigida pode ser também executada in vitro por mutagênese em cassete envolvendo a divagem por uma enzima de restrição em um sítio no plasmídeo compreendendo um polinucleotideo que codifica o original e a subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo uma mutação no polinucleotideo. Geralmente a enzima de restrição que digere no plasmídio e no oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades pegajosas do plasmídio e dos elementos de inserção se liguem umas as outras. Consulte, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0112]A mutagênese sitio-dirigida pode também ser executada in vivo com o uso de métodos conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, a publicação de pedido de patente US n° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al. , 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

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40/153 [ 0113]Qualquer procedimento de mutagênese sítiodirigida pode ser usado na presente invenção. Existem muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[0114]A construção de genes sintéticos requer a síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo projetada para codificar um polipeptideo de interesse. A síntese de gene pode ser executada com o uso de várias técnicas, como a tecnologia multiplex baseada em microcircuitos descrita por Tian, et. al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares, sendo que os oligonucleotídeos são sintetizados e montados sobre circuitos integrados microfluídicos fotoprogramáveis.

[ 0115]Substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicas ou múltiplas podem feitas e testadas com o uso de métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos de um procedimento de triagem relevante, como aqueles revelados Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem POR propenso a erro, exibição de fago (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente US n° 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida por região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0116]Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem automatizados de alto rendimento para detectar a atividade de polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896).

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Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptideos ativos podem ser recuperadas a partir de células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos-padrão conhecidos na técnica. Estes métodos permitem uma determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0117]A construção de genes semissintéticos é efetuada pela combinação dos aspectos da construção do gene sintético, e/ou mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória, e/ou embaralhamento. A construção semissintética é exemplificada por um processo que utiliza fragmentos de polinucleotídeo que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões de genes definidas podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítioespecíficos, enquanto ainda outras regiões podem ser submetidas à amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências de polinucleotídeos podem então ser embaralhadas.

Variantes [0118]As variantes de uma alfa-amilase parental essencial à presente invenção podem compreender (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade

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42/153 de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase.

Por este meio, são fornecidas variantes que têm desempenho de lavagem otimizado em baixa temperatura, em comparação à alfa-amilase parental ou em comparação à alfa-amilase da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0119]Variantes adequadas podem ter uma

identidade	de	sequência	de ao menos	80%,	ao menos	85%,	ao
menos	90%,	ao	menos 95	%, ao menos	96%,	ao menos	97%,	ao
menos	98%	ou	ao menos	99%, porém	menos	que 100%	, com	a

sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental.

[0120]As variantes isoladas de uma alfa-amilase parental adequada à presente invenção podem compreender (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

ou 8,	e (iii)	a variante	tem atividade	de alfa-amilase.
	[0121]As	variantes adequadas	podem ter ao menos
80%,	como ao	menos	85%,	ao menos 90%, ao menos 95%, como ao
menos	96%, ao	menos	97%,	ao menos 98% e	ao menos 99%, porém
menos	que	100%,	de	identidade de	sequência com o

polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

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43/153 [0122]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0123]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 3.

[0124]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 4.

[0125]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 5.

[0126]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 6.

[0127]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 7.

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44/153 [0128]Em uma outra modalidade, uma variante adequada tem ao menos 80%, como ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, como ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, e ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 8.

[0129]Em uma modalidade, o número de modificações em uma variante adequada para uso na presente invenção é de 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 modificações.

[0130]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0131]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em duas ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0132]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em três ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

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45/153 [0133]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em quatro ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0134]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em cinco ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0135]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em seis ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0136]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em sete ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0137]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 50/168

46/153 substituição, em oito posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 e, opcionalmente, uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0138]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0139]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em duas ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0140]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em três ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0141]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em quatro ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 51/168

47/153 modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0142]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em cinco ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0143]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em seis ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0144]Em uma outra modalidade, uma variante adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em sete ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às

posições 140, 181,	182,	183, 184, 195, 203,	243,	260,	304
e 476, sendo que a	numeração é de acordo com	SEQ	ID NO:	1.
[0145]Em	uma	outra modalidade,	uma	variante

adequada compreende uma modificação, como uma substituição, em oito posições correspondentes às posições

109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181,

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182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, sendo que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0146]Em uma modalidade preferencial, a variante compreende uma modificação em uma, duas, três, quatro ou cinco posições selecionadas do grupo que consiste em 1, 7, 109, 280 e 391. Em uma modalidade, a variante compreende ao menos uma deleção e ao menos uma substituição em duas, três, quatro ou cinco posições selecionadas do grupo que consiste em 1, 7, 109, 280 e 391.

[0147]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende uma substituição em uma, duas, três ou quatro posições selecionadas dentre 7, 109, 280 e 391.

[0148]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende modificações nas posições selecionadas dentre o grupo de posições que consiste em: X1+X7; X1+X109; X1+X280; X1+X284; X1+X320; X1+X323; X1+X391; X109+X280; X109+X284; X109+X320; X109+X323; X109+X391; X7+X109; X7+X280; X7+X284; X7+X320; X7+X323; X7+X391; X280+X284; X280+X320; X280+X323; X280+X391; X284+X320; X284+X323; X284+X391; X320+X323; X320+X391; e X323+X391, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0149]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende modificações nas posições selecionadas dentre o grupo de posições que consiste em: X109+X7+X1; XI09+X7+X391; X109+X7+X280; X109+X7+X284; X109+X7+X320; X109+X7+X323; X109+X1+X391; X109+X1+X280; XI09+X1+X284; X109+X1+X320; X109+X1+X323; X109+X391+X280; X109+X391+X284; X109+X391+X320; X109+X391+X323; X109+X280+X284; X109+X280+X320; X109+X280+X323; X109+X284+X320; X109+X284+X323; X109+X320+X323; X7+X1+X391; X7+X1+X280;

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X7+X1+X284; X7+X1+X320; X7+X1+X323; X7+X391+X280; X7+X391+X284; X7+X391+X32Ο; Χ7+Χ391+Χ323; Χ7+Χ280+Χ284; Χ7+Χ280+Χ32Ο; Χ7+Χ280+Χ323; Χ7+Χ284+Χ32Ο; Χ7+Χ284+Χ323; Χ7+Χ320+Χ323; Χ1+Χ391+Χ28 Ο; Χ1+Χ391+Χ284; Χ1+Χ391+Χ320; Χ1+Χ391+Χ323; Χ1+Χ280+Χ284; Χ1+Χ280+Χ32Ο; Χ1+Χ280+Χ323; Χ1+Χ284+Χ320; Χ1+Χ284+Χ323; Χ1+Χ320+Χ323; Χ391+Χ280+Χ284; Χ391+Χ280+Χ320; Χ391+Χ280+Χ323; Χ391+Χ284+Χ320; Χ391+Χ284+Χ323; Χ391+Χ320+Χ323; Χ280+Χ284+Χ320; Χ280+Χ284+Χ323; Χ280+Χ320+Χ323; e Χ284+Χ320+Χ323, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0150]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende modificações nas posições selecionadas dentre o grupo de posições que consiste em: X109+X7+X1+X391; X109+X7+X1+X280; X109+X7+X1+X284; XI09+X7+X1+X320; X109+X7+X1+X323; X109+X7+X391+X280; XI09+X7+X391+X284; X109+X7+X391+X320; X109+X7+X391+X323; X109+X7+X280+X284 ; X109+X7+X280+X320; XI09+X7+X280+X323; X109+X7+X284+X320; X109+X7+X284+X323; X109+X7+X320+X323; X109+X1+X391+X280; X109+X1+X391+X284; X109+X1+X391+X320; X109+X1+X391+X323; X109+X1+X280+X284; XI09+X1+X280+X320 ; XI09+X1+X280+X323 ; X109+X1+X284+X320; XI09+X1+X284+X323; X109+X1+X320+X323; XI09+X391+X280+X284 ; X109+X391+X2 8 0+X32 0; X109+X391+X280+X323; X109+X391+X284+X320; X109+X391+X284+X323; X109+X391+X320+X323; X109+X280+X284+X320; X109+X280+X284+X323; X109+X280+X320+X323; X109+X284+X320+X323; X7+X1+X391+X280; X7+X1+X391+X284; X7+X1+X391+X320; X7+X1+X391+X323 ; X7+X1+X280+X284; X7+X1+X280+X320; X7+X1+X280+X323; X7+X1+X284+X320; X7+X1+X284+X323; X7+X1+X320+X323; X7+X391+X280+X284; X7+X391+X280+X320 ; X7+X391+X280+X323;

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50/153

X7+X391+X284+X320; X7+X391+X284+X323 ; X7+X391+X320+X323; X7+X280+X284+X320; X7+X280+X284+X323; X7+X280+X320+X323; X7+X284+X320+X323; X1+X391+X280+X284; X1+X391+X280+X320; X1+X391+X280+X323; X1+X391+X284+X320; X1+X391+X284+X323; X1+X391+X320+X323; X1+X280+X284+X320; X1+X280+X284+X323; X1+X280+X320+X323; X1+X284+X320+X323; X391+X280+X284+X320; X391+X280+X284+X323; X391+X280+X320+X323; X391+X284+X320+X323; e X280+X284+X320+X323, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0151]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em XI*, XIA, X7A, X7K, X7E, X7N. X7Q, X7L, X7D, X109A, X109S, X140Y, X181*, X182*, X183*, X184*, X195F, X206Y, X243F, X260G, X280S, X284H, X284R, X284F, X304R, X320A, X320M, X320T, X320V, X320S, X323N, X323R, X323S, X323K, X391A, X391V e X476K, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0152]Em uma modalidade especifica, uma variante adequada compreende as modificações selecionadas do grupo que consiste em: X1*+X1A; X1*+X7A; Xl*+X109A; Xl*+X280S; X1*+X284H; Χ1*+Χ320Α; X1*+X323N; X1*+X391A; X1A+X7A; X1A+X109A; X1A+X280S; X1A+X284H; X1A+X320A; X1A+X323N; X1A+X391A; X7A+X109A; X7A+X280S; X7A+X284H; X7A+X320A; X7A+X323N; X7A+X391A; X109A+X280S; X109A+X284H; X109A+X320A; X109A+X323N; X109A+X391A; X280S+X284H; X280S+X320A; X280S+X323N; X280S+X391A; X284H+X320A; X284H+X323N; X284H+X391A; X320A+X323N; X320A+X391A; e X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0153]Em uma modalidade, uma variante adequada compreende as modificações selecionadas do grupo que

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 55/168

51/153 consiste em: XI*+Χ7Α+Χ109A; XI*+X7A+X28 OS; X1*+X7A+X284H; XI*+X7A+X32OA; X1*+X7A+X323N; X1*+X7A+X391A; XI*+Χ109A+X28 OS ; Xl*+X109A+X284H; Xl*+X10 9A+X32 0A; XI*+Χ109A+X323N; Xl*+X109A+X391A; Xl*+X280S+X284H; XI*+X280S+X32OA; Xl*+X280S+X323N; Xl*+X280S+X391A; XI*+X284H+X32OA; X1*+X284H+X323N; X1*+X284H+X391A; XI*+X320A+X323N; Xl*+X320A+X391A; X1*+X323N+X391A; X1A+X7A+X109A; X1A+X7A+X28 OS; X1A+X7A+X284H; X1A+X7A+X32OA; X1A+X7A+X323N; X1A+X7A+X391A; X1A+X109A+X28 OS; X1A+X109A+X284H; X1A+X109A+X32OA; X1A+X109A+X323N; X1A+X109A+X391A; X1A+X280S+X284H; X1A+X280S+X32OA; X1A+X280S+X323N; X1A+X280S+X39IA; X1A+X284H+X32OA; X1A+X284H+X323N; X1A+X284H+X39IA; X1A+X320A+X323N; X1A+X320A+X391A; X1A+X323N+X391A; X7A+X109A+X28 OS; X7A+X109A+X284H; X7A+X109A+X32OA; X7A+X109A+X323N; X7A+X109A+X391A; X7A+X280S+X284H; X7A+X280S+X32OA; X7A+X280S+X323N; X7A+X280S+X39IA; X7A+X284H+X32OA; X7A+X284H+X323N; X7A+X284H+X39IA; X7A+X320A+X323N; X7A+X320A+X391A; X7A+X323N+X391A; XI09A+X280S+X284H; XI09A+X280S+X32OA; XIΟ9A+X280S+X323N; XI Ο9A+X280S+X39ΙΑ; XI Ο9A+X284H+X32OA; X109A+X284H+X323N; XI Ο9A+X284H+X39ΙΑ; XI09A+X320A+X323N; XIΟ9A+X320A+X39IA; XI09A+X323N+X391A; X280S+X284H+X32OA; X280S+X284H+X323N; X280S+X284H+X391A; X280S+X320A+X323N; X280S+X320A+X391A; X280S+X323N+X39IA; X284H+X320A+X323N; X284H+X320A+X39IA; X284H+X323N+X391A; e X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0154]Uma variante preferencial compreende modificações nas posições correspondentes às posições selecionadas do grupo que consiste em:

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52/153

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

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53/153

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A; Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as amilases apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0155]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 58/168

54/153

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 59/168

55/153 tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 1.

[0156]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 60/168

56/153

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 2.

[0157]Uma variante preferencial pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

Hl*+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7K+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7E+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7N+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7Q+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7L+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7D+G109A+N280S+E391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 61/168

57/153

Hl*+G109A+N280S+K320A+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320M+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320T+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320V+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323R+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+E391V;

Hl*+G109A+W284R+E391A;

Hl*+G109A+W284F+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+W284F+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323N+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323K+E391A;

Hl*+G109S+N280S+E391A;

Hl*+G109A+W284H+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A;

G7A+W284H+K320A+M323N;

G7A+K320A+M323N;

K32 0A;

G7A+K320A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+W284H+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 62/168

58/153

Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+W284R+E391A; e Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A.

[0158]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 63/168

59/153

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 3.

[0159]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 64/168

60/153

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 65/168

61/153

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 4.

[0160]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 66/168

62/153

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 5.

[0161]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 67/168

63/153

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 68/168

64/153

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 6.

[0162]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 69/168

65/153

Xl*+X109A+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A;

Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 7.

[0163]Uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes às posições da

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 70/168

66/153 sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 selecionadas do grupo que consiste em:

Xl*+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7K+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7E+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7N+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7Q+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7L+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X7D+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320M+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320T+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320V+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323R+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X320S+X391A; Xl*+X109A+X280S+X391V;

Xl*+X109A+X284R+X391A;

Xl*+X109A+X284F+X391A; Xl*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323K+X391A; Xl*+X109S+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X284H+X391A; Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A; Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A;

X7A+X284H+X320A+X323N;

X7A+X320A+X323N;

X320A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 71/168

67/153

X7A+X320A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X284H+X391A;

Xl*+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A; Xl*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Xl*+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XI*+X7A+X1Ο9A+X280S+X320A+X323N+X391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: lea variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com as amilases apresentadas na SEQ ID NO: 8.

[0164]É preferencial que a variante compreenda uma modificação em uma, duas, três, quatro ou cinco posições selecionadas do grupo que consiste em XI*, XIA, X7A, X109A, X280S e X391A. Em uma modalidade mais preferencial, as modificações em uma, duas, três, quatro ou cinco posições são selecionadas dentre XI*, X7A, X109A, X280S e X391A.

[0165]Em um aspecto, uma variante adequada pode compreender modificações nas posições correspondentes a

Xl*+X109A+X280S+X391A,

Xl*+X109A+X284H+X391A,

Xl*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A,

Xl*+X7A+X109A+X280S+X391A e

Xl*+X7A+X109A+X280S+X284H+X323N+X391A,

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 72/168

68/153 sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO:

1, e sendo que a variante tem ao menos 8 0% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0166]Uma variante adequada pode compreender variantes da SEQ ID NO: 1 compreendendo modificações nas posições correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO:

1, e sendo que a variante tem ao menos 8 0% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0167]Uma variante adequada pode compreender uma variante da SEQ ID NO: 2 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[0168]Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 3 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

[0169]Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 4 compreendendo modificações

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 73/168

69/153 correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A; Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4.

[0170]Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 5 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A; Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.

[0171]Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 6 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A; Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6.

[0172]Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes da SEQ ID NO: 7 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A; Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A; e Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7.

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 74/168

70/153 [0173]Em uma modalidade as variantes podem compreender variantes da SEQ ID NO: 8 compreendendo modificações correspondentes a Hl*+G109A+N280S+E391A; Hl*+G109A+W284H+E391A; Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, e sendo que a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8.

[0174]Em uma modalidade, a variante para a invenção compreende adicionalmente uma modificação em uma ou mais posições selecionadas do grupo de 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476. Em uma modalidade especifica, a variante para a invenção compreende uma ou mais modificações adicionais selecionadas do grupo de W140Y/F, R181*, G182*, D183*, G184*, N195F/Y, I206Y/F,

Y243F

E260A/D/C/Q/L/M/F/P/S/W/V/G/H/I/K/N/R/T/Y

G304R/K/E/Q e G476E/Q/R/K. A variante para a invenção pode compreender adicionalmente substituições em duas, três ou quatro posições selecionadas do grupo que consiste em G304R, W140YF, E26OGHIKNPRTY e G476EQRK. Em uma modalidade mais preferencial, as substituições nas duas, três ou quatro posições são selecionadas do grupo consistindo em G304R, W140Y, E260G e G476K.

[0175]A variante para a invenção pode compreender as modificações correspondentes a

Hl*+G109A+W140Y+Dl83*+G184*+N195F+1206Y+Y243F+E2

60G+N280S+G304R+E391A+G476K,

Hl*+G109A+W140Y+Dl83*+G184*+N195F+1206Y+Y243F+E2

60G+W284H+G304R+E391A+G476K,

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71/153

Hl*+ G109A+W140Y+Dl83*+ G184*+N195F+12 Ο6Y+Y243F+E2 60G+N280S+G304R+K320A+M323N+E391A+G476K,

Hl* + G7A+G109A+W140Y+D183* + Gl84*+N195F+12 Ο6Y+Y243 F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K, e

Hl*+ G7A+G1O9A+W14OY+D183* + Gl84*+N195F+12 Ο6Y+Y243 F+E260G+N280S+W284H+G304R+M323N+E391A+G476K, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1, a variante tem ao menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e é uma variante da SEQ ID NO: 1.

[0176]Os aminoácidos essenciais em um original podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sitio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica anterior, mutações de alanina individuais são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para verificar a atividade de alfa-amilase para identificar os resíduos de aminoácidos que são críticos à atividade da molécula. Consulte também, Hilton et al. , 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima alfa-amilase ou outra interação biológica pode, também, ser determinado pela análise física da estrutura, conforme determinado por técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos com sítio de contato putativo. Consulte, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEES Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser

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72/153 inferidas a partir da análise de identidades com polipeptideos que são relacionados ao original.

Construtos de ácido nucleico [0177]Os construtos de ácido nucleico podem compreender um polinucleotideo que codifica uma variante essencial à presente invenção funcionalmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. O polinucleotideo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para possibilitar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotideo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar os polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0178]A sequência de controle pode ser uma sequência promotora, que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotideo. A sequência promotora contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que mostra atividade traducional na célula hospedeira, inclusive promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptideos extracelulares ou intracelulares, sejam estes homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0179]Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são

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73/153 os promotores obtidos do gene para alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, do gene para alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, do gene para penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, do gene para amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, do gene para levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, dos genes para xylA e xylB de Bacillus subtilis, do operon lac de E. coli, do gene para agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e do gene para beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25) . Outros promotores são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria, em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94, e em Sambrook et al., 1989, acima.

[0180]Os exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável a ácidos de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose-fosfatoisomerase de Aspergillus oryzae, protease similar a tripsina de Fusarium oxisporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei,

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74/153 celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e também o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em Aspergillus em que a sequência de iniciação não traduzida foi substituída por uma sequência de iniciação não traduzida proveniente de um gene codificando triose-fosfato-isomerase em Aspergillus; exemplos não limitadores incluem promotores modificados incluindo o gene que codifica alfa-amilase neutra em Aspergillus niger, em que a sequência de iniciação não traduzida foi substituída por uma sequência de iniciação não traduzida proveniente do gene que codifica triose-fosfatoisomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae) ; e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.

[0181]Em uma levedura hospedeira, os promotores úteis são obtidos de genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcooldesidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose-fosfatoisomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3fosfoglicerato-quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

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75/153 [0182]A sequência de controle pode, também, ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, a qual é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está funcionalmente ligada na terminação 3' do polinucleotideo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[0183]Os terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes para antranilato-sintase de Aspergillus nidulans, alfaglicosidase de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, e protease similar a tripsina de Fusarium oxisporum.

[0184]Os terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, acima citado.

[0185]A sequência de controle pode, também, ser uma sequência de iniciação adequada, uma região nãotraduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência de iniciação está funcionalmente ligada à terminação 5' do polinucleotideo que codifica a variante. Pode ser usada qualquer sequência de iniciação que seja funcional na célula hospedeira.

[0186]As sequências de iniciação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas

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76/153 dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0187]As sequências de iniciação adequadas para células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3fosfoglicerato-quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcooldesidrogenase/gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0188]A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência funcionalmente ligada na terminação 3' da sequência que codifica a variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como uma sinalização para adicionar resíduos de poliadenosina no mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[0189]As sequências de poliadenilação preferíveis para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes para antranilato-sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxisporum.

[0190]As sequências de poliadenilação úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo eSherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0191]A sequência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinalização que codifica um peptídeo de sinalização ligado ao terminal amino de uma variante, e direciona a variante para dentro

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77/153 da rota secretória da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação do polinucleotideo pode inerentemente conter uma região de codificação de peptideo de sinalização naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptideo de sinalização que é estranha à sequência de codificação. A região estranha de codificação de peptideo de sinalização pode ser necessária nos casos em que a sequência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptideo de sinalização. Alternativamente, a região estranha de codificação de peptideo de sinalização pode simplesmente substituir a região natural de codificação de peptideo de sinalização, a fim de intensificar a secreção da variante. Entretanto, pode ser usada qualquer região de codificação de peptideo de sinalização que direcione a variante expressada para dentro da rota secretória de uma célula hospedeira.

[0192]As sequências de codificação de peptideo de sinalização eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação de peptideo de sinalização obtidas dois genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina deBacillus licheniformis, betalactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de <Bacillus subtilis. Outros peptideos de sinalização são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

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78/153 [0193]As sequências de codificação de peptideo de sinalização eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação de peptideo de sinalização obtidas dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[0194]Os peptideos de sinalização úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de codificação de peptideo de sinalização úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0195]A sequência de controle pode também ser uma região de codificação de propeptideo que codifica um propeptideo posicionado no terminal amino de uma variante. 0 polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou, em alguns casos, um zimogênio). Um propolipeptídeo é em geral inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por divagem catalítica ou autocatalítica do propeptideo a partir do propolipeptídeo. A região de codificação de propeptideo pode ser obtida dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophtora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

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79/153 [0196]Nos casos em que tanto as regiões de peptídeo como as de propeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a região de propeptídeo fica posicionada junto ao terminal amino da variante, e a região do peptídeo de sinalização fica posicionada junto ao terminal amino da região de propeptídeo.

[0197]Pode ser desejável, também, adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão da variante em relação à proliferação da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ativada ou desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, inclusive à presença de um composto regulatório. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em leveduras, pode ser usado o sistema ADH2 ou GAL1. Em fungos filamentosos, podem ser usados o promotor glicoamilase de Aspergillus niger, o promotor TAKA alfaamilase deAspergillus oryzae, e o promotor glicoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene di-hidrofolato-redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica a variante estaria funcionalmente ligado na sequência regulatória.

Vetores de expressão [0198]Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um polinucleotídeo essencial à presente invenção, um promotor, e sinais de interrupção

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80/153 transcricional e traducional. As várias sequências de nucleotídeos e sequências de controle podem ser unidas umas às outras para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição do polinucleotídeo que codifica a variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso mediante a inserção do polinucleotídeo ou de um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao produzir o vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor, de modo que a sequência de codificação esteja funcionalmente ligada às sequências de controle adequadas para expressão.

[0199]O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode desencadear a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá, tipicamente, da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual é para ser introduzido o vetor. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0200]O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para garantir a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com os

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81/153 um ou mais cromossomos aos quais foi integrado. Além disso, pode-se usar um plasmídeo ou vetor único ou dois ou mais plasmídeos ou vetores que, juntos, contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[0201]0 vetor compreende, de preferência, um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto oferece características biocidas ou resistência viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxotrofos, e similares.

[0202]Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3.

[0203]O vector compreende, de preferência, um ou mais elementos que permitem a integração do vetor ao genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[0204]Para integração ao genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a codificação da variante pela sequência do polinucleotídeo ou com qualquer outro elemento do vetor para integração ao genoma por meio de recombinação homóloga ou não-homóloga. Alternativamente, o vetor pode compreender sequências de nucleotídeo adicionais para dirigir a integração por meio de recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira, em um

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82/153 ou mais locais precisos nos um ou mais cromossomos. Para aumentar a possibilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração precisam conter um número suficiente de ácidos nucléicos, como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um grau alto de identidade com a sequência-alvo correspondente, a fim de aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem consistir em qualquer sequência que seja homóloga à sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotideo não-codificadoras ou codificadoras. Por outro lado, o vetor pode ser integrado ao genoma da célula hospedeira mediante recombinação não homóloga.

[0205]Para replicação autônoma, o vetor pode compreender, ainda uma origem de replicação capacitando o vetor a replicar-se autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo que medeia replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo origem de replicação ou replicador de plasmídeo significa uma sequência de nucleotídeos que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique ín vivo.

[0206]Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira a fim de aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido mediante a integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou mediante a inclusão de um gene marcador selecionável

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83/153 amplificável com o polinucleotídeo, em que as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e portanto as cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas mediante o cultivo das células na presença do agente selecionável adequado.

[0207]Os procedimentos usados para ligar os elementos acima descritos a fim de construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelo versado na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, acima) para obter variantes substancialmente puras.

Células hospedeiras [0208]As células hospedeiras recombinantes podem compreender um polinucleotídeo essencial à presente invenção, ligado de maneira funcional a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a produção de uma variante para a presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de modo que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante, conforme descrito anteriormente. O termo célula hospedeira abrange qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em uma grande extensão do gene que codifica a variante e sua fonte.

[0209]A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarionte ou um eucarionte.

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84/153 [0210]A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não se limitam a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não se limitam a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[0211]A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulars, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus lichen!formis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[0212]A célula hospedeira bacteriana pode também ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0213]A célula hospedeira bacteriana pode também ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[0214]A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser efetuada por meio de

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85/153 transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), mediante ο uso de células competentes (consulte, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacterial. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por meio de eletroporação (consulte, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou por meio de conjugação (consulte, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacterial. 169: 5271-5278) . A introdução de DNA em uma célula de E. coll pode, por exemplo, ser efetuada por meio de transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou por meio de eletroporação (consulte, por exemplo, Dower et al. , 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode, por exemplo, ser efetuada por meio de transformação de protoplasto e eletroporação

(consulte,	por	exemplo,	Gong et	al. ,	2004, Folia
Microbiol.	(Praha) 49: 399	-405), por	meio	de	conj ugação
(consulte,	por	exemplo,	Mazodier	et al	• r	1989, J.
Bacteriol.	171:	3583-3585)	ou por	meio	de	transdução
(consulte,	por	exemplo, Burke et al.	, 2001	r	Proc. Natl.
Acad. Sei.	USA	98: 6289-6294). A introdução	de	DNA em uma

célula de Pseudomonas pode, por exemplo, ser efetuada por meio de eletroporação (consulte, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por meio de conjugação (consulte, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57) . A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser efetuada por meio de competência natural (consulte, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295

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1297), por meio de transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, por meio de eletroporação (consulte, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por meio de conjugação (consulte, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436) . Entretanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[0215]A célula hospedeira pode, também, ser um eucarionte, como uma célula de mamífero, de inseto, de planta ou de fungo.

[0216]As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular de um modo conhecido por si só. Os procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 14701474. Os métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al. , 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada com o uso dos procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., New York, EUA; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de produção [0217]O método para produção de uma variante pode compreender: (a) cultivar uma célula hospedeira da

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87/153 presente invenção sob condições adequadas para a expressão da variante; e (b) recuperar a variante. Consequentemente, a presente invenção se refere a métodos para produção de uma variante, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão de uma variante codificadora de polinucleotideo compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, sob condições adequadas à expressão da variante; e (b) recuperar a variante.

[0218]As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção de uma variante com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou em grande escala (incluindo fermentações continua, em batelada, em batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio adequado e sob condições que permitam que uma variante seja expressada e/ou isolada. O cultivo se dá em meio nutritivo adequado, compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio, bem como sais inorgânicos, mediante o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). Se a

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88/153 variante é secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não é secretada, ela pode ser recuperada de lisados celulares.

[0219]A variante pode ser detectada com o uso de métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Esses métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto enzimático, ou o desaparecimento de um substrato enzimático. Por exemplo, em ensaio de enzima pode ser utilizado para determinar a atividade da variante.

[0220]A variante pode ser recuperada por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais que incluem, mas não se limitam a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação, ou precipitação.

[0221]A variante pode ser purificada por meio de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica que incluem, mas não se limitam a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação por sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (consulte, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, EUA, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[0222]Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada mas, em vez disso, uma célula hospedeira da

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89/153 presente invenção expressando uma variante é usada como uma fonte da variante.

[0223]As composições podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem ser sob a forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de um granulado ou microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Composições para limpeza [0224]A presente invenção se refere, de preferência, a produtos para e/ou métodos relacionados a e/ou uso das composições reivindicadas que são para cuidados com o ar, cuidados com o carro, lavagem de louça, condicionamento de tecidos (incluindo amaciante), detergência para lavagem de roupas, aditivo e/ou cuidados de lavagem e enxágue de roupas, limpeza e/ou tratamento de superfícies duras, e outras limpezas para uso do consumidor ou institucional. De acordo com a invenção, as variantes de alfa-amilases acima podem, tipicamente, ser um componente em uma composição de como um sólido, líquido, gel e/ou dose unitária de detergentes de limpeza, como uma composição detergente, por exemplo, uma composição detergente para lavagem de roupas ou uma composição detergente para a lavagem de louças. É especificamente preferencial uma composição detergente líquida para lavagem de roupas.

[0225]Essas composições de limpeza compreendem um adjunto de limpeza/detergente, de preferência uma mistura de componentes. Tipicamente, o composto auxiliar de limpeza estará presente na composição em uma quantidade de 0, 001 a 99,9% em peso, mais tipicamente de 0,01 a 80% em peso de

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90/153 composto auxiliar de limpeza. Os adjuntos de limpeza adequados compreendem: tensoativos, builders, alvejantes, catalisadores de alvejante, corantes, reforçadores alvejantes, agentes quelantes, agentes de transferência de corantes, auxiliadores de deposição, dispersantes, enzimas adicionais e estabilizantes de enzima, materiais catalíticos, ativadores de alvejante, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, clareadores ópticos, fotoativadores, fluorescedores, agentes de matiz para tecidos, condicionadores de tecido, perácidos preformados, agentes poliméricos dispersantes, agentes antirredeposição/remoção de sujeira de argila, sais de carga, hidrótropos, clareadores, supressores de espuma, agentes elastificantes de estrutura, amaciantes de tecido, tensoativos hidrolisáveis, conservantes, antioxidantes, agentes antiencolhimento, germicidas, fungicidas, antiembaciamento, agentes anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes solubilizantes, carreadores, elementos auxiliares ao processamento, pigmentos, colorantes, perfumes e agentes de controle de pH, encapsulados, polímeros. Por exemplo, estes podem incluir: ingredientes alvejantes, como reforçadores de alvejante à base de imina; fontes de peróxido de hidrogênio como percarbonato e/ou perborato, especificamente percarbonato revestido com material como sal de carbonato e/ou sulfato, sal de silicato, borossilicato, e qualquer mistura desses materiais; perácido pré-formado, incluindo perácido pré-formado em forma encapsulada; catalisadores de metais de transição; supressores de espuma ou sistemas supressores, como supressores de espuma à base de silicone e/ou supressores de espuma à base de ácido

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91/153 graxo; amaciantes de tecido, como argila, silicone e/ou compostos de amônio quaternário; floculantes, como óxido de polietileno; inibidores de transferência de corantes, como polivinil pirrolidona, N-óxido de poli 4-vinil piridina e/ou copolimero de vinil pirrolidona e vinil imidazol; componentes para integridade de tecidos, como oligômeros produzidos pela condensação de imidazol e epicloridrina; dispersantes de sujeira e auxiliares de antirredeposição de sujeira, como poliaminas alcoxiladas e polímeros de etilenoimina etoxilada; componentes antirredeposição, como poliésteres; polímeros de carboxilato, como polímeros de ácido maleico ou copolímeros de ácido maleico e acrílico; perfumes como microcápsulas de perfume, acordes encapsulados em amido, perfume de aspersão; anéis de sabão; partículas estéticas; corantes; caras, como sulfato de sódio, embora seja preferencial para a composição que seja substancialmente isenta de cargas; sal de silicato, como silicato de sódio, inclusive silicato de sódio 1,6R e 2, OR, ou metassilicato de sódio; copoliésteres de ácidos dicarboxílicos e dióis; polímeros celulósicos, como metil celulose, carbóxi metil celulose, hidróxi etóxi celulose ou outras alquil ou alquilalcóxi celuloses; solventes como 1,2 propanodiol, monoetanolamina; dietileno glicol, etanol, e qualquer mistura desses materiais; hidrótropos como cumenossulfonato de sódio, xilenossulfonato de sódio, toluenossulfonato de sódio, e quaisquer misturas; ácidos orgânicos, como ácido cítrico; e qualquer combinação dos mesmos. A composição pode ser tal que o composto auxiliar de limpeza compreende um ou mais selecionados do grupo que consiste em (i) microcápsula de perfume; (ii) agente de

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92/153 matização de tecidos; (iii) protease; (iv) polímero de limpeza anfifílico; (v) lipase ou (vi) misturas dos mesmos.

[0226]Em um outro aspecto preferencial, a composição compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos, incluindo semipolares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwiteriônicos e/ou anfolíticos e/ou não iônicos semipolares e/ou misturas dos mesmos. Os tensoativos estão tipicamente presentes a um nível de 0,1% a 60%, em peso ou de 0,5 a 50% em peso ou 1 a 40% em peso da composição.

[0227]Quando incluído na mesma, a composição de limpeza conterá de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico, como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etóxi sulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, éster metílico de ácido alfa-sulfo graxo, ácido alquil ou alquenil succínico ou sabonete.

[0228]Quando incluído na mesma, o agente de limpeza conterá, normalmente, de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico, como etoxilato de álcool, etoxilato de nonila-fenol, alquil poliglicosídeo, óxido de alquil dimetil amina, monoetanol-amida de ácido etoxilado graxo, monoetanol amida de ácido graxo, amida de poliidróxi alquil ácido graxo, ou derivados de N-acila Nalquila de glicosamina (glucamidas).

[0229]A composição de limpeza pode compreender uma ou mais outras enzimas. Portanto, uma composição preferencial compreende (a) uma variante de uma alfaamilase parental, sendo que a dita variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondentes às

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93/153 posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, (ii) a dita variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a dita variante tem atividade de alfaamilase; e (b) uma ou mais enzimas adicionais, de preferência selecionadas do grupo que consiste em aminopeptidase, amilase, carboidrase, carbóxi peptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosil transferase, desoxirribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfaglicosidase, beta-glicosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolitica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenol oxidase,

enzima proteolitica, ribonuclease,	transglutaminase ou
xilanase. As	uma	ou mais	enzimas	adiei	onais podem ser
produzidas,	por	exemplo	, por	um	micro-organismo
pertencente	ao	gênero	Aspergillus,	por exemplo,

Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cereal!s, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium

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94/153 oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo, Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, por exemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[0230]De preferência a composição compreende uma protease ou misturas de mais de uma protease, uma lipase ou misturas de mais de uma lipase, uma peroxidase ou misturas de mais de uma peroxidase, uma ou mais enzimas amiloliticas adicionais, por exemplo, uma alfa-amilase adicional, uma glicoamilase adicional, uma amilase maltogênica adicional, de preferência uma alfa-amilase adicional, uma ou misturas de mais de uma CGTase e/ou uma celulase ou misturas de mais de uma celulase, mananase (como MANNAWAY™, disponível junto à Novozymes, Dinamarca) ou misturas de mais de uma mananase, pectinase, pectato liase, cutinase e/ou lacase ou misturas de mais de uma dentre uma ou mais destas.

[0231] Em geral, as propriedades das uma ou mais enzimas escolhidas deveríam ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, nível ótimo de pH, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e as uma ou mais enzimas deveríam estar presentes em quantidades eficazes. De preferência, o produto da invenção compreende ao menos 0,01 mg, de preferência de cerca de 0,05 a cerca de 10, com mais preferência de cerca de 0,1 cerca de 6, especialmente de cerca de 0,2 a cerca de 5 mg de enzima adicional ativa/g de composição.

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95/153 [0232]Proteases : As proteases adequadas incluem metaloproteases e/ou proteases de serina, incluindo proteases de serina microbianas neutras ou alcalinas, como subtilisinas (EC 3.4.21.62). As proteases adequadas incluem as de origem animal, vegetal ou microbiana. Em um aspecto, tai protease adequada pode ser de origem microbiana. As proteases adequadas incluem mutantes química ou geneticamente modificados das proteases adequadas supracitadas. Em um aspecto, a protease adequada pode ser uma protease serina, como uma protease microbiana alcalina e/ou uma protease do tipo tripsina. Exemplos de proteases neutras ou alcalinas adequadas incluem:

(a) subtilisinas (EC 3.4.21.62), inclusive aquelas derivadas de Bacillus, como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii, descritas em US 6.312.936 Bl, US 5.679.630, US 4.760.025, US 7.262.042 e W009/021867.

(b) proteases do tipo tripsina ou do tipo quimotripsina, como tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) , inclusive a protease de Fusarium descrita em WO 89/06270 e as quimotripsina-proteases derivadas de Cellumonas descritas em WO 05/052161 e WO 05/052146.

(c) metaloproteases, incluindo aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens descritas em WO 07/044993A2.

[0233]As proteases preferenciais incluem aquelas derivadas de Bacillus gibsonii ou Bacillus lentus.

[0234]Enzimas protease adequadas comercialmente disponíveis incluem aquelas comercializadas sob os nomes comerciais Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase

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Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® e Esperase® por Novozymes A/S (Dinamarca), aquelas vendidas sob o nome comercial de Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®,

Excellase® e Purafect OXP® por Genencor International, aquelas vendidas sob o nome comercial de Opticlean® e Optimase® por Solvay Enzymes, aquelas disponíveis junto à Henkel/ Kemira, a saber BLAP (sequência mostrada na Figura 29 de US 5.352.604 com as mutações a seguir S99D + S101 R + S103A + V104I +G159S, mais adiante neste documento chamadas de BLAP) , BLAP R (BLAP com S3T + V4I + V199M + V205I +

L217D) , BLAP X (BLAP com S3T + V4I + V2051) e BLAP F49 (BLAP com S3T + V4I + A194P + V199M + V205I + L217D) - todos obtidos Junto à Henkel/Kemira; e KAP (subtilisina de

Bacillus alkalophilus com mutações A230V + S256G + S259N) de Kao. Outras proteases adequadas são descritas em

W02011/03623, W02011/140316, W02011/140364 e WO2012/05778.

[0235]Lipases: As lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas estão incluídos. Os exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo de Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) ou de H. insolens, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705, P. wisconsinensis, uma lipase de Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica

Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus ou B. pumilus.

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97/153 [0236]A lipase pode ser uma lipase de primeiro ciclo como aquelas descritas na patente US 6.939.702 BI e US PA 2009/0217464. Em um aspecto, a lipase é uma lipase de primeira lavagem, de preferência uma variante da lipase de ocorrência natural obtida de Thermomyces lanuginosus compreendendo as mutações T231R e N233R. A sequência de ocorrência natural são os 269 aminoácidos (aminoácidos 23 a 291) do número de acesso Swiss-Prot 059952 (derivado de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)) . Lipases preferenciais incluiríam aquelas vendidas sob os nomes comerciais Lipex®, Lipolex® e Lipoclean®.

[0237]Celulases : As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas estão incluídos. As celulases adequadas incluem celulases provenientes dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum.

[0238]Em um aspecto, as enzimas preferenciais incluem endoglucanases derivadas de micróbios exibindo atividade de endo-beta-1,4-glucanase (E.C. 3.2.1.4), de preferência selecionadas do grupo que compreende:

(a) um polipeptideo bacteriano endógeno a um membro do gênero Bacillus que tem uma sequência com pelo menos 90%, 94%, 97% e mesmo 99% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 em 7.141.403B2;

(b) uma glicosil hidrolase tendo atividade enzimática tanto para o xiloglucano como para os substratos

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98/153 de celulose amorfos, sendo que a glicosil hidrolase é selecionada de famílias GH 5, 12, 44 ou 74;

(c) uma glicosil hidrolase tendo uma sequência de ao menos 90%, 94%, 97% e mesmo 99% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 em WO09/148983;

(d) e misturas dos mesmos.

[0239]As endoglucanases adequadas são vendidas sob os nomes comerciais Celluclean® e Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

[0240]Outras celulases comercialmente disponíveis incluem CELLUZYME® e CAREZYME® (Novozymes A/S) , CLAZINASE® e PURADAX HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporation).

[0241]Outras amilases: De preferência, a composição compreende uma amilase adicional. As amilases adicionais adequadas incluem alfa-amilases, inclusive aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes (variantes) química ou geneticamente modificados estão incluídos. Uma alfa-amilase alcalina preferencial é derivada de uma cepa de Bacillus, como Bacillus lichen!form!s, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou outro Bacillus sp. , como Bacillus sp. NCBI 12289, NCBI 12512, NCBI 12513, DSM 9375 (USP 7.153.818) DSM 12368, DSMZ n° 12649, KSM AP1378 (WO 97/00324), KSM K36 ou KSM K38 (EP 1.022.334). As amilases adicionais preferenciais podem ser selecionadas de: (a) as variantes descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO96/23874 e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais dentre as seguintes posições versus a enzima mencionada como SEQ ID NO: 2 em WO

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96/23874:	15,	23, 105, 106, 124, 128,	133,	154,	156,	181,
188, 190,	197,	202, 208, 209, 243, 264,	304,	305,	391,	408
e 4 4 4;	(b)	as variantes descritas	em	WO	96/23873,

WO00/60060, W006/002643 e W02017/192657, especialmente as variantes com uma ou mais substituições nas seguintes posições versus a enzima AA560 mencionada como SEQ ID NO:

12 eir	l WO 06/002643:	26, 30, 33, 82,	37,	106,	118,	128,	133,
149,	150, 160, 178,	182, 186, 193,	203,	214,	231,	246,	256,
257,	258, 269, 270,	272, 283, 295,	296,	298,	299,	303,	304,
305,	311, 314, 315,	318, 319, 339,	345,	361,	378,	383,	419,
421,	437, 441, 444,	445, 446, 447,	450,	461,	471,	482,	484

que, de preferência, contenham também as deleções de D183* e G184*; (c) variantes exibindo ao menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4 em W006/002643, a enzima de tipo selvagem de Bacillus SP722, especialmente variantes com deleções nas posições 183 e 184 e as variantes descritas em WO 00/60060, as quais estão aqui incorporadas a titulo de referência; (d) variantes que apresentam ao menos 95% de identidade com a enzima de ocorrência natural obtida de Bacillus sp. 707 (SEQ ID NO: 7 em US 6.093.562), especialmente aquelas compreendendo uma ou mais dentre as seguintes mutações M202, M208, S255, R172, e/ou M261. De preferência, a dita amilase compreende uma ou mais dentre M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, M202W, S255N e/ou R172Q. São particularmente preferenciais aquelas que compreendem as mutações M202L ou M202T; (e) variantes descritas em WO 09/149130, de preferência aquelas que exibem ao menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2 em WO 09/149130, a enzima de tipo selvagem proveniente de Geobacillus stearophermophilus ou uma versão

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100/153 truncada da mesma; (f) variantes que exibem ao menos 89% de identidade com a SEQ ID NO: 1 em WO20160 91688, especialmente aquelas que compreendem deleções nas posições H183+G184 e adicionalmente uma ou mais mutações nas posições 405, 421, 422 e/ou 428; (g) variantes exibindo ao menos 60% de identidade de sequência de aminoácidos com a PcuAmyl α-amilase de Paenibacillus curdlanolyticus YK9 (SEQ ID NO: 3 em WO2014099523) ; (h) variantes exibindo ao menos 60% de identidade de sequência de aminoácidos com a CspAmy2 amilase de Cytophaga sp. (SEQ ID NO: 1 em

WO2014164777);	(i)	variantes	exibindo	ao menos	85%	de
identidade com	AmyE	de Bacillus subtilis	(SEQ ID	NO: 1	em
WQ2009149271);	(j)	variantes	exibindo	ao menos	90%	de

identidade com a amilase de tipo selvagem de Bacillus sp. KSM-K38, com número de acesso AB051102; (k) variantes exibindo ao menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos maduros de AAI10 de Bacillus sp. (SEQ ID NO: 7 em WO2016180748) ; (1) variantes exibindo ao menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos maduros de amilase de Alicyclobacillus sp. (SEQ ID NO: 8 em WO2016180748); ou misturas dos mesmos. Quando presente, a composição da invenção compreende, de preferência, desde ao menos 0,01 mg, de preferência de cerca de 0,05 a cerca de 10, com mais preferência de cerca de 0,1 cerca de 6, especialmente de cerca de 0,2 a cerca de 5 mg de amilase adicional ativa/g de composição.

[0242]As alfa-amilases adequadas comercialmente disponíveis incluem DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL®, ATLANTIC®, INTENSA® e BAN® (Novozymes A/S,

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Bagsvaerd, Dinamarca), KEMZYM® AT 9000 (Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Wien, Áustria) , RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, POWERASE®, série PREFERENZ S® (inclusive PREFERENZ S1000® e PREFERENZ S2000®) e PURASTAR OXAM® (DuPont, Palo Alto, Califórnia, EUA) e KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1chome, Chuo-ku, Tóquio 103-8210, Japão). Em um aspecto, as amilases adequadas incluem ATLANTIC®, STAINZYME®, POWERASE®, INTENSA® e STAINZYME PLUS®, e misturas das mesmas.

[0243]Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprínus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes do mesmo, como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

[0244]Peroxidades comercialmente disponíveis incluem GUARDZYME® (Novozymes A/S) .

[0245]Outras enzimas: Outras enzimas preferenciais incluem pectato liases vendidas sob os nomes comerciais Pectawash® e Pectaway®, e mananases vendidas sob os nomes comerciais Mannaway® (todas disponíveis junto à Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) e Purabrite® (Genencor International Inc., Paio Alto, Califórnia, EUA).

[0246]As uma ou mais enzimas detergentes podem ser incluídas em uma composição detergente ao acrescentar aditivos separados que contêm uma ou mais enzimas ou ao acrescentar um aditivo combinado que compreende todas essas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou em um aditivo combinado, pode ser

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102/153 formulado, por exemplo, granulado, um liquido, uma pasta aquosa, etc. Formulações de aditivo detergente preferenciais são granulados, em particular granulados não-pulverizados, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas aquosas.

[0247]Granulados sem pulverização podem ser produzidos e podem, opcionalmente, ser revestidos por meio de métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos à base de poli(óxido de etileno) (poli(glicol etilênico), PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonil fenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono, e nos quais há de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos. Os materiais de revestimento formadores de filme podem ser aplicados, por exemplo, por meio de técnicas de leito fluidizado. Preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos.

[0248]A composição pode compreender um agente de matiz para tecidos (algumas vezes chamado de agentes de tonalização, azulamento ou agentes branqueadores). Tipicamente, o agente de matização confere uma tonalidade azul ou violeta ao tecido. Os agentes de matização podem ser usados sozinhos ou em combinação para criar uma tonalidade específica de matiz e/ou para tonalizar tipos diferentes de tecidos. Isso pode ser obtido, por exemplo,

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103/153 mediante a mistura de corantes vermelho e azul esverdeado para produzir uma tonalidade azul ou violeta. Os agentes de matização podem ser selecionados de qualquer classe química de corante conhecida, incluindo, mas não se limitando a, acridina, antraquinona (incluindo quinonas policíclicas), azina, azo (por exemplo, monoazo, disazo, trisazo, tetraquisazo, poliazo), incluindo azo premetalizado, benzodifurano e benzodifuranona, carotenoide, cumarina, cianina, diaza-hemicianina, difenilmetano, formazano, hemicianina, indigoides, metano, naftalimidas, naftoquinona, nitro e nitroso, oxazina, ftalocianina, pirazóis, estilbeno, estirila, triarilmetano, trifenilmetano, xantenos e misturas dos mesmos.

[0249]Os agentes de matização para tecidos adequados incluem corantes, conjugados de corante-argila e pigmentos orgânicos e inorgânicos. Os corantes adequados incluem corantes de moléculas pequenas e corantes poliméricos. Corantes de moléculas pequenas adequados incluem corantes de moléculas pequenas selecionadas do grupo que consiste em corantes enquadrados nas classificações de índice de cor (C.I.) de direto, básico, reativo ou reativo hidrolisado, solvente ou dispersos, por exemplo, aqueles que são classificados como azul, violeta, vermelho, verde ou preto, e que proporcionam a matiz desejada, sozinhos ou em combinação. Em um outro aspecto, corantes de moléculas pequenas adequados incluem corantes de moléculas pequenas selecionados do grupo que consiste nos números de índice de cor (Society of Dyers and Colourists, Bradford, Reino Unido) de corantes violeta direto, como 9, 35, 48, 51, 66 e 99, corantes azul direto

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104/153 como 1, 71, 80 e 279, corantes vermelho ácido como 17, 73, 52, 88 e 150, corantes violeta ácido como 15, 17, 24, 43, 49 e 50, corantes azul ácido como 15, 17, 25, 29, 40, 45, 75, 80, 83, 90 e 113, corantes preto ácido como 1, corantes violeta básico como 1, 3, 4, 10 e 35, corantes azul básico como 3, 16, 22, 47, 66, 75 e 159, corantes dispersos ou solvente, como aqueles descritos em EP1794275 ou EP1794276 ou corantes como revelado em US 7.208.459 B2, e misturas dos mesmos. Em outro aspecto, os corantes de moléculas pequenas adequados incluem corantes de moléculas pequenas selecionados do grupo que consiste em números de índice de cor violeta ácido 17, azul direto 71, violeta direto 51, azul direto 1, vermelho ácido 88, vermelho ácido 150, azul ácido 29, azul ácido 113 ou misturas dos mesmos.

[0250]Corantes poliméricos adequados incluem corantes poliméricos selecionados do grupo que consiste em polímeros contendo cromógenos covalentemente ligados (algumas vezes chamados de conjugados), (conjugados corante-polímero), por exemplo, polímeros com cromógenos copolimerizados na cadeia principal do polímero e misturas dos mesmos. Corantes poliméricos incluem aqueles descritos em WO2011/98355, WO2011/47987, US2012/090102, WO2010/145887, WO2006/055787 e WO2010/142503.

[0251]Em outro aspecto, os corantes poliméricos adequados incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em colorantes aderentes a tecido disponíveis comercialmente sob o nome de Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, EUA), conjugados corantepolímero formados de ao menos um corante reativo e um polímero selecionado do grupo que consiste em polímeros

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105/153 compreendendo uma porção selecionada do grupo que consiste em uma porção hidroxila, uma porção amina primária, uma porção amina secundária, uma porção tiol e misturas dos mesmos. Em ainda um outro aspecto, corantes poliméricos adequados incluem corantes poliméricos selecionados do grupo que consiste em Liquitint® Violeta CT, carboximetilcelulose (CMC) covalentemente ligado a um corante azul reativo, violeta reativo ou vermelho reativo como CMC conjugado com C.I. Azul reativo 19, vendido por Megazyme, Wicklow, Irlanda sob o nome de produto AZO-CMCELLULOSE, código de produto S-ACMC, colorantes poliméricos tri-fenilmetano alcoxilados, colorantes poliméricos de tiofeno alcoxilado e misturas dos mesmos.

[0252]Os corantes de matização preferenciais incluem os agentes branqueadores azo tiofeno alcoxilados encontrados em US2008/0177090, que podem ser opcionalmente aniônicos, como aqueles selecionados dos exemplos 1 a 42 na Tabela 5 de W02011/011799. Outros corantes preferenciais são revelados em US 8138222.

[0253]Os conjugados corante-argila adequados incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em pelo menos um corante catiônico/básico e uma argila esmectita, bem como suas misturas. Em outro aspecto, os conjugados corante-argila adequados incluem conjugados corante-argila selecionados do grupo que consiste em um corante catiônico/básico selecionado do grupo que consiste em C.I. Amarelo Básico 1 até 108, C.I. Laranja Básico 1 até 69, C.I. Vermelho Básico 1 até 118, C.I. Violeta Básico 1 até 51, C.I. Azul Básico 1 até 164, C.I. Verde Básico 1 até 14, C.I.

Marrom Básico 1 a 23,

Cl Preto Básico 1 a 11, e uma argila

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106/153 selecionada do grupo que consiste em argila de Montmorilonita, argila de hectorita, argila saponita, e misturas das mesmas. Em ainda um outro aspecto, conjugados de corante de argila adequados incluem conjugados de corante de argila selecionados do grupo que consiste em: Azul Básico de montmorilonita B7 I.C. conjugado 42595, Azul Básico de montmorilonita B9 I.C. conjugado 52015, Violeta Básico de montmorilonita V3 I.C. conjugado 42555, Verde Básico de montmorilonita G1 I.C. conjugado 42040, Vermelho Básico de montmorilonita RI I.C. 45160 conjugado, Montmorilonita C.I. conjugado Basic Black 2, Hectorite Basic Blue B7 C.I. 42595 conjugado, Azul Básico de hectorita B9 I.C. 52015 conjugado, Violeta Básico de hectorita V3 I.C. 42555 conjugado, Verde Básico de hectorita G1 I.C. 42040 conjugado, Vermelho Básico de hectorita R1 I.C. 45160 conjugado, Hectorita C.I. Preto Básico 2 conjugado, Azul Básico de Saponita B7 C.I. 42595 conjugado, Azul Básico de saponita B9 I.C. 52015 conjugado, Violeta Básico de saponita V3 I.C. 42555 conjugado, Verde Básico de saponita G1 I.C. 42040 conjugado, Vermelho Básico de saponita R1 I.C. 45160 conjugado, Saponita C.I. Preto Básico 2 conjugado e misturas dos mesmos.

[0254]Os pigmentos adequados incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em flavantrona, indantrona, indantrona clorada contendo de 1 a 4 átomos de cloro, pirantrona, dicloropirantrona, monobromodicloropirantrona, dibromodicioropirantrona, tetrabromopirantrona, diimida de ácido perileno-3,4,9,10tetracarboxílico, sendo que os grupos imida podem ser não substituídos ou substituídos com alquila C1-C3 ou uma fenila ou radical heterocíclico, e sendo que a fenila e os

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107/153 radicais heterociclicos podem, adicionalmente, transportar radicais que não conferem solubilidade em água, amidas de ácido antrapirimidinocarboxilico, violantrona, isoviolantrona, pigmentos à base de dioxazina, ftalocianina de cobre que pode conter até 2 átomos de cloro por molécula, ftalocianina de policloro-cobre ou ftalocianina de polibromocloro-cobre contendo até 14 átomos de bromo por molécula, bem como suas misturas.

[0255]Em outro aspecto, os pigmentos adequados incluem pigmentos selecionados do grupo que consiste em azul ultramarino (Pigmento Azul C.I. 29), Violeta Ultramarino (Pigmento Violeta C.I. 15) e misturas dos mesmos. Builders A composição de limpeza pode, ainda, conter builders, como builders à base de carbonato, bicarbonate ou silicatos, os quais podem ser Zeólitos, como Zeólito A, Zeólito MAP (Máximo Alumínio tipo P) . Os zeólitos, que podem ser usados na lavagem de roupas, de preferência têm a fórmula

Nai2 (AIO2) 12 (S1O2) i2’27H₂O, e o tamanho de partícula geralmente está entre 1 e 10 pm para zeólito A e 0,7 e 2 um para zeólito MAP. Outros builders são metassilicato de sódio (Na₂SiO₃ · nH₂O ou Na₂SÍ2O₅ · n H₂O) , fortemente alcalino e usado, de preferência, na lavagem de louças. Em modalidades preferenciais, a quantidade de um builder detergente pode ser acima de 5%, acima de 10%, acima de 20%, acima de 30%, acima de 40% ou acima de 50%, e pode ser abaixo de 80%, 65%. Em um detergente para a lavagem de louças, o nível de builder é tipicamente 40 a 65%, particularmente 50 a 65% ou mesmo 75 a 90%.

[0256]Encapsulados - A composição pode compreender um encapsulado. Em um aspecto, é apresentado

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108/153 um encapsulado que compreende um núcleo e um envoltório que tem uma superfície interna e uma superfície externa, sendo que o dito envoltório encapsula o dito núcleo.

[0257]Em um aspecto do dito encapsulado, o dito núcleo pode compreender um material selecionado do grupo consistindo em perfumes; abrilhantadores; corantes; repelentes de inseto; silicones; ceras; flavorizantes; vitaminas; agentes amaciantes de tecido; agentes para tratamento de pele, em um aspecto, parafinas; enzimas; agentes antibacterianos; agentes alvejantes; elementos sensoriais; e misturas dos mesmos; e o dito envoltório pode compreender um material selecionado do grupo que consiste em polietilenos; poliamidas; poliestirenos; poliisoprenos; policarbonatos; poliésteres; poliacrilatos; plásticos aminados, em um aspecto, o dito plástico aminado pode compreender poliureia, poliuretano e/ou poliureauretano, em um aspecto, a dita poliureia pode compreender polioximetilenoureia e/ou melaminaformaldeído; poliolefinas; polissacarídeos, em um aspecto, o dito polissacarídeo pode compreender alginato e/ou quitosano; gelatina; goma-laca; resinas epoxídicas; polímeros vinílicos; compostos inorgânicos insolúveis em água; silicone; e misturas dos mesmos.

[0258] Em um aspecto do dito encapsulado, o dito núcleo pode compreender perfume. Esses encapsulados são microcápsulas de perfume.

[0259]Em um aspecto do dito encapsulado, a dita casca pode compreender melamina-formaldeido e/ou melaminaformaldeído reticulado.

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109/153 [0260]Em um aspecto, encapsulados adequados podem compreender um material de núcleo e uma película, em que a dita película circunda pelo menos parcialmente o dito material de núcleo. Pelo menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter uma resistência à fratura de cerca de 0,2 MPa a cerca de 10 MPa, de cerca de 0,4 MPa a cerca de 5 MPa, de cerca de 0,6 MPa a cerca de 3,5 MPa, ou mesmo de cerca de 0,7 MPa a cerca de 3 MPa; e um escoamento do agente de benefício de 0% a cerca de 30%, de 0% a cerca de 20%, ou mesmo de 0% a cerca de 5%.

[0261] Em um aspecto, ao menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter um tamanho de partícula de cerca de 1 micrometro a cerca de 80 micrometros, de cerca de 5 micrometros a 60 micrometros, de cerca de 10 micrometros a cerca de 50 micrometros, ou mesmo de cerca de 15 micrometros a cerca de 40 micrometros.

[0262]Em um aspecto, pelo menos 75%, 85% ou mesmo 90% dos ditos encapsulados podem ter uma espessura de parede de partícula de cerca de 30 nm a cerca de 250 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm, ou mesmo de cerca de 100 nm a cerca de 160 nm.

[0263]Em um aspecto, o dito material nuclear de encapsulados pode compreender um material selecionado do grupo consistindo em uma matéria-prima de perfume e/ou, opcionalmente, um material selecionado do grupo que consiste em óleo vegetal, incluindo óleos vegetais puros e/ou misturados, incluindo óleo de rícino, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de uva, colza, óleo de soja, óleo de milho, óleo de babaçu, óleo de linhaça, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de coco, óleo de

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110/153 caroço de palma, óleo de rícino, óleo de limão e suas misturas; ésteres de óleos vegetais, ésteres, incluindo adipato de dibutila, ftalato de dibutila, adipato de benzila e butila, adipato de benzila e octila, fosfato de tricresila, fosfato de trioctila e suas misturas; hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada, inclusive aqueles hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada que têm um ponto de ebulição maior que cerca de 80 °C; terfenilas parcialmente hidrogenadas, ftalatos de dialquila, alquilbifenilas, incluindo monoisopropilbifenila, naftaleno alquilado, incluindo dipropilnaftaleno, éter de petróleo, incluindo querosene, óleo mineral e suas misturas; solventes aromáticos, incluindo benzeno, tolueno e suas misturas; óleos de silicone; e misturas dos mesmos.

[0264]Em um aspecto, o material de parede dos ditos encapsulados pode compreender uma resina adequada incluindo o produto de reação de um aldeido e uma amina, em que os aldeidos adequados incluem formaldeido. As aminas adequadas incluem melamina, ureia, benzoguanamina, glicolurila, e misturas dos mesmos. As melaminas adequadas incluem metilolmelamina, metilolmelamina metilada, iminomelamina e misturas dos mesmos. As ureias adequadas incluem, dimetilolureia, dimetilolureia metilada, ureiaresorcinol, e misturas dos mesmos.

[0265]Em um aspecto, sequestrantes de formaldeido adequados podem ser utilizados com os encapsulados, por exemplo, em uma pasta aquosa em cápsula e/ou adicionados a um produto destinado ao consumidor antes, durante ou depois que os encapsulados forem adicionados a tal produto destinado ao consumidor.

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111/153 [0266]Cápsulas adequadas podem ser adquiridas junto à Appleton Papers Inc. de Appleton, Wisconsin, EUA.

[0267]Além disso, os materiais para preparação dos encapsulados supracitados podem ser obtidos junto à Solutia Inc. (St Louis, Missouri EUA), Cytec Industries (West Paterson, New Jersey, EUA)), sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri EUA), CP Kelco Corp, of San Diego, Califórnia, EUA; BASF AG de Ludwigshafen, Alemanha; Rhodia Corp, de Cranbury, New Jersey, EUA; Hercules Corp, de Wilmington, Delaware, EUA; Agrium Inc. de Calgary, Alberta, Canadá, ISP de New Jersey, EUA, Akzo Nobel de Chicago, IL, EUA; Stroever Shellac Bremen de Bremen, Alemanha; Dow Chemical Company de Midland, MI, EUA; Bayer AG de Leverkusen, Alemanha; SigmaAldrich Corp., St. Louis, Missouri, EUA.

[0268]Em um aspecto, a composição pode compreender um estabilizante de enzima selecionado a partir do grupo consistindo em (a) sais inorgânicos selecionados a partir do grupo consistindo em sais de cálcio, sais de magnésio e misturas dos mesmos; (b) carboidratos selecionados a partir do grupo consistindo em oligossacarideos, polissacarideos e misturas dos mesmos; (c) inibidores de protease reversíveis eficientes em massa selecionados a partir do grupo consistindo em ácido fenil borônico e derivados dos mesmos; e (d) misturas dos mesmos.

[0269]Em outra modalidade, a composição compreende: (1) inibidores reversíveis de protease, como um composto que contém boro; (2) 1-2 propanodiol; (3) formiato de cálcio e/ou formiato de sódio; e (4) qualquer combinação dos mesmos.

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112/153 [0270]Em um aspecto, a composição pode compreender um estruturante selecionado do grupo consistindo em diglicerideos e triglicerideos, celulose microcristalina de diestearato de etileno glicol, materiais à base de celulose, microfibra de celulose, biopolímeros, goma de xantana, goma gelana, e misturas dos mesmos.

Polímeros [0271]O produto destinado ao consumidor pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose poli(vinilpirrolidona), poli(etilenoglicol), álcool (poli)vinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, e polímeros anfifílicos.

Polímeros de limpeza anfifílicos [0272]De preferência, o polímero de limpeza anfifílico é um composto tendo a seguinte estrutura geral: bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O) n) (CH₃) -N⁺-CxH2x-N⁺- (CH3) -bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O) n) , sendo que n = de 20 a 30, e x = de 3 a 8 ou variantes sulfatadas ou sulfonatadas dos mesmos.

[0273]Os polímeros anfifílicos alcoxilados para limpeza de graxa da presente invenção referem-se a qualquer polímero alcoxilado que tenha propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas equilibradas de modo que removam as partículas de graxa dos tecidos e superfícies. Modalidades específicas dos polímeros anfifílicos alcoxilados para limpeza de graxas\gorduras da presente invenção compreendem uma estrutura de núcleo e uma pluralidade de grupos alcoxilato ligados à estrutura de núcleo. Esses podem compreender

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113/153 polialquilenoiminas alcoxiladas, de preferência, que tenham um bloco interno de poli (óxido de etileno) e um bloco externo de poli(óxido de propileno).

[0274]A estrutura de núcleo pode compreender uma estrutura de polialquileno imina que compreende, sob a forma condensada, unidades de repetição com as fórmulas (I) , (II), (III) e (IV) :

'n—a¹-# (i) /* #—N χ #

(II)

sendo que # em cada caso denota metade de uma ligação entre um átomo de nitrogênio e a posição de ligação livre de um grupo A¹ de duas unidades de repetição adjacentes das fórmulas (I), (II), (III) ou (IV); * em cada caso denota metade de uma ligação a um dos grupos alcoxilato; e A¹ é independentemente selecionado dentre alquileno C2-C6 linear ou ramificado; sendo que a estrutura de polialquileno imina consiste em 1 unidade de repetição de fórmula (I), x unidades de repetição de fórmula (II), y unidades de repetição de fórmula (III) e y+1 unidades de repetição de fórmula (IV), sendo que x e y em cada caso têm um valor na faixa de 0 a cerca de 150; em que o peso molecular médio de peso médio, Pm, da estrutura de núcleo de polialquileno imina é um valor na faixa de cerca de 60 a cerca de 10.000 g/mol.

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114/153 [0275]A estrutura de núcleo pode compreender, alternativamente, uma estrutura de polialcanolamina dos produtos de condensação de ao menos um composto selecionado a partir de N-(hidróxi alquila)aminas com as seguintes fórmulas (I.a) e/ou (I.b),

A

OH

R⁵

R⁵ (l-b) sendo que A é independentemente selecionado a partir de alquileno Ci-C₆; R¹, R¹*, R², R²*, R³, R³*, R⁴, R⁴*, R⁵ e R⁵* são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila, cicloalquila ou arila, sendo que os três últimos radicais mencionados podem ser opcionalmente substituídos; e R⁶ é selecionado a partir de hidrogênio, alquila, cicloalquila ou arila, sendo que os três últimos radicais mencionados podem ser opcionalmente substituídos.

[0276]A pluralidade de grupos oxialquileno fixados à estrutura de núcleo são independentemente selecionados a partir de unidades oxialquileno com a seguinte fórmula (V) •+^Α-^οΈύ°^ΗΓ0Η_Γο-^Α-ο]_;-η (V)

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115/153 sendo que * em cada caso denota metade de uma ligação de um átomo de nitrogênio da unidade de repetição o com as seguintes formulas (I), (II) ou (IV); A e, em cada caso, independentemente selecionado a partir de 1,2o propileno, 1,2-butileno e 1,2-isobutileno; A e um 1,2propileno; R é em cada caso independentemente selecionado a partir de hidrogênio e alquila C1-C4; m tem um valor médio na faixa de 0 a cerca de 2; n tem um valor médio na faixa de cerca de 20 a cerca de 50; e p tem um valor médio na faixa de cerca de 10 a cerca de 50.

[0277]Modalidades especificas dos polímeros alcoxilados anfifílicos para limpeza de graxa podem ser selecionados a partir de polialquileno iminas alcoxiladas que têm um bloco de óxido de polietileno interno e um bloco de óxido de polipropileno externo, o grau de etoxilação e o grau de propoxilação não ficando acima ou abaixo de valores limitadores específicos. As modalidades específicas das polialquileno iminas alcoxiladas, de acordo com a presente invenção, têm uma razão mínima de blocos de polietileno para blocos de polipropileno (n/p) de cerca de 0,6 e um máximo de cerca de l,5(x+2y+l) . Descobriu-se que as polialquileno iminas alcoxiladas com uma razão n/p de cerca de 0,8 a cerca de l,2(x+2y+l) tem propriedades especialmente beneficas.

[0278]As polialquileno iminas alcoxiladas, de acordo com a presente invenção, têm uma cadeia principal consistindo em átomos de nitrogênio de aminas primária, secundária e terciária que são fixadas uma à outra por radicais alquileno A e são dispostas aleatoriamente. Porções de amina primária que iniciam ou finalizam a cadeia principal e as cadeias laterais da cadeia principal de

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116/153 polialquileno imina e cujos átomos de hidrogênio remanescentes são subsequentemente substituídos por unidades de oxialquileno, são denominadas unidades de repetição com a fórmula (I) ou (IV), respectivamente. Porções de amina secundária cujos átomos de hidrogênio remanescentes são subsequentemente substituídos por unidades oxialquileno são denominadas unidades de repetição de fórmula (II). Porções de amina terciária que apresentam ramificação na cadeia principal e nas cadeias laterais são denominadas unidades de repetição de fórmula (III) .

[0279]Visto que pode ocorrer ciclização na formação da cadeia principal de polialquileno imina, é possível também que porções de amina cíclica estejam presentes em pequena quantidade na cadeia principal. Tais polialquileno iminas que contêm porções de amina cíclica são com certeza alcoxiladas, da mesma forma que aquelas consistindo em porções de amina não cíclica primária e porções de amina secundária.

[0280]A cadeia principal de polialquileno imina consistindo em átomos de nitrogênio e em grupos A¹, tem um peso molecular médio PM de cerca de 60 a cerca de

10.000	g/mol, de preferência, de t	serca de 100	a cerca de
8.000	g/mol e, com mais	preferência	, de cerca de	500	a cerca
de 6.000 g/mol.
	[0281]A soma	(x+2y+l)	corresponde	ao	número
total	de unidades de	alquileno	imina presentes	em uma

cadeia principal de polialquileno imina individual e, dessa forma, está diretamente relacionada ao peso molecular da cadeia principal de polialquileno imina. Os valores fornecidos no relatório descritivo, entretanto, se

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117/153 referem ao número médio de todas as polialquileno iminas

presentes	na mistura. A soma	(x+2y+2)	corresponde	ao
número total de grupos amina	presentes	em uma cadeia
principal	de polialquileno imina individual	•
	[0282]Os radicais A¹	que ligam	os átomos	de
nitrogênio	do grupo amino	podem ser	idênticos	ou
diferentes	, radicais C₂-C₆-	alquileno	lineares	ou

ramificados, como 1,2-etileno, 1,2-prolileno, 1,2-butileno, 1,2-isobutileno,1,2-pentanedi-il, 1,2-hexanedi-il ou hexametileno. Um alquileno ramificado preferencial é 1,2propileno. As alquilas lineares preferenciais são etileno e hexametileno. Um alquileno mais preferencial é 1,2-etileno.

[0283]Os átomos de hidrogênio dos grupos amina primária e secundária da cadeia principal de polialquileno imina são substituídos por unidades de oxialquileno de fórmula (V).

•+^A-°4^^CHrCH_rO-^A-o]_;-R (V) [0284]Nesta fórmula, as variáveis têm, de preferência, um dos significados fornecidos abaixo:

o [0285]A em cada caso e selecionado a partir de 1,2-propileno, 1,2-butileno e 1,2-isobutileno; de preferencia, A e 1,2-propileno. A e um 1,2-propileno; R em cada caso é selecionado dentre hidrogênio e alquila C1-C4, como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila e terc-butila; de preferência, R é hidrogênio. O índice m em cada caso tem um valor de 0 a cerca de 2; de

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118/153 preferência, m é 0 ou aproximadamente 1; mais preferencialmente m é 0. O índice n tem um valor médio na faixa de cerca de 20 a cerca de 50, de preferência, na faixa de cerca de 22 a cerca de 40, e com mais preferência na faixa de cerca de 24 a cerca de 30. O índice n tem um valor médio na faixa de cerca de 10 a cerca de 50, de preferência, na faixa de cerca de 11 a cerca de 40, e com mais preferência na faixa de cerca de 12 a cerca de 30.

[0286]De preferência, a unidade oxialquileno de fórmula (V) é uma sequência não aleatória de blocos alcoxilato. Por sequência não aleatória entende-se que [-A-O-]_m e adicionado primeiro (isto e, mais perto da ligação ao átomo de nitrogênio da unidade de repetição da fórmula (I), (II) ou (III)), [-CH₂-CH₂-O-] _n é adicionado em o segundo lugar, e [-A-O-]_p e adicionado em terceiro lugar. Esta orientação dá à polialquileno imina alcoxilada um bloco de óxido de polietileno interno e um bloco de óxido de polipropileno externo.

[0287]A parte substancial destas unidades de oxialquileno das fórmulas (V) é formada pelas unidades de oxietileno -[CH₂-CH₂-O) ] _n- e unidades de oxipropileno -[CH₂CH₂ (CH₃) -O] _p-. As unidades de oxialquileno podem ter, adicionalmente, uma pequena proporção de unidades de oxipropileno ou oxibutileno -[A-O]_m-, isto e, a cadeia principal de polialquileno imina saturada com átomos de hidrogênio pode reagir inicialmente com pequenas quantidades de até cerca de 2 mols, especialmente de cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mol, em particular, de cerca de 0,8 a cerca de 1,2 mol de óxido de propileno ou óxido de

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119/153 butileno por mol de porções de NH presentes, isto é, alcoxilada, de forma incipiente.

[0288]Esta modificação inicial da cadeia principal de polialquileno imina permite, se necessário, que a viscosidade da mistura de reação na alcoxilação seja reduzida. Entretanto, geralmente, a modificação não influencia nas propriedades de desempenho da polialquileno imina alcoxilada e, portanto, não constitui uma medida preferencial.

[0289]Os polímeros anfifílicos alcoxilados para limpeza de graxa estão presentes nos produtos para tratamento de tecidos e cuidados domésticos incluindo, mas não se limitando a, detergentes da presente invenção em teores na faixa de cerca de 0,05% a 10%, em peso, do produto para tratamento de tecidos e cuidados domésticos. As modalidades dos produtos para tratamento de tecidos e cuidados domésticos podem compreender de cerca de 0,1% a cerca de 5%, em peso. Mais especificamente, as modalidades podem compreender de cerca de 0,25 a cerca de 2,5% do polímero para limpeza de graxas.

[0290]Polímero de carboxilato - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem, também, incluir um ou mais polímeros de carboxilato, como um copolímero aleatório de maleato/acrilato ou um homopolímero de poliacrilato. Em um aspecto, o polímero de carboxilato é um homopolímero de poliacrilato que tem um peso molecular de 4.000 Da a 9.000 Da ou de 6.000 Da a 9.000 Da.

[0291]Polímero para liberação de sujeiras - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem, também, incluir um ou mais polímeros para liberação

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120/153 de sujeira que têm uma estrutura conforme definida por uma das seguintes estruturas (I), (II) ou (III):

(I) - [ (OCHR¹-CHR²) _a-O-OC-Ar-CO-] _d (II) - [ (OCHR³-CHR⁴) _b-O-OC-sAr-CO-] _e (III) - [ (OCHR⁵-CHR⁶) C-OR⁷] f sendo que:

a, b e c são de 1 a 200;

d, e e f são de 1 a 50;

Ar é um fenileno 1,4-substituído;

sAr é fenileno 1,3-substituído, substituído na posição 5 com SO₃Me;

	Me é Li,	K, Mg/2, Ca/2, Al/3,	amônio, mono,	di-,
tri- ou	tetra-alquilamônio sendo que os	grupos alquila	são
alquila	01“ 018 ou	hidroxialquila C2-C10,	ou misturas	dos
me smo s;

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ e R⁶ são, independentemente, selecionados de H ou n- ou iso-alquila Ci-Cis; e

R⁷ é uma alquila Ci-Cis linear ou ramificada, ou uma alquenila C2-C30 linear ou ramificada, ou um grupo cicloalquila com 5 a 9 átomos de carbono, ou um grupo arila C₈-C₃o ou um grupo arilalquila C₆-C₃o.

[0292]Os polímeros para liberação de sujeiras adequados são polímeros para a liberação de sujeiras à base de poliéster como polímeros Repel-o-tex, incluindo Repel-otex SF, SF-2 e SRP6 fornecidos por Rhodia. Outros polímeros soltadores de sujeiras adequados incluem polímeros Texcare, incluindo Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 e SRN325 fornecidos por Clariant. Outros polímeros soltadores de sujeiras adequados são polímeros Marloquest, como Marloquest SL fornecido pela Sasol.

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121/153 [0293]Polímero celulósico - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção também podem incluir um ou mais polímeros celulósicos inclusive aqueles selecionados dentre alquilcelulose, alquilalcoxialquilcelulose, carboxialquilcelulose, alquilcarboxialquilcelulose. Em um aspecto, os polímeros celulósicos são selecionados do grupo que compreende carboximetilcelulose, metilcelulose, metilhidroxietilcelulose, metilcarboximetilcelulose, e misturas do mesmo. Em um aspecto, a carboximetilcelulose tem um grau de substituição de carboximetila de 0,5 a 0,9 e um peso molecular de 100.000 Da a 300.000 Da.

[0294]O detergente pode conter um sistema de alvejamento, o qual pode compreender uma fonte de H2O2, como perborato ou percarbonato, que pode ser combinado com um ativador de alvejante formador de perácido, como tetraacetil etilenodiamina ou nonanoil oxibenzeno sulfonato. Por outro lado, o sistema de alvejamento pode compreender peroxiácidos de, por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona. Em geral, quando um agente de alvejamento é usado, as composições da presente invenção podem compreender de cerca de 0,1% a cerca de 50% ou mesmo de cerca de 0,1 % a cerca de 25% de agente de alvejamento, em peso, da composição de limpeza em questão.

[0295]Agentes quelantes - Os produtos destinados ao consumidor da presente invenção podem conter um agente quelante. Os agentes quelantes adequados incluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês, e suas combinações. Quando é usado um agente quelante, o produto destinado ao consumidor em questão pode compreender de

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122/153 cerca de 0,005% a cerca de 15% ou mesmo de cerca de 3,0% a cerca de 10%, em peso de agente quelante do produto destinado ao consumidor em questão. Os quelantes adequados incluem DTPA (ácido dietilenotriamino penta-acético), HEDP (ácido hidroxietano difosfônico), DTPMP (ácido dietilenotriamino penta(metilenofosfônico)), sal dissódico hidratado de ácido 1,2-di-hidróxi benzeno-3,5-dissulfônico, etilenodiamina, dietilenotriamina, ácido etilenodiamino dissuccinico (EDDS), ácido N-hidroxietil etilenodiamino triacético (HEDTA), ácido trietilenotetramino-hexa-acético (TTHA), ácido N-hidroxietil iminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilenodiamino tetrapropiônico (EDTP) e derivados dos mesmos.

[0296]As variantes de enzima do invenção podem ser estabilizadas com o uso de agentes estabilizantes convencionais, e/ou inibidores de protease, por exemplo, um poliol como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, sais, como cloreto de sódio e cloreto de potássio, ácido láctico, ácido fórmico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenila borônico, como ácido 4-formilfenil borônico, ou um aldeido de peptideo, como aldeidos de di-, tri- ou tetrapeptideo ou análogos de aldeido (ou de forma B1-B0-R em que R é H, CH3, CX3, CHX2, ou CH2X (X=halogênio) , B0 é um resíduo de aminoácido único (de preferência com uma cadeia lateral aromática ou alifática opcionalmente substituída); e BI consiste em um ou mais resíduos de aminoácido (de preferência um, dois ou três), que compreende opcionalmente um grupo de proteção amino-terminal ou, conforme descrito, em WO09118375,

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WO98/13459) ou um inibidor de protease do tipo de proteína, como RASI, BASI, WASI (inibidores de alfaamilases/subtilisina bifuncionais de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI. Em algumas modalidades, as enzimas empregadas no presente documento são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições terminadas que fornecem tais íons às enzimas, assim como outros íons metálicos (por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II), e oxovanádio (IV)).

[0297]A composição também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais, como, por exemplo, condicionadores de tecido, incluindo argilas, acentuadores de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes de redeposição antissujeira, corantes, bactericidas, alvejantes ópticos, hidrótropos, inibidores de deslustre, solventes de orgânico, como etanol ou perfumes. Ademais, o detergente podería conter um pré-alvejador ou um intensificador, que é adicionado à lavagem para aumentar o nível de limpeza geral, sendo que alguns desses aditivos também podem ser usados como um agente pretratamento aplicado ao tecido antes da etapa de lavagem.

[0298]Contempla-se no momento que, nas composições detergentes, qualquer enzima, em particular a enzima essencial à presente invenção, podem ser acrescentadas em uma quantidade correspondente a 0,001 a 100 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavagem, de preferência 0,005 a 5 mg de proteína enzimática por litro de líquido de

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124/153 lavagem, com mais preferência 0,01 a 1 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavagem e, em particular, 0,1 a 1 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavagem. Entretanto, as composições da presente invenção compreendem pelo menos 0,0001 a cerca de 0,1% por cento, em peso, de proteína enzimática pura, como de cerca de 0,0001% a cerca de 0,01%, de cerca de 0,001% a cerca de 0,01% ou de cerca de 0,001% a cerca de 0,01%. Entretanto, quando se usa uma enzima formulada, a composição detergente compreende de cerca de 0,02% a cerca de 20% por cento, em peso, como ou de cerca de 0,05% a cerca de 15% em peso, ou de cerca de 0,05 a cerca de 20 %, ou de cerca de 0, 05% a cerca de 5 %, ou de cerca de 0,05 % a cerca de 3 %.

[0299]As variantes de alfa-amilases úteis na presente invenção podem, adicionalmente, ser incorporadas nas formulações detergentes apresentadas em WO 97/07202, que é aqui incorporada a título de referência.

[0300]A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta, um gel ou um líquido. A composição pode ser um agente de lavagem para tarefas pesadas sob a forma de pó para múltiplas finalidades, sob a forma de pasta para múltiplas finalidades, um tipo líquido para tarefas pesadas, um líquido para tecidos finos, um agente para lavagem de louças à mão, um agente para lavagem de louças para tarefas leves, um tipo de alta espumação, um agente para lavagem de louças a máquina, um tablete variado, um granulado para lavagem de louças, um líquido para lavagem de louças ou um tipo de auxílio ao enxágue. A composição também pode ser em

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125/153 embalagens de dose unitária, inclusive aquelas conhecidas na técnica e aquelas que são solúveis em água, insolúveis em água e/ou permeáveis à água. Um detergente líquido pode ser aquoso, que contém tipicamente até 70 % de água e 0 a 30 % de solvente orgânico, ou não aquoso ou uma solução que contém mais que 0,5 g/1 da composição detergente.

[0301]A composição da invenção pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente de lavagem de roupas à máquina ou à mão, incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupas adequada para o pretratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecidos adicionada ao enxágue, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfície rígida de casa geral, ou ser formulada para operações de lavagem de louças à máquina ou à mão. O detergente pode ser um pó, ou forma granulada, ou pode estar na forma de líquido, gel ou pasta ou na forma de um produto de dose unitária, como um tablete ou saco de contenção, incluindo bolsas de múltiplos compartimentos, ou o detergente pode estar na forma de uma folha.

Exemplos

Ensaio pNP-G7 para determinação da atividade de alfa-amilase [0302]A atividade de alfa-amilase pode ser determinada por um método que emprega o substrato G7-pNP. G7-pNP, que é uma abreviação para 4,6-etilideno(G7)-pnitrofenil (Gi)-a, D-malto heptaosídeo, é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase, como uma alfa-amilase. Em seguida à divagem, a alfa-glicosidase incluída no kit digere adicionalmente o substrato

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126/153 hidrolisado para liberar uma molécula de PNP livre, que tem uma cor amarelada e, portanto, pode ser medida por espectrofotometria no visível a λ = 405 nm (400 a 420 nm) . Kits contendo substrato de G7-pNP e alfa-glicosidase são fabricados pela Roche/Hitachi (cat. n° 11876473).

Reagentes:

[0303]O substrato G7-pNP deste kit contém 4,6etilideno- G7-pNP 22 mM e HEPES (2-[4-(2-hidróxi etila)-1piperazinila]-ácido etano sulfônico) 52,4 mM, pH 7,0).

[0304]O reagente de alfa-glicosidase contém 52,4 mM de HEPES, 87 mM de NaCl, 12,6 mM de MgCl₂, 0, 075 mM de CaC12, 1 4 kU/L de alfa-glicosidase).

[0305]A solução de trabalho do substrato é fabricada pela mistura de 1 ml do reagente alfa-glicosidase com 0,2 ml do substrato G7-PNP. Essa solução de trabalho do substrato é feita imediatamente antes do uso.

[0306] Tampão de diluição: 50 mM de MOPS, 0,05% (peso/volume) de Triton X100 (polietileno glicol p(1, 1,3,3-tetrametil butil)-fenil éter (C14H22O (C2H4O) _n (n = 9-10))), 1 mM de CaC12, pH 8,0.

Procedimento:

[0307]A amostra de amilase a ser analisada foi diluída em um tampão de diluição para assegurar que o pH na amostra diluída seja 7. O ensaio foi realizado pela transferência de amostras de enzimas de 20 μΐ diluídas em uma placa de microtitulação de 96 poços e pela adição de 80 μΐ de solução de trabalho com substrato. A solução foi misturada e pré-incubada 1 minuto à temperatura ambiente e a absorção é medida a cada 20 segundos por 5 minutos a OD de 405 nm.

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127/153 [0308]0 coeficiente angular (absorbância por minuto) da curva de absorção dependente de tempo é diretamente proporcional à atividade especifica (atividade por mg de enzima) da alfa-amilase em questão sob o dado conjunto de condições. A amostra de amilase deveria ser diluída a um nível sendo que o coeficiente angular está abaixo de 0,4 de unidades de absorbância por minuto.

Teste de esforço mecânico automático (TEMA) para lavanderia [0309]Para avaliar o desempenho de lavagem em experimentos de lavanderia são realizados, com o uso do Teste de esforço mecânico automático (TEMA). Com o TEMA, o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções enzima-detergente de pequeno volume pode ser examinado. A placa TEMA tem inúmeras fendas para testar soluções e uma tampa firmemente apertadas na amostra de lavanderia, para o produto têxtil ser lavado contra as aberturas das fendas. Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, os materiais têxteis e a tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o tecido e aplicar esforço mecânico de maneira regular, periódica, oscilante. Para uma descrição adicional consulte W002/42740, especialmente o parágrafo Modalidades de métodos especiais nas páginas 23 a 24.

Descrição do desempenho de lavagem geral [0310]É preparada uma solução de teste que compreende água (10°dH), detergente, por exemplo, 5,1 g/L detergente líquido Europeu conforme descrito abaixo e a enzima da invenção, por exemplo, em concentração de 0, 0,8 e/ou 1,2 mg de proteína enzimática/L. Tecidos manchados com

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128/153 amido (por exemplo, CS-28 disponível junto à Center For Testmaterials BV, Caixa Postal 120, 3133 KT, Vlaardingen, Holanda) são adicionados e lavados durante 20 minutos a 20°C. Após o enxágue intenso sob água da torneira corrente e secagem no escuro, os valores de intensidade de luz ou de reflectância dos tecidos manchados são subsequentemente medidos como uma medida para o desempenho de lavagem. O teste com 0 mg de proteína enzimática/1 é usado como um bloco bruto para obter um valor de remissão delta. De preferência, ação mecânica é aplicada durante a etapa de lavagem, por exemplo, na forma de sacudimento, rotação ou agitação da solução de lavagem com os tecidos.

[0311]Os experimentos de desempenho de lavagem da TEMA foram conduzidos sob as condições experimentais especificadas abaixo:

Tabela 1: Condições experimentais de TEMA

Dosagem de detergente liquido para lavanderia	5,7 g/L modelo de detergente líquido europeu (EU) (cf. Exemplo IA) ou 0,8 g/L modelo de detergente líquido norte-americano (US) (cf. Exemplo 1B)
Volume da solução de teste	160 micro L
pH	no estado
Tempo de lavagem	20 minutos
Temperatura	20°C
Dureza da água	10°dH, Ca²⁺:Mg²⁺: HCO₃~ = 3:1:6
Concentração de enzimas na solução de teste	0,8 e 1,2 Mg/L
Material de Teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

[0312]Tampão de diluição de Amilase: A amilase foi diluída em água ultrapura (água MilliQ) com uma pequena concentração de cálcio (0,1 mM) para estabilizar a amilase durante o armazenamento e com 0,01 % de Triton X100 para reduzir o risco de adsorção da proteína enzimática para recipientes e pipetas.

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129/153 [0313]A dureza da água foi ajustada para 10°dH mediante a adição de CaCÍ2, MgCÍ2, e NaHCOs (Ca²⁺:Mg²⁺: HCO3- = 3:1:4,5) ao sistema de teste. Após a lavagem, os produtos têxteis foram enxaguados em água da rede pública e secos.

[0314]0 desempenho de lavagem é medido como a brilho da cor do material têxtil lavado. O brilho também pode ser expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[ 0315]Medições de cor são feitas com um escâner de base plana profissional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brondby, Dinamarca), que é usado para captura de uma imagem do material têxtil lavado.

[0316]Para extrair um valor para a intensidade de luz a partir das imagens escaneadas, valores de pixel em 24 bits provenientes da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB - Red, Green, Blue). 0 valor da intensidade (Int) é calculado mediante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o comprimento do vetor resultante:

Int =ylr² + g² + b² [0317]Os resultados do teste de lavagem TEMA para diferentes variantes são mostrados nas Tabelas 1 e 2. No resultado o índice é 100. O resultado do desempenho da alfa-amilase original é atribuído ao valor de 100 e os resultados das variantes são comparados a esse valor.

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Desempenho de lavagem TOM [0318]A dureza da água foi ajustada até a intensidade descrita abaixo, mediante a adição de CaCÍ2, MgCÍ2 e NAHCO3. Foram preparadas soluções de lavagem com a quantidade de detergente desejada, temperatura e dureza da água em um balde, conforme descrito abaixo. O detergente foi dissolvido durante 10 minutos sob agitação por magneto (a solução de lavagem foi usada dentro de 30 a 60 min após o preparo).

[0319]A temperatura e a rotação (rpm) no banho de água no Terg-O-toMeter foram ajustadas de acordo com as configurações abaixo, na Tabela 2. Quando a temperatura foi ajustada de acordo com as configurações (tolerância é +/- 0,5°C) a solução de lavagem foi adicionada ao béquer TOM de acordo com a quantidade descrita abaixo.

[0320]A agitação no béquer estava em 200 rpm. Duas amostras de amido de arroz feitas à mão (HM CS-28), duas amostras de amido de tapioca feitas à mão (HM CS-29) e lastro foram adicionados a cada um dos béqueres, e a lavagem foi executada de acordo com o tempo declarado abaixo. As amostras foram enxaguadas em água fria da rede pública durante 5 minutos e colocadas em uma bolsa de lavanderia e enxaguadas em máquina de lavar (AEG ÕKO LAVAMAT 86820) no programa STIVN. As amostras foram classificadas e deixadas secar entre papel filtro, em um armário de secagem sem calor, de um dia para o outro.

[0321]As amostras de produto têxtil HM CS-28 (amido de arroz em algodão, 5x5 cm, amido aplicado em circulo de 2,5 cm de diâmetro), HM CS-29 (amido de tapioca em algodão, 5x5 cm, amido aplicado em circulo de 2,5 cm de

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131/153 diâmetro) e HM CS-2 6 (amido de milho em algodão, 5x5 cm, amido aplicado em círculo de 2,5 cm de diâmetro) foram obtidas junto à Center for Test Materials BV, Caixa Postal 120, 3133 KT Vlaardingen, Paises-Baixos.

[0322]A malha de algodão branca foi usada como lastro e foi obtida junto à Warwick Equest Ltd, Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham, DH8 6BN, Reino Unido.

Tabela 2: Condições experimentais

	Condições europeias com uso do modelo de detergente WE SUD	Condições europeias com uso do modelo de detergente WE HDL
Dosagem de detergente	1,87 g/L	5,30 g/L
Concentração de enzimas na solução de lavagem	0,065 mg de proteína enzimática/L	0,2 mg de proteína enzimática/L
Dureza da água	20,6°dH (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 4:1:7,5)
Volume da solução de teste	1.000 ml
Tempo de lavagem	5 a 15 minutos, de preferência 15 minutos
Rotação	200 rpm
pH	no estado
TEMPERATURA	15 a 40°C, de preferência 15°C

Detergentes e materiais de teste foram os seguintes:

Detergente líquido para lavanderia	Condições europeias (WE): WE SUD, conforme descrito no Exemplo 2A, abaixo, e modelo de detergente WE HDL, conforme descrito no Exemplo 2B, abaixo (Detergente K)
Material de Teste	HM CS-28 (amido de arroz em algodão, amostra de 5x5 cm com amido aplicado em um círculo com 2,5 cm de diâmetro), HM CS-29 (amido de tapioca em algodão, amostra de 5x5 cm com amido aplicado em um círculo com 2,5 cm de diâmetro).
Lastro	Malha de algodão branca em tamanho de 5x5 cm adicionada até um peso total de 40 g (40 g incluindo todas as amostras, isto é, lastro e material de teste).

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132/153 [0323]0 desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor do material têxtil lavado, expressa em valores de remissão (REM). Medidas de remissão foram feitas com o uso de um espectrofotômetro Macbeth 7000 Color Eye. Cada uma das amostras secas foi medida. Como há risco de interferência proveniente do plano de fundo, as amostras foram colocadas sobre 2 camadas de tecido durante a medição da remissão. A remissão foi medida a 460 nm. O filtro UV não foi incluído. Um resultado médio da remissão para as amostras foi calculado.

[0324]O desempenho de lavagem das diferentes variantes é mostrado na Tabela 5 como fator de aprimoramento (IF), e é calculado conforme mostrado abaixo:

IF

REMva riante

REMc_ontrole

REM_En zima de referência -REMcontrole

Exemplo 1

Desempenho de lavagem de alfa-amilases com o uso de teste de esforço mecânico automático [0325]A fim de avaliar o desempenho de lavagem das alfa-amilases em uma composição base de detergente, podem ser realizados experimentos de lavagem com o uso do teste de esforço mecânico automático (TEMA) . Com o teste TEMA, podese examinar o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções enzimáticas detergentes em pequenos volumes. A placa de TEMA tem um certo número de fendas para soluções de teste, e uma tampa que comprime firmemente a amostra de produto têxtil a ser lavada contra as aberturas em fenda.

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Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, os materiais têxteis e a tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o tecido e aplicar esforço mecânico de maneira regular, periódica, oscilante. Para uma descrição adicional, consulte o documento WO 02/42740, especialmente o parágrafo Modalidades de métodos especiais na página 23 a 24.

Descrição do desempenho de lavagem geral [0326]É preparada uma solução de teste compreendendo água (6°dH ou 15°dH), 0,79 g/L de detergente, por exemplo, o modelo de detergente J conforme descrito abaixo, e a enzima da invenção em uma concentração de 0 ou 0,2 mg de proteína enzimática/L. Os tecidos manchados com amido (CS-28, disponível junto à Center For Test materials BV, Caixa Postal 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países-Baixos) são adicionados e lavados durante 10 minutos a 20°C e 40°C ou, alternativamente, durante 10 minutes a 20°C e 30°C, conforme especificado nos exemplos. Após enxágue cuidadoso sob água corrente da rede pública e secagem no escuro, os valores de intensidade de luz dos tecidos manchados são subsequentemente medidos como uma medida para o desempenho de lavagem. O teste com 0 mg de proteína enzimática/L é usado como um controle, e corresponde à contribuição do detergente. De preferência, ação mecânica é aplicada durante a etapa de lavagem, por exemplo, na forma de sacudimento, rotação ou agitação da solução de lavagem com os tecidos. Os experimentos de desempenho de lavagem TEMA podem ser conduzidos sob as condições experimentais especificadas abaixo:

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Tabela A: Condição experimental

Detergente	Modelo de detergente líquido J (consulte a Tabela B)
Dosagem de detergente	0,79 g/L
Volume da solução de teste	160 micro L
pH	tal como é
Tempo de lavagem	10 minutos
Temperatura	20°C ou 30°C
Dureza da água	6°dH
Concentração de enzimas no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L e 0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de Teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

Tabela B: Modelo de detergente J

Composto	Teor de composto	% de componente ativo
(% p/p)	(% p/p)
LAS	5,15	5,00
AS	5,00	4,50
AEOS	14,18	10,00
Ácido graxo de coco	1,00	1,00
AEO	5,00	5,00
MEA	0,30	0,30
MPG	3,00	3,00
Etanol	1,50	1,35
DTPA (como sal de Na5)	0,25	0,10
Citrato de sódio	4,00	4,00
Formato de sódio	1,00	1,00
Hidróxido de sódio	0,66	0,66
H₂O, com troca iônica	58,95	58,95

[0327]A dureza da água foi ajustada para 6°dH por meio da adição de CaCl₂, MgCl₂ e NaHCO₃ (Ca²⁺ :Mg²⁺: HCO³~ = 2:1:4,5) ao sistema de teste. Após a lavagem, os produtos têxteis foram limpos em água da torneira e secos no escuro.

Tabela C: Condição experimental

Detergente	Modelo de detergente líquido A
(consulte a Tabela	D)
Dosagem de detergente	3,33 g/L
Volume da solução de teste	160 micro L
pH	tal como é

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Tempo de lavagem	10 minutos
TEMPERATURA	20 °C ou 40 °C
Teor de dureza da água	15°dH
Concentração de enzimas no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L, 0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de Teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

Tabela D: Modelo de detergente A

Composto	Teor de composto	% de componente ativo
(% p/p)	(% p/p)
LAS	12,00	11,60
AEOS, SLES	17,63	4,90
Ácido graxo de soja	2,75	2,48
Ácido graxo de coco	2,75	2,80
AEO	11,00	11,00
Hidróxido de sódio	1,75	1,80
Etanol / Propan-2-ol	3,00	2,70/0,30
MPG	6, 00	6, 00
Glicerol	1,71	1,70
TEA	3,33	3,30
Formato de sódio	1,00	1,00
Citrato de sódio	2,00	2,00
DTMPA	0,48	0,20
PCA	0,46	0,18
Fenoxietanol	0,50	0,50
H₂O, com troca iônica	33,64	33,64

[0328]A dureza da água foi ajustada para 15 °dH por meio da adição de CaCÍ2, MgCÍ2, e NaHCCh (Ca²⁺:Mg²⁺: HCO³~ = 4:1:7,5) ao sistema de teste.

[0329]Após a lavagem, os produtos têxteis foram enxaguados em água da rede pública e secos.

Tabela E: Condição experimental

Detergente	Composição detergente K
Dosagem de detergente	5,3 g/L
Volume da solução de teste	160 micro L
pH	tal como é
Tempo de lavagem	10 minutos
TEMPERATURA	20 °C ou 40 °C
Teor de dureza da água	15°dH
Concentração de enzimas no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L,

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	0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de Teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

Tabela F: Detergente K

Composto	Teor do composto (% em
peso do ativo)
Alquil benzeno sulfonato de sódio	8,7
Alquil etóxi-3sulfato de sódio	1,0
C12-18 alquil 1,5-7etoxilato	5,3
Ácido cítrico	3,1
Clareador óptico	0,05
Poli(glicol propilênico)	1,1
Quelante fosfonatado	0,5
Secundários (corantes, perfumes, enzimas, estabilizantes de enzima, solventes, estruturantes, polímeros) e água	até 100%

[0330]A dureza da água foi ajustada para 15°dH por meio da adição de CaC12, MgC12, e NaHCOs (Ca²⁺:Mg²⁺: HCO³~ =

4:1:7,5) ao sistema de teste.

[0331]Após a lavagem, os produtos têxteis foram enxaguados em água da rede pública [0332]0 desempenho de lavagem é medido como o brilho expresso sob a forma de intensidade da luz refletida a partir da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa que aquela de uma amostra limpa. Portanto a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

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137/153 [0333]As medições de cor são feitas com um scanner de base plana profissional (EPSON Expression 10000XL, EPSON) usado para capturar uma imagem do material têxtil lavado.

[0334]Para extrair um valor para a intensidade de luz a partir das imagens escaneadas, valores de pixel em cores de 48-^24 bits provenientes da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor da intensidade (Int) é calculado mediante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o comprimento do vetor resultante:

Int =.jr² + g²+b² [0335]O desempenho de lavagem das variantes de acordo com a invenção é mostrado nas tabelas abaixo. A Tabela 3 mostra os resultados obtidos a partir do experimento acessando o desempenho de lavagem em modelos de detergente A (Tabela D) e J (Tabela B) em diferentes concentrações (0,05 mg de enzima/L de detergente e 0,2 mg de enzima/L de detergente), e sob diferentes temperaturas (20°C e 40°C) . A Tabela 4 mostra os resultados obtidos a partir do experimento acessando o desempenho de lavagem no detergente K (Tabela F) em diferentes concentrações (0,05 mg de enzima/L de detergente e 0,2 mg de enzima/L de detergente), e sob diferentes temperaturas (20°C e 40°C).

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Tabela 3: Resultados do desempenho de lavagem em modelos de detergente

Mutações	0,05 mg/L-A-20C	0,2 mg/L-A-20C	0,05 mg/L-A-40C	0,2 mg/L-A-40C	0,05 mg/L-J-20C	0,2 mg/L-J-20C	0,05 mg/L-J-30C	0,2 mg/L-J-30C
Referência - SEQ ID NO: 2	1, 0	1, o	1, 0	1, o	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0
SEQ ID NO: 2+ H1* +G7A+Gl0 9A+N2 8 0 S +W2 8 4 H+K3 2 0A+M3 2 3N+E 391A	4,7	1,5	2,3	1,1	2,7	1,1	3,5	1,5
SEQ ID NO: 2+ G7A+W284H+K320A+M323N	4,7	1,4	1, θ	1, 0	3, 0	1,1	2,0	1,2
SEQ ID NO: 2+ G7A+K320A+M323N	4,3	1, 6	2,0	1, 0	2,0	1,1	2,0	1,2
SEQ ID NO: 2+ K320A	4,7	1,3	2,3	1, 0	3,7	1, 0	4,5	1,5
SEQ ID NO: 2+ G7A+K320A	4,3	1,4	2,3	1,1	3,3	1,1	2,5	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A	1,7	1,2	1,3	1,3	1,5	1,3	1,1	1,4
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+W284H+E391A	2,3	1,7	2,8	1,4	5, 0	2,0	5,5	1, θ
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+E391A	0, 8	1, o	1, o	1,1	1, o	1,1	1,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+M323S+E391A	1,3	1, 9	1,5	1,3	1,5	1,5	1, 6	1, 6
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A	1,5	1,2	1,3	1,2	1,2	1,1	1,7	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A	1,3	1,3	1,5	1,1	1, o	1, o	1,2	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A	1,4	1,3	1,3	1,2	1, o	1,2	1, 6	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A	1,3	1,4	1,3	1,2	0, 9	1,2	1, 6	1, o
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A	1,1	1,3	1, o	1, o	0,7	1,2	1,4	0, 9
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A	1,1	1,3	0, 9	1,1	0,5	1,2	0, 8	1, o
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+W284R+E391A	1, o	1,2	0, 9	1,1	0, 6	1,1	1,1	1, o
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1, o	1,2	0, 8	1, o	0, 8	1,2	0, 9	1, o

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Tabela 4: Resultados do desempenho de lavagem em detergente K

Mutações	0,05 mg/L-K -20C	0,2 mg/L-K -20C	0,05 mg/L-K -40C	0,2 mg/L-K -40C
Referência - SEQ ID NO: 2	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+E391A	1,1	1, 0	2,0	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7K+G109A+N280S+E391A	1,2	1, 6	0, 9	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7E+G109A+N280S+E391A	1,2	1, 6	0, 6	1, 0
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7N+G109A+N280S+E391A	0, 9	1, 6	1, o	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7Q+G109A+N280S+E391A	1, 6	1, 6	1,1	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7L+G109A+N280S+E391A	1, 6	1, 6	1,4	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7D+G109A+N280S+E391A	1, 9	1, 6	1,5	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320A+E391A	0,4	0, 9	1, o	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320M+E391A	1,5	1,1	1, θ	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320T+E391A	1,3	1,1	1,5	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320V+E391A	1, o	0, 9	1,7	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+M323R+E391A	0,7	0, 9	1,3	1, o
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320S+E391A	1, θ	1,3	1, θ	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+E391V	1,3	1,1	2,0	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+W284R+E391A	1,2	1,3	1,2	1,2
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+W284F+E391A	1,7	1,3	1, θ	1,2
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A	2,0	1,4	1,4	1,2
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+W284F+E391A	0, 9	0, 9	1,3	1, o
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+M323N+E391A	2,0	1, 6	2,0	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+M323K+E391A	2,3	1, 6	2,0	1, 6
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109S+N280S+E391A	2,5	1,3	2,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+W284H+E391A	1,5	1,2	1,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1, 6	1,1	1,2	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A	1,5	1,4	1,2	1,2

[0336] Conforme pode ser visto na Tabela 1 e na Tabela 2, todas as variantes testadas têm um desempenho de lavagem aprimorado, em comparação à referência (SEQ ID NO: 2) em ao menos uma das condições testadas.

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Exemplo 2 - Desempenho de lavagem das alfaamilases no detergente liquido K [0337]O desempenho de lavagem da variante testada e da alfa-amilase parental correspondente (SEQ ID NO: 2) foi testado conforme descrito acima. Os resultados são dados como (desempenho da variante menos desempenho do controle) dividido por (desempenho do original menos desempenho do controle) .

Tabela 5: Desempenho de lavagem em escala TOM

	Modelo de detergente WE HDL
IF HM CS-28	IF HM CS-29
Referência SEQ ID NO: 2	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+W284H+E39 IA	1,28	1,58
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E39IA	1,13	1,61
SEQ ID NO: 2 + H1*+G7A+G109A+N280S+E39IA	1,22	2,02

Tabela 6: Desempenho de lavagem em escala TOM

1 L, 5 minutos de lavagem 0,13 mg de proteína enzimática/L	Modelo de detergente WE SUD
IF HM CS-29	IF HM CS-26
Referência SEQ ID NO: 2	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+W284H+E39IA	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E39IA	1,08	1,11
SEQ ID NO: 2 + H1*+G7A+G109A+N280S+E39IA	1,10	1,13

Tabela 7: Desempenho de lavagem em teste com máquina de lavar em escala total

Escala total, 0,072 mg de proteína enzimática/L	Modelo de detergente NA HDL
IF HM CS-29	IF HM CS-26
Referência SEQ ID NO: 2	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+W284H+E39IA	1,07	1,02
SEQ ID NO: 2 + H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E39IA	1,22	1,32
SEQ ID NO: 2 + H1*+G7A+G109A+N280S+E39IA	1,32	1,41

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141/153 [0338]A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ser limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui apresentados, já que esses aspectos são destinados a ilustrar diversos aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são destinados a estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas no presente documento, se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição anteriormente mencionada. Tais modificações também são destinadas a caírem no escopo das reivindicações em anexo. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo definições, será predominante.

Método de uso [0339]A presente invenção inclui um método para limpeza e/ou tratamento de um situs como, entre outros, uma superfície ou um produto têxtil. Em um aspecto, este método compreende as etapas de opcionalmente lavar e/ou enxaguar a dita superfície ou o dito tecido, colocar em contato a dita superfície ou o dito tecido em contato com qualquer produto destinado ao consumidor apresentado neste relatório descritivo e, então, opcionalmente lavar e/ou enxaguar a dita superfície ou o dito tecido.

[0340]Para uso na presente invenção, a lavagem inclui, mas não se limita a, esfregamento e agitação mecânica. A secagem de tais superfícies ou tecidos pode ser realizada por qualquer um dos meios comuns utilizados em instalações domésticas ou industriais. Esses meios incluem, mas não se limitam a, secagem por ar forçado ou ar parado, sob temperatura ambiente ou temperaturas

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142/153 elevadas e pressões entre 5 e 0,01 atmosferas na presença ou na ausência de radiação eletromagnética, inclusive irradiação por luz solar, infravermelho, ultravioleta e micro-ondas. Em um aspecto, a dita secagem pode ser realizada a temperaturas acima da temperatura ambiente, mediante o uso de um ferro sendo que, por exemplo, o dito tecido pode estar em contato direto com o dito ferro durante um período relativamente curto ou mesmo por extensos períodos de tempo e sendo que pode ser exercida uma pressão além daquela que de outro modo estaria normalmente presente devido à força gravitacional. Em um outro aspecto, a dita secando pode ser realizada a temperaturas acima da temperatura ambiente mediante o uso de uma secadora. O aparelho para secagem de tecidos é bem conhecido, sendo frequentemente chamado de secadora de roupas. Em adição a roupas, esses eletrodomésticos são usados para secar muitos outros itens, inclusive toalhas, lençóis, fronhas, fraldas e assim por diante, e esse equipamento tem sido aceito como uma conveniência padrão em muitos países do mundo, substituindo substancialmente o uso de varais de roupas para a secagem de tecidos. A maioria das secadoras atualmente em uso utiliza ar aquecido que é passado sobre e/ou através do tecido, conforme este é revolvido no interior da secadora. O ar pode ser aquecido, por exemplo, eletronicamente, via chama de gás, ou mesmo com radiação em microondas. Esse ar pode ser aquecido de cerca de 15°C a cerca de 400°C, de cerca de 25°C a cerca de 200°C, de cerca de 35°C a cerca de 100°C, ou mesmo de cerca de 40°C a cerca de 85°C, e usado na secadora para secar uma superfície e/ou um tecido. Como

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143/153 será apreciado por um elemento versado na técnica, as composições de limpeza da presente invenção são idealmente adequadas para uso em aplicações de lavagem de roupas. Consequentemente, a presente invenção inclui um método de lavagem de um tecido. 0 método inclui as etapas de colocar um tecido a ser lavado em contato com a dita solução de limpeza para lavagem de roupas contendo pelo menos uma modalidade da composição para limpeza dos requerentes, aditivo de limpeza ou sua mistura. 0 tecido pode compreender praticamente qualquer tecido que possa ser lavado sob condições normais de uso doméstico ou institucional. A solução tem, de preferência, um pH na faixa entre cerca de 8 a cerca de 10,5. As composições podem ser empregadas em concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água tipicamente variam de cerca de 5 °C a cerca de 90 °C. A razão entre água e tecido situa-se, tipicamente, na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

Exemplos de detergente

Exemplos 1 a 6 [ 0341]Composições detergentes granulares destinadas à lavagem de roupa manual ou para máquinas de lavar automáticas com carregamento superior.

	1 (%, em peso)	2 (%, em peso)	3 (%, em peso)	4 (%, em peso)	5 (%, em peso)	6 (%, em peso)
Alquilbenzenossulfonato linear	20	22	20	15	20	20
cloreto de dimetilhidroxietil C₁₂_₁₄ cloreto de amônio	0,7	0,2	1	0,6	0,0	0
AE3S	0,9	1	0,9	0,0	0,5	0,9
AE7	0,0	0,0	0,0	1	0,0	3

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Tripolifosfato de sódio	5	0,0	4	9	2	0,0
Zeólita A	0,0	1	0,0	1	4	1
Silicato 1,6R (SiO₂:Na₂O na razão de 1,6:1)	7	5	2	3	3	5
Carbonato de sódio	25	20	25	17	18	19
Poliacrilato com PM 4500	1	0,6	1	1	1,5	1
Copolimero de enxerto aleatório¹	0,1	0,2	0,0	0,0	0,0	0,0
Carboximetilcelulose	1	0,3	1	1	1	1
Protease (Savinase®, 32,89 mg de ativo/g)	0,1	0,1	0,1	0,1		0,1
Lipase - Lipex® (18 mg de ativo/g)	0,03	0,07	0,3	0,1	0,07	0,4
*Amilase da presente invenção (mg de ativo)	0,63	1,0	2,0	0,44	0,88	0,3
Abrilhantador fluorescente 1	0,06	0,0	0,06	0,18	0,06	0,06
Abrilhantador fluorescente 2	0,1	0,06	0,1	0,0	0,1	0,1
DTPA	0,6	0,8	0,6	0,25	0,6	0,6
MgSO₄	1	1	1	0,5	1	1
Percarbonato de sódio	0,0	5,2	0,1	0,0	0,0	0,0
Perborato de sódio monohidrato	4,4	0,0	3,85	2,09	0,78	3,63
NOBS	1,9	0,0	1,66	0,0	0,33	0,75
TAED	0,58	1,2	0,51	0,0	0,015	0,28
Ftalocianina de zinco sulfonada	0,0030	0,0	0,0012	0,0030	0,0021	0,0
S-ACMC	0,1	0,0	0,0	0,0	0,06	0,0
Violeta Direto 9	0,0	0,0	0,0003	0,0005	0,0003	0,0
Azul Ácido 29	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0003
Sulfato/Umidade	Restante

a amilase da presente invenção é mostrada como mg de enzima ativa por 100 g de detergente.

Exemplos 7 a 12 [0342]Composições detergentes granulares para lavagem de roupas, planejadas para máquinas de lavar automáticas com carregamento frontal.

	7 (%, em peso)	8 (%, em peso)	9 (%, em peso)	10 (%, em peso)	11 (%, em peso)	12 (%, em peso)
Alquilbenzenossulfonato linear	8	7,1	7	6, 5	7,5	7,5
AE3S	0	4,8	0	5,2	4	4
C12-14 alquilsulfato	1	0	1	0	0	0

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145/153

AE7	2,2	0	3,2	0	0	0
Cloreto de dimetil hidróxi etilamônio C₁₀ ₁₂	0,75	0,94	0,98	0,98	0	0
Silicato cristalino em camadas (5-Na₂Si₂O₅)	4,1	0	4,8	0	0	0
Zeólita A	5	0	5	0	2	2
Ácido cítrico	3	5	3	4	2,5	3
Carbonato de sódio	15	20	14	20	23	23
Silicato 2R (SiO₂:Na₂O na razão de 2:1)	0,08	0	0,11	0	0	0
Agente de liberação de sujeira	0,75	0,72	0,71	0,72	0	0
Copolímero de ácido acrilico/ácido maleico	1,1	3,7	1,0	3,7	2,6	3,8
Carboximetilcelulose	0,15	1,4	0,2	1,4	1	0,5
Protease - Purafect® (84 mg de agente ativo/g)	0,2	0,2	0,3	0,15	0,12	0,13
Lipase - Lipex® (18,00 mg de ativo/g)	0,05	0,15	0,1	0	0	0
Celulase - Celluclean™ (15,6 mg de ativo/g)	0	0	0	0	0,1	0,1
*Amilase da presente invenção (mg de ativo)	4,0	2,0	1,0	0,7	6, 0	3,0
Amilase⁴	0,15	0,04	0,03	-	0,01	0,16
TAED	3,6	4,0	3,6	4,0	2,2	1,4
Percarbonato	13	13,2	13	13,2	16	14
Sal sódico de ácido etilenodiamino-N,N'dissuccínico, isômero (S,S) (EDDS)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Difosfonato de hidroxietano(HEDP)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
MgSO₄	0,42	0,42	0,42	0,42	0,4	0,4
Perfume	0,5	0,6	0,5	0,6	0,6	0,6
Aglomerado de supressor de espuma	0,05	0,1	0,05	0,1	0,06	0,05
Sabão	0,45	0,45	0,45	0,45	0	0
Ftalocianina de zinco sulfonada (ativo)	0,0007	0,0012	0,0007	0	0	0
S-ACMC	0,01	0,01	0	0,01	0	0
Violeta Direto 9 (ativo)	0	0	0,0001	0,0001	0	0
Sulfato/ Água e Diversos	Restante

a amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

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Exemplos 13 a 18 Composições detergentes liquidas para lavagem de roupas para tarefas pesadas

	13 (%, em peso)	14 (%, em peso)	15 (%, em peso)	16 (%, em peso)	17 (%, em peso)	18 (%, em peso)
sulfato de alquil etóxi C₁₂_i5 (1.8)	14,7	11,6		16, 31		17,29
Sulfonato de alquil benzeno Cll, 8	4,3	11,6	8,3	7,73	11,7	7,73
Sulfato de alquila ramificada 016-17	1,7	1,29		3,09		3,3
Ci2-i4 alquil-9-etoxilato	0,9	1,07		1,31		1,31
Ci2 óxido de dimetilamina	0,6	0,64		1,03		1,03
Ácido cítrico	3,5	0,65	3	0,66	2,27	0,67
Ácido graxo C₁₂ ₁₈	1,5	2,32	3,6	1,52	0,82	1,52
Borato de sódio (bórax)	2,5	2,46	1,2	2,53		2,53
Ci2-i4 alquil etóxi 3 sulfato de sódio			2,9		3,9
Ci4 i5 alquil-7-etoxilato			4,2		1,9
C12-14 alquil-7-etoxilato			1,7		0,5
cloreto di-hidrato de Ca					0,045
Formiato de Ca	0,09	0,09		0,09		0,09
Um composto: bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O)n) (CH₃)-N⁺-CxH2xN⁺- (CH3) -bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O) η) ; n é de 20 a 30; xéde3a8, opcionalmente sulfatado ou sulfonatado			1,2		0,66
Copolimero de enxerto aleatório¹		1,46	0,5		0,83
Polietilenoimina etoxilada²	1,5	1,29		1,44		1,44
Ácido dietileno triamina penta-acético	0,34	0,64		0,34		0,34
Ácido dietileno triamina (ácido metileno fosfônico)			0,3		0,3
ácido 1-hidroxietilideno-l,1difosfônico					0,18
Hidrato do sal dissódico do ácido di-hidróxi benzeno-3,5dissulfônico						0,19
Tinopal AMS-GX		0,06				0,29
Tinopal CBS-X	0,2	0,17		0,29
Tinopal TAS-X B36					0,091
Polímero alcoxilado anfifílico para limpeza de graxas³	1,28	1	0,4	1,93		1,93
CHEC			0,2
Etanol	2	1,58	1,6	5,4	1,2	3,57
Glicol propilênico	3,9	3,59	1,3	4,3		3,8
Dietilenoglicol	1,05	1,54		1,15		1,15
Poli(glicol etilênico)	0,06	0,04		0,1		0,1
*Amilase da presente invenção	15,0	10,0	5,0	8,0	4,25	11,7

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 151/168

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(mg de ativo)
Amilase⁴	0,01	0,1	0,15	0,12	-	0,05
Monoetanolamina	3,05	2,41	0,4	1,26	0,31	1,13
NaOH	2,44	1,8		3,01	3,84	0,24
Cumeno sulfonato de sódio			1		0,95
Formiato de sódio		0,11		0,09	0,2	0,12
Água, componentes estéticos (corantes, perfumes) e secundários (enzimas, inclusive lipase, protease, amilase adicional, cada qual a 0,2% de proteína ativa, solventes, estruturantes)	qsp 100%

copolimero de enxerto aleatório é um copolimero de poli(óxido de etileno) enxertado com poli(acetato de vinila) tendo uma cadeia principal de poli(óxido de etileno) e múltiplas cadeias laterais de poli(acetato de vinila). 0 peso molecular da cadeia principal de poli(óxido de etileno) é cerca de 6.000 e a razão entre o peso do poli (óxido de etileno) e o peso do poli (acetato de vinila) é

cerca	de	40 a 60	e não mais que 1	ponto de enxerto por 50 unidades de
óxido	de	etileno.
		2	Polietilenoimina	(PM = 60 0) com 2 0	grupos	etoxilato
por -	NH.
		3	Polímero alcoxilado anfifílico para	limpeza	de graxas

é uma polietilenoimina (PM = 600) com 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxilato por -NH.

* a amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

Exemplos 19 a 21 Composição detergente líquida para tarefas pesadas para lavagem de roupas

	19 (%, em peso)	20 (%, em peso)	21 (%, em peso)
Alquil benzeno sulfato de sódio	21,0	10,2	3,53
C₁₂4 i8 alquil 1.5-9-etoxilato	18,0	6, 32	0,88
Sulfato de alquila ramificada			2,44
Alquil etóxi 1-3 sulfato de sódio		1,17	14,81
Ácido cítrico		3,14	2,05
C₁₂ óxido de dimetilamina			0,56
Ácido graxo C₁₂ ₁₈	15,0	2,59	1,48

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 152/168

148/153

Protease (Purafect Prime®, 40,6 mg de ativo/g)	1,5	0,52	1,64
Mananase (Mannaway®, 11 mg de ativo/g)	0,1	0,06
Xiloglucanase (Whitezyme®, 20 mg de ativo/g)	0,2	0,06
Lipase (ILipex)	0,1	0,2	0,05
*Amilase da presente invenção (mg de ativo)	5,9	2,3	12,8
bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O)n) (CH₃)-N⁺-CxH2x-N⁺(CH3)-bis ( (C₂H₅O) (C₂H₄O)n), sendo que n = de 20 a 30, e x = de 3 a 8, opcionalmente sulfatado ou sulfonatado	2,0	0,63
Copolimero de enxerto aleatório¹		1,07
Polietilenoimina etoxilada²	0,8		1,51
Polímero alcoxilado anfifílico³
Amilase⁴
Quelante fosfonatado	0,8	0,41	0,53
Hidrótropo		0,93
Abrilhantador	0,2	0,09	0,19
Corante tonalizante de tiofeno etoxilado	0,004
Secundários: corantes, perfume, microcápsulas de perfume, enzimas, estabilizantes enzimáticos, solventes, estruturantes, agentes de modificação de pH	Restante	Restante	Restante

** Com base no peso da composição de limpeza e/ou tratamento total, um total de não mais que 7% de água.

Matérias-primas e observações para os exemplos de composição 1 a 21

Alquilbenzenossulfonato linear tendo um comprimento médio de cadeia de carbono alifática de Cn a C18

Cloreto de dimetil hidróxi etil amônio C12-18 AE3S é C12-15 alquil etóxi (3) sulfato

AE7 é etoxilato de álcool C12-15 com um grau médio de etoxilação de 7

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AE9 é etoxilato de álcool C12-16 com um grau médio de etoxilação de 9

HSAS é um sulfato de alquila primária com cadeia média ramificada com comprimento de cadeia carbônica de cerca de 16 a 17 como apresentado em US 6.020.303 e US 6.060.443

O poliacrilato PM 4500 é fornecido pela BASF Carboximetilcelulose é Finnfix® V fornecida pela CP Kelco, Arnhem, Holanda

CHEC é um polímero de hidróxi etil celulose cationicamente modificado.

Quelantes de fosfonato são, por exemplo, ácido dietilenotetra-amina penta-acético (DTPA) hidroxietano difosfonato (HEDP)

Savinase®, Natalase®, Stainzyme®, Lipex®, Celluclean™, Mannaway® e Whitezyme® são todos produtos da Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.

Purafect®, Purafect Prime® são produtos da Genencor International, Paio Alto, Califórnia, EUA

Clareador fluorescente 1 é Tinopal® AMS, clareador fluorescente 2 é Tinopal® CBS-X, Violeta Direto 9 é Pergasol® Violet BN-Z, NOBS é nonanoil oxibenzeno sulfonato de sódio

TAED é tetra-acetil etilenodiamina

S-ACMC é carboximetilcelulose conjugada com Azul Reativo C.I. 19 nome do produto AZO-CM-CELLULOSE

O agente de liberação de sujeira é Repel-o-tex® PE O copolímero de ácido acrílico/ácido maléico tem peso molecular 70.000 e uma razão acrilato:maleato de 70:30

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150/153

EDDS é um sal sódico de ácido etileno diaminaN,Ν'-dissuccínico, isômero (S,S) Aglomerado de supressor de espuma disponível junto à Dow Corning, Midland, Michigan, EUA

HSAS é um sulfato de alquila ramificada média

Liquitint® Violet CT é fornecido pela Milliken,

Spartanburg, Carolina do Sul, EUA ¹ O copolímero de enxerto aleatório é um copolímero de poli(óxido de etileno) enxertado com poli (acetato de vinila) tendo uma cadeia principal de poli(óxido de etileno) e múltiplas cadeias laterais de poli (acetato de vinila) . O peso molecular da cadeia principal de poli(óxido de etileno) é cerca de 6.000 e a razão entre o peso do poli (óxido de etileno) e o peso do poli (acetato de vinila) é cerca de 40 a 60 e não mais que 1 ponto de enxerto por 50 unidades de óxido de etileno.

o

Polietileno imina (MW = 600) com 20 grupos etoxilato por -NH.

o

Polímero anfifilico alcoxilado e uma polietilenoimina (peso molecular 600), preparada a partir de um polímero que é derivatizado para conter 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxilato por -NH.

Amilase⁴ é qualquer uma dentre a) a k) na presente invenção (mg de proteína ativa).

Exemplos 22 a 26 Dose unitária de composições detergentes para lavagem de roupas. Tais formulações em dose unitária podem compreender um ou múltiplos compartimentos.

22	23	24	25	26
(%, em	(%, em	(%, em	(%, em	(%, em
peso)	peso)	peso)	peso)	peso)

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151/153

Ácido alquilbenzenossulfônico	14,5	14,5	14,5	14,5	14,5
012-18 alquil etóxi 3 sulfato	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
012-18 alquil-7-etoxilato	13,0	13,0	13,0	13,0	13,0
Ácido cítrico	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Ácido graxo	14,8	14,8	14,8	14,8	14,8
*Amilase da presente invenção (mg de ativo)	6	12	8	2	10
Polietilenoimina etoxilada¹	4,0	4,0	4,0	4,0	4,0
Protease (Purafect Prime®, 40,6 mg de ativo/g)	1,4	2,0	0,9	1,2	0
Celulase (Celluclean, proteína ativa)	0,1	0,2			0,1
Amilase⁴ (proteína ativa) a) a k) da presente invenção	0,1	0,05	0,1	0,2	0,1
Ácido hidroxietano difosfônico	1,2	1,2	1,2	1,2	1,2
Abrilhantador	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
P-diol	15,8	13,8	13,8	13,8	13,8
Glicerol	6, 1	6, 1	6, 1	6, 1	6, 1
MEA	8,0	8,0	8,0	8,0	8,0
TI PA	-	-	2,0	-	-
TEA	-	2,0	-	-	-
Cumenossulfonato	-	-	-	-	2,0
ciclo-hexil dimetanol	-	-	-	2,0	-
Água	10	10	10	10	10
Estruturante	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14
Perfume	1,9	1,9	1,9	1,9	1,9
Tampões (monoetanolamina)	Até pH 8,0
Solventes (1,2-propanodiol, etanol)	q.s.p. 100%

Ί

-¹- Polietilenoimina (PM=600) com 20 grupos etoxilato por -NH.

Exemplo 27 Composição de dose unitária em múltiplos compartimentos [0343]As formulações detergentes para lavagem de roupas em dose unitária multicompartimentadas da presente invenção são apresentadas abaixo. Nestes exemplos, a dose unitária tem três compartimentos, mas composições similares podem ser feitas com dois, quatro ou cinco compartimentos. O filme usado para encapsular os compartimentos é poli(álcool vinilico).

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Composição-base 1	27 (%, em peso)
Glicerol (min 99)	5,3
1,2-propanodiol	10,0
Ácido cítrico	0,5
Monoetanolamina	10,0
Soda cáustica	-
Dequest 2010	1,1
Sulfito de potássio	0,2
*Amilase da presente invenção (mg ativo)	8,0
Marlipal C24EO7 não iônico	20,1
HLAS	24,6
Abrilhantador óptico FWA49	0,2
Ácido graxo C12-15	16, 4
Polímero Lutensit Z96	2,9
Etoxilato de polietilenoimina PEI600 E20	1,1
MgC12	0,2
Solventes (1,2-propanodiol, etanol)	q.s.p. 100%

Formulações de múltiplos compartimentos

Composição	1		2
Compartimento	A	B	c	A	B	c
Volume de cada compartimento	4 0 ml	5 ml	5 ml	4 0 ml	5 ml	5 ml
Material ativo, % em peso
Perfume	1,6	1,6	1,6	1,6	1,6	1,6
Corantes	< 0,01	< 0,01	< 0,01	< 0,01	< 0,01	< 0,01
TiO2	0,1	-	-	-	0,1	-
Sulfito de sódio	0,4	0,4	0,4	0,3	0,3	0,3
Acusol 305	1,2			2	-	-
Óleo de rícino hidrogenado	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14
Composição-base 1	q.s.p. 100%	q.s.p. 100%	q.s.p. 100%	q.s.p. 100%	q.s.p. 100%	q.s.p. 100%

[0344]As dimensões e os valores aqui revelados não devem ser entendidos como estando estritamente limitados aos valores numéricos exatos mencionados. Em vez disso, exceto onde especificado em contrário, cada uma dessas dimensões se destina a significar tanto o valor mencionado como uma faixa de valores funcionalmente equivalentes em torno daquele

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153/153 valor. Por exemplo, uma dimensão revelada como 40 mm destina a significar cerca de 40 mm.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de compreender:

a) uma variante de uma alfa-amilase parental, sendo que a variante compreende

(i) uma modificação em uma ou mais posições correspondente s a 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, em uma ou mais posições correspondentes às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e

476 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, (ii) a dita variante tem ao menos 80, como ao menos 90%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a dita variante tem atividade de alfaamilase; e

b) um composto auxiliar de limpeza, de preferência, em uma quantidade de 0,01 a 99,9%, em peso.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a alteração é uma deleção ou uma substituição.
3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende uma modificação em ao menos uma posição correspondente às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que

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2/6 a dita variante compreende uma modificação em ao menos uma ou duas posições correspondentes às posições 109, 1, 7, 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 280, 284,

304, 320, 323, 391 e 476 da sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO: 1.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que as ditas uma ou mais modificações são substituições.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que ao menos uma dentre as ditas uma ou mais modificações é uma deleção.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende uma modificação em ao menos duas posições selecionadas do grupo que consiste em 1, 109 e 391.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, na variante, as ditas uma ou mais modificações são

selecionadas do grupo X7E, X7N. X7Q, X7L, que consiste em: XI*, X109S, XIA, X7A, X7K, X7D, X109A, X140Y, X181*, X182*, X183*, X184*, X195F, X206Y , X243F, X260G, X280S, X284H, X284R, X284F, X304R, X320A , X320M, X320T, X320V,

X320S, X323N, X323R, X323S, X323K, X391A, X391V e X476K.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a dita variante tem um desempenho aprimorado, como um desempenho de lavagem aprimorado.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que

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3/6 a dita variante tem ao menos 90%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ou ao menos 99%, porém menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase parental.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que, na variante, o número de modificações é de 1 a 30, ou de 1 a 20, ou de 1 a 10, ou de 1 a 5, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 modificações.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a variante compreende modificações nas posições selecionadas do grupo de posições que consiste em: X1+X7; X1+X109; X1+X280; X1+X284; X1+X320; X1+X323; X1+X391;

X109+X280; X109+X284; X109+X320; X109+X323; X109+X391;

X7+X109; X7+X280; X7+X284; X7+X320; X7+X323; X7+X391;

X280+X284; X280+X320; X280+X323; X280+X391; X284+X320;

X284+X323; X284+X391; X320+X323; X320+X391; e X323+X391, sendo que a numeração é de acordo com a SEQ ID NO: 1.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a variante compreende modificações nas posições correspondentes às posições da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

Hl*+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7K+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7E+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7N+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7Q+G109A+N280S+E391A;

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4/6

Hl*+G7L+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7D+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320A+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320M+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320T+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320V+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323R+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+E391V;

Hl*+G109A+W284R+E391A;

Hl*+G109A+W284F+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+W284F+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323N+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323K+E391A;

Hl*+G109S+N280S+E391A;

Hl*+G109A+W284H+E391A;

Hl*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A;

G7A+W284H+K320A+M323N;

G7A+K320A+M323N;

K32 0A;

G7A+K320A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+E391A;

Hl*+G109A+N280S+W284H+E391A;

Hl*+G109A+N280S+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A;

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 162/168

5/6

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A;

Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

Hl*+G7A+G109A+W284R+E391A; e

Hl*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A.
14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase parental para a variante é selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos

apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, ou qualquer alfa-amilase tendo ao menos 90%, como ao menos 92%, como ao menos 95 %, como ao menos 97%, como ao menos 98%, como ao menos 99 % ou 100% de identidade de sequência

com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8.
15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase parental para a variante é selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 ou 2, ou qualquer alfa-amilase tendo ao menos 90%, como ao menos 92%, como ao menos 95%, como ao menos 97%, como ao menos 98%, como ao menos 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer dentre as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 ou 2.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a variante tem ao menos 85%, ao menos 87%, ao menos 90%, ao menos 95% de identidade, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99%, porém menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de qualquer uma das

Petição 870190072995, de 30/07/2019, pág. 163/168

6/6 sequências SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, ou sendo que a variante da alfa-amilase parental compreende a, ou consiste na, sequência de aminoácidos de um polipeptídeo maduro selecionada dentre: (i) SEQ ID NO: 1; (ii) SEQ ID NO: 2; (iii) SEQ ID NO: 3; (iv) SEQ ID NO: 4; (v) SEQ ID NO: 5;

(vi) SEQ ID NO: 6; (vii) SEQ ID NO: 7; (viii) SEQ ID NO: 8.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de ser uma composição detergente líquida para lavagem de roupas ou composição detergente em dose unitária.
18. Método para tratamento de uma superfície, de preferência um material têxtil, caracterizado pelo fato de compreender:

(i) formar um líquido de lavagem aquoso que compreende água e uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores;

(ii) tratar a superfície com o líquido de lavagem aquoso, de preferência a uma temperatura de 40°C ou menos, ou com mais preferência a uma temperatura de 35°C ou menos, com a máxima preferência a uma temperatura de 30°C ou menos; e (iii) enxaguar a superfície.