CN110938117B

CN110938117B - 一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110938117B
Application number: CN201911205894.7A
Authority: CN
Inventors: 孙军勇; 陆健; 田甜甜
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110938117A

Abstract

一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用。本发明从大麦麦芽中纯化得到一种大麦麦芽内源木聚糖酶的竞争型抑制蛋白。经鉴定该蛋白为大麦α‑淀粉酶/枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(barleyα‑amylase/subtilisin inhibitor，BASI)。BASI的发现，可以解释阿拉伯木聚糖在糖化过程中未被降解的原因，还可作为筛选因子，用于筛选啤酒糖化工艺条件下，对BASI不敏感，对大麦麦芽高分子量阿拉伯木聚糖具有高效降解能力的微生物木聚糖酶，这对于降低麦汁和啤酒中高分子量阿拉伯木聚糖的含量和提高啤酒的生产效率具有重要意义。

Description

一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用，属于啤酒生产技术领域。

背景技术

啤酒糖化生产中，糖化醪液经过滤槽分离而得到透明澄清的麦汁，糖化醪液中麦汁的分离速度即过滤速度。麦汁的过滤速度是酿酒师最为重视的指标之一，其决定了啤酒生产过程的效率。大麦麦芽是啤酒酿造的主要原料，阿拉伯木聚糖是大麦麦芽胚乳细胞壁的主要成分，在实际生产过程发现，由于高含量的阿拉伯木聚糖影响了麦汁的过滤速度。高分子量的阿拉伯木聚糖水溶液具有较高的粘度，致使糖化的粘度高，大麦麦芽的过滤速度慢，同时醪液的高粘度不利于酶与底物的接触，导致蛋白和淀粉等大分子物质降解不充分，浸出物收得率较低，降低了啤酒的生产效率，增加了生产成本。

研究表明，在整个糖化过程中都可以检测到大麦麦芽内源木聚糖酶的活性，但醪液中的阿拉伯木聚糖含量却始终保持在一个相对稳定的值，即大麦麦芽内源木聚糖酶无法降解阿拉伯木聚糖。推测可能是大麦中存在某种抑制内源木聚糖酶活力的物质。内源木聚糖酶抑制剂能够阻碍木聚糖酶发挥作用，降低木聚糖酶的催化效率，使木聚糖酶无法有效的降解阿拉伯木聚糖。

目前关于大麦麦芽中木聚糖酶抑制剂研究的相关文献相对较少，仅Goesaert等《Purification and partial characterization of an endoxylanase inhibitor frombarley》(Cereal Chemistry,2001,78(4):33-41)利用离子交换和凝胶过滤色谱从大麦中纯化到一种对部分微生物(Asperillus aculeatus、Aspergillus niger、Bacillussubtilis、Trichoderma viride和Rumen microorganism)分泌的木聚糖酶具有抑制作用的蛋白，该抑制剂是一种分子量为40.0kDa的蛋白，且该论文未研究其得到的蛋白对大麦内源木聚糖酶是否具有抑制活性，无法解释在糖化过程中大麦麦芽内源木聚糖酶未能降解阿拉伯木聚糖的现象。目前还没有文献报道大麦麦芽中是否存在对内源性木聚糖酶有抑制作用的抑制剂。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白——大麦α-淀粉酶/枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(barleyα-amylase/subtilisin inhibitor，BASI)及其应用，该抑制蛋白的存在解释了大麦麦芽糖化过程中高分子量阿拉伯木聚糖未能降解的原因；同时，为能在啤酒糖化工艺中最终降解高分子量阿拉伯木聚糖，该抑制蛋白可用于筛选对大麦麦芽内源木聚糖酶抑制剂具有抗性的微生物木聚糖酶，这类微生物木聚糖酶能够高效降解糖化醪液中的高分子量阿拉伯木聚糖，这对于提高微生物木聚糖酶的应用效果及啤酒生产效率均有重要意义。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白质在抑制木聚糖酶活力中的应用，所述蛋白NCBI登录号：1210227A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述木聚糖酶为大麦麦芽内源木聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，将所述的蛋白质以摩尔比2～4:1的比例加入至含木聚糖酶的环境中，于30～40℃反应25～35min。

本发明提供了一种筛选对木聚糖酶抑制因子具有抗性的木聚糖酶的方法。

在本发明的一种实施方式中，以所述蛋白质作为抑制剂，加入至含有待筛选的木聚糖酶的反应体系中，于30～40℃反应25-35min，残余酶活相对高的为对权利要求1所述的蛋白质有抗性的木聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，所述筛选方法包括以下步骤：以终浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖为底物，加入权利要求1所述的蛋白质和待筛选的木聚糖酶溶液在35-40℃下反应28～35mim，测定木聚糖酶的残余活性。

在本发明的一种实施方式中，测定木聚糖酶的方法为DNS比色法。

在本发明的一种实施方式中，反应是在乙酸-乙酸钠缓冲液中进行。

本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的BASI蛋白的制备方法。

在本发明的一种实施方式中，所述BASI蛋白制备步骤包括：(1)大麦麦芽中水溶性蛋白的提取；(2)脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分的初步分离；(3)离子交换柱对水溶性蛋白的分离；(4)凝胶层析柱纯化。

本发明提供了一种大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白BASI的制备方法，所述BASI蛋白的制备步骤包括：

(1)利用含L-抗坏血酸与乙酸-乙酸钠缓冲溶液对大麦麦芽中水溶性蛋白进行提取，离心后取上清；(2)利用脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分进行初步分离；(3)利用离子交换柱对水溶性蛋白组分再次分离，收集洗脱液；(4)将洗脱液进行凝胶层析柱纯化。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中使用乙酸-乙酸钠缓冲液，步骤(2)中所述脱盐柱为Sephadex G-25。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的离子交换柱为DEAE Sepharose FastFlow，步骤(4)中所述凝胶层析柱为Sephacryl S-100，并使用PEG20000包埋浓缩收集的具有抑制活性的组分。

有益效果：

本发明提供了一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活性的蛋白(BASI)，通过调节BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比，使得该抑制蛋白对大麦麦芽内源木聚糖酶的抑制率最大可达81％。大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的存在解释了大麦麦芽糖化过程中高分子量阿拉伯木聚糖未能降解的原因，同时该抑制蛋白可用于筛选对大麦麦芽内源木聚糖酶抑制剂具有抗性微生物木聚糖酶，筛选得到的微生物木聚糖酶能够高效降解大麦麦芽糖化醪液中的高分子量阿拉伯木聚糖，从而提高啤酒的生产效率。

附图说明

图1为木聚糖酶活标准曲线。

图2为麦芽内源木聚糖酶抑制剂纯化过程中的SDS-PAGE图谱，泳道1为大麦麦芽水溶性蛋白提取液；泳道2为纯化到电泳纯的大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白；M为标准分子量蛋白。

图3为大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的质谱图。

图4为添加和未添加BASI的麦芽内切木聚糖酶的Lineweaver-Burk曲线。

图5为BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比对抑制率的影响。

具体实施方式

实施例1：麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的纯化

具体步骤如下：

(1)大麦麦芽中水溶性蛋白的提取

细粉碎的大麦麦芽(1kg)悬浮于5L含0.1％(w/v)L-抗坏血酸的pH5.5、0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，4℃提取4h，10000×g离心15min，取上清。

(2)Sephadex G-25脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分的初步分离

采用75％％饱和度的硫酸铵沉淀提取大麦麦芽水溶性蛋白，离心(15min，10000g，4℃)，沉淀溶解于pH8.0、0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，上样(30mL)于经同样缓冲溶液充分平衡的Sephadex G-25凝胶柱(1.6cm×80cm)，并用该缓冲溶液以20mL/h的流速洗脱，收集脱盐后的蛋白溶液备用。

(3)离子交换柱(DEAE Sepharose Fast Flow)对水溶性蛋白的分离

测定步骤(2)中收集的蛋白溶液的浓度，上样20mL于经pH8.0、0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液充分平衡的离子交换柱(DEAE Sepharose Fast Flow，1.6cm×20cm)，用含0～1.00.5mol/L NaCl的相同缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为100mL/h，每管收集5mL，即具有抑制活性的组分。

(4)凝胶层析柱(Sephacryl S-100)纯化

①用PEG20000包埋浓缩收集的具有抑制活性的组分，取4mL进样于经0.1mol/L的乙酸—乙酸钠缓冲溶液(pH5.5，含0.15mol/L的NaCl)充分平衡的Sephacryl S-100凝胶柱(1.6cm×95cm)；

②用相同缓冲溶液以20mL/h的流速洗脱，收集6mL，收集到的溶液即具有抑制内源木聚糖酶活力的组分；

纯化过程中，以浓度为10mg/mL、体积为0.5mL溶解于pH5.5、100mmol/L的乙酸—乙酸钠缓冲溶液中的燕麦木聚糖为底物，向麦芽内源木聚糖酶溶液中加入纯化得到的不同管中的蛋白后，37℃水浴反应30min，采用DNS法在540nm下测定反应体系中的还原糖浓度，根据标准曲线(图1)计算木聚糖酶的活力，一个酶活力单位是指在测定条件下每分钟释放1μmol的木糖所需要的酶量。比较添加不同管中蛋白前后麦芽内源木聚糖酶溶液酶活的变化，用相同体积的pH 5.5、100mmol·L-1的乙酸—乙酸钠缓冲溶液代替抑制剂溶液作为对照。

表1木聚糖酶活标准曲线的测定

(5)利用SDS-PAGE法，将纯化后的蛋白溶液跑胶。

麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白纯化过程的SDS-PAGE图谱见图1，在未分离纯化的大麦麦芽水溶性蛋白提取液中有多种不同的蛋白，经过分离纯化后的大麦麦芽水溶性蛋白提取液中只含有一个分子量约为22.0kDa的蛋白能够抑制麦芽内源木聚糖酶的活力。

实施例2：麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的质谱鉴定

具体步骤如下：

(1)蛋白点的挖取和酶解

①用枪头切取凝胶中的目标蛋白点，置于EP管中；

②加入200μL脱色液(100mmol/L NH₄HCO₃，溶于30％的乙腈中)脱色；

③于摇床上振荡至脱色完全；

④吸去脱色液后，加入50μL无水乙腈冻干3～5min；

⑤各加入5～8μL经稀释后的胰蛋白酶溶液，于4℃冰箱放置30～60min使胶粒充分吸胀；

⑥加入20～30μL的25mmol/L NH₄HCO₃溶液，37℃过夜反应16～20h；

⑦将管中酶解液转移至新的EP管中，冻干机中冻干后至剩余5μL并将其进行质谱分析。

(2)质谱鉴定

①取0.7μL浓缩后的蛋白酶解液，点在Anchorchip靶板上，待其风干；

②用0.7μL的0.1％的TFA脱盐，待其风干；

③点0.7μL 0.7mg/mL的基质(50％乙腈和2.5％三氟乙酸的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液)，待其风干；

④采用Ultraflex基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪对靶板进行分析。一级质谱数据采用正离子模式和自动获取数据模式采集，在700～3500Da范围内扫描肽指纹图谱，二级质谱采集选择高强度峰进行；

⑤通过BioTools软件整合一级和二级质谱数据，采用软件Mascot在NCBInr中搜索质谱数据，确定蛋白质的名称和来源。

质谱鉴定结果见表2，表2的鉴定结果表明，该蛋白是一种已知蛋白—大麦α-淀粉酶/枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂(barleyα-amylase/subtilisin inhibitor，BASI)。

表2抑制蛋白的质谱鉴定结果

实施例3：BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比对抑制率的影响

(1)以浓度为10mg/mL、体积为0.5mL溶解于pH5.5、100mmol/L的乙酸—乙酸钠缓冲溶液中的燕麦木聚糖为底物，测定麦芽木聚糖酶溶液的初始酶活及木聚糖酶的蛋白浓度，分别向木聚糖酶溶液中加入不同量的抑制蛋白，使反应体系中BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比分别为0.5:1至6:1，37℃水浴反应30min，采用DNS法测定反应体系中的还原糖浓度，根据标准曲线计算木聚糖酶的活力，用相同体积的pH 5.5、100mmol·L-1的乙酸—乙酸钠缓冲溶液代替抑制剂溶液作为对照，计算不同添加量的抑制剂对木聚糖酶活力的影响。结果见图4。

随着BASI添加量的增大，BASI的抑制活性显著增加，当BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比为3:1，抑制率达到最大为81％；摩尔比继续增加，对抑制率影响不大。

实施例4：BASI抑制麦芽内源木聚糖酶的动力学参数

具体步骤如下：

(1)以一系列浓度分别为1～10mg/mL、体积为0.5mL的燕麦木聚糖为底物(溶解于pH5.5、100mmol/L乙酸—乙酸钠缓冲溶液)，

实验组：添加0.25mL抑制蛋白溶液和0.25mL麦芽内源木聚糖酶溶液；

对照组：未添加抑制蛋白，添加0.25mL缓冲溶液和0.25mL的麦芽内源木聚糖酶溶液；

(2)保温30min；

(3)采用DNS法，在37℃、pH5.5条件下测定反应后的溶液中燕麦木聚糖经反应生成的还原糖含量；

(4)以1/[S]为横坐标，1/[V]为纵坐标，采用Line weaver-Burk法作图获得Km和Vmax值。

由图3可知，未添加BASI时，麦芽内源木聚糖酶的Vmax为1.12μmol/min/mL，Km值为10.69mg/mL；添加BASI后，麦芽内源木聚糖酶的Vmax为1.12μmol/min/mL，Km值为23.20mg/mL。即添加BASI后，Vmax值不变，Km值增大，说明BASI是大麦麦芽内源木聚糖酶的一种竞争型抑制剂。

实施例5：抗大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的微生物木聚糖酶的筛选

分别选取来源于不同微生物的共7种木聚糖酶；以浓度为10mg/mL、体积为0.5mL的燕麦木聚糖为底物，溶解于pH5.5、100mmol/L的乙酸—乙酸钠缓冲溶液中，与250μL的BASI溶液与250μL的微生物木聚糖酶溶液混合后，在37℃下反应30mim，测定木聚糖酶的残余活性。以未加BASI时的酶活为100％，外加BASI对几种微生物木聚糖酶的抑制作用结果见表3。

表3 BASI对微生物来源的木聚糖酶的抑制作用

由表2可以看出，BASI的添加对本试验中测试的几种木聚糖酶活力均起到一定程度的抑制作用。其中对2号和7号木聚糖酶的抑制活性最强，抑制率达到92％-93％，来源于里氏木霉(Trichoderma Reesei)的内切木聚糖酶Ⅲ对木聚糖酶抑制蛋白BASI的敏感性最弱。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 203

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare L.

<400> 1

Met Gly Ser Arg Arg Ala Gly Ser Ser Ser Ser Pro Leu Phe Trp Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Ser Arg Ala Ala Asp Pro Pro Pro Val His Asp Thr Asp

20 25 30

Gly His Glu Leu Arg Ala Asp Ala Asn Tyr Tyr Val Leu Ser Ala Asn

35 40 45

Arg Ala His Gly Gly Gly Leu Thr Met Ala Pro Gly His Gly Arg His

50 55 60

Cys Pro Leu Phe Val Ser Gln Asp Pro Asn Gly Gln His Asp Gly Phe

65 70 75 80

Pro Val Arg Ile Thr Pro Tyr Gly Val Ala Pro Ser Asp Lys Ile Ile

85 90 95

Arg Leu Ser Thr Asp Val Arg Ile Ser Phe Arg Ala Tyr Thr Thr Cys

100 105 110

Leu Gln Ser Thr Glu Trp His Ile Asp Ser Glu Leu Ala Ala Gly Arg

115 120 125

Arg His Val Ile Thr Gly Pro Val Lys Asp Pro Ser Pro Ser Gly Arg

130 135 140

Glu Asn Ala Phe Arg Ile Glu Lys Tyr Ser Gly Ala Glu Val His Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Leu Met Ser Cys Gly Asp Trp Cys Gln Asp Leu Gly Val Phe

165 170 175

Arg Asp Leu Lys Gly Gly Ala Trp Phe Leu Gly Ala Thr Glu Pro Tyr

180 185 190

His Val Val Val Phe Lys Lys Ala Pro Pro Ala

195 200

Claims

1.一种蛋白质在抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力中的应用，其特征在于，所述蛋白NCBI登录号：1210227A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抑制大麦麦芽内源木聚糖酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白以摩尔比2～4:1的比例加入至含木聚糖酶的环境中，于30～40℃反应25～35min。

3.一种筛选对木聚糖酶抑制因子具有抗性的木聚糖酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白质作为抑制剂，加入至含有待筛选的木聚糖酶的反应体系中，于30～40℃反应25～35min，残余酶活相对高的为对权利要求1所述的蛋白质有抗性的木聚糖酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包含如下步骤：以终浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖为底物，加入权利要求1所述的蛋白质和待筛选的木聚糖酶溶液在35～40℃下反应28～35mim，测定木聚糖酶的残余活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，测定木聚糖酶残余活性的方法为DNS比色法。

6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，反应是在乙酸-乙酸钠缓冲液中进行。