CN110234747B

CN110234747B - 包含淀粉酶变体的清洁组合物

Info

Publication number: CN110234747B
Application number: CN201880009806.3A
Authority: CN
Inventors: C·安德森; C·加迪亚拉姆; P·V·伊耶; R·K·塞纳坦; I·达马杰
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: EP3357994B1; FI3357994T3; JP2020510712A; PL3357994T3; CN110234747A; MX2019009093A; RU2019123965A; DK3357994T3; US20200339917A1; EP3357994A1; JP6899912B2; ES2965826T3; CA3051426C; WO2018144399A1; US20180216039A1; CA3051426A1; BR112019015689A2

Abstract

本发明涉及包含α淀粉酶的变体的清洁组合物，和用包含此类组合物的含水液体处理表面诸如纺织物的方法，尤其是在低温下。

Description

包含淀粉酶变体的清洁组合物

参考序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及包含α-淀粉酶的变体的清洁组合物，所述α-淀粉酶的变体相对于其亲本淀粉酶在冷水表面处理过程中具有改善的清洁性能。

背景技术

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，它们催化淀粉以及其他直链和支化1,4-葡糖苷低聚糖和多糖的水解。

使用的第一细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，也称为特妙淀粉酶，其已经被广泛的表征并且已经测定了这种酶的晶体结构。碱性淀粉酶，诸如AA560形成了一组特定的α-淀粉酶，其已经应用于洗涤剂中。多种这些已知的细菌淀粉酶已被修饰以便改善它们在特定应用中的功能。芽孢杆菌淀粉酶诸如特妙淀粉酶、AA560(WO 2000/060060)和SP707(由Tsukamoto等人，1988,Biochem.Biophys.Res.Comm.151:25-31所述)形成已应用于洗涤剂中的一组特定α-淀粉酶。这些淀粉酶已被修饰成用于改善在洗涤剂中的稳定性。WO 96/23873例如公开了使SP707(WO 96/23873的SEQ ID NO:7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184缺失，以改善该淀粉酶的稳定性。WO 96/23873还公开了通过用例如亮氨酸替代M202来修饰SP707淀粉酶，以针对氧化稳定分子。因此，修饰淀粉酶来改善某些特性是已知的。

出于环保原因，降低洗涤、盘碟洗涤和/或清洁过程中的温度已经越来越重要。然而，包括淀粉酶在内的大多数酶具有高于低温洗涤中通常使用的温度的最佳温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶，并且就含淀粉的污渍在衣物洗涤或盘碟洗涤过程中的去除而言，其使用已变得日益重要。因此，找到当温度降低时保持它们的洗涤性能、去污效果和/或活性的α-淀粉酶变体是重要的。然而，无论当前的洗涤剂酶组合物的效率如何，有许多污渍难以被彻底地除去。低(例如，冷水)洗涤温度和更短的洗涤周期的使用的增加使这些问题更加复杂化。因此，希望拥有能够在低温下发挥作用并且同时保持或提高其他合乎期望的性能如特异性活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能的淀粉分解酶，以允许在较短洗洗涤循环中良好的清洁。

因此，提供包含能够在低温下的洗涤、盘碟洗涤和/或清洁过程中使用的α-淀粉酶变体的清洁组合物，是本发明的一个目的。本发明的另一个目的是提供与亲本α-淀粉酶相比或与包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中任一者的α-淀粉酶的清洁组合物相比，在低温下洗涤性能得到改善的包含α-淀粉酶变体的清洁组合物。

发明内容

本发明提供了清洁组合物，所述清洁组合物包含：

(a)亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含(i)在对应于选自SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391的位置的一个或多个位置处，以及任选地在对应于选自如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的位置的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性；

(b)和清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％。

本发明还提供了一种处理表面，优选地纺织物的方法，所述方法包括：

(i)形成包含水和此类清洁组合物的含水洗涤液体，

(ii)优选地在5℃或10℃至40℃，或者优选地35℃或更低的温度，更优选地在30℃或更低的温度，或者在20℃或更低的温度下，用含水洗涤液体处理表面；以及

(iii)漂洗所述表面。

具体实施方式

本发明提供了清洁组合物，所述清洁组合物包含：

(a)亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性；

和

(b)清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％。

定义

等位变体：术语“等位变体”指占据相同染色体座位的基因的任何两个或更多个供选择的替代形式。等位变体通过突变天然产生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可为沉默突变(不改变编码的多肽)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶”(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，它们催化淀粉以及其他直链和支化1,4-葡糖苷低聚糖和多糖的水解。就本发明的目的而言，根据实施例部分中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO：1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”包括标准二十种基因编码的氨基酸以及它们对应的“d”形式(相比于天然“l”形式)的立体异构体、ω氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常见氨基酸(例如α,α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生氨基酸。一种或多种氨基酸的化学衍生物可通过与功能侧基进行反应来实现。此类衍生分子包括例如游离氨基经衍生化形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、羧苯酰氧基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可经衍生化形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯和酰肼。游离羟基可经衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。作为化学衍生物还包括含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸并且鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括包含一个或多个添加或缺失的肽，只要维持所需活性即可。其他所包括的修饰为酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧酰胺化(例如采用氨或甲胺)，以及类似的末端修饰。

当具体地枚举氨基酸诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，除非另行明确指出，该术语是指l-丙氨酸和d-丙氨酸二者。其他非常见氨基酸也可为适于本发明多肽的组分，只要多肽保留所期望的功能特性即可。对于所示的肽而言，在适当情况下，各个编码的氨基酸残基用对应于常规氨基酸的惯用名的单字母名称来表示。在一个实施方案中，本发明的多肽包含或由l-氨基酸组成。

cDNA：术语“cDNA”是指能够通过逆转录从自真核细胞获得的成熟的、经拼接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初始RNA转录物是mRNA的前体，其在作为成熟的经拼接的mRNA出现之前，通过一系列步骤(包括拼接)而被加工。

编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接指定变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，它通常起始于起始密码子诸如ATG、GTG或TTG，并终止于终止密码子诸如TAA、TAG或TGA。编码序列可为DNA、cDNA、合成的、或重组的多核苷酸。

控制序列：术语“控制序列”是指编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可为原生的(即，出自相同基因)或外源的(即，出自不同基因)，或彼此原生或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有助于控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接的特异性限制性位点的目的，控制序列可设置有接头。

Δ强度：术语“Δ强度”或“Δ强度值”在本文定义为测试材料，例如样本CS-28(Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120(3133 KT Vlaardingen,theNetherlands))或硬质表面的强度测量结果。样本用相同条件下洗涤的样本的一部分作为背景进行测量。Δ强度是用淀粉酶洗涤的测试材料的强度值减去未经淀粉酶洗涤的测试材料的强度值。

酶去污有益效果：本文使用的术语“酶去污有益效果”是指相比于不含酶的相同洗涤剂，可添加有酶的洗涤剂的有益效果。可由酶提供的重要去污有益效果是在洗涤和/或清洁之后没有或几乎没有可见污垢的去污效果，防止或减少洗涤过程中所释放污垢的再沉积(也称为抗再沉积的效果)，完全或部分地恢复最初呈白色但在重复使用和洗涤之后获得浅灰色或微黄色外观的纺织物的白度(也称为增白的效果)。纺织物护理有益效果与催化去污或防止污垢再沉积没有直接关系，也可能对于酶去污有益效果很重要。此类纺织物护理有益效果的示例是防止或减少染料从一个织物向另一个织物或同一织物的另一部分转移(也称为染料转移抑制或防返染的效果)，移除从织物表面突出或断裂的纤维以减小起球趋势或移除已存在的球或绒毛(也称为防起球的效果)，改善织物柔软性，织物颜色纯化，以及移除织物或衣物纤维中捕集的颗粒污垢。酶漂白是另一种酶去污有益效果，其中催化活性通常用于催化漂白组分诸如过氧化氢或其他过氧化物的形成。

表达：术语“表达”包括在变体的产生中所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至提供其表达的附加的核苷酸。

片段：术语“片段”是指SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的氨基和/或羧基末端缺乏一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的至少200个连续氨基酸残基，例如SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8的至少300个连续氨基酸残基，或至少350个连续氨基酸残基，或至少400个连续氨基酸残基，或至少450个连续氨基酸残基。

宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对用包含本文所述的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。

强度值：如本文所用，术语“强度值”是指洗涤性能测量。其作为亮度被测量，表示为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品有污渍时，反射光的强度低于清洁样品的反射光强度。因此，可使用反射光的强度测量洗涤性能，其中较高强度值与较高洗涤性能相关联。用专业的平面扫描器(Kodak iQsmart，Kodak)进行颜色测量，该平面扫描器用于捕集经洗涤的纺织物的图像。为了从扫描图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值加到一起作为载体计算强度值(Int)，然后获得所得载体的长度：

改善的性能：术语“改善的性能”是指与变体相关联的与亲本相比改善的特性。此类改善的性能包括但不限于洗涤性能、热活性、热稳定性、储存条件下的稳定性、以及化学稳定性。

改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”或“提高的洗涤性能”是指变体酶在洗涤过程诸如衣物洗涤或盘碟洗涤中能够提供清洁效果(例如去污效果)，该清洁效果相比于亲本淀粉酶或相对于具有SEQ ID NO:2或1中所示氨基酸序列的α-淀粉酶的活性得到改善，例如提高的去污效果。洗涤性能可使用本领域公知的方法，诸如使用自动机械应力测定(AMSA)来测定。本领域的技术人员应当理解，提高的洗涤性能可仅在一些或可能所有的洗涤条件，例如在20℃或更高(诸如40℃)的洗涤温度下实现。改善的洗涤性能可由在例如以下实施例1中所列的一种或多种条件下高于1.0，优选地高于1.05的改善因子(IF)指示：模型洗涤剂A中20℃下，其中α-淀粉酶变体浓度为0.2mg/L；或模型洗涤剂A中40℃下，其中α-淀粉酶变体浓度为0.05mg/L；或模型洗涤剂J中20℃下，其中α-淀粉酶变体浓度为0.2mg/L；或模型洗涤剂J中30℃下，其中α-淀粉酶变体浓度为0.05mg/L；或模型洗涤剂K中20℃下，其中α-淀粉酶变体浓度为0.2mg/L。洗涤条件在实施例部分中有所描述。

分离的：术语“分离的”是指处于非天然存在的形式或环境的物质。分离的物质的非限制性示例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子(从其天然相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中至少部分地去除)的任何物质；(3)相对于天然存在的物质经过人手改性的任何物质；或(4)通过增加相对于其天然相关联的其它组分的物质的量而改性的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可存在于发酵液体培养基样品中。在一个方面，本发明涉及一种分离的α-淀粉酶变体。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”是指经人工修改的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、至少90％纯、和至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的、或它们的任何组合。

分离的变体：术语“分离的变体”是指经人工修改的变体。在一个方面，变体是至少1％纯的，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、和至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。

低温：“低温”是5-40℃，优选5-35℃，优选5-30℃，更优选5-25℃，更优选5-20℃，最优选5-15℃，并且具体地5-10℃的温度。在一个优选的实施方案中，“低温”是10-35℃，优选10-30℃，或10-25℃，或10-20℃，或10-15℃的温度。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指翻译后和任何翻译后修饰(诸如，N-末端加工，C-末端截短，糖基化，磷酸化等)呈其最终形式的多肽。本领域已知的是宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

突变体：术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因分离的，或者是以否则将不会天然地存在的方式经过修改以包含核酸的片段的，或者它是合成的，其包含一个或多个控制序列。当所述核酸构建体包含本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。

可操作地连接：术语“可操作地连接”是指一种构型，控制序列在其中被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位点上，使得控制序列指导编码序列的表达。

亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”是指对其进行修改以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。例如，亲本可为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶(称为SP722)。另选地，其可指SEQ ID NO:2的α-淀粉酶或任何合适的α淀粉酶，诸如本文如SEQ ID No:3、4、5、6、7和8所列的那些。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，这种相关性用参数“序列同一性”描述。

就本发明的目的而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如在EMBOSS程序包的Needle程序中实现(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)，优选地3.0.0或更新的版本。所用的任选参数是10的空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中的总空位数)

另选地，所用的参数可为10的空位罚分，0.5的空位延伸罚分，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的总空位数)。

淀粉去除过程：表述“淀粉去除过程”是指淀粉在其中被去除(或转化)的任何类型的过程，诸如在淀粉在其中从纺织物去除的洗涤过程中，例如纺织物清洁诸如衣物洗涤。淀粉去除过程也能够是硬质表面清洁如盘碟洗涤，或者其能够是一般性的清洁过程，诸如工业或公共设施清洁。该表述还包括其他淀粉去除过程或淀粉转化、乙醇生产、淀粉液化、纺织物退浆、纸和纸浆生产、啤酒制造和一般性洗涤剂。

亚序列：术语“亚序列”是指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端删除了一个或多个(例如若干个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”指不含其他外来的或不期望的核苷酸并且其形式适用于遗传工程的多肽制备体系的多核苷酸制剂。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计包含至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、和至多0.5％的其他多核苷酸物质，所述其他多核苷酸物质是与该多核苷酸天然地或重组地相关联的。然而基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5'和3'非翻译区，例如启动子和终止子。优选地，基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90％纯的，例如，至少92％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、和99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地为基本上纯的形式。

基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”是指按重量计包含至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、和至多0.5％的其他多肽物质的制剂，所述多肽物质是与其天然地或重组地相关联的。优选地，变体按制剂中存在的总多肽物质的重量计是至少92％纯的，例如，至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％、至少99.5％纯、和100％纯的。本发明的变体优选地为基本上纯的形式。这能够例如通过熟知的重组方法或通过经典的纯化方法制备变体来实现。

纺织物护理有益效果：如本文所用，术语“纺织物护理有益效果”定义为与催化去污效果或防止污垢再沉积没有直接关系，对于酶去污有益效果也很重要。此类纺织物护理有益效果的示例是防止或减少染料从一个纺织物向另一个纺织物或同一纺织物的另一部分转移(也称为染料转移抑制或防返染效应)，移除纺织物表面突出或断裂的纤维以减小起球趋势或移除已存在的球或绒毛(也称为防起球效应)，改善纺织物柔软性，纺织物颜色纯化，以及移除纺织物纤维中捕集的颗粒污垢。酶漂白是另一种酶去污有益效果，其中催化活性通常用于催化漂白组分诸如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白物类形成。

变体：“术语“变体”是指相对于亲本α-淀粉酶，在一个或多个(例如若干个)位点包含改变/突变(即取代、插入、和/或删除)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指占据一个位置的氨基酸的移除；而插入是指在邻近和紧接着占据一个位点的氨基酸处添加1-3个氨基酸。

洗涤性能：在本发明的上下文中，术语“洗涤性能”作为在例如衣物洗涤或硬质表面清洁如盘碟洗涤期间，酶去除存在于待清洁的物体上的淀粉或包含淀粉的污渍的能力被使用。洗涤性能可通过计算在AMSA的描述中或下文的“方法”部分中的烧杯洗涤性能测试中定义的所谓的强度值(Int)而被定量。

野生型酶：术语“野生型”α-淀粉酶是指由天然存在的微生物例如天然存在的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。

术语“洗涤性能”包括一般性的清洁，例如，硬质表面清洁如在盘碟洗涤中，以及在纺织物上的洗涤性能诸如衣物洗涤，以及工业和公共设施清洁。改善的洗涤性能可通过比较如本文定义中所述的Δ强度进行测量。

术语“洗涤性能”包括一般性的清洁，例如，硬质表面清洁如在盘碟洗涤中，以及在纺织物上的洗涤性能诸如衣物洗涤，以及工业和公共设施清洁。

变体设计的规则

具有α-淀粉酶活性的本发明多肽对应于衍生自芽孢杆菌属的α-淀粉酶(如SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示)的变体。

SEQ ID NO:1

HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASNLRNRGITAIWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVYGDVVMNHKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEISGDYTIEAWTKFDFPGRGNTYSDFKWRWYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMDHPEVVNELRRWGEWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLTHVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAVTFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHSVPAMKAKIDPILEARQNFAYGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGEKWMYVGQNKAGQVWHDITGNKPGTVTINADGWANFSVNGGSVSIWVKR

就本发明的目的而言，将SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽用于测定另一种α-淀粉酶多肽中对应的氨基酸残基。然而，技术人员将认识到，SEQ ID NO:2的序列还可用于测定另一种α-淀粉酶多肽中对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶氨基酸序列与SEQ ID NO:1所公开的成熟多肽进行比对，并且基于比对，确定对应于SEQ IDN O:1所公开的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，其使用了Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如在EMBOSS程序包的Needle程序中实现(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)，优选地5.0.0或更新的版本。所用的参数是，为10的空位开放罚分，为0.5的空位延伸罚分，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

另一个α-淀粉酶中对应的氨基酸残基的鉴定可通过将多个多肽序列用若干个计算机程序进行比对来确定，程序包括但不限于MUSCLE(multiple sequence comparison bylog-expectation；版本3.5或更新的；Edgar，2004，Nucleic Acids Research 32：1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，Nucleic Acids Research 30:3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research 33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh等人，2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)，以及EMBOSS EMMA employingClustalW(1.83或更新的；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)，使用它们各自的默认参数。

当其他α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽存在分化由此使得传统的基于序列的比较未检测出它们的关系(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，能够使用其他两两序列比对算法。使用利用了多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库的搜索程序能够获得基于序列的搜索中的更高灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远缘同系物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，能够实现甚至更高的敏感性。诸如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)的程序利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶解能)作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.313:903-919的方法能够被用于将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多种为此目的开发的工具来评估这类模型的精确性。

对于已知结构的蛋白质，已经有数种可用于检索和生成结构性比对的工具和资源。例如，蛋白质的SCOP超家族已经过了结构性比对，并且可以获取和下载那些比对。可使用多种算法诸如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins 33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering 11:739-747)来比对两个或更多个蛋白结构，并且这些算法的实现可以另外用于使用感兴趣的结构来查询结构数据库以便发现可能的结构同系物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics 16:566-567)。

在对本发明的α-淀粉酶的变体的描述中，采用下述命名法以便于参考。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代：对于氨基酸取代，使用下列命名法：初始氨基酸、位点、取代的氨基酸。因此，将在第226位处用丙氨酸取代例如苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“T226A”。用加号(“+”)分隔多个突变，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在第205和411位处分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸，位点，*。因此，第181位处甘氨酸的缺失被命名为“Ser181*”或“S181*”。用加号(“+”)分隔多个缺失，例如“Ser181*+Thr182*”或“S181*+T182*”。

插入：对于氨基酸插入，使用下列命名法：初始氨基酸、位点、初始氨基酸、插入氨基酸。相应地，在例如位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被命名为[初始氨基酸，位点，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在这类情况下，通过在插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号上添加小写字母，来对插入的氨基酸残基编号。因此，在上述示例中，序列将是：

<u>亲本</u>：	<u>变体</u>：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多个修饰：包含多个修饰的变体用加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位点170和195用酪氨酸取代精氨酸及用谷氨酸取代甘氨酸。

不同修饰：在某一个位置处可以引入不同的改变的情况下，用逗号分开不同的改变，例如“Arg170Tyr，Glu”代表在第170位处用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了下列变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

亲本α-淀粉酶

亲本α-淀粉酶可为与SEQ ID NO:1中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:2中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:2的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:3中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:3的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:4中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:4的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:4的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:5中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:5的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:5的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:6中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:6的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:6的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:7中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:7的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:7的多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶也可为与SEQ ID NO:8中所示的多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:8的多肽(其具有α-淀粉酶活性)具有至少80％，诸如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本α-淀粉酶优选地包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:8的多肽的等位变体。

根据本领域熟知的方法，可使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针，以鉴定和克隆编码不同属或种菌株的亲本的DNA。具体地讲，此类探针可用于按照标准的Southern印迹法与受关注的属或物种的基因组或cDNA杂交以便鉴定并分离其中对应的基因。此类探针能够显著地比完整序列更短，但是长度应为至少14个，例如，至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。能够使用DNA和RNA探针。探针通常进行标记以检测对应的基因(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素、或亲和素标记)。本发明涵盖此类探针。

可筛选从此类其他生物体制备的基因组DNA或cDNA文库，以获取与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离来自此类其他生物体的基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可被转移到并固定在Southern印迹中使用的硝化纤维素或其他适合的载体材料上。

就本发明目的而言，杂交指多核苷酸在低至非常高的严格条件下杂交到对应于编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8的多核苷酸、或其亚序列的标记核苷酸探针上。与所述探针杂交的分子能够使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段进行检测。

在一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的多肽或其片段的多核苷酸。

就长度为至少100个核苷酸的长探针而言，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃下，在5X SSPE，0.3％SDS，200微克/mL剪切变性鲑精DNA，以及25％甲酰胺(非常低和低严格度)，35％甲酰胺(中和中-高严格度)或50％甲酰胺(高和非常高严格度)中预杂交和杂交，随后最佳地进行标准Southern印迹程序持续12至24小时。载体材料被最终洗涤三次，每次在45℃(非常低的严格度)、50℃(低严格度)、55℃(中等严格度)、60℃(中-高严格度)、65℃(高严格度)、或70℃(非常高的严格度)用2X SSC、0.2％SDS进行15分钟。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格度条件根据预杂交和杂交来限定，进行预杂交和杂交的温度比按照Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)计算的T_m低约5℃至约10℃，在0.9M NaCl、0.09MTris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA每毫升中按照标准的Southern印迹规程进行最佳12至24小时。最后，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤载体材料一次，时间15分钟，并且用6X SSC在比所计算的T_m低5℃至10℃的温度下洗涤两次，每次15分钟。

亲本可得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文所用，与给定来源相关的术语“得自”将指由多核苷酸编码的亲本由该来源或者由来自该来源的多核苷酸已被插入至其中的细胞产生。在一个方面，亲本被分泌到细胞外。

亲本可以是细菌的α-淀粉酶。例如，亲本可为革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶；或革兰氏阴性细菌多肽如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。

在一个方面，亲本为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)α-淀粉酶。

在另一个方面，亲本为似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽痕亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。

在另一个方面，亲本为不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。

在另一方面，亲本为芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的α-淀粉酶。

应当理解的是，对于前述的种，本发明涵盖了完全和不完全阶段，和其他分类学的等同物，例如无性型，而无论它们已知的种名如何。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份。

公众能够从许多培养物保藏机构容易地取得这些物种的菌株，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)、和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

也可以使用上述的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然物质(例如，土壤、堆肥、水等)中获得的DNA样品鉴定和获得亲本。用于从天然生境分离微生物和直接分离DNA的技术是本领域内为人们所熟知的。随后可通过相似地筛选另外的微生物或混合的DNA样品的基因组或cDNA文库来得到编码亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如Sambrook等人，1989，见上)。

亲本可以是杂交体多肽，一种多肽的部分在其中被融合到另一种多肽的部分的N末端或C末端处。

亲本还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，一种多肽在其中被融合到另一种多肽的N末端或C末端处。通过使编码一种多肽的多核苷酸与编码另一种多肽的多核苷酸融合，产生融合的多肽。用于制备融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，和使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白也可以使用内含肽技术构建，该技术中融合是翻译后创建的(Cooper等人，1993,EMBO J.12:2575-2583；Dawson等人，1994,Science 266:776-779)。

融合多肽还可包含两种多肽之间的切割位点。融合多肽被分泌时，位点被切割，释放了两种多肽。切割位点的示例包括但不限于Martin等人，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetin等人，2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等人，1995,Biotechnology 13:498-503；和Contreras等人，1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton等人，1986,Biochemistry 25:505-512；Collins-Racie等人，1995,Biotechnology 13:982-987；Carter等人，1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48中所公开的位点。

变体的制备

一种适于获得具有α-淀粉酶活性的本发明所需变体的方法，该方法包括：(a)将在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰引入亲本α-淀粉酶中，其中各修饰独立地为取代或缺失，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)回收所述变体。

在一个方面，一种用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括：(a)将在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰引入亲本α-淀粉酶中，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中各修饰独立地为取代或缺失，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)回收所述变体。

在一个实施方案中，修饰是取代。在一个实施方案中，修饰是缺失。

在另一个实施方案中，用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法包括(a)将在一个或多个位置处的取代引入亲本α-淀粉酶中，其中所述取代选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的H1A、G7A、G109A、N280S、W284H、K320A、M323N和E391A，其中编号根据SEQ IDNO:1，以及(b)回收该变体。

该方法还可包括将一个或多个位置中的缺失引入亲本α-淀粉酶中，其中所述缺失选自：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的H1*、R181*、G182*、D183*和G184*，其中编号根据SEQ ID NO:1，以及回收该变体。

该方法还可包括将在一个或多个位置中的取代引入亲本α-淀粉酶中，其中所述取代选自：SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7或8的多肽的W140Y、N195F、V206Y、Y243F、E260G、G304R和G476K，以及回收该变体。

变体可使用本领域中已知的任何诱变方法来制备，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等等。

定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点制造一个或多个(若干个)突变的技术。

定点诱变能够在体外通过PCR完成，所述PCR涉及包含期望突变的寡核苷酸引物的使用。定点诱变也可在体外通过盒诱变进行，所述盒诱变涉及限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的一个位点处裂解以及随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常在质粒和寡核苷酸处消化的限制性酶是相同的，使得质粒的粘性末端和插入序列彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

定点诱变也可通过本领域已知的方法在体内完成。参见，例如，美国专利申请公布No.2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

本发明能够使用任何定点诱变程序。有许多可利用的商品化试剂盒能够用于制备变体。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码受关注的多肽。基因合成能够利用多种技术进行，诸如由Tian等人(2004，Nature 432:1050-1054)描述的基于多元微芯片的技术，以及在光-可编程的微流体芯片上合成和组装寡核苷酸的类似技术。

能够使用已知的诱变、重组、和/或改组方法生成并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入，随后进行有关的筛选程序，诸如那些由以下文献公开的程序：Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry 30:10832-10837美国专利5,223,409；WO 92/06204)和区域定点诱变(Derbyshire等人，1986，Gene 46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量的、自动的筛选方法相结合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变处理的多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的诱变处理的DNA分子可从宿主细胞中回收并使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许多肽中单个氨基酸残基的重要性的快速确定。

半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组这些方面来完成。半合成构建的典型是通过利用合成的多核苷酸片段与PCR技术相结合的方法。因此可从头合成限定的基因区域，而其它区域可使用位点特异性诱变引物进行扩增，而其它区域可经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后多核苷酸亚序列可以被改组。

变体

本发明所需的亲本α-淀粉酶的变体可包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且

(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性。由此，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8的α-淀粉酶相比在低温下具有改善的洗涤性能的变体。

合适的变体可与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。

本文合适的亲本α-淀粉酶的分离的变体可包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性。

合适的变体可与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，合适的变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、诸如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，适用于本发明的变体中的修饰的数量为1至20，例如，1至10和1至5，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。

在一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的两个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的三个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的四个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的五个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的六个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的七个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的八个位置处的修饰诸如取代，以及任选地在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的两个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的三个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的四个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的五个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的六个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的七个或更多个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在另一个实施方案中，合适的变体包含在对应于第109、1、7、280、284、320、323和391位的八个位置处的修饰诸如取代，以及在对应于第140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476位的一个或多个位置处的修饰，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个优选的实施方案中，变体包含在选自1、7、109、280和391的一个、两个、三个、四个或五个位置中的修饰。在一个实施方案中，变体包含在选自1、7、109、280和391的两个、三个、四个或五个位置中的至少一个缺失和至少一个取代。

在一个实施方案中，合适的变体包含在选自7、109、280和391的一个、两个、三个或四个位置处的取代。

在一个实施方案中，合适的变体包含在选自由以下组成的位置的组的位置中的修饰：X1+X7；X1+X109；X1+X280；X1+X284；X1+X320；X1+X323；X1+X391；X109+X280；X109+X284；X109+X320；X109+X323；X109+X391；X7+X109；X7+X280；X7+X284；X7+X320；X7+X323；X7+X391；X280+X284；X280+X320；X280+X323；X280+X391；X284+X320；X284+X323；X284+X391；X320+X323；X320+X391；和X323+X391，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，合适的变体包含在选自由以下组成的位置的组的位置中的修饰：X109+X7+X1；X109+X7+X391；X109+X7+X280；X109+X7+X284；X109+X7+X320；X109+X7+X323；X109+X1+X391；X109+X1+X280；X109+X1+X284；X109+X1+X320；X109+X1+X323；X109+X391+X280；X109+X391+X284；X109+X391+X320；X109+X391+X323；X109+X280+X284；X109+X280+X320；X109+X280+X323；X109+X284+X320；X109+X284+X323；X109+X320+X323；X7+X1+X391；X7+X1+X280；X7+X1+X284；X7+X1+X320；X7+X1+X323；X7+X391+X280；X7+X391+X284；X7+X391+X320；X7+X391+X323；X7+X280+X284；X7+X280+X320；X7+X280+X323；X7+X284+X320；X7+X284+X323；X7+X320+X323；X1+X391+X280；X1+X391+X284；X1+X391+X320；X1+X391+X323；X1+X280+X284；X1+X280+X320；X1+X280+X323；X1+X284+X320；X1+X284+X323；X1+X320+X323；X391+X280+X284；X391+X280+X320；X391+X280+X323；X391+X284+X320；X391+X284+X323；X391+X320+X323；X280+X284+X320；X280+X284+X323；X280+X320+X323；和X284+X320+X323，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，合适的变体包含在选自由以下组成的位置的组的位置中的修饰：X109+X7+X1+X391；X109+X7+X1+X280；X109+X7+X1+X284；X109+X7+X1+X320；X109+X7+X1+X323；X109+X7+X391+X280；X109+X7+X391+X284；X109+X7+X391+X320；X109+X7+X391+X323；X109+X7+X280+X284；X109+X7+X280+X320；X109+X7+X280+X323；X109+X7+X284+X320；X109+X7+X284+X323；X109+X7+X320+X323；X109+X1+X391+X280；X109+X1+X391+X284；X109+X1+X391+X320；X109+X1+X391+X323；X109+X1+X280+X284；X109+X1+X280+X320；X109+X1+X280+X323；X109+X1+X284+X320；X109+X1+X284+X323；X109+X1+X320+X323；X109+X391+X280+X284；X109+X391+X280+X320；X109+X391+X280+X323；X109+X391+X284+X320；X109+X391+X284+X323；X109+X391+X320+X323；X109+X280+X284+X320；X109+X280+X284+X323；X109+X280+X320+X323；X109+X284+X320+X323；X7+X1+X391+X280；X7+X1+X391+X284；X7+X1+X391+X320；X7+X1+X391+X323；X7+X1+X280+X284；X7+X1+X280+X320；X7+X1+X280+X323；X7+X1+X284+X320；X7+X1+X284+X323；X7+X1+X320+X323；X7+X391+X280+X284；X7+X391+X280+X320；X7+X391+X280+X323；X7+X391+X284+X320；X7+X391+X284+X323；X7+X391+X320+X323；X7+X280+X284+X320；X7+X280+X284+X323；X7+X280+X320+X323；X7+X284+X320+X323；X1+X391+X280+X284；X1+X391+X280+X320；X1+X391+X280+X323；X1+X391+X284+X320；X1+X391+X284+X323；X1+X391+X320+X323；X1+X280+X284+X320；X1+X280+X284+X323；X1+X280+X320+X323；X1+X284+X320+X323；X391+X280+X284+X320；X391+X280+X284+X323；X391+X280+X320+X323；X391+X284+X320+X323；和X280+X284+X320+X323，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，合适的变体包含选自以下的一个或多个修饰：X1*、X1A、X7A、X7K、X7E、X7N、X7Q、X7L、X7D、X109A、X109S、X140Y、X181*、X182*、X183*、X184*、X195F、X206Y、X243F、X260G、X280S、X284H、X284R、X284F、X304R、X320A、X320M、X320T、X320V、X320S、X323N、X323R、X323S、X323K、X391A、X391V和X476K，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个具体实施方案中，合适的变体包含选自以下的修饰：X1*+X1A；X1*+X7A；X1*+X109A；X1*+X280S；X1*+X284H；X1*+X320A；X1*+X323N；X1*+X391A；X1A+X7A；X1A+X109A；X1A+X280S；X1A+X284H；X1A+X320A；X1A+X323N；X1A+X391A；X7A+X109A；X7A+X280S；X7A+X284H；X7A+X320A；X7A+X323N；X7A+X391A；X109A+X280S；X109A+X284H；X109A+X320A；X109A+X323N；X109A+X391A；X280S+X284H；X280S+X320A；X280S+X323N；X280S+X391A；X284H+X320A；X284H+X323N；X284H+X391A；X320A+X323N；X320A+X391A；和X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，合适的变体包含选自以下的修饰：X1*+X7A+X109A；X1*+X7A+X280S；X1*+X7A+X284H；X1*+X7A+X320A；X1*+X7A+X323N；X1*+X7A+X391A；X1*+X109A+X280S；X1*+X109A+X284H；X1*+X109A+X320A；X1*+X109A+X323N；X1*+X109A+X391A；X1*+X280S+X284H；X1*+X280S+X320A；X1*+X280S+X323N；X1*+X280S+X391A；X1*+X284H+X320A；X1*+X284H+X323N；X1*+X284H+X391A；X1*+X320A+X323N；X1*+X320A+X391A；X1*+X323N+X391A；X1A+X7A+X109A；X1A+X7A+X280S；X1A+X7A+X284H；X1A+X7A+X320A；X1A+X7A+X323N；X1A+X7A+X391A；X1A+X109A+X280S；X1A+X109A+X284H；X1A+X109A+X320A；X1A+X109A+X323N；X1A+X109A+X391A；X1A+X280S+X284H；X1A+X280S+X320A；X1A+X280S+X323N；X1A+X280S+X391A；X1A+X284H+X320A；X1A+X284H+X323N；X1A+X284H+X391A；X1A+X320A+X323N；X1A+X320A+X391A；X1A+X323N+X391A；X7A+X109A+X280S；X7A+X109A+X284H；X7A+X109A+X320A；X7A+X109A+X323N；X7A+X109A+X391A；X7A+X280S+X284H；X7A+X280S+X320A；X7A+X280S+X323N；X7A+X280S+X391A；X7A+X284H+X320A；X7A+X284H+X323N；X7A+X284H+X391A；X7A+X320A+X323N；X7A+X320A+X391A；X7A+X323N+X391A；X109A+X280S+X284H；X109A+X280S+X320A；X109A+X280S+X323N；X109A+X280S+X391A；X109A+X284H+X320A；X109A+X284H+X323N；X109A+X284H+X391A；X109A+X320A+X323N；X109A+X320A+X391A；X109A+X323N+X391A；X280S+X284H+X320A；X280S+X284H+X323N；X280S+X284H+X391A；X280S+X320A+X323N；X280S+X320A+X391A；X280S+X323N+X391A；X284H+X320A+X323N；X284H+X320A+X391A；X284H+X323N+X391A；和X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1。

优选的变体包含在对应于选自以下的位置的位置中的修饰：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的淀粉酶中的任一者具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:1中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:2中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

优选的变体可包含在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述修饰选自：

H1*+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7K+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7E+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7N+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7Q+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7L+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7D+G109A+N280S+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320M+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320T+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320V+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323R+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320S+E391A；

H1*+G109A+N280S+E391V；

H1*+G109A+W284R+E391A；

H1*+G109A+W284F+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；

H1*+G109A+N280S+W284F+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323N+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323K+E391A；

H1*+G109S+N280S+E391A；

H1*+G109A+W284H+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A；

G7A+W284H+K320A+M323N；

G7A+K320A+M323N；

K320A；

G7A+K320A；

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；

H1*+G109A+N280S+W284H+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+W284R+E391A；和

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:3中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:4中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:5中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:6中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:7中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包含在对应于SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述位置选自：

X1*+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X391V；

X1*+X109A+X284R+X391A；

X1*+X109A+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；

X1*+X109S+X280S+X391A；

X1*+X109A+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；

X7A+X284H+X320A+X323N；

X7A+X320A+X323N；

X320A；

X7A+X320A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；

X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；

X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；

X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且变体与SEQ ID NO:8中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。

优选的是变体包含选自X1*、X1A、X7A、X109A、X280S和X391A的一个、两个、三个、四个或五个位置处的修饰。在一个更优选的实施方案中，在一个、两个、三个、四个或五个位置处的修饰选自X1*、X7A、X109A、X280S和X391A。

在一个方面，合适的变体可包含在对应于以下的位置中的修饰：

X1*+X109A+X280S+X391A，

X1*+X109A+X284H+X391A，

X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，

X1*+X7A+X109A+X280S+X391A和

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X323N+X391A，

其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包括包含在对应于以下的位置中的修饰的SEQ ID NO：1的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，

其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列同一性。

合适的变体可包括包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO：2的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ IDNO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:3的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:4的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:4具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:5的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:5具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:6的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:7的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，变体可包括包含对应于以下的修饰的SEQ ID NO:8的变体：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中编号根据SEQ ID NO:1，并且其中变体与SEQ ID NO:8具有至少80％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的变体还包含在选自140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰。在一个具体的实施方案中，本发明的变体包含选自W140Y/F、R181*、G182*、D183*、G184*、N195F/Y、I206Y/F、Y243F、E260A/D/C/Q/L/M/F/P/S/W/V/G/H/I/K/N/R/T/Y、G304R/K/E/Q和G476E/Q/R/K的一个或多个另外的修饰。本发明的变体还可包含选自G304R、W140YF、E260GHIKNPRTY和G476EQRK的两个、三个或四个位置处的取代。在一个更优选的实施方案例中，所述两个、三个或四个位置处的取代选自G304R、W140Y、E260G和G476K。

本发明的变体可包含对应于以下的修饰：

H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K，

H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+W284H+G304R+E391A+G476K，

H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+K320A+M323N+E391A+G476K，

H1*+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K，和

H1*+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+W284H+G304R+M323N+E391A+G476K，

其中编号根据SEQ ID NO:1，变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8具有至少80％的序列同一性，并且为SEQ ID NO:1的变体。

亲本中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)。在后一种技术中，单个丙氨酸突变被引入分子中的每一残基，并且针对α-淀粉酶活性测试所得到的突变体分子，以鉴定对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还可参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。α-淀粉酶的活性位点或其他生物学相互作用也能通过结构的物理分析进行测定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术，连同推定接触位点氨基酸突变技术一起所测定的。参见，例如，de Vos等人，1992，Science 255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，(1992)FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的特性还能够从与所述亲本相关的多肽的特性的分析中推断。

核酸构建体

核酸构建体可包含编码本发明所需变体的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列，该控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中、在与控制序列相容的条件下表达。可以多种方式操作多核苷酸以提供变体的表达。根据表达载体，在多核苷酸插入载体中之前对所述多核苷酸的操纵可为可取的和必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术为本领域所熟知。

控制序列可为启动子序列，被宿主细胞识别用于表达多核苷酸。启动子序列包含转录控制序列，其介导变体的表达。启动子可为在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，其包括突变型、截短的和杂交体启动子，可得自对宿主细胞同源的或异源的、编码细胞外或细胞内多肽的基因。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的例子是得自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因、大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼胶酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，21-25)。另外的启动子在Gilbert等人，1980，Scientific American 242:74-94和Sambrook等人，1989，同上的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinantbacteria)”中描述。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的例子是得自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉(Aspergillus niger)酸性稳定的α-淀粉酶、黑曲霉(Aspergillusniger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)碱性蛋白酶、米曲霉(Aspergillusoryzae)磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、毒性镰孢菌(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、毒性镰孢菌(Fusarium venenatum)Daria(WO 00/56900)、毒性镰孢菌(Fusarium venenatum)Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II，里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(包括编码曲霉属(Aspergillus)中性α-淀粉酶的基因的经修饰启动子，其中未翻译前导序列被编码曲霉属磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译前导序列所替换；非限制性示例包括包含编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的经修饰启动子，其中未翻译前导序列被编码构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译前导序列所替换)；以及它们的突变的、截短的和杂交启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)，和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子在Romanos等人，1992，Yeast 8:423-488中有所描述。

控制序列还可为合适的转录终止子序列，其被宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的3'-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子是得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

对于酵母宿主细胞优选的终止子得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。Romanos等人，1992，同上描述了对于酵母宿主细胞有用的其它终止子。

控制序列还可为合适的前导序列，对通过宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。所述前导序列可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的5'-末端。可使用在宿主细胞中有功能性的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列得自米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)磷酸丙糖异构酶的基因。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

所述控制序列还可为聚腺苷酸化序列，序列可操作地连接至编码变体的序列的3'-末端，并且当被转录时被宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至被转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能性的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，Mol.CellularBiol.15:5983-5990中有所描述。

所述控制序列还可为信号肽编码区，其编码连接至变体的N-末端的信号肽并指导所述变体进入细胞的分泌途径中。多核苷酸的编码序列的5'-末端可固有地包含信号肽编码区，其与编码变体的编码区的片段天然地连接在翻译阅读框中。另选地，编码序列的5'-末端可包含信号肽编码区，其对该编码序列是外源的。在编码序列天然不包含信号肽编码区的情况下，需要外源信号肽编码区。作为另外一种选择，外源信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可使用指导被表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。

对于细菌宿主细胞，有效的信号肽编码序列是得自芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)prsA的基因的信号肽编码序列。另外的信号肽在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57:109-137中有所描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶、和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因的信号肽编码序列。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。由Romanos等人，1992，同上描述了其它有用的信号肽编码序列。

控制序列还可为前肽编码区，其编码定位在变体的N-末端的前肽。所得的多肽被称为酶原或多肽原(或有时候为酵素原)。多肽原是大体失活的，并且能够通过来自多肽原的多肽的催化或自催化裂解转变为活性多肽。前肽编码区可得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和啤酒糖酵母α-因子的基因。

在信号肽和前肽区同时在变体的N-末端处存在的情况下，前体区定位在紧挨变体的N-末端，并且信号肽区定位在紧挨前肽区的N-末端。

添加调控序列还可为可取的，其允许调控相对于宿主细胞的生长的变体的表达。调控系统的示例是使得基因的表达打开或关闭响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)的那些。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，也可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其它示例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与所述调控序列可操作地连接。

表达载体

重组表达载体可包含本发明所需的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号。可将各种核苷酸和控制序列结合在一起以制备重组表达载体，其可包括一个或多个(若干个)方便的限制性位点以允许在此类位点插入或取代编码变体的多核苷酸。作为另外一种选择，可通过将所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入合适的用于表达的载体中来表达所述多核苷酸。在创建表达载体中，所述编码序列位于载体中使得所述编码序列与合适的用于表达的控制序列可操作地连接。

重组表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便的经过重组DNA步骤并可形成多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与被导入所述载体的宿主细胞的相容性。载体可为线性或封闭的环形质粒。

载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。所述载体可包含用于确保自我复制的任何手段。作为另外一种选择，所述载体可为一种载体，当其被导入宿主细胞中时被整合进基因组中并连同已经被整合进的染色体一起复制。此外，可使用单个载体或质粒、或者一起包含被导入宿主细胞的基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒、或者转座子。

载体优选地包含一个或多个(若干个)选择性标记，其允许简单选择转化的，转染的，转导等的细胞。选择性标记是一个基因，其产物提供了生物灭杀剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等等。

细菌选择性标记的示例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。对于酵母宿主细胞合适的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。

载体优选地包含元件，其允许载体整合至宿主细胞基因组或在细胞中独立于基因组自主复制载体。

对于整合进入宿主细胞基因组，载体可依赖于编码变体的多核苷酸的序列或载体的任何其他元件，通过同源或非同源重组整合进基因组。作为另外一种选择，载体可包含另外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组在染色体的精确位置整合进入宿主细胞的基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应包含足够数量的核酸，诸如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与对应的靶序列具有高度的同一性以提高同源重组的概率。所述整合元件可为与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可为非编码或编码核苷酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组被整合进宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，所述载体还可包含复制起点，使得所述载体在所考虑的宿主细胞中自主复制。所述复制起点可为在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使得质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。

可将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的制备。可通过将序列的至少一个附加拷贝整合进宿主细胞基因组中、或在细胞包含选择性标记基因的扩增拷贝的情况下通过包含所述多核苷酸的可扩增的选择性标记基因来获得所述多核苷酸拷贝数的增加，从而能够通过在合适的选择性试剂的存在下培养所述细胞而选择所述多核苷酸的附加拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的过程是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等人，1989，同上)，以获得基本上纯的变体。

宿主细胞

重组宿主细胞可包含本发明所需的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列，所述控制序列指导本发明变体产生。如前面所述，将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中使得构建体或载体保持为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码所述变体的基因和它的来源。

宿主细胞可为在变体的重组制备中有用的任何细胞，例如，原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属。

细菌宿主细胞可为任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

细菌宿主细胞还可为任何链球菌属(Streptococcus)细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可为任何链霉菌属(Streptomyces)细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

将DNA导入芽孢杆菌属细胞可例如通过原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，通过使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，通过电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)，或通过结合(参见，例如Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278)实现。将DNA导入大肠杆菌细胞可例如通过原生质体转化(参见例如Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见例如Dower等人，1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)实现。将DNA导入链霉菌属细胞可例如通过原生质体转化和电穿孔(参见例如Gong等人，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，通过结合(参见例如Mazodier等人，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或通过转导(参见例如Burke等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)实现。将DNA导入假单胞菌属细胞可例如通过电穿孔(参见例如Choi等人，2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或通过结合(参见例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)实现。将DNA导入链球菌属细胞可例如通过自然感受态(参见例如Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，通过原生质体转化(参见例如Catt和Jollick,1991,Microbios 68:189-2070)，通过电穿孔(参见例如Buckley等人，1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或通过结合(参见例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)实现。然而，可使用本领域已知的用于将DNA导入宿主细胞中的任何方法。

所述宿主细胞还可为真核细胞，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法，以本身已知的方式转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属(Trichoderma)宿主细胞的合适的过程在EP238023和Yelton等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474中有所描述。用于转化镰孢属(Fusarium)菌种的合适的方法在Malardier等人，1989,Gene 78:147-156和WO96/00787中有所描述。可使用Becker和Guarente,In Abelson,J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology，第194卷,第182-187页，Academic Press,Inc.,New York；Ito等人，1983,J.Bacteriol.153:153-163；和Hinnen等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920所述的过程转化酵母。

制备方法

制备变体的方法可包括：(a)在适于变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收变体。因此，本发明涉及制备变体的方法，该方法包括：(a)在适于变体表达的条件下，培养包含表达载体或编码变体的多核苷酸的宿主细胞，所述变体包含在对应于SEQID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰；以及(b)回收变体。

使用本领域已知的方法在适于制备所述变体的营养培养基中培养所述宿主细胞。例如，细胞可以在实验室或工业发酵罐中，在合适的培养基中和在允许多肽被表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、或小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批或固态发酵)进行培养。在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域已知的程序进行培养。合适的培养基可购自商业供应商或可根据公布的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果所述变体被分泌到营养培养基中，可从培养基中直接回收所述变体。如果所述变体不是分泌的，可从细胞裂解物中回收它。

可使用本领域已知的对所述变体为特异性的方法检测所述变体。这些检测方法可包括使用特异性抗体、形成酶产物或酶底物的消失。例如，可使用酶测定以确定所述变体的活性。

可通过本领域中已知的方法回收变体。例如，可通过常规程序(包括但不限于采集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从营养培养基回收所述变体。

可通过本领域中已知的多种方法，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和体积排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers,New York,1989)纯化变体，以获得基本上纯的变体。

在一个可供选择的方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明的宿主细胞作为变体源。

所述组合物可根据本领域已知的方法制备，并且可为液体形式或干燥组合物的形式。例如，所述组合物可以是粒状或微粒状的形式。所述变体可以根据本领域中已知的方法被稳定化。

清洁组合物

本发明优选涉及用于毛发护理、汽车护理、盘碟洗涤、织物调理(包括软化)、衣物去污、衣物洗涤和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理、以及其他用于消费者清洁或机构使用的产品和/或涉及和/或使用受权利要求书保护的组合物的方法。根据本发明，上述α-淀粉酶变体通常可为清洁组合物(如固体、液体、凝胶和/或单位剂量洗涤剂组合物)，例如衣物洗涤剂组合物或盘碟洗涤剂组合物中的组分。尤其优选的是液体衣物洗涤剂组合物。

此类清洁组合物包含清洁/洗涤剂助剂，优选为组分的混合物。通常所述清洁助剂以0.001至99.9重量％，更典型地0.01至80重量％的清洁助剂的量存在于所述组合物中。合适的清洁助剂包括：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白催化剂、着色剂、漂白增强剂、螯合剂、染料转移剂、沉积助剂、分散剂、附加酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、光学增白剂、光活化剂、荧光剂、织物调色剂、织物调理剂、预成形过酸、聚合分散剂、粘土污垢移除/抗再沉积剂、填料盐、水溶助长剂、增白剂、抑泡剂、结构增弹剂、织物软化剂、水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、防缩水剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗晦暗剂、抗腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、染料、香料和pH控制剂、胶囊、聚合物。例如，这些可包括：漂白成分诸如亚胺漂白增效剂；过氧化氢源如过碳酸盐和/或过硼酸盐，尤其是用材料如碳酸盐和/或硫酸盐、硅酸盐、硼硅酸盐和它们的任何混合物涂覆过的过碳酸盐；预成形过酸，包括胶囊形式的预成形过酸；过渡金属催化剂；抑泡剂或抑泡剂体系，诸如基于硅氧烷的抑泡剂和/或基于脂肪酸的抑泡剂；织物软化剂，诸如粘土、硅氧烷和/或季铵化合物；絮凝剂，诸如聚环氧乙烷；染料转移抑制剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚4-乙烯基吡啶N-氧化物和/或乙烯基吡咯烷酮和乙烯基咪唑的共聚物；织物完整组分，例如通过咪唑和表氯醇缩合产生的低聚物；污垢分散剂和污垢抗再沉积助剂例如烷氧基化的聚胺和乙氧基化的乙烯亚胺聚合物；抗再沉积组分，诸如聚酯；羧酸酯聚合物，诸如马来酸聚合物或马来酸和丙烯酸共聚物；香料，诸如香料微胶囊、淀粉胶囊包封物、香料喷雾；皂环；美学颗粒；染料；填料如硫酸钠，但是优选的是所述组合物基本上不含填料；硅酸盐，诸如硅酸钠，包括1.6R和2.0R硅酸钠，或偏硅酸钠；二羧酸和二醇的共聚酯；纤维素聚合物诸如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、或其他烷基或烷基烷氧基纤维素；溶剂如1,2丙二醇、单乙醇胺；二乙二醇、乙醇、以及它们的任何混合物；水溶助长剂，诸如异丙苯磺酸钠、二甲苯磺酸钠、甲苯磺酸钠、以及任何混合物；有机酸如柠檬酸；以及它们的任何组合。组合物可使得清洁助剂包括选自下列的一种或多种：(i)香料微胶囊；(ii)织物调色剂；(iii)蛋白酶；(iv)两亲性清洁聚合物；(v)脂肪酶，或(vi)它们的混合物。

在另一个优选的方面所述组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子和/或两性和/或半极性非离子和/或它们的混合物。表面活性剂通常以0.1重量％至60重量％，或0.5重量％至50重量％或1至40重量％组合物的含量存在。

当包括在清洁组合物中时，洗涤剂将通常包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸盐、α烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、脂肪醇乙氧基硫酸酯、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基丁二酸或皂。

虽然本文包括的清洁剂通常将包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物、乙氧基化壬基苯酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的正烷基正烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

清洁组合物可包含一种或多种其他酶。因此，优选的组合物包含(a)亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第109、1、7、280、284、320、323和391位的一个或多个位置处，以及任选地在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的第140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476位的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)一种或多种附加的酶，其优选地选自氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳醣苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。可生产附加的酶，例如通过属于以下属的微生物：曲霉属(Aspergillus)，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillusoryzae)；镰孢霉属(Fusarium)，例如杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(FusariumcuImorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、或镶片镰孢(Fusarium venenatum)；腐质霉属(Humicola)，例如特异腐质霉(Humicola insolens)或疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)；或木霉属(Trichoderma)，例如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)。

优选地，组合物包含蛋白酶或多于一种蛋白酶的混合物、脂肪酶或多于一种脂肪酶的混合物、过氧化物酶或多于一种过氧化物酶的混合物，一种或多种附加的淀粉分解酶(例如附加的α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶(优选附加的α淀粉酶)、一种或多于一种环糊精葡萄糖基转移酶的混合物和/或纤维素酶或多于一种纤维素酶的混合物、甘露聚糖酶(诸如MANNAWAY^TM，得自Novozymes,Denmark)或多于一种甘露聚糖酶的混合物、果胶酶、果胶酸裂解酶、角质酶和/或漆酶，或一种或多种这些的多于一种的混合物。

所选择酶的特性通常将与所选择的洗涤剂相容(即最适pH，与其他酶或非酶成分相容等)，并且该酶将是有效量的。优选地，本发明的产物包含至少0.01mg，优选约0.05mg至约10mg，更优选约0.1mg至约6mg，尤其约0.2mg至约5mg的另外活性酶/g组合物。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶，包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，诸如枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)。合适的蛋白酶包括动物源、植物源或微生物源的那些。在一个方面，此类合适的蛋白酶可为微生物源。合适的蛋白酶包括前述合适蛋白酶的经化学修饰或基因修饰的突变体。在一个方面，合适的蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，诸如碱性微生物蛋白酶或/和胰蛋白酶型蛋白酶。合适的中性或碱性蛋白酶的示例包括：

(a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)，包括来源于芽孢杆菌属的那些，如US 6,312,936 B1、US 5,679,630、US 4,760,025、US 7,262,042和WO09/021867中所述的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌。

(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，例如胰蛋白酶(例如源自猪或牛)，包括WO 89/06270中所述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶，以及WO 05/052161和WO 05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶。

(c)金属蛋白酶，包括WO 07/044993A2中所述的来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的那些。

优选的蛋白酶包括来源于吉氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的那些。

适宜的可商购获得的蛋白酶包括以商品名

Liquanase

Savinase

和

由Novozymes A/S(Denmark)出售的那些，以商品名

Purafect

Purafect

和Purafect

由Genencor International出售的那些，以商品名

和

由SolvayEnzymes出售的那些，得自Henkel/Kemira的那些即BLAP(序列示于US 5,352,604图29中，具有下列突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文称为BLAP)、BLAP R(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的BLAP)、BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)和BLAP F49(具有S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D的BLAP)-均得自Henkel/Kemira；以及来自Kao的KAP(具有突变A230V+S256G+S259N的嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。更多的适合的蛋白酶描述于WO2011/03623、WO2011/140316、WO2011/140364和WO2012/05778中。

脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。可用脂肪酶的示例包括来自腐质霉属(同义词嗜热真菌属(Thermomyces))的脂肪酶例如来自绵毛状腐质霉(H.lanuginosa)(疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))或来自特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、施氏假单孢菌(P.stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)菌株SD 705，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)的脂肪酶，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)的脂肪酶。

所述脂肪酶可为“第一循环脂肪酶”，如美国专利公开6,939,702 B1和美国专利申请2009/0217464中所述。在一个方面，脂肪酶为第一洗涤脂肪酶，优选为来自包含T231R和N233R突变的疏棉状嗜热丝孢菌的野生型脂肪酶变体。野生型序列是Swissprot登录号为Swiss-Prot O59952(来源于疏绵状嗜热丝孢菌(棉毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)))的269个氨基酸(氨基酸23–291)。优选的脂肪酶将包括以商品名

和

出售的那些。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、草根霉属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。

在一个方面，优选的酶包括源自微生物的内切葡聚糖酶，其表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性(E.C.3.2.1.4)，优选地选自：

(a)对芽孢杆菌属的成员内源性的细菌多肽，其具有与US 7,141,403B2中的氨基酸序列SEQ ID NO:2的至少90％、94％、97％和甚至99％的同一性的序列；

(b)对木葡聚糖和无定形纤维素底物都具有酶活性的糖基水解酶，其中所述糖基水解酶选自GH家族5、12、44或74；

(c)具有与WO09/148983中氨基酸序列SEQ ID NO:3有至少90％、94％、97％和甚至99％的同一性的序列的糖基水解酶；

(d)以及它们的混合物。

合适的内葡聚糖酶以商品名

和

(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)出售。

其他可商购获得的纤维素酶包括

和

(NovozymesA/S)，

和PURADAX

(Genencor International Inc.)，以及KAC-

(Kao Corporation)。

其他淀粉酶：优选地，组合物包含另外的淀粉酶。适宜的另外淀粉酶包括α-淀粉酶，包括细菌来源或真菌来源的。包括经化学修饰或基因修饰的突变体(变体)。优选的碱性α-淀粉酶来源于芽孢杆菌的菌株，诸如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或其他芽孢杆菌属，诸如芽孢杆菌属NCBI 12289、NCBI 12512、NCBI12513、DSM 9375(USP 7,153,818)DSM 12368、DSMZ no.12649、KSM AP1378(WO 97/00324)、KSM K36或KSM K38(EP 1,022,334)。优选的另外淀粉酶可选自：(a)描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO96/23874和WO 97/43424中的变体，尤其是相对于WO 96/23874中如SEQ IDNo.2所列的酶，在下列一个或多个位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444；(b)WO 96/23873、WO00/60060、WO06/002643和WO2017/192657中所述的变体，尤其是相对于WO 06/002643中如SEQ ID No.12所列的AA560酶，在下列位置中具有一个或多个取代的变体：26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、203、214、231、246、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、461、471、482、484，所述变体优选地还包含D183*和G184*的缺失；(c)与WO06/002643中的SEQ ID No.4表现出至少90％的同一性的变体，来自芽孢杆菌属SP722的野生型酶，尤其是在第183和184位具有缺失的变体，以及WO 00/60060中描述的变体，将所述文献以引用方式并入本文；(d)与来自芽孢杆菌属707的野生型酶(US 6,093,562中的SEQ ID NO:7)表现出至少95％的同一性的变体，尤其是包含下列突变M202、M208、S255、R172和/或M261中的一个或多个的那些。优选地，所述淀粉酶包含M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、M202W、S255N和/或R172Q中的一个或多个。尤其优选的是包含M202L或M202T突变的那些；(e)描述于WO 09/149130中的变体，优选地与WO 09/149130中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表现出至少90％的同一性的那些，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的野生型酶或其截短型式；(f)与WO2016091688中的SEQ ID NO:1表现出至少89％的同一性的变体，尤其是包含在第H183+G184位处的缺失以及在第405、421、422和/或428位处的附加的一个或多个突变的那些；(g)与来自解凝乳类芽胞杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus)YK9的“PcuAmylα-淀粉酶”(WO2014099523中的SEQ IDNO:3)表现出至少60％的氨基酸序列同一性的变体；(h)与来自噬纤维菌属(Cytophagasp.)的“CspAmy2淀粉酶”(WO2014164777中的SEQ ID NO:1)表现出至少60％的氨基酸序列同一性的变体；(i)与来自枯草芽孢杆菌的AmyE(WO2009149271中的SEQ ID NO:1)表现出至少85的％同一性的变体；(j)与来自登录号AB051102的芽孢杆菌属KSM-K38的野生型淀粉酶表现出至少90％的同一性的变体；(k)与来自芽孢杆菌属的AAI10(WO2016180748中的SEQID NO:7)的成熟氨基酸序列表现出至少80％的同一性的变体；(l)与脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus sp.)淀粉酶(WO2016180748中的SEQ ID NO:8)的成熟氨基酸序列表现出至少80％的同一性的变体；或它们的混合物。在存在的情况下，本发明的组合物优选地包含至少0.01mg，优选约0.05mg至约10mg，更优选约0.1mg至约6mg，尤其是约0.2mg至约5mg的另外活性淀粉酶/g组合物。

适宜的可商购获得的α-淀粉酶包括

TERMAMYL

STAINZYME

和

(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)、

AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbHWehlistrasse 27b A-1200 Wien Austria、

OPTISIZE HT

PREFERENZ

系列(包括PREFERENZ

以及PREFERENZ

和PURASTAR

(DuPont，Palo Alto，California)和

(Kao，14-10 Nihonbashi Kayabacho，1-chome，Chuo-ku Tokyo 103-8210，Japan)。在一个方面，适合的淀粉酶包括

和STAINZYME

以及它们的混合物。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌起源的酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。可用的过氧化物酶的示例包括来自鬼伞的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中所述的那些。

可商购获得的过氧化物酶包括

(Novozymes A/S)。

其他酶：其他优选的酶包括以商品名

出售的果胶酸裂合酶和以商品名

出售的甘露聚糖酶(均得自Novozymes A/S(Bagsvaerd，Denmark))和

(Genencor International Inc.(Palo Alto，California))。

可通过加入包含一种或多种酶的单独添加剂或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂，即，单独添加剂或组合添加剂配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，具体地讲无粉尘颗粒，液体，具体地讲稳定液体，或浆液。

可制备无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的示例为聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其具有1000至20000平均摩尔量；乙氧基化的壬基酚具有16个至50个环氧乙烷单位；乙氧基化的脂肪醇，其中所述醇包含12个至20个碳原子并且其中有15个至80个环氧乙烷单位；脂肪醇、脂肪酸；和脂肪酸甘油一酯和甘油二酯和甘油三酯。成膜涂覆材料可例如通过流化床技术来施加。例如液体酶制备可根据已建立的方法，通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。

组合物可包含织物调色剂(有时被称为遮光剂、上蓝剂或美白剂)。调色剂通常向织物提供蓝色或紫色色调。调色剂能够单独使用或组合使用，以产生特定的调色色调和/或对不同的织物类型调色。这可例如通过将红色和蓝绿色染料混合以产生蓝色或紫色色调来提供。调色剂可选自任何已知化学类别的染料，包括但不限于吖啶、蒽醌(包括多环醌类)、吖嗪、偶氮(例如，单偶氮、双偶氮、三偶氮、四偶氮、多偶氮)、包括预金属化偶氮、苯并二呋喃和苯并二呋喃酮、类胡萝卜素、香豆素、花菁、二氮杂半花菁、二苯甲烷、甲臜、半花菁、靛蓝类、甲烷、萘酰亚胺、萘醌、硝基和亚硝基、噁嗪、酞菁、吡唑类、二苯乙烯、苯乙烯基、三芳基甲烷、三苯甲烷、氧杂蒽以及它们的混合物。

合适的织物调色剂包括染料、染料-粘土缀合物、以及有机颜料和无机颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自以下的小分子染料：属于染料索引(C.I.)分类的直接、碱性、活性、或水解的活性、溶剂或分散染料(例如被分类为蓝、紫、红、绿或黑的)并且单独地或组合地提供所期望的色调的染料。在另一方面，合适的小分子染料包括选自染料索引(英国布拉德福德的染色工作者学会(Society of Dyersand Colourists，Bradford，UK))的下列编号的小分子染料：直接紫染料，诸如9、35、48、51、66、和99；直接蓝染料，诸如1、71、80和279；酸性红染料，诸如17、73、52、88和150；酸性紫染料，诸如15、17、24、43、49和50；酸性蓝染料，诸如15、17、25、29、40、45、75、80、83、90和113；酸性黑染料，诸如1；碱性紫染料，诸如1、3、4、10和35；碱性蓝染料，诸如3、16、22、47、66、75和159；分散或溶剂染料，诸如EP1794275或EP1794276中所描述的那些；或如US 7,208,459B2中所公开的染料；以及它们的混合物。在另一方面，合适的小分子染料包括选自下列的小分子染料：染料索引编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或它们的混合物。

合适的聚合物染料包括选自以下的聚合物染料：包含共价结合(有时称为缀合)的色原体的聚合物(染料-聚合物缀合物)(例如具有共聚至该聚合物主链中的色原体的聚合物)以及它们的混合物。聚合物染料包括描述于WO2011/98355、WO2011/47987、US2012/090102、WO2010/145887、WO2006/055787和WO2010/142503中的那些。

在另一方面，合适的聚合物染料包括选自以下的聚合物染料：以商品名

(Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA)销售的织物-实体着色剂、由至少一种活性染料和聚合物形成的染料-聚合物缀合物，该聚合物选自包含以下部分的聚合物，该部分选自羟基部分、伯胺部分、仲胺部分、硫醇部分以及它们的混合物。在另一方面，合适的聚合物染料包括选自以下的聚合物染料：

Violet CT，共价结合到活性蓝、活性紫或活性红染料的羧甲基纤维素(CMC)诸如与C.I.活性蓝19缀合的CMC(由Megazyme(Wicklow，Ireland)以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC销售)、烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂、烷氧基化的噻吩聚合物着色剂、以及它们的混合物。

优选的调色染料包括可见于US2008/0177090的烷氧基化噻吩偶氮增白剂，其可任选地为阴离子，诸如选自WO2011/011799的表5中实施例1-42的那些。其他优选的染料公开于US 8138222中。

合适的染料粘土缀合物包括选自以下的染料粘土缀合物：至少一种阳离子/碱性染料和绿土粘土、以及它们的混合物。在另一方面，合适的染料粘土缀合物包括选自以下的染料粘土缀合物：一种阳离子/碱性染料，其选自：C.I.碱性黄1至108，C.I.碱性橙1至69，C.I.碱性红1至118，C.I.碱性紫1至51，C.I.碱性蓝1至164，C.I.碱性绿1至14，C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11以及粘土，该粘土选自蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、皂石粘土以及它们的混合物。在另一个方面，合适的染料粘土缀合物包括选自以下的染料粘土缀合物：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595缀合物、蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015缀合物、蒙脱石碱性紫V3C.I.42555缀合物、蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040缀合物、蒙脱石碱性红R1 C.I.45160缀合物、蒙脱石C.I.碱性黑2缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015缀合物、锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555缀合物、锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040缀合物、锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160缀合物、锂蒙脱石C.I.碱性黑2缀合物、皂碱性蓝B7C.I.42595缀合物、皂碱性蓝B9 C.I.52015缀合物、皂碱性紫V3 C.I.42555缀合物、皂碱性绿G1 C.I.42040缀合物、皂碱性红R1 C.I.45160缀合物、皂C.I.碱性黑2缀合物，以及它们的混合物。

合适的颜料包括选自以下的颜料：黄烷士酮、靛蒽酮、包含1至4个氯原子的氯化靛蒽酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中所述酰亚胺基团可为未取代的或者被C1至C3的烷基或苯基或杂环基取代，并且其中苯基和杂环基可另外带有不提供水中溶解度的取代基)、蒽嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可包含至多2个氯原子的铜酞菁、每个分子包含至多14个溴原子的多氯铜酞菁或多溴氯铜酞菁、以及它们的混合物。

在另一方面，合适的颜料包括选自以下的颜料：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)以及它们的混合物。助洗剂——清洁组合物还可包含助洗剂，例如基于碳酸盐、碳酸氢盐、或硅酸盐的助洗剂，所述硅酸盐可为沸石，例如沸石A、沸石MAP(最大铝型P)。在衣物洗涤中可用的沸石优选具有下式：Na₁₂(AlO₂)₁₂(SiO₂)₁₂·27H₂O并且沸石A的粒度通常介于1-10μm之间并且沸石MAP的粒度通常介于0.7-2um之间。其他助洗剂是强碱性偏硅酸钠(Na₂SiO₃·nH₂O或Na₂Si₂O₅·n H₂O)并且优选地用于盘碟洗涤。在优选的实施方案中，洗涤剂助剂的量可为高于5％，高于10％，高于20％，高于30％，高于40％或高于50％，并且可为低于80％，65％。在盘碟洗涤洗涤剂中，助洗剂的含量通常为40-65％，具体地讲50-65％或甚至75-90％。

包封物-所述组合物可包含包封物。在一个方面，包封物包括芯、具有内表面和外表面的壳，所述壳包封所述芯。

在所述包封物的一个方面，所述芯可包含选自以下的材料：香料；增白剂；染料；驱虫剂；硅氧烷；蜡；风味剂；维生素；织物软化剂；皮肤护理剂，在一个方面，石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感觉剂；以及它们的混合物；并且所述壳可包含选自下列的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面所述氨基塑料可包含聚脲、聚氨酯、和/或聚脲氨酯，在一个方面所述聚脲可包括聚甲醛脲和/或三聚氰胺甲醛树脂；聚烯烃；多糖，在一个方面所述多糖可包括藻酸盐和/或脱乙酰壳多糖；明胶；紫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；硅氧烷；以及它们的混合物。

在所述包封物的一个方面，所述芯可包含香料。此类包封物是香料微胶囊。

在所述包封物的一个方面，所述壳可包含三聚氰胺甲醛和/或交联三聚氰胺甲醛。

在一个方面，公开了可包含芯材料和壳的适宜包封物，所述壳至少部分包围所述芯材料。至少75％，85％或甚至90％的所述包封物具有约0.2MPa至约10MPa，约0.4MPa至约5MPa，约0.6MPa至约3.5MPa，或甚至约0.7MPa至约3MPa的破裂强度；以及0％至约30％，0％至约20％，或甚至0％至约5％的有益剂渗漏度。

在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约1微米至约80微米，约5微米至60微米，约10微米至约50微米，或甚至约15微米至约40微米的粒度。

在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约30nm至约250nm，约80nm至约180nm，或甚至约100nm至约160nm的颗粒壁厚。

在一个方面中，所述包封物的芯材料可包含选自以下的材料：香料原料和/或任选的物质，所述任选的物质选自：植物油(包括纯植物油和/或混合的植物油)，包括蓖麻子油、椰油、棉籽油、葡萄油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油以及它们的混合物；植物油的酯，酯类，包括己二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、丁基苄基己二酸酯、苄基辛基己二酸酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯以及它们的混合物；直链或支链烃，包括那些沸点大于约80℃的直链或支链烃；部分氢化的三联苯、邻苯二甲酸二烷基酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化萘(包括二丙基萘)、石油溶剂油(包括煤油、矿物油)以及它们的混合物；芳族溶剂，包括苯、甲苯以及它们的混合物；硅油；以及它们的混合物。

在一个方面，所述包封物的壁材料可包括适宜的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适宜的醛包括甲醛。合适的胺包括三聚氰胺、脲、苯胍胺、甘脲、以及它们的混合物。合适的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺以及它们的混合物。合适的脲包括二羟甲基脲、甲基化二羟甲基脲、脲-间苯二酚、以及它们的混合物。

在一个方面，适合的甲醛清除剂可与所述包封物一起使用，例如，在所述包封物被加入到此类消费产品之前、期间或之后在胶囊悬浮液中和/或加入到消费产品。

适宜的胶囊可购自Appleton Papers Inc.(Appleton，Wisconsin，USA)。

此外，用于制备前述包封物的材料可以从Solutia Inc.(St Louis，MissouriU.S.A.)、Cytec Industries(West Paterson，New Jersey U.S.A.)、sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri U.S.A.)、CP Kelco Corp.(San Diego，California，USA)；BASF AG(Ludwigshafen，Germany)；Rhodia Corp.(Cranbury，New Jersey，USA)；Hercules Corp.(Wilmington，Delaware，USA)；Agrium Inc.(Calgary，Alberta，Canada)、ISP(New JerseyU.S.A.)、Akzo Nobel(Chicago，IL，USA)；Stroever Shellac Bremen(Bremen，Germany)；Dow Chemical Company(Midland，MI，USA)；Bayer AG(Leverkusen，Germany)；Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，Missouri，USA)获得。

在一个方面，所述组合物可包含酶稳定剂，所述酶稳定剂选自：(a)无机盐，所述无机盐选自：钙盐、镁盐、以及它们的混合物；(b)碳水化合物，所述碳水化合物选自：低聚糖、多糖、以及它们的混合物；(c)高效可逆蛋白酶抑制剂，所述高效可逆蛋白酶抑制剂选自：苯基硼酸及其衍生物；以及(d)它们的混合物。

在另一个实施方案中，组合物包含：(1)可逆蛋白酶抑制剂，诸如含硼化合物；(2)1-2丙二醇；(3)甲酸钙和/或甲酸钠；以及(4)它们的任意组合。

在一个方面，所述组合物可包含结构剂，所述结构剂选自：甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、以及它们的混合物。

聚合物

消费产品可包含一种或多种聚合物。示例是羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物以及两亲性聚合物。

两亲性清洁聚合物

优选地，两亲性清洁聚合物为具有以下通式结构的化合物：双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)，其中n＝20至30，并且x＝3至8，或它们的硫酸化或磺酸化变体。

本发明的两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是指任何具有平衡的亲水性和疏水性的烷氧基化的聚合物，使得它们从织物和表面移除油脂颗粒。本发明的两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施方案包括芯结构和多个连接至该芯结构的烷氧基化物基团。这些可包括烷氧基化的聚亚烷基亚胺，优选地具有内部聚亚乙基氧嵌段和外部聚亚丙基氧嵌段。

芯结构可包括聚亚烷基亚胺结构，其以密集的形式包含式(I)、(II)、(III)和(IV)的重复单元：

其中#在各种情况下，表示介于分子式(I)、(II)、(III)或(IV)的两个邻近重复单元的氮原子和基团A¹的自由结合位置之间的半个键；*在各种情况下指示其中一个烷氧基化物基团的半个键；并且A¹独立地选自直链或支化的C₂-C₆-亚烷基；其中聚亚烷基亚胺结构由1个分子式(I)的重复单元、x个分子式(II)的重复单元、y个分子式(III)的重复单元和y+1个分子式(IV)的重复单元组成，其中在各种情况下x和y具有在0至约150范围内的值；其中聚亚烷基亚胺芯结构的平均重均分子量Mw为约60g/mol至约10,000g/mol范围内的值。

作为另一种选择，芯结构可包含至少一种选自式(I.a)和/或(I.b)N-(羟烷基)胺的化合物的缩合产物的聚链烷醇胺结构，

其中A独立地选自C₁-C₆-亚烷基；R¹、R¹*、R²、R²*、R³、R³*、R⁴、R⁴*、R⁵和R⁵*独立地选自氢、烷基、环烷基或芳基，其中最后三个提到的基团可被任选地取代；并且R⁶选自氢、烷基、环烷基或芳基，其中最后三个提到的基团可被任选地取代。

连接至芯结构的多个亚烷氧基基团独立地选自式(V)的亚烷氧基单元，

其中*在各种情况下，表示键合到式(I)、(II)或(IV)的重复单元的氮原子上的半个键；在各种情况下，A²独立地选自1,2-亚丙基、1,2-亚丁基和1,2-异亚丁基；A³是1,2-亚丙基；在各种情况下，R独立地选自氢和C₁-C₄-烷基；m具有在0至约2范围内的平均值；n具有在约20至约50范围内的平均值；p具有在约10至约50范围内的平均值。

两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施方案可选自具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段的烷氧基化聚亚烷基亚胺，乙氧基化度和丙氧基化度不会超过或低于具体的限定值。根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺的具体实施方案具有约0.6的聚亚乙基嵌段与聚亚丙基嵌段的最小比率(n/p)和约1.5(x+2y+1)^1/2的最大比率。已发现，n/p比率为约0.8至约1.2(x+2y+1)^1/2的烷氧基化聚亚烷基亚胺具有尤其有益的特性。

根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺具有主链，所述主链由伯胺、仲胺和叔胺氮原子组成，其通过亚烷基基团A互相连接并且是无规排列的。伯氨基部分，其是聚亚烷基亚胺主链的主链和侧链的起始点或终结点并且其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元取代，这样的部分分别被称为式(I)或(IV)的重复单元。仲氨基部分，其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元取代，被称为式(II)的重复单元。叔氨基部分，其使主链和侧链分支，被称为式(III)的重复单元。

由于在聚亚烷基亚胺主链的形成中会发生环化，在主链中还可能存在少量的环状氨基部分。当然，包含环状氨基部分的此类聚亚烷基亚胺以与由非环状伯氨基和仲氨基部分组成的那些相同的方式烷氧基化。

由氮原子和基团A¹组成的聚亚烷基亚胺主链具有约60至约10,000g/mol，优选约100至约8,000g/mol，并且更优选约500至约6,000g/mol的平均分子量Mw。

总和(x+2y+1)对应于存在于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中的亚烷基亚胺单元的总数，从而直接与所述聚亚烷基亚胺主链的分子量相关。然而，在本说明书中给出的值涉及所述混合物中存在的所有聚亚烷基亚胺的平均数。总和(x+2y+2)对应于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中存在的氨基的总数。

连接氨基氮原子的基团A¹可以是相同或不同的、直链或支化的C₂-C₆-亚烷基基团，如1,2-亚乙基、1,2-亚丙基、1,2-亚丁基、1,2-亚异丁烯、1,2-亚戊基、1,2-亚己基、或六亚甲基。优选的支化亚烷基是1,2-亚丙基。优选的直链亚烷基是亚乙基和六亚甲基。更优选的亚烷基是1,2-亚乙基。

聚亚烷基亚胺主链的伯胺基和仲胺基的氢原子被式(V)的亚烷氧基单元取代。

在该式中，所述变量优选具有以下所给出的含义之一：

在各种情况下，A²选自1,2-亚丙基、1,2-亚丁基和1,2-亚异丁基；优选地A²是1,2-亚丙基。A³是1,2-亚丙基；在各种情况下R选自氢和C₁-C₄-烷基，如甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、和叔-丁基；R优选地是氢。每种情况下的指数m具有0至约2的值；m优选为0或约1；m更优选为0。指数n具有在约20至约50范围内，优选在约22至约40范围内，并且更优选在约24至约30范围内的平均值。指数p具有在约10至约50范围内，优选在约11至约40范围内，并且更优选在约12至约30范围内的平均值。

式(V)的亚烷氧基单元优选是烷氧基化物嵌段的非随机序列。非随机序列是指首先添加[-A²-O-]_m(即最接近式(I)、(II)或(III)重复单元的氮原子的键)，其次添加[-CH₂-CH₂-O-]_n，再次添加[-A³-O-]_p。该取向提供具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段的烷氧基化聚亚烷基亚胺。

式(V)这些亚烷氧基单元的基本部分由亚乙氧基单元-[CH₂-CH₂-O)]_n-和亚丙氧基单元-[CH₂-CH₂(CH₃)-O]_p-形成。亚烷氧基单元还可另外地具有少部分亚丙氧基或亚丁氧基单元-[A²-O]_m-，即用氢原子饱和的聚亚烷基亚胺主链起初可与少量的，即对于每摩尔存在的NH部分为至多约2摩尔，尤其为约0.5至约1.5摩尔，特别是约0.8至约1.2摩尔的环氧丙烷或环氧丁烷反应，即初始烷氧基化。

如果需要的话，所述聚亚烷基亚胺主链的这种初始改性可使烷氧基化过程中反应混合物的粘度降低。然而，所述改性通常不会影响烷氧基化聚亚烷基亚胺的性能特性，因此不构成优选的量度。

两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物以按织物和家居护理产品的重量计约0.05％至10％范围内的水平存在于本发明的织物和家居护理产品(包括但不限于洗涤剂)中。织物和家居护理产品的实施方案可包含按重量计约0.1％至约5％。更具体地，所述实施方案可包含约0.25％至约2.5％的油脂清洁聚合物。

羧酸酯聚合物-本发明的消费产品还可包含一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一个方面，羧酸酯聚合物为聚丙烯酸酯均聚物，其具有4,000Da至9,000Da，或6,000Da至9,000Da的分子量。

去垢性聚合物-本发明的消费产品也可包含一种或多种去垢性聚合物，其具有由下列结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d

(II)-[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e

(III)-[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f

其中：

a、b和c为1至200；

d、e和f为1至50；

Ar为1,4-取代的亚苯基；

sAr为在5位被SO₃Me取代的1,3-取代的亚苯基；

Me为Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、一烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团为C₁-C₁₈烷基或C₂-C₁₀羟烷基或它们的混合物；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地选自H或C₁-C₁₈正烷基或C₁-C₁₈异烷基；并且

R⁷为直链或支化的C₁-C₁₈烷基，或直链或支化的C₂-C₃₀烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C₈-C₃₀芳基，或C₆-C₃₀芳基烷基基团。

合适的去垢性聚合物为聚酯去垢性聚合物，诸如Repel-o-tex聚合物，包括由罗地亚公司(Rhodia)供应的Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6。其他合适的去垢性聚合物包括Texcare聚合物，包括由科莱恩公司(Clariant)供应的Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325。其它合适的去垢性聚合物为Marloquest聚合物，诸如由Sasol提供的Marloquest SL。

纤维素聚合物-本发明的消费产品还可包含一种或多种纤维素聚合物，其包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧烷基纤维素的那些。在一个方面，纤维素聚合物选自包含以下各项的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物。在一个方面，羧甲基纤维素具有0.5至0.9的羧甲基取代度和100,000Da至300,000Da的分子量。

洗涤剂可包含漂白体系，其可包含H₂O₂源如过硼酸盐或过碳酸盐，它们可与过酸成形漂白活化剂如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸混合。作为另外一种选择，所述漂白体系可包含过氧酸例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。通常，当使用漂白剂时，本发明的组合物可包含按本主题清洁组合物的重量计约0.1％至约50％或甚至约0.1％至约25％的漂白剂。

螯合剂-本文的消费产品可包含螯合剂。合适的螯合剂包括铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。当使用螯合剂时，主题消费产品可包含按所述主题消费产品重量计约0.005％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。适合的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二乙烯三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚胺二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的混合物。

本发明的酶的变体可使用常规稳定剂和/或蛋白酶抑制剂进行稳定，所述蛋白酶抑制剂如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、盐如氯化钠和氯化钾、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸、或肽醛如二-、三-或四肽醛或醛类似物(任一形式的B1-B0-R，其中R为H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)、B0是单个氨基酸残基(优选具有任选取代的脂族或芳族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包含一个N-末端保护基团，或如WO09118375、WO98/13459所述)或蛋白类型的蛋白酶抑制剂如RASI、BASI、WASI(稻、大麦和小麦的双官能的α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。在一些实施方案中，本文使用的酶通过在提供此类离子给酶的成品组合物中存在的水溶性来源锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))进行稳定。

所述组合物可也可包含其他常规洗涤剂成分如织物调理剂，包括粘土、泡沫增强剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬垢剂、抗垢再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、有机溶剂如乙醇或香料。此外，洗涤剂可包含污点预清除剂或增强剂，将它们加入洗涤过程以提高总清洁水平，一些这些添加剂也可用作在洗涤步骤之前施用于纺织物的预处理剂。

当前预期在洗涤剂组合物中可加入任何酶，具体地将本发明所需的酶，其加入的量对应于每升洗涤液体0.001-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液体0.005-5mg酶蛋白，更优选每升洗涤液体0.01-1mg酶蛋白，以及具体地讲每升洗涤液体0.1-1mg酶蛋白。然而，本发明的组合物包含至少0.0001至约0.1重量％的纯酶蛋白，例如约0.0001％至约0.01％，约0.001％至约0.01％或约0.001％至约0.01％的纯酶蛋白。然而，当使用配制的酶时，所述洗涤剂组合物包含约0.02％至约20重量％的酶，例如或约0.05％至约15重量％，或约0.05至约20％，或约0.05％至约5％，或约0.05％至约3％的酶。

可用于本发明的α-淀粉酶变体可附加地掺入公开于WO 97/07202中的洗涤剂制剂中，所述文献以引用方式并入本文。

本发明的洗涤剂组合物可为任何常规形式，例如棒、片剂、粉末、颗粒、糊剂、凝胶或液体。组合物可为粉末形式的多功能“重垢型”洗涤剂、糊剂形式的多功能重型液体、精细织物液体、手洗盘碟洗涤剂、轻垢型盘碟洗涤剂、高起泡型机洗盘碟洗涤剂、多种片剂、盘碟洗涤颗粒、盘碟洗涤液、漂洗助剂型。组合物也可为单位剂量的包装件，包括本领域已知的那些和水溶性的、水不溶性的和/或水可渗透的那些。液体洗涤剂可为含水的，通常包含至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或为不含水的或包含大于0.5g/L洗涤剂组合物的溶液。

可例如将本发明的组合物配成手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，其包括适用于预处理脏污织物的衣物洗涤添加剂组合物和漂洗附加织物的软化剂组合物，或可将其配成一般用于家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制其用于手洗或机洗盘碟洗涤操作。所述洗涤剂可为粉末或颗粒形式，或它可为液体、凝胶或糊剂的形式，或为单位剂量产品如片剂或小袋的形式，包括多隔室小袋，或所述洗涤剂可为片材的形式。

实施例

用于测定α-淀粉酶活性的pNP-G7测定法

可通过使用G7-pNP底物的方法测定α-淀粉酶活性。G7-pNP是4,6-亚乙基(G₇)-对-硝基苯基(G₁)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写，它是封端低聚糖，其能够被内淀粉酶如α-淀粉酶裂解。在裂解后，在试剂盒中包括的α-葡糖苷酶消化水解底物，进一步释放游离的PNP分子，该分子显黄色并因此可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)进行测量。包含G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche/Hitachi(目录号11876473)制造。

试剂：

来自这个试剂盒的G7-pNP底物包含22mM的4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)。

α-葡糖苷酶试剂包含52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl₂、0.075mM CaCl₂、≥4kU/Lα-葡糖苷酶。

底物工作溶液通过混合1mL的α-葡糖苷酶试剂与0.2mL的G7-PNP底物制成。这种底物工作溶液在使用前现配现用。

稀释缓冲液：50mM MOPS、0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n(n＝9-10)))、1mM CaCl₂、pH8.0。

过程：

待分析的淀粉酶样品被稀释在稀释缓冲液中，以确保被稀释的样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板并添加80μl的底物工作溶液进行了测定。混合所述溶液并在室温下预温育1分钟，并且在5分钟内每隔20秒测量在OD 405nm下的吸光度。

时间依赖性吸光度曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(每mg酶活性)在给定一组条件下成正比。淀粉酶样品将被稀释至其中斜率低于每分钟0.4个吸光度单位的水平。

用于衣物洗涤的自动化机械应力测定(AMSA)

为了评估在衣物洗涤实验中的洗涤性能，使用自动化机械应力测定(AMSA)进行了实验。使用AMSA测试，能够检测大量小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的狭槽，并且还具有一个紧压衣物洗涤样品的封盖，待洗涤的纺织物对着所有的狭槽开口。在洗涤期间，剧烈振荡板、测试溶液、纺织物和封盖以使测试溶液接触纺织物并以规律的定期振荡方式施加机械应力。进一步的描述参见WO02/42740，尤其是第23-24页的段落“Special method embodiments(具体方法实施例)”。

一般洗涤性能描述

制备了测试溶液，其包含水(10°dH)、洗涤剂例如如下文所述的5.1g/L欧洲液体洗涤剂、以及本发明的酶例如浓度为0、0.8和/或1.2mg酶蛋白/L的酶。加入淀粉玷污的织物(例如CS-28，得自Center For Testmaterials BV，P.O.Box 120，3133 KT，Vlaardingen，The Netherlands)并在20℃洗涤20分钟。在流动自来水下充分漂洗并在暗处干燥后，随后测量脏污织物的光照强度或反射率值，将其作为洗涤性能的量度。用0mg酶蛋白/L进行的测试被用作空白对照以获得Δ衰减值。优选在洗涤步骤中施加力，例如以振荡、旋转或搅拌形式施力于洗涤溶液和织物。

AMSA洗涤性能实验在下文指定的实验条件下进行：

表1：AMSA实验条件

淀粉酶稀释缓冲液：淀粉酶被稀释在超纯水(MilliQ水)中，其中含有低浓度的钙(0.1mM)以使淀粉酶在储存期间稳定化，以及0.01％Triton X-100以减少容器和移液器吸附酶蛋白的风险。

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝3:1:4.5)添加至测试系统，将水硬度调节至10°dH。在洗涤后，在自来水中冲洗纺织物并干燥。

根据经洗涤的纺织物颜色的亮度测量了洗涤性能。也能够将亮度表示为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品有污渍时，反射光的强度低于清洁样品的反射光强度。因此可使用反射光的强度测量洗涤性能。

使用专业的平面扫描仪(Kodak iQsmart，Kodak，Midtager 29，DK-2605

Denmark)(其用于捕获经洗涤的纺织物的图像)进行了颜色测量。

为了从扫描图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值加到一起作为载体计算强度值(Int)，然后获得所得载体的长度：

不同变体的AMSA衣物洗涤测试的结果显示在表1和2中。在上述结果中的指数是100。亲本α-淀粉酶的性能结果被指定为100的值，而将变体的结果与该值进行比较。

TOM洗涤性能

通过添加CaCl₂、MgCl₂和NAHCO₃，将水硬度调节至以下所述的强度。在如下文所述的桶中制备了具有所期望的洗涤剂的量、温度和水硬度的洗涤溶液。使洗涤剂在磁体搅拌10分钟期间溶解(在制备后30分钟至60分钟内使用洗涤溶液)。

Terg-O-toMeter中的水浴中的温度和旋转(rpm)按照下表2的设置被设定。当温度按照设置被调节时(容差为+/-0.5℃)，洗涤溶液按照下文描述的量被添加至TOM烧杯中。

在烧杯中以200rpm搅拌。将2件手制稻米淀粉样本(HM CS-28)、2件手制木薯淀粉样本(HM CS-29)和压载物添加至每一烧杯，并按照下文所述的时间进行洗涤。将样本在冷自来水中漂洗5分钟并置入洗涤袋中，并且在洗衣机(AEG

LAVAMAT 86820中)中以“STIVN”程序进行漂洗。对样本进行分类，并使其在干燥柜中于滤纸之间干燥过夜而无需加热。

纺织物样品HMCS-28(棉制品上的稻米淀粉，5×5cm，淀粉以2.5cm直径的圆施加)和HM CS-29(棉制品上的木薯淀粉，5×5cm，淀粉以2.5cm直径的圆施加)以及HM CS-26(棉制品上的玉米淀粉，5×5cm，淀粉以2.5cm直径的圆施加)获自于Center for TestMaterials BV(P.O.Box 120,3133 KT Vlaardingen,the Netherlands)。

将白色针织棉用作压载物，并且获自Warwick Equest Ltd(Unit 55,ConsettBusiness Park,Consett,County Durham,DH8 6BN UK)。

表2：实验条件

洗涤剂和测试材料如下：

洗涤性能被测量为以反射值(REM)表示的经洗涤的纺织物颜色的亮度。反射值的测量使用Macbeth 7000 Color Eye分光光度计进行。测量了每种干样本。由于存在来自背景的干扰的风险，在反射值的测量过程中，样本被置于2层织物顶部。在460nm下测量了反射值。没有包括UV滤光器。计算了样本的反射值的平均结果。

不同变体的洗涤性能在表5中示为改善因子(IF)，并且如下所示进行计算：

实施例1

使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能

为了评估α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。用AMSA测试能够检查大量小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的狭槽，并且还具有一个抵靠所有狭槽开口紧压待洗涤的纺织物样本的封盖。在洗涤期间，剧烈振荡板、测试溶液、纺织物和封盖以使测试溶液接触纺织物并以规律的定期振荡方式施加机械应力。关于进一步的描述参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的段落“Special method embodiments”。

一般洗涤性能描述

制备测试溶液，其包含水(6°dH或15°dH)，0.79g/L洗涤剂例如如下所述的模型洗涤剂J，以及浓度为0mg或0.2mg酶蛋白/L的本发明酶。加入淀粉玷污的织物(CS-28，得自Center For Test materials BV，P.O.Box120，3133KT，Vlaardingen，The Netherlands)并在20℃和40℃下洗涤10分钟，或另选地在20℃和30℃下洗涤10分钟，如实施例中所指定。在流动自来水下充分漂洗并在暗处干燥后，随后测量沾污织物的光照强度值，将其作为洗涤性能的量度。用0mg酶蛋白/L进行的测试用作空白并且对应于洗涤剂的贡献。优选在洗涤步骤中施加力，例如以振荡、旋转或搅拌形式施力于洗涤溶液和织物。AMSA洗涤性能实验可在下文指定的实验条件下进行：

表A：实验条件

<u>洗涤剂</u>	<u>液体模型洗涤剂J(参见表B)</u>
		洗涤剂剂量	0.79g/L
测试溶液体积	160微升
		pH	按原样
洗涤时间	10分钟
		温度	20℃或30℃
水硬度	6°dH
		测试中的酶浓度	0.2mg酶蛋白/L和0,05mg酶蛋白/L
测试材料	CS-28(稻米淀粉棉制品)

表B：模型洗涤剂J

<u>化合物</u>	<u>化合物的含量(重量/重量％)</u>	<u>活性组分％(重量/重量％)</u>
			LAS	5.15	5.00
AS	5.00	4.50
			AEOS	14.18	10.00
椰油脂肪酸	1.00	1.00
			AEO	5.00	5.00
MEA	0.30	0.30
			MPG	3.00	3.00
乙醇	1.50	1.35
			DTPA(作为Na5盐)	0.25	0.10
柠檬酸钠	4.00	4.00
			甲酸钠	1.00	1.00
氢氧化钠	0.66	0.66
			H<sub>2</sub>O，离子交换	58.95	58.95

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO^3-＝2:1:4.5)添加至测试系统，将水硬度调节至6°dH。在洗涤后，在自来水中冲洗纺织物并干燥。

表C：实验条件

<u>洗涤剂</u>	<u>液体模型洗涤剂A(参见表D)</u>
		洗涤剂剂量	3.33g/L
测试溶液体积	160微升
		pH	按原样
洗涤时间	10分钟
		温度	20℃或40℃
水硬度	15°dH
		测试中的酶浓度	0.2mg酶蛋白/L，0.05mg酶蛋白/L
测试材料	CS-28(稻米淀粉棉制品)

表D：模型洗涤剂A

<u>化合物</u>	<u>化合物的含量(重量/重量％)</u>	<u>活性组分％(重量/重量％)</u>
			LAS	12.00	11.60
AEOS，SLES	17.63	4.90
			大豆脂肪酸	2.75	2.48
椰油脂肪酸	2.75	2.80
			AEO	11.00	11.00
氢氧化钠	1.75	1.80
			乙醇/丙-2-醇	3.00	2.70/0.30
MPG	6.00	6.00
			甘油	1.71	1.70
TEA	3.33	3.30
			甲酸钠	1.00	1.00
柠檬酸钠	2.00	2.00
			DTMPA	0.48	0.20
PCA	0.46	0.18
			苯氧基乙醇	0.50	0.50
H<sub>2</sub>O，离子交换	33.64	33.64

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO^3-＝4:1:7.5)添加至测试系统，将水硬度调节至15°dH。在洗涤后，在自来水中冲洗纺织物并干燥。

表E：实验条件

<u>洗涤剂</u>	<u>洗涤剂组合物K</u>
		洗涤剂剂量	5.3g/L
测试溶液体积	160微升
		pH	按原样
洗涤时间	10分钟
		温度	20℃或40℃
水硬度	15°dH
		测试中的酶浓度	0.2mg酶蛋白/L，0.05mg酶蛋白/L
测试材料	CS-28(稻米淀粉棉制品)

表F：洗涤剂K

洗涤性能被测量为亮度，所述亮度表示为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品有污渍时，反射光的强度低于清洁样品的反射光强度。因此可使用反射光的强度测量洗涤性能。

用专业的平面扫描器(EPSON Expression 10000XL，EPSON)进行颜色测量，该平面扫描器用于捕集经洗涤的纺织物的图像。

为了从扫描图像中提取光强度值，将来自图像的48→24位彩色像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值加到一起作为载体计算强度值(Int)，然后获得所得载体的长度：

根据本发明的变体的洗涤性能示于下表中。表3示出了在不同浓度(0.05mg酶/L洗涤剂和0.2mg酶/L洗涤剂)以及在不同的温度(20℃和40℃)下，在模型洗涤剂A(表D)和J(表B)中获得洗涤性能的实验所获的结果。表4示出了在不同浓度(0.05mg酶/L洗涤剂和0.2mg酶/L洗涤剂)以及在不同的温度(20℃和40℃)下，在洗涤剂K(表F)中获得洗涤性能的实验所获的结果。

实施例2——液体洗涤剂K中α-淀粉酶的洗涤性能

如上文所述测试了被测试的变体和对应的亲本α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的洗涤性能。按照(变体的性能减空白的性能)除以(亲本的性能减空白的性能)给出了结果。

表5：TOM规模的洗涤性能

表6：TOM规模的洗涤性能

表7：满刻度洗衣机测试中的洗涤性能

如本文所描述和要求保护的发明不受本文所公开的特定方面的范围的限制，因为这些方面旨在作为本发明的多个方面的示例。任何等同的方面旨在处于在本发明的范围内。实际上，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。此类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，包括定义的本公开将控制。

使用方法

本发明包括一种用于清洁和/或处理部位，特别是表面或织物的方法。在一个方面，公开了此类方法包括如下步骤：任选地洗涤和/或漂洗所述表面或织物，使所述表面或织物与本说明书中公开的任何消费产品接触，然后任选地洗涤和/或漂洗所述表面或织物。

如本文所用，洗涤包括但不限于刷洗和机械搅拌。此类表面或织物的干燥可通过家庭或工业环境中采用的普通方法中的任一种而实现。此类方法包括但不限于在电磁辐射(包括日光、红外线、紫外线和微波辐射)的存在或不存在下、在介于5个和0.01个大气压之间的压力下、在环境温度或高温下的强迫通风或静止空气干燥。在一个方面，所述干燥可通过使用熨斗而在高于环境温度的温度下实现，其中，例如所述织物可处于与所述熨斗的直接接触下，接触持续相对短或甚至是延长的时间，并且其中可以施加由于重力而通常存在的之外的压力。在另一方面，所述干燥可通过使用烘干机而在高于环境温度的温度下实现。用于干燥织物的设备是众所周知的，其通常被称为烘干机。除衣物之外，此类设备还被用于干燥许多其他物品，包括毛巾、床单、枕套、尿布等等，在世界上的许多国家，此类设备已作为基本上取代晾衣绳用于干燥织物的用途的标准便利设备而被接受。如今所使用的大多数烘干机都利用热空气，当织物在烘干机内翻滚时，热空气经过织物之上和/或穿过织物。空气可以，例如，通过气火焰电子地、或甚至通过微波辐射被加热。此类空气可被加热至约15℃至约400℃，约25℃至约200℃，约35℃至约100℃，或甚至约40℃至约85℃，并在烘干机内被用于干燥表面和/或织物。正如本领域的技术人员所认可的那样，本发明的清洁组合物理想地适用于洗衣用途。因此，本发明包括洗涤织物的方法。该方法包括以下步骤：将待洗涤的织物与所述清洁洗涤溶液相接触，该溶液包括申请人的至少一种实施方案的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物。织物可包括大多数可在正常的消费者或机构使用条件下洗涤的任何织物。溶液优选具有约8至约10.5的pH。组合物可以按溶液中约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。水温范围通常在约5℃至约90℃的范围内。水与织物的比率通常为约1:1至约30:1。

洗涤剂实施例

实施例1-6

设计用于手洗或顶部加载式洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物。

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

实施例7-12

设计用于前加载式自动洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物。

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

实施例13-18重垢型液体衣物洗涤剂组合物

1无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。

2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。

3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物为聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化基团，并且每个-NH具有16个丙氧基化基团

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

实施例19-21重垢型液体衣物洗涤剂组合物

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

**基于总清洁和/或处理组合物重量计，共计不超过7％的水。

用于组合物实施例1-21中的原料和说明

具有C₁₁-C₁₈平均脂族碳链长度的直链烷基苯磺酸盐

C_12-18二甲基羟乙基氯化胺

AE3S为C_12-15烷基乙氧基(3)硫酸盐

AE7为C_12-15醇乙氧基化物，平均乙氧基化度为7

AE9为C_12-16醇乙氧基化物，平均乙氧基化度为9

HSAS是如US 6,020,303和US 6,060,443所公开的具有约16-17的碳链长度的中间支化的伯烷基硫酸盐

聚丙烯酸酯MW 4500是由BASF供应的

羧甲基纤维素是由CP Kelco(Arnhem，Netherlands)供应的

V

CHEC是阳离子改性的羟乙基纤维素聚合物。

膦酸酯螯合剂是例如二亚乙基四胺五乙酸(DTPA)羟基乙烷二膦酸酯(HEDP)

Celluclean^TM、

和

均为Novozymes(Bagsvaerd，Denmark)的产品。

Purafect

是Genencor International，Palo Alto，California，USA的产品

荧光增白剂1是

AMS，荧光增白剂2是

CBS-X，直接紫9是

Violet BN-Z NOBS是壬酰氧苯磺酸钠

TAED是四乙酰基乙二胺

S-ACMC是与C.I.缀合的羧甲基纤维素。活性蓝19产品名称AZO-CM-CELLULOSE

去垢剂为

PF。

丙烯酸/马来酸共聚物的分子量为70,000，丙烯酸根与马来酸根的比率为70:30

EDDS是乙二胺-N,N'-二琥珀酸的钠盐，(S,S)异构体抑泡剂附聚物是由DowCorning(Midland，Michigan，USA)提供的

HSAS是中间支化的烷基硫酸盐

Violet CT由Milliken(Spartanburg，South Carolina，USA)提供

2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。

3两亲性烷氧基化聚合物是聚乙烯亚胺(分子量＝600)，制备自被衍生为每个-NH包含24个乙氧基化物基团每–NH和每个–NH包含16个丙氧基化物基团的聚合物。

淀粉酶⁴是本文a)至k)中任一者(mg活性蛋白)。

实施例22-26单位剂量衣物洗涤剂组合物：此类单位剂量制剂可包括一个或多个隔室。

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

1聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。

实施例27多隔室单位剂量组合物

下文中提供了本发明的多隔室单位剂量衣物洗涤剂制剂。在这些实施例中，单位剂量具有三个隔室，但类似的组合物能够以两个、四个或五个隔室被制得。用于包封所述隔室的膜是聚乙烯醇。

多隔室制剂

*本发明的淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

Claims

1.一种清洁组合物，所述清洁组合物包含：

a)亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体的亲本α-淀粉酶为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述变体具有α-淀粉酶活性，并且

所述变体包含在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中的修饰，所述修饰选自：

H1*+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7K+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7E+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7N+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7Q+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7L+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7D+G109A+N280S+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320M+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320T+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320V+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323R+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320S+E391A；

H1*+G109A+N280S+E391V；

H1*+G109A+W284R+E391A；

H1*+G109A+W284F+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；

H1*+G109A+N280S+W284F+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323N+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323K+E391A；

H1*+G109S+N280S+E391A；

H1*+G109A+W284H+E391A；

H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A；

G7A+W284H+K320A+M323N；

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；

H1*+G109A+N280S+W284H+E391A；

H1*+G109A+N280S+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A；

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；

H1*+G7A+G109A+W284R+E391A；和

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；和

b)清洁助剂，其量为0.01重量％至99.9重量％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是液体衣物洗涤剂组合物或单位剂量洗涤剂组合物。

3.一种处理表面的方法，所述方法包括：

(i)形成含水洗涤液体，所述含水洗涤液体包含水和根据前述权利要求中任一项所述的组合物；

(ii)在40℃或更低的温度下，用所述含水洗涤液体处理所述表面；以及

(iii)漂洗所述表面。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表面为纺织物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中在(ii)中在35℃或更低的温度下，用所述含水洗涤液体处理所述表面。

6.根据权利要求3所述的方法，其中在(ii)中在30℃或更低的温度下，用所述含水洗涤液体处理所述表面。