CN1471582A - 用共有翻译起始区序列制备多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备多肽的方法，其包括：(a)在有益于制备多肽的培养基内培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞含有编码多肽的第一核酸序列，其可操作地连接至包含共有翻译起始区序列的第二核酸序列，该共有翻译起始区序列对第一核酸序列是外源的；和(b)从培养基中分离多肽。本发明还涉及分离的共有翻译起始区序列，涉及包含可操作地连接至编码多肽的核酸序列的共有翻译起始区序列的构建体、载体和真菌宿主细胞。

Description

用共有翻译起始区序列制备多肽的方法

                      发明背景

发明领域

本发明涉及制备多肽的方法。本发明还涉及核酸构建体、载体和宿主细胞，其包含可操作地连接至编码多肽的核酸序列的共有翻译起始区序列；还涉及分离的共有翻译起始区序列。

有关技术说明

在真菌宿主细胞，特别是丝状真菌细胞，如曲霉属(Aspergillus)中重组制备异源蛋白质，可提供更称心的载体用于制备商业价值量的蛋白质。

重组制备异源蛋白质是通过构建表达盒实现的，在所述表达盒中，编码蛋白质的DNA被置于启动子的表达控制之下，该启动子是从调节基因中切除下来，适合于宿主细胞的。所述表达盒通常通过质粒介导的转化被引入宿主细胞。然后通过在表达盒所含启动子发挥适当功能所必需的诱导条件下培养转化宿主细胞，来实现异源蛋白质的制备。

提高蛋白质的重组制备，一般需要获得新的调节序列，其适于在宿主细胞中控制蛋白质的表达。

Kozak在1981年的核酸研究(Nucleic Acids Research)9：5233-5252中，提出在高等真核生物中翻译起始的下列“共有”序列：

                    Aa Acc  AUG G

在这一被称为“Kozak共有序列”(“consensus Kozak”)的序列中，最高度保守的核苷酸是嘌呤，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，如上用大写字母表示。突变分析证实，这两个位置对起始的影响最大(Kozak，1987，分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)7：3438-3445)。Kozak还确定了在Kozak共有序列上游的序列可影响翻译(Kozak，1986，美国国家科学院院报(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA)83：2850-2854)。

本发明的目的是提供在真菌宿主细胞中用共有翻译起始区序列制备多肽的改进方法。

                      发明概述

本发明涉及制备多肽的方法，其包括：(a)在有益于制备多肽的培养基内培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞含有编码多肽的第一核酸序列，其可操作地连接至包含共有翻译起始区序列的第二核酸序列，该共有翻译起始区序列对第一核酸序列是外源的，其中该共有翻译起始区序列3’末端紧靠第一核酸序列的起始密码子的上游，且该共有翻译起始区序列包含序列5’-NYCNNBCACC-3’(SEQ ID NO.1)，其中N是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸，Y是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)，而B是选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸；和(b)从培养基中分离多肽。

本发明还涉及分离的共有翻译起始区序列，涉及包含一个或多个可操作地连接至编码多肽的核酸序列的共有翻译起始区序列的构建体、载体和真菌宿主细胞。

                  附图简要说明

图1显示pJaL292的限制酶图谱。

图2显示pKS6的限制酶图谱。

图3显示pBANe13的限制酶图谱。

图4显示pBANe6的限制酶图谱。

图5显示pMHan37的限制酶图谱。

图6显示pBANe8的限制酶图谱。

图7显示pBANe15的限制酶图谱。

图8显示pDBEL1的限制酶图谱。

图9显示pUC4-AN.pyrG1&2的限制酶图谱。

图10显示pBANe11的限制酶图谱。

图11显示pBANe12的限制酶图谱。

图12显示pJaL485的限制酶图谱。

图13显示pJaL448的限制酶图谱。

                      发明详述

本发明涉及制备多肽的方法，其包括：(a)在有益于制备多肽的培养基内培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞含有编码多肽的第一核酸序列，其可操作地连接至包含共有翻译起始区序列的第二核酸序列，该共有翻译起始区序列对第一核酸序列是外源的；和(b)从培养基中分离多肽。

在本发明的制备方法中，用本领域已知的方法在适合制备多肽的营养培养基中培养细胞。例如可以在实验室或工业发酵罐中用摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)的方法，在适合的培养基中以及允许多肽表达和/或分离的条件下培养细胞。细胞培养采用本领域已知的方法，在适合的营养培养基中进行，所述培养基包含碳源和氮源，以及无机盐。适合的培养基可从市场上购得或可按照已发表的组成成分配制(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。如果多肽分泌至营养培养基中，可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽未被分泌出来，可从细胞溶解产物中回收多肽。

可用本领域已知的对多肽特异性的方法检测多肽。这些检测方法可包括使用特异性抗体、酶产物的形成、或酶底物的消失。

在本发明的方法中，相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下，所述真菌细胞优选多产生至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约100％，甚至更优选至少约200％，最优选至少300％，甚至最优选至少约400％的多肽。

所得多肽可用本领域已知的方法回收。例如，可用传统方法从营养培养基中回收多肽，所述方法包括但不限于：离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可用本领域已知的各种方法纯化多肽，所述方法包括但不限于：层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦电泳)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCH出版社，NewYork，1989)。

共有翻译起始区序列

术语“翻译起始区序列”此处定义为紧靠编码多肽的核酸序列的可读框的起始密码子上游的10个核苷酸。起始密码子编码氨基酸甲硫氨酸，即所谓“起始”密码子。典型的起始密码子是ATG，但也可以是任何功能性起始密码子，如GTG。尿嘧啶，U，在RNA中代替脱氧核苷胸腺嘧啶，T，这一点在本领域广为人知。

术语“共有翻译起始区序列”此处定义为紧靠编码多肽的核酸序列的可读框的起始密码子上游的10个核苷酸，其具有下列序列：

5’-NYCNNBCACC-3’，其中N＝A、G、C或T；Y＝C或T；而B＝A、C或T。(SEQ ID NO.1)

本发明还涉及上述分离的共有翻译起始区序列。在优选实施方案中，该共有翻译起始区序列具有核酸序列5’-GTCCTTCACC-3’(SEQ IDNO.2)，或其亚序列，该亚序列具有与SEQ ID NO.2的共有翻译起始区序列相同的生物学活性。在另一个优选方案中，共有翻译起始区序列具有核酸序列5’-GTCCTCCACC-3’(SEQ ID NO.3)，或其亚序列，该亚序列具有与SEQ ID NO.3的共有翻译起始区序列相同的生物学活性。在另一个优选方案中，共有翻译起始区序列具有核酸序列5’-GTCCTACACC-3’(SEQ ID NO.4)，或其亚序列，该亚序列具有与SEQ ID NO.4的共有翻译起始区序列相同的生物学活性。

术语“可操作地连接”此处定义为一种构型，其中控制序列，例如共有翻译起始区序列，被适当地置于相对于编码序列的一个位置，使得控制序列指导编码序列编码的多肽的合成。

术语“编码序列”此处定义为核酸序列，当置于适当的控制序列的控制之下时，所述核酸序列被转录为mRNA，所得mRNA被翻译为多肽。所述编码序列的边界一般是由位于mRNA 5’端的可读框起点的起始密码子和位于mRNA可读框的3’端的终止密码子确定的。编码序列可包括，但不限于，基因组DNA、cDNA、半合成的、合成的和重组的核酸序列。

在本发明的方法中，共有翻译起始区序列对编码所感兴趣多肽的核酸序列是外源的，但该共有翻译起始区序列或核酸序列可以是真菌宿主细胞天然的。

编码多肽的核酸序列

所述核酸序列编码的多肽对所感兴趣的真菌宿主细胞而言，可以是天然的或异源的。

术语“多肽”此处并不意指特定长度的编码产物，因而包括肽、寡肽和蛋白质。术语“异源多肽”此处定义为非真菌细胞天然的多肽、经修饰改变了天然序列的天然多肽或用重组DNA技术操作真菌细胞导致表达量改变的天然多肽。例如，可以通过下列方法重组制备天然多肽，如将编码多肽的基因置于本发明的共有翻译起始区序列的控制之下，以提高多肽的表达，通过使用信号序列加速所感兴趣的天然多肽输出到细胞外，以及增加编码细胞正常产生的多肽的基因的拷贝数。所述真菌细胞可含有一个或多个编码多肽的核酸序列的拷贝。

优选多肽是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。在优选方案中，多肽被分泌到胞外。在更优选的方案中，所述多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在更优选的方案中，所述多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

编码所感兴趣多肽的核酸序列可从任何原核的、真核的或其他来源获得。为了本发明的目的，此处所用的术语从某给定来源“获得”意味着该来源，或该来源的基因插入其中的细胞产生该多肽。

用于分离或克隆编码所感兴趣多肽的核酸序列的技术在本领域是已知的，其包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或二者结合。可通过，例如广为人知的聚合酶链式反应(PCR)从上述基因组DNA克隆核酸序列。参见，例如Innis等，1990，PCR方案：方法和应用指南(PCRProtocols：A Guide to Methods and Application)，Academic Press，New York。克隆程序可以包括切除和分离包含编码多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，以及将重组载体引入突变的真菌细胞，在其中多拷贝或克隆的核酸序列将得以复制。所述核酸序列可以源于基因组、cDNA、RNA、半合成、合成，或其任意组合。

在本发明的方法中，所述多肽还可包括融合或杂合多肽，其中另一条多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽是通过将编码一条多肽的核酸序列(或其一部分)融合至编码另一条多肽的核酸序列(或其一部分)产生的。制备融合多肽的技术在本领域是已知的，其包括连接编码多肽的编码序列，以使其符合读框，而且该融合多肽的表达在同样的启动子和终止子的控制之下。杂合多肽可包括获自至少两种不同多肽的部分或完整多肽序列的结合，其中一种或多种多肽对于突变真菌细胞可能是异源的。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至本发明的共有翻译起始区序列的编码多肽的核酸序列，和一或多个控制序列，所述控制序列在与之适合的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞内的表达。表达可理解为包括任何在产生多肽过程中涉及的步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“核酸构建体”此处定义为单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或经修饰包含核酸片段，所述片段以自然界中不存在的方式组合和并列。术语核酸构建体当含有编码序列和所有表达编码序列所需的控制序列时，与术语表达盒同义。

编码多肽的分离的核酸序列可进一步用各种方法操作，为多肽的表达作准备。在插入载体之前对核酸序列的操作可能是希望的或必需的，取决于所用的表达载体。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术在本领域广为人知。

在本发明的方法中，所述核酸序列可包含一或多个天然控制序列，或可用一或多个对该核酸序列外源的控制序列替代一或多个天然控制序列，以增加编码序列在宿主细胞中的表达。

术语“控制序列”此处定义为包括所有对表达本发明的多肽必要或有利的元件。每一控制序列可以是对编码多肽的核酸序列天然或外源的。这样的控制序列包括但不限于：前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、本发明的共有翻译起始区序列、信号肽序列和转录终止子。控制序列最少包括本发明的共有翻译起始区序列，以及转录和翻译终止信号。控制序列可带有接头，目的在于引入特异性的限制酶切位点，以易化控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接。

控制序列可以是适当的启动子序列，启动子序列是一种核酸序列，被宿主细胞识别以表达核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的核酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，其可从编码胞外或胞内多肽的基因中获得，所述多肽可以是对宿主细胞同源或异源的。

适合在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的启动子的例子是获自下列基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)类胰蛋白酶的蛋白酶(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合启动子)；及其突变的、截短的和杂合启动子。

在酵母细胞中，有用的启动子获自编码下列酶的基因：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其他对酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等在1992，酵母(Yeast)8：423-488中描述。

控制序列可以是适合的转录终止子序列，这是一种被宿主细胞识别终止转录的序列。终止子序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3’末端。任何在所选宿主细胞中有功能的终止子都可以用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞而言，优选的终止子获自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢类胰蛋白酶的蛋白酶。

对于酵母宿主细胞而言，优选的终止子获自编码下列酶的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其他对酵母宿主细胞有用的终止子由Romanos等在1992，同上中描述。

控制序列还可以是适合的前导序列，这是mRNA的非翻译区，它对宿主细胞的翻译很重要。前导序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5’末端。任何在所选宿主细胞中有功能的前导序列都可以用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞而言，优选的前导序列获自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

适合酵母宿主细胞的前导序列获自编码下列酶的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，该序列可操作地连接至核酸序列的3’末端，经转录后被宿主细胞识别，作为在转录的mRNA上加上多腺苷残基的信号。任何在所选宿主细胞中有功能的多腺苷酸化序列都可以用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞而言，优选的多腺苷酸化序列获自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢类胰蛋白酶的蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman在1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990中描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接至多肽氨基末端的氨基酸序列，指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。所述核酸序列的编码序列的5’端可内在含有信号肽编码区，在翻译读框中天然地与编码分泌多肽的编码区片段连接。或者，编码序列的5’端可含有信号肽编码区，其对编码序列是外源的。当编码序列本身不含有信号肽编码区时，可能需要该外源信号肽编码区。或者，该外源信号肽编码区可简单地替代天然信号肽编码区，以提高多肽的分泌。但是，任何引导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。

对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是获自编码下列酶的基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂酶。

对酵母宿主细胞有用的信号肽获自编码下列酶的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他有用的信号肽编码区由Romanos等在1992，同上中描述。

控制序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(在某些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的，可通过前肽从多肽原上催化或自动催化的切除转变为成熟的有活性的多肽。前肽编码区可获自编码下列酶的基因：枯草杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)。

信号肽和前肽编码区均位于多肽的氨基末端，前肽编码区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽编码区紧邻前肽编码区的氨基末端。

也可加入调节序列，其调节有关宿主细胞生长的多肽的表达。调节系统的例子是那些能对化学或物理刺激，包括调节化合物的存在作出反应，引起基因表达开启或关闭的系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。其他调节序列的例子是那些可使基因扩增的序列。在真核系统中，这些例子包括二氢叶酸还原酶基因，其在氨甲蝶呤的存在下被扩增，和金属硫蛋白基因，其可用重金属扩增。在这些情况下，编码多肽的核酸序列与调节序列可操作地相连接。

本发明还涉及核酸构建体，其用于改变编码宿主细胞内源的多肽的基因的表达。所述构成物可含有改变内源基因表达所必需的最少数目的组分。在一个实施方案中，所述核酸构建体优选含有(a)导向序列，(b)本发明的共有翻译起始区序列，(c)外显子，和(d)剪接供体位点。在将所述核酸构建体引入细胞时，构成物通过同源重组在内源基因位点插入细胞基因组。导向序列引导元件(a)-(d)整合入内源基因，以使元件(b)-(d)可操作地连接至内源基因。在另一个实施方案中，所述核酸构建体含有(a)导向序列，(b)本发明的共有翻译起始区序列，(c)外显子，(d)剪接供体位点，(e)内含子，和(f)剪接受体位点，其中导向序列引导元件(a)-(f)的整合，以使元件(b)-(f)可操作地连接至内源基因。但是，所述构成物可含有附加组分，如选择标记。

在上述两个实施方案中，这些组分的引入结果产生了一个新的转录单位，其中内源基因的表达被改变了。实质上，新的转录单位是导向构建体引入的序列和内源基因的融合产物。在内源基因被改变的个实施方案中，所述基因被激活。在该实施方案中，用同源重组通过插入调节序列替代、破坏正常情况下与亲本细胞的内源基因相联的调节区或使其失去功能，所述调节序列可引起基因表达水平明显高于在相应的亲本细胞中的表达水平。通过用本领域熟知的方法(参见，例如美国专利号5,641,670)在构建体中包含可扩增的选择性标记基因，可进一步扩增所述被激活的基因。在内源基因被改变的另一个实施方案中，基因的表达减少。

导向序列可在内源基因内、紧邻该基因、在上游基因内或在所述内源基因的上游并相隔一段距离。可用一或多个导向序列。例如，环状质粒或DNA片段优选使用单一的导向序列，而线型质粒或DNA片段优选使用两条导向序列。

所述构建体可进一步含有一或多个内源基因的外显子。外显子定义为被拷贝为RNA并存在于成熟的mRNA分子中的DNA序列，从而外显子序列是符合内源基因编码区读框的。外显子可任选地含有编码一或多个氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。或者，外显子含有对应5’非编码区的DNA。当外源性外显子编码一或多个氨基酸和/或氨基酸的一部分时，所述核酸构建体被设计成这样，即经转录和拼接后，读框符合内源基因编码区读框，使得来源于第二个外显子的mRNA部分的适当的读框不变。

构建体的剪接供体位点引导一个外显子与另一个外显子的拼接。典型的情况是，第一个外显子位于第二个外显子的5’端，而与第一个外显子重叠并在其3’端一侧的剪接供体位点识别在第二个外显子5’端一侧的剪接受体位点。剪接受体位点，类似于剪接供体位点，是引导一个外显子与另一个外显子拼接的序列。通过与剪接供体位点一起作用，剪接器使用剪接受体位点来去除内含子。

本发明进一步涉及制备多肽的方法，其包括(a)在适合制备多肽的条件下培养同源重组细胞，其中引入了新的转录单位，该转录单位包含本发明的共有翻译起始区序列、外显子和/或剪接供体位点，它们可操作地连接至编码多肽的内源核酸序列的第二个外显子；和(b)回收多肽。所述方法基于使用基因激活技术，例如在美国专利号5,641,670中记载的。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，其包含本发明的共有翻译起始区序列、编码多肽的核酸序列以及转录和翻译终止信号。可将上述的各种核酸和控制序列结合在一起以产生重组表达载体，其可包括一或多个方便使用的限制酶切位点，使启动子和/或编码多肽的核酸序列可在这些位点进行插入或置换。或者，可将核酸序列或包含共有翻译起始区序列和/或序列的核酸构建体插入适当的表达载体，来表达所述核酸序列。在创建表达载体时，将编码序列置于载体中，以使编码序列与本发明的共有翻译起始区序列和一或多个适当的表达控制序列可操作地相连接。

所述重组表达载体可以是任何能方便地进行重组DNA操作，以及使所述核酸序列得以表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择典型地取决于载体与载体所要引入的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线型的或闭合环状的质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何确保自复制的手段。或者，载体可以在引入宿主细胞后，整合入基因组并与整合入的染色体一起复制。此外，可使用单一的载体或质粒，或一起含有要引入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或更多的载体或质粒，或使用转座子。

本发明的载体优选含有一或多个选择标记，以便于转化细胞的选择。选择标记是一个基因，其产物提供对杀虫剂或病毒的抗性，对重金属的抗性、对自养生物的原养，以及诸如此类特性。适合酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等效物。优选用于曲霉细胞的标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有使载体稳定地整合入宿主细胞基因组或使载体在细胞中的复制独立于基因组的元件。对于整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的核酸序列或载体的任何其他元件，使载体通过同源或非同源重组稳定地整合入基因组。或者，载体可含有另外的核酸序列，通过同源重组引导载体整合入宿主细胞的基因组。所述另外的核酸序列能使载体在染色体上的精确位点整合入宿主细胞基因组。为增加在精确位点整合的可能性，整合元件优选含有足够数目的核酸，如100至1,500碱基对，优选400至1,500碱基对，最优选800至1,500碱基对，其与相应的靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组。

对于自主复制，载体可进一步包含能使载体在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子是2μ复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的结合，和ARS4和CEN6的结合。所述复制起点可以具有突变，该突变使其功能在宿主细胞中对温度敏感(参见，例如，Ehrlich，1978，美国国家科学院院报(Proceedings of theNational Academy of Sciences USA)75：1433)。

可将多于一个拷贝的编码多肽的核酸序列插入宿主细胞，以增加基因产物的产量。可通过下面的方法增加核酸序列的拷贝数：将至少一个附加拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括可扩增的选择标记基因和该核酸序列，其中可通过在适当选择剂存在时培养细胞，选择含有扩增拷贝的选择标记基因、因而含有附加拷贝的核酸序列的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。(参见，例如，Sambrook等，1989，supra)。

宿主细胞

本发明还涉及重组的宿主细胞，其包含本发明的共有翻译起始区序列，该序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列，所述重组的宿主细胞在用于多肽的重组制备中是有利的。将含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的本发明共有翻译起始区序列的载体引入宿主细胞，从而载体作为染色体整合体或如前所述的自复制的染色体外载体被保留在细胞中。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是任何在本发明方法中有用的真菌细胞。此处所用的“真菌”包括以下门：子囊菌亚门(Ascomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)、壶菌亚门(Chytridiomycota)和接合菌亚门(Zygomycota)(由Hawksworth等在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8^th版，1995，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK中定义)以及卵菌亚门(Oomycota)(由Hawksworth等在1995，supra，171页中引用)和所有的有有丝分裂孢子的真菌(Hawksworth等，1995，supra)。

在优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。此处所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子酵母和属于半知菌类的酵母(酵母菌(Blastomycetes))。由于酵母的分类将来可能会改变，为了本发明的目的，应如在酵母生物学和活性(Biologyand Activities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)一书中描述的内容来定义酵母。

在更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉(Yarrowia)细胞。

在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowialipolytica细胞。

在另一个优选实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有真菌门亚门和卵菌亚门的丝状形式(如Hawksworth等在1995，同上中描述的)。丝状真菌的特征是由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，其碳分解代谢是专性需氧的。与此相比，酵母，如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，其碳分解代谢可以是发酵的。

在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是，但不限于下列属物种的细胞：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)。

在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、曼赫根毛霉、嗜热毁丝酶、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

在一个甚至最优选的实施方案中，Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5，其最初作为禾本科镰孢ATCC 20334保藏，最近由Yoder和Christianson在1998，真菌遗传学和生物学(FungalGenetics and Biology)23：62-80和由O’Donnell等在1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics and Biology)23：57-67中被重新分类为Fusarium venenatum；以及Fusarium venenatum在分类学上相同的种，无论其现在已知的种名是什么。在另一个优选实施方案中，Fusariumvenenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5或Fusarium venenatumATCC 20334的形态突变种，如在WO 97/26330中公开的。

可用以下方法转化真菌细胞，其包括原生质体形成、原生质体的转化和细胞壁以本身已知的方式再生。适合转化曲霉宿主细胞的方法在下列文献中记载：EP 238 023和由Yelton等在1984，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)81：1470-1474发表的文章。适合转化镰孢属物种的方法由Malardier等在1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787中记载。可用下列文献中记载的方法转化酵母细胞：Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编辑，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法(Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology)194卷，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)153：163；和Hinnen等，1978，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of SciencesUSA)75：1920。

本发明通过下列实施例作进一步说明，不应将实施例理解为对本发明的范围的限制。

                      实施例

用作缓冲液和底物的化学制剂是至少为试剂级别的市售产品。

培养基和溶液

每升pH6.5的MY25培养基含有25g麦芽糖、2.0g MgSO₄·7H₂O、10g KH₂PO₄、2.0g柠檬酸、10g酵母提取物、2.0g K₂SO₄、2.0g尿素、1.0ml CaCl₂·2H₂O(100g/l贮存液)和0.5ml痕量金属溶液。用490ml玻璃蒸馏水和500ml 2X MY盐将MY25微量滴定培养基1∶100稀释。置于34℃培养。

每升pH6.5的2X MY盐溶液含有4g MgSO₄·7H₂O、4g K₂SO₄、20gKH₂PO₄、4g柠檬酸、1ml痕量金属溶液和2ml CaCl₂·2H₂O(100g/l贮存液)。

每升基本培养基转化平板含有6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52gKH₂PO₄、1ml痕量金属溶液、10g葡萄糖、500mg MgSO₄·7H₂O、342.3g蔗糖和20g纯净琼脂(pH6.5)。每升基本培养基转移平板(pH6.5)含有6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52g KH₂PO₄、1ml痕量金属溶液、1g葡萄糖、500mg MgSO₄·7H₂O和20g纯净琼脂(pH6.5)。

每升含氟乙酰胺的乙酸培养基含有12.77g醋酸钠、2g氯化钠、500mg MgSO₄·7H₂O、3g KH₂PO₄、300mg尿素、痕量硫酸亚铁和硫酸锌、342.3g蔗糖、2g氟乙酰胺和12g的纯净琼脂，pH6.1。

每升基本培养基含有6g NaNO₃、0.52g KCl、1.52g KH₂PO₄、1ml痕量金属溶液、10g葡萄糖、500mg MgSO₄·7H₂O、342.3g蔗糖和20gpH6.5的纯净琼脂。转移平板与上述相同，但省去蔗糖。

每升痕量金属溶液(100X)含有22g ZnSO₄·7H₂O、11g H₃BO₃、5g MnCl₂·4H₂O、5g FeSO₄·7H₂O、1.6g CoCl₂·5H₂O、1.6g(NH₄)₆Mo₇O₂₄和50g Na₄EDTA。

氯酸平板是在基本培养基中添加470mM氯酸和10mM作为唯一氮源的谷氨酸。

每升COVE平板含有343.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、10ml 3M CsCl和25g纯净琼脂。每升COVE盐(50X)溶液含有26g KCl、26g MgSO₄·7H₂O、76g KH₂PO₄和50ml COVE痕量金属溶液。每升COVE痕量金属溶液含有0.04g NaB₄O₇·10H₂O、0.040gCuSO₄·5H₂O、0.70g FeSO₄·H₂O、0.80g Na₂MoO₂·2H₂O和10g ZnSO₄。

每升COVE上层培养基含有0.52g KCl、0.52g MgSO₄·7H₂O、1.52g KH₂PO₄、1ml痕量金属、0.8M蔗糖，并用1％低熔点琼脂将其铺在转化平板上。

每升YEG培养基含有5g酵母提取物和20g右旋糖。

实施例1：pBANe8的构建

如下所述构建pBANe8，其包含TAKA/NA2-tpi前导杂合启动子、Humicola lanuginosa脂酶基因(该基因两边分别是PacI和SwaI位点)、AMG终止子和全长的构巢曲霉amdS基因作为选择标记。

用PCR方法，使用下面所示的引物1和2，在pToC90的全长amdS基因两侧插入NsiI位点(Christensen等，1988，生物技术(Biotechnology)6：1419-1422)，使用下面所示的引物3和4在pJaL292(图1)的NA2-tpi前导杂合启动子的5’端插入EcoRI位点，在其3’端插入SWaI位点。所述引物用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)，按照制造商的操作指示合成。引物1：5′-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3′(SEQ ID NO.5)引物2：5′-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3′(SEQ ID NO.6)引物3：5′-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3′(SEQ ID NO.7)引物4：5′-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3′(SEQ ID NO.8)

用大约0.2μg的pToC90或pJaL292作为模板制备扩增反应体系(100μl)。每一反应体系包含下列组成成分：0.2μg质粒DNA、48.4pmol正向引物、48.4pmol反向引物、各1mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1X Taq DNA聚合酶缓冲液和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Ericomp TwinBloek^TMSystem(Ericomp，Inc.，San Diego，CA)中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃5分钟；接下来30个循环，每个循环依次为：95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。

所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以证实2.7kb的amdS片段和0.6kb的NA2-tpi片段的存在。

接下来用TA Cloning Kit(Invitrogen，San Diego，CA)，按照制造商的用法说明将PCR产物亚克隆至pCRII。然后通过以下方法来筛选转化体：用QIAwell-8质粒试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)，按照制造商的用法说明从转化体中提取质粒DNA，用NsiI或EcoRI/SwaI对质粒DNA作限制酶切消化，再经琼脂糖电泳证实正确大小片段的存在：对于NsiI amdS片段大小为2.7kb，对于SwaI/EcoRINA2-tpi片段为0.6kb。为了证实PCR产物，用Applied Biosystems Model373A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)，通过引物步行技术使用染料终止化学法(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志(Journal of Viol.Methods)38：47-60)，用M13反向(-48)引物和M13正向(-20)引物以及对所要测序的DNA特异性的引物，对产物进行双链测序。然后用质粒设计针对的限制酶消化从正确的转化体中提取的质粒，消化产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并用FMCSpinBind Kit(FMC，Rockland，ME)，按照制造商的操作说明进行纯化。

pKS6(图2)包含TAKA淀粉酶启动子、多位点接头、AMG终止子和构巢曲霉pyrG基因，用EcoRI和SwaI消化pKS6，以除去TAKA淀粉酶启动子的部分。用NA2-tpi替代去除的区域，产生pBANe13(图3)。

用NsiI消化pBANe13，除去构巢曲霉pyrG基因。然后用上述的全长amdS基因PCR产物替代这一区域，产生pBANe6(图4)。

用PCR方法，使用如下所示的引物5和6，将SwaI和PacI位点插入pMHan37(图5)的全长的Humicola lanuginosa脂酶基因两侧。引物5和6的合成如上所述。

引物5：5′-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3(SEQ ID NO.9)

引物6：5′-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3′(SEQ ID NO.10)

扩增反应体系(100μl)包含下列组成成分：100ng pMHan37、48.4pmol引物5、48.4pmol引物6、各1mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1X Taq DNA聚合酶缓冲液和2.5U Taq DNA聚合酶。反应在Ericomp TwinBlock^TM System中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃5分钟；接下来30个循环，每个循环依次为：95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。取2μl反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以证实约为900bp的脂酶基因扩增产物。

然后用TA Cloning Kit将脂酶基因的PCR扩增产物亚克隆至pCRII。用以下方法筛选转化体：用QIAwell-8质粒试剂盒从转化体中提取质粒DNA，用SwaI/PacI限制酶切消化质粒DNA，并按照上述方法对DNA进行测序以证实PCR产物。

通过用SwaI和PacI消化从pCRII中切除脂酶基因，随后将该基因亚克隆至用SwaI/PacI消化的pBANe6，产生pBANe8(图6)。

实施例2：pBANe15的构建

构建pBANe15，使其包含构巢曲霉amdS基因，而且在米曲霉α-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子之间有多位点接头。

用PCR方法，使用下面所示的引物7和8，在全长amdS基因两侧插入NsiI位点，所述引物用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成仪按照制造商的操作指示合成。引物7：5′-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3′(SEQ ID NO.11)引物8：5′-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3′(SEQ ID NO.12)

用大约0.2μg的pToC90(Christensen等，1988，生物技术(Biotechnology)6：1419-1422)作为模板制备扩增反应体系(100μl)。每一反应体系包含下列组成成分：0.2μg pToC90、48.4pmol引物7、48.4pmol引物8、各1mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1X Taq DNA聚合酶缓冲液和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Ericomp TwinBlock^TM System中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃5分钟；接下来30个循环，每个循环依次为：95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。

接下来用TA Cloning Kit，按照制造商的用法说明将PCR产物亚克隆至pCRII。然后通过以下方法来筛选转化体：用QIAwell-8质粒试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)，按照制造商的用法说明从转化体中提取质粒DNA，用NsiI对质粒DNA作限制酶切消化，证实正确大小片段的存在，并按照实施例1所述的方法对DNA进行测序，以证实PCR产物。然后用NsiI消化从正确的转化体中提取的质粒，消化产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并用FMC SpinBind Kit，按照制造商的操作说明进行纯化。

用NsiI消化pKS6，除去构巢曲霉pyrG基因，然后用上述的全长amdS基因NsiI消化片段替代这一区域，产生pBANe15(图7)。

实施例3：pDBEL1及其变体的构建

用PacI和SwaI消化质粒pBANe8和pBANe15。消化之后，各取25μl反应产物用40mM Tris-乙酸-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，在1％琼脂糖凝胶上电泳。将适当大小的片段(6904bp pBANe15片段和908bp脂酶片段)从胶上切下来，用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)遵循制造商的使用说明进行纯化。用T4 DNA连接酶将这些片段连接在一起，产生pDBEL1(图8)，其包含构巢曲霉amdS基因、来自pBANe15的米曲霉α-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子，和来自pBANe8的Humicola lanuginosa脂酶基因。在pDBEL1中，Hnmicola lanuginosa脂酶基因上游的翻译起始区的核苷酸序列确定为CATTTAAATGATG(SEQ ID NO.13)

其-3位含核苷酸A。

用Stratagene QuikChange^TM定点诱变试剂盒(Site-DirectedMutagenesis Kit)(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)，按照制造商的使用说明，并使用下列的引物，改变Humicola lanuginosa脂酶基因上游的-3位核苷酸，产生3个pDBEL1的变体，彼此区别仅为-3位的核苷酸。引物9：5′-CCACAGAAGGCATTTAATTGATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ IDNO.14)引物10：5′-CAAGGGAGCTCCTCATCAATTAAATGCCTTCTGTGG-3′(SEQ IDNO.15)引物11：5′-CCACAGAAGGCATTTAACTGATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ IDNO.16)引物12：5′-CAAGGGAGCTCCTCATCAGTTAAATGCCTTCTGTGG-3′(SEQ IDNO.17)引物13：5′-CCACAGAAGGCATTTAAGTGATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ IDNO.18)引物14：5′-CAAGGGAGCTCCTCATCACTTAAATGCCTTCTGTGG-3′(SEQ IDNO.19)

引物9和10用于产生pDBEL1T，引物11和12用于产生pDBEL1C，引物13和14用于产生pDBEL1G。每个反应体系含有下列组成成分：100ng pDBEL1、50pmol正向引物、50pmol反向引物、各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1X Taq DNA聚合酶缓冲液(Invitrogen，San Diego，CA)和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-ElmerCorp.，Branchburg，NJ)。反应在Perkin-Elmer Model 9600Thermocycle中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃30秒；接下来12个循环，每个循环依次为：95℃30秒，55℃1分钟和68℃14分钟。用10单位的DpnI处理PCR反应物，以消化未突变的亲本DNA。然后遵循Stratagene QuikChange^TM定点诱变试剂盒的使用方案，用反应物转化大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue超感受态细胞。

用荧光标记的核苷酸通过Taq聚合酶循环测序法测定pDBEL1变体(pDBEL1T、pDBEL1C、pDBEL1G)的核苷酸序列。测序反应物在Applied Biosystems自动DNA测序仪Model 377，version 3.0上电泳。所用的测序引物如下：

测序引物971308：

5′-AGAGTGACTAGGGGCGGAAAT-3′(SEQ ID NO.20)

测序引物971309：

5′-CCGGTGACATCGCCCACTCCA-3′(SEQ ID NO.21)

pDBEL1变体的核苷酸序列如下：

pDBEL1T  CATTTAA TTGATG    (SEQ ID NO.22)

pDBEL1C  CATTTAA CTGATG    (SEQ ID NO.23)

pDBEL1G  CATTTAA GTGATG    (SEQ ID NO.24)

实施例4：米曲霉BANe3的构建

将米曲霉HowB711在25ml 0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培养基中，37℃250rpm培养24小时。然后通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤，收集菌丝体，并用蒸馏水洗3遍。将多余的水从菌丝体制备物中沥出，然后在液氮中冷冻。用研钵和研杵将冷冻的菌丝体制备物研磨成细粉末，将所得粉末加入装有20ml 10mM Tris-1mMEDTA(TE)缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)的一次性塑料离心管中。将混合物温和地颠倒数次，确保混合均匀，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)抽提2次。将醋酸钠(3M溶液)加入提取物中，使其终浓度达到0.3M，接下来用2.5倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。将离心管在15,000xg离心30分钟，沉集DNA。将DNA沉淀在空气中干燥30分钟，之后重新悬于0.5ml TE缓冲液中。将无DNA酶的核糖核酸酶A加入重悬的DNA沉淀中，使其浓度达100μg/ml，然后将所得混合物在37℃温育30分钟。加入蛋白酶K(200μg/ml)，将离心管在37℃再温育1小时。最后，所得样本用酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，并用乙醇沉淀DNA。用70％乙醇洗涤DNA沉淀，经真空干燥，重悬于TE缓冲液，4℃贮存。

从如上所述分离的米曲霉HowB711基因组DNA，用如下所示的引物15和16，PCR扩增amdS基因。该引物是基于由Gomi等报道的米曲霉amdS基因序列(1991，基因(Gene)108：91-98)。PCR反应体系包含下列组成成分：200ng基因组DNA、50pmol正向引物、50pmol反向引物、各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1X Taq DNA聚合酶缓冲液(Invitrogen，San Diego，CA)和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Ericomp TwinBlock^TMSystem中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃5分钟；接下来30个循环，每个循环依次为：95℃1分钟，55℃1分钟和72℃1.5分钟。

引物15(95-589)5′-GGTCCAGACAACTCCCAGAAC-3′(SEQ ID NO.25)

引物16(95-590)5′-CGAGGCGTGCGTAGTAGGTCT-3′(SEQ ID NO.26)

取10μl反应物用TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上电泳，得到2660bp产物。用TA Cloning Kit，按照制造商的操作方案将该2660bp片段亚克隆至pCRII，然后将pCRII转化至One Shot Cells(大肠杆菌(E.coli)TOP10感受态细胞)。用M13反向(-48)引物和M13正向(-20)引物和荧光标记的核苷酸通过Taq DNA聚合酶循环测序法，用Applied Biosystems自动DNA测序仪(Model 373A，version 1.2.0)测定核苷酸序列以证实PCR产物。

用PstI消化pUC4K(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，并用小牛碱性磷酸酶处理经消化的质粒来构建pUC4L。经消化的质粒用TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上电泳，从胶上切下3.9kb的条带。切除下来的DNA用Prep-a-Gene Kit(Biorad，Hercules，CA)纯化。用下列自互补的寡核苷酸在pUC4k-PstI中创建接头：5′-GCCCGGGATCGATGCATCTAGATATCTAGATGCATCGATCCCGGGCTGCA-3′(SEQ ID NO.27)

在标准条件及1.0mM ATP的存在下，用T4激酶处理该寡核苷酸，68℃加热30分钟，缓慢地冷却至室温退火30分钟。退火的引物和经消化的pUC4K连接在一起，并用于转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。通过分离DNA，并用XbaI，也可以是StuI加ScaI对DNA作限制酶切消化来筛选菌落。然后用Wizard Midiprep Kit(Promega，Madison，WI)分离pUC4L。

用EcoRV消化pUC4L，并用小牛碱性磷酸酶处理经消化的质粒来构建pUC4-AN.pyrG1&2(图9)。将经消化和磷酸酶作用的pUC4L用TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上电泳，分离约3.9kb的片段。将该3.9kbEcoRV片段从胶上切下来，并用Prep-A-Gene Kit纯化。纯化的EcoRV片段与来自pPYRG1(真菌遗传学贮藏中心(Fungal Genetics StockCenter)，Kansas City，KS)的含构巢曲霉pyrG基因的约1.6kb片段连接。用ScaI和NdeI消化pPYRG1，然后在dNTP的存在下用Klenow片段处理以补平末端。然后将所得片段用TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上电泳，切下含1.6kb构巢曲霉pyrG片段的条带。用BioradPrep-A-Gene Kit纯化pyrG片段。

连接pUC4L和pyrG片段，并用于转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。使用作为pJeRS4(美国专利5,861,280)的1.7kb片段的米曲霉pyrG基因作为探针，通过杂交筛选转化体。对4个阳性菌落作鉴定并用XbaI限制酶切消化作进一步分析，以证实构巢曲霉pyrgI基因的存在。

为获得盒以破坏米曲霉的amdS基因座，将amdS基因内的800bpNsiI片段删除，并用如下的构巢曲霉pyrG基因取而代之。用EcoRI消化将amdS基因从pCRII载体上切除，随后亚克隆至pUC118，产生pBANe11(图10)。

用Nsil消化pUC4-AN.pyrG1&2，用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分离含pyrG基因的1.6kb片段，然后用FMC SpinBind Kit纯化。纯化片段用乙醇沉淀，并重悬于30μl TE。为破坏amdS基因，用NsiI消化pBANe11，以切除800bp片段，插入1.6kb构巢曲霉pyrG基因产生pBANe12(图11)。用EcoRI消化使pBANe12成为线型，所得片段用FMC SpinBind Kit纯化。用该线型片段转化米曲霉HowB425。

将米曲霉HowB425在150ml YEG培养基中，34℃，130rpm振荡培养16-18小时。用0.2μm滤器过滤回收菌丝体，直到约10ml留在滤器上，用约50ml 1M MgSO₄·7H₂O(经0.2μm滤器过滤的)洗涤，然后用无菌匙收集，置于125ml Ehrlenmeyer烧瓶中。然后用含5mg/mlNOVOZYM 234^TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)的20ml1M MgSO₄·7H₂O重悬菌丝体。所得悬液在34℃，80rpm温和振荡下温育约30分钟，以生成原生质体。

然后将125ml Ehrlenmeyer烧瓶中的内容物经无菌Miracloth过滤至30ml聚丙烯离心管中，并用20ml 2M山梨糖醇洗涤Miracloth。将离心管盖好、轻轻混匀，置于Sorval RT6000吊桶式转头3000xg离心15分钟，回收原生质体。去除上清液，将原生质体重悬于1ml 1M山梨糖醇。然后加入1M山梨糖醇至体积达30ml，2000xg离心10分钟。用STC(1.2M山梨糖醇-10mM Tris-10mM CaCl₂·2H₂O，pH7.5)重复洗涤。将原生质体重悬于STC，终浓度为2×10⁷原生质体/毫升。

用浓度为2×10⁷原生质体/毫升的原生质体进行米曲霉HowB425的转化。将100μl原生质体与5μg pBANe12的EcoRI片段置于冰上30分钟。加入1ml SPTC(40％聚乙二醇4000-0.05M CaCl₂-0.8M山梨糖醇-0.05M Tris pH8.0)，将原生质体在37℃温育20分钟。将5ml STC加入每一个转化反应，之后各将3ml铺至基本培养基或含氟乙酰胺的乙酸培养基。将平板在37℃温育5至7天。用无菌牙签将菌落挑至同样培养基的平板。通过将孢子划线接种并挑取分离的菌落来纯化菌落。在基本培养基或乙酸培养基平板上分别获得47和65个转化体。将菌落转移至与最初生长作孢子纯化同样类型的培养基。

将推定的转化体孢子在25ml YEG培养基37℃过夜培养。菌丝体经Miracloth过滤，用蒸馏水漂洗3遍。挤出多余的水，将菌丝体在液氮中冷冻，并用研钵和研体研磨成细粉末。用Purgene DNA Isolation Kit(Gentra Systems Inc.，Minneapolis，MN)从每一个转化体中分离基因组DNA。用如上所示的引物15和16通过PCR筛选出31个转化体，方法与前相同，但反应的程序设置有所不同：第一个循环：95℃5分钟；接下来25个循环，每个循环依次为：94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。未转化的对照产生2.66kb的条带。3个转化体产生预期大小(3370bp)的amdS破坏的PCR产物。

所得的3株推定的ΔamdS株用DNA印迹分析，证实amdS基因座已被破坏了。

从推定的ΔamdS株中取2μg基因组DNA，用限制性内切酶SalI、EcoRI、NotI、BamHI和HindIII在10μl各自的1X缓冲液中37℃消化24小时。经消化的DNA用TAE缓冲液在0.6％琼脂糖凝胶(SeakemGold，FMC，Rockland，ME)上电泳。将凝胶变性、中和，并浸在20XSSC中，每一步骤作用30分钟。用Schleicher&Schuell TurboBlotter(Keene，NH)将消化的DNA转移16小时至Nytran膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上。将薄膜在2X SSC中漂洗，用UV Stratalinker2400(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)将DNA用UV交联至薄膜上。用Genius System(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)探测薄膜。用20ml Easy Hyb在42℃与薄膜预杂交1小时。用pBANe11 DNA、寡核苷酸1和2、5U Taq DNA聚合酶和BoehringerMannheim Dig DNA label mix(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)将amdS探针作DIG标记。将探针变性后定量并以1ng/ml加入。薄膜与探针在42℃杂交过夜。滗出探针，将薄膜在室温下2X SSC；0.1％SDS中洗2次，5分钟，在65℃，0.1X SSC；0.1％SDS中，洗2次，15分钟。按照Boehringer Mannheim提供的方案，用Lumi-Phos 530检测DIG-标记的核苷酸。将薄膜曝光至胶片15分钟。

DNA印迹分析提示有两株，即米曲霉BANe1和BANe2，表现为具有多个拷贝的破坏盒整合在amdS基因座，当用BamHI和HindIII消化DNA，可观察到两侧翼区和3500bp位置的一个串联重复。米曲霉BANe3表现为单个破坏，其中一个拷贝的破坏盒被整合在amdS基因座。经限制酶切消化后，米曲霉BANe3只有两个预期条带，用BamHI消化为5.2kb和3.5kb，用HindIII消化为6kb和3.8kb。

实施例5：米曲霉BANe3的转化

将米曲霉BANe3在100ml YEG培养基中，34℃，160rpm振荡培养16-18小时。用0.2μm滤器过滤回收菌丝体，直到约10ml留在滤器上，用约20ml 1M MgSO₄·7H₂O(经0.2μm滤器过滤的)洗涤，然后用无菌环收集，置于125ml Ehrlenmeyer烧瓶中。然后将菌丝体与75mgNOVOZYM 234^TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)重悬于15ml 1M MgSO₄·7H₂O。所得悬液在34℃，50rpm温和振荡下温育约1小时，以生成原生质体。

然后将125ml Ehrlenmeyer烧瓶中的内容物经无菌Miracloth过滤至30ml Corex离心管中，上层加入6ml 0.6M山梨糖醇-100mM TrispH7.0，置于吊桶式转头3500xg离心15分钟，回收原生质体。用巴氏吸管从缓冲液界面回收原生质体。然后用2体积的STC(1.2M山梨糖醇-10mM Tris-10mM CaCl₂·2H₂O，pH7.5)洗涤原生质体，3500xg离心5分钟。将原生质体在10ml STC中洗2次，如前述离心。将原生质体重悬于STC，终浓度为1.7×10⁷原生质体/毫升。

用浓度为1.7×10⁷原生质体/毫升的原生质体进行米曲霉BANe3的转化，以筛选amdS。将10μg DNA(pDBEL1、pDBEL1T、pDBEL1C、pDBEL1G)加入100μl原生质体中，再向其中加入250μl PEG溶液(60％PEG 4000-10mM CaCl₂)。将所得混合物置于37℃30分钟。然后加入4ml STC，将所得混合物铺至COVE平板上筛选amdS。将所述平板在37℃温育5-7天。通过将孢子划线接种，从37℃温育的COVE平板上挑取分离的菌落获得纯的转化体。

实施例6：转化体产脂酶分析

测定实施例5中得到的米曲霉BANe3转化体的脂酶表达。对于微量滴定测定，用49％玻璃蒸馏水和50％2X MY盐pH6.5溶液将MY25培养基稀释100倍。将1.25ml 1/100强度的MY25培养基加入24孔细胞培养平板的板孔中。用10μl各转化体的孢子接种板孔，将培养平板在34℃100rpm振荡温育。每个转化体接种3个板孔。用未转化的米曲霉BANe3接种3个板孔。

在第3天和第5天从24孔细胞培养平板的每一孔中取100μl样品。每一样品用200μl在4mM CaCl₂-100mM MOPS pH7.5(MC缓冲液)中的100mM α-烯属磺酸酯(AOS)洗涤剂稀释，将20μl等分溶液分别加入96孔板的板孔中，再加入200μl稀释的底物。脂酶测定底物如下制备：即用即配，将对硝基苯基丁酸酯底物贮液底物(21μl对硝基苯基丁酸酯/ml DMSO)在MC缓冲液中按1∶50稀释。制备标准脂酶(LIPOLASE^TM，Novo Nordisk A/S，Bagsvrd，Denmark)，其浓度为每ml含0.02％AOS洗涤剂的MC缓冲液中含有40LU脂酶。使用之前将标准脂酶贮存于4℃。就在使用前将标准脂酶在MC缓冲液中按1/40稀释。由于两次读数之间约1分钟间隔即有差异，所以使用读板器，记录在405nm处的吸光度。相对脂酶标准计算脂酶单位/ml(LU/ml)。脂酶测定的结果，相对于用pDBEL1获得的脂酶活性，如表1所示。

         表1-米曲霉BANe3转化体的脂酶表达

质粒DNA    筛选的转化体数    相对平均脂酶    相对中值脂酶

                             (LU/ml)         (LU/ml)

pDBEL1     46                1               1

pDBEL1G    46                0.91            0.87

pDBEL1C    47                0.57            0.42

pDBEL1T    50                0.31            0

如表1所示，当Humicola lanuginosa脂酶基因在-3位含嘌呤时，脂酶表达较高，当-3位是核苷酸A时，表达最高。当-3位含嘧啶时，脂酶表达显著下降，当-3位是核苷酸T时，表达最低。

实施例7：pJaL485及其变体的构建

构建pJaL485(图12)使其含有截短的niaD基因和一个表达盒，其中Humicola lanuginosa脂酶基因夹在NA2启动子和黑曲霉AMG终止子之间。

用HindIII消化编码米曲霉niaD基因(Unkles等，1989，分子普通遗传学(Molecular General Genetics)218：99-104)的质粒pSTA14，纯化所得的5136bp片段，并将其克隆至用HindIII消化的pUC19，生成质粒pToC108。用BglII-SalI消化质粒pToC108，纯化所得的3700bp片段，并将其克隆至用BglII-SalI消化的pUC19，生成质粒pJaL410。该质粒编码截短的niaD基因，其N-末端85个氨基酸被去除。

用SacI-PstI消化质粒pJaL410，并用Klenow酶和dNTP处理，将所得的6018bp片段纯化并再连接，生成质粒pJaL420。用Chameleon双链定点诱变试剂盒(Double-Stranded Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)按照制造商的使用说明，通过制造一个沉默突变去除pJaL420中的BamHI位点，产生质粒pJaL423。通过用下列引物把BamHI位点中的T变为C，破坏了BamHI位点：5′-GGAACGATGGA CCCGGAAGGTTTAAAAGC-3′(SEQ ID NO.28)

对破坏了的BamHI位点周围的测序结果显示，在更远的下游发生了一些意想不到的变化，导致niaD基因发生移码，并创造了一个SmaI位点。为修复此移码，用pJaL420中的相应片段替换pJaL423中的291bp的AccI-DraI片段，生成pJaL475。

将pJaL475中编码截短的niaD基因的3381bp的HindIII片段克隆至质粒pJaL211的HindIII位点，产生质粒pJaL479。用HindIII部分消化，再用Klenow酶和dNTP处理，破坏2位的HindIII位点。将所得的8586bp片段纯化并再连接，生成质粒pJaL485(图12)。

在pJaL485中，Humicola lanuginosa脂酶基因上游的核苷酸序列是GGGATCCACCATG(SEQ ID NO.29)

其-3位为核苷酸A。

用Stratagene QuickChange^TM定点诱变试剂盒按照制造商的使用说明，使用下列引物，通过改变Humicola lanuginosa脂酶基因上游的核苷酸序列，产生pJaL485的6个变体：

引物17：5′-CCCCACAGAAGGGATCCACTATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.30)

引物18：5′-CAAGGGAGCTCCTCATAGTGGATCCCTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.31)

引物19：5′-CCCCACAGAAGGGATCCATCATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.32)

引物20：5′-CAAGGGAGCTCCTCATGATGGATCCCTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.33)

引物21：5′-CCCCACAGAAGGGATCCTCCATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.34)

引物22：5′-CAAGGGAGCTCCTCATGGAGGATCCCTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.35)

引物23：5′-CCCCACAGAAGGGATCTACCATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.36)

引物24：5′-CAAGGGAGCTCCTCATGGTAGATCCCTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.37)

引物25：5′-CCCCACAGAAGGGATCTTTTATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.38)

引物26：5′-CAAGGGAGCTCCTCATAAAAGATCCCTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.39)

引物27：5′-CCCCACAGAAGTCCTTCACCATGAGGAGCTCCCTTG-3′(SEQ ID

NO.40)

引物28：5′-CAAGGGAGCTCCTCATGGTGAAGGACTTCTGTGGGG-3′(SEQ ID

NO.41)

用引物17和18构建pDBEL2-1T，其与pJaL485的区别仅在Humicola lanuginosa脂酶基因的-1位。pJaL485在这个位置含核苷酸C，而pDBEL2-1T含核苷酸T。

用引物19和20构建pDBEL2-2T，其与pJaL485的区别仅在Humicola lanuginosa脂酶基因的-2位。pJaL485在这个位置含核苷酸C，而pDBEL2-2T含核苷酸T。

用引物21和22构建pDBEL2-3T，其与pJaL485的区别仅在Humicola lanuginosa脂酶基因的-3位。pJaL485在这个位置含核苷酸A，而pDBEL2-3T含核苷酸T。

用引物23和24构建pDBEL2-4T，其与pJaL485的区别仅在Humicola lanuginosa脂酶基因的-4位。pJaL485在这个位置含核苷酸C，而pDBEL2-4T含核苷酸T。

用引物25和26构建pDBEL2-1-4T，其与pJaL485的区别仅在Humicola lanuginosa脂酶基因的-4至-1位。pJaL485在这些位置含核苷酸CACC，而pDBEL2-1-4T含核苷酸TTTT。

用引物27和28构建pDBEL3，其与pJaL485的区别仅在Humicolalanuginosa脂酶基因的-9至-7位和-5位。pJaL485在-5位含核苷酸C，在-9至-7位含核苷酸GGA，而pDBEL3在-5位含核苷酸T，在-9至-7位含核苷酸TCC。

所述PCR反应在Perkin Elmer 9600 Thermocycle中进行，程序设置如下：第一个循环：95℃30秒；接下来12个循环，每个循环依次为：95℃30秒，55℃1分钟和68℃14分钟。用10单位的DpnI处理PCR反应物，消化非突变的亲本DNA。然后按照Stratagene QuickChange^TM定点诱变试剂盒操作方案，用消化反应物转化大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue超感受态细胞。

使用荧光标记的核苷酸通过Taq DNA聚合酶循环测序法，测定pJaL485变体(pDBEL2-1 、pDBEL2-2T、pDBEL2-3T、pDBEL2-4T、pDBEL2-1-4T和pDBEL3)的核苷酸序列。测序反应物在AppliedBiosystems自动DNA测序仪(Model 377，version 3.0)上电泳。用前面所列的测序引物(971308和971309)测定pJaL485变体的序列。

实施例8：米曲霉JaL294的构建

为构建确定的米曲霉niaD基因突变体，构建替代质粒pJaL448(图13)，其中niaD基因的C-末端部分被米曲霉pyrG基因置换。

用KpnI消化质粒pJaL410(其构建如实施例7所述)，将所得的4307bp片段纯化并再连接，生成质粒pJaL419。用KpnI消化编码米曲霉pyrG基因的质粒pJeRS4(美国专利5,861,280)，将所得的1515bp片段纯化并与用KpnI消化的pJaL419连接，生成pJaL448(图13)。

质粒pJaL448是双交换质粒，其中米曲霉pyrG基因(来自pJeRS4的1515bp KpnI消化片段)两侧分别为编码niaD蛋白85-276位氨基酸的长782bp的BglII-KpnI片段，和含有niaD终止子的长841bp的KpnI-HindIII片段。

用如实施例5中所述相同的方案制备米曲霉JaL250的原生质体。用XhoI将pJaL448线型化，转化至米曲霉JaL250(米曲霉JaL228的pyrG衍生株)的原生质体。用浓度为1.7×10⁷原生质体/毫升的原生质体进行米曲霉JaL250的转化，筛选氯酸抗性。将10μg线型化的pJaL448加入100μl原生质体中。再向其中加入250μl PEG溶液(60％PEG4000-10mM CaCl₂)，将所得混合物置于37℃30分钟。然后加4mlSTC，将所得混合物铺至基本培养基平板上筛选氯酸抗性。将所述平板在37℃温育5-7天。分离具有氯酸抗性的转化体(从45个中选出9个)，进一步在含有氯酸，以谷氨酸作为唯一氮源的基本培养基上纯化。评价这9个突变体以硝酸盐和亚硝酸盐为唯一氮源生长的能力。有3株的表型提示其存在硝酸还原酶结构突变(niaD)，即它们不能以硝酸盐为唯一氮源生长，但以亚硝酸盐为唯一氮源生长。

提取这3个突变株的基因组DNA，经BamHI-、KpnI-和HindIII-消化，用来自pJaL410的2kb KpnI片段或3.7kb HindIII片段为探针杂交，作DNA印迹分析，结果证实，只有一个转化体，命名为米曲霉JaL294，在niaD基因座具有预期的基因置换，如图12所示。

实施例9：米曲霉JaL294的转化

用如实施例5中所述相同的方案制备米曲霉JaL294的原生质体。

用浓度为1.7×10⁷原生质体/毫升的原生质体进行米曲霉JaL294的转化，筛选niaD。将10μg DNA(pDBEL2-1T、pDBEL2-2T、pDBEL2-3T、pDBEL2-4T、pDBEL2-1-4T、pDBEL3或pJaL485)加入100μl原生质体中。再向其中加入250μl PEG溶液(60％PEG4000-10mM CaCl₂)，将所得混合物置于37℃30分钟。然后加入4mlSTC，将所得混合物铺至基本培养基平板上筛选niaD。将所述平板在37℃温育5-7天。通过将孢子划线接种，从37℃温育的基本培养基平板上挑取分离的菌落获得纯的转化体。

实施例10：在米曲霉JaL294转化体中整合事件的表征

按照下列方法从所有的米曲霉JaL294转化体中分离基因组DNA：将每个转化体在5ml YEG培养基中，置于小培养皿(60×15mm)中，37℃培养24小时。然后将每一培养物经Whatman 1号滤纸(Whatman，Springfield Mill，England)过滤回收菌丝体，转移至1.7ml离心管中。将菌丝体制备物在液氮中冷冻，之后在SpeedVac(Savant Instruments，Inc.，Farmingdale，NY)中干燥1.5小时。用无菌牙签将冷冻的菌丝体制备物研磨成细粉末。用Qiagen DNeasy Kit(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)，按照制造商的使用说明，从冷冻的菌丝体中提取基因组DNA。

按照由Sambrook等，在1989，同上中描述的方法，用PstI消化基因组DNA，然后用DNA印迹杂交确定是否有单个拷贝的质粒整合入转化体中。另外，从未转化的米曲霉JaL294中提取基因组DNA。消化物的DNA印迹用获自pJaL485的0.834kb niaD片段为探针杂交。用Boehringer Mannheim PCR DIG探针合成试剂盒(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)，按照制造商的使用说明，将所述片段用dioxygenin标记。将印迹在DIG Easy Hyb中50℃预杂交2小时，然后50℃杂交过夜。如制造商推荐的方法洗涤并加工印迹。

DNA印迹证实，当用niaD片段为探针杂交时，pJaL485含有8.5kb的条带，而未转化的米曲霉JaL294含有5.7kb的条带。整合了单个拷贝的质粒的转化体应当含有11.7kb和2.6kb的条带。整合了多个拷贝的质粒的转化体应当含有同样的11.7kb和2.6kb的条带，以及8.5kb的第三个条带。然后将整合了单个拷贝的质粒的转化体在摇瓶中培养，随后测定脂酶活性。

实施例11：摇瓶中的转化体分析

如下培养米曲霉转化体：将170μl孢子悬液(0.01％吐温-80加上基本培养基平板上的孢子)接种至25ml pH6.5的MY25培养基，置于125ml聚丙烯摇瓶中，34℃，225rpm振荡培养。第3天和第5天取样，如实施例5所述测定脂酶活性。

表2显示pJaL485及其所有变体-9至+3位的核苷酸序列。所得结果，相对于用pJaL485获得的脂酶活性，如下面的表3所示。

             表2--9至+3位的核苷酸序列

      质粒            核苷酸序列

      pJal485         5′-GGATCCACCATG-3′(SEQ ID NO.42)

      pDBEL2-1        5′-GGATCCACTATG-3′(SEQ ID NO.43)

      pDBEL2-2        5′-GGATCCATCATG-3′(SEQ ID NO.44)

      pDBEL2-3        5′-GGATCCTCCATG-3′(SEQ ID NO.45)

      pDBEL2-4        5′-GGATCTACCATG-3′(SEQ ID NO.46)

      pDBEL2-1-4      5′-GGATCTTTTATG-3′(SEQ ID NO.47)

      pDBEL3          5′-TCCTTCACCATG-3′(SEQ ID NO.48)

           表3-米曲霉JaL294转化体的脂酶表达

质粒DNA      筛选的转化体数     平均脂酶      中值脂酶

                                (LU/ml)       (LU/ml)

pJaL485      3                  1             1

pDBEL2-1     5                  0.94          0.94

pDBEL2-2     5                  0.94          0.89

pDBEL2-3     8                  0.36          0.35

pDBEL2-4     7                  0.95          0.92

pDBEL2-1-4   6                  0.07          0.07

pDBEL3       6                  1.66          1.65

如表3所示，当-1、-2或-4位的核苷酸变为核苷酸T时(pDBEL2-1、pDBEL2-2和pDBEL2-4)，脂酶表达与野生型质粒(pJaL485)相比，无显著改变。当-3位的核苷酸从核苷酸A(pJaL485)变为核苷酸T(pDBEL2-3)时，脂酶表达显著降低。但是，当-4至-1位都变为核苷酸T(pDBEL2-1-4)时，脂酶表达进一步下降，超过在任何位置仅单个核苷酸改变时观察到的下降。pDBEL3在-9至-1位含有曲霉属共有序列。这导致脂酶表达的显著增加。

在此描述和要求保护的发明并不限于在此公开的特定实施方案的范围，因为这些实施方案是为了举例说明的本发明的几个方面。任何等效的实施方案都在本发明的范围之内。事实上，除了在此描述的内容以外的本发明的各种修改，对本领域的技术人员来说，在前面的说明基础上是显而易见的。这样的修改也在所附的权利要求范围之内。若发生冲突，则以本公开文本，包括定义为准。

在此引用了各种参考文献，其公开内容作为整体引入作为参考。

                   序列表<110>Yaver，Debbie S.

 Bellini，Daniel Alan<120>用共同翻译起始区序列制备多肽的方法<130>5996.204-WO<140>待指定<141>2000-11-20<150>09/451,503<151>1999-11-30<160>48<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>10<212>DNA<213>米曲霉<220><223>N为A，C，G，或T；Y为C或T；B为A，C，

 或T<400>1nycnnbcacc                                                                 10<210>2<211>13<212>DNA<213>米曲霉<400>2gtccttcacc atg                                                             13<210>3<211>13<212>DNA<213>米曲霉<400>3gtcctccacc atg                                                             13<210>4<211>13<212>DNA<213>米曲霉<400>4gtcctacacc atg                                                             13<210>5<211>24<212>DNA<213>米曲霉<400>5atgcatctgg aaacgcaacc ctga                                                 24<210>6<211>24<212>DNA<213>米曲霉<400>6atgcattcta cgccaggacc gagc                                                 24<210>7<211>21<212>DNA<213>米曲霉<400>7tggtgtacag gggcataaaa t                                                    21<210>8<211>34<212>DNA<213>米曲霉<400>8atttaaatcc agttgtgtat atagaggatt gtgg                                      34<210>9<211>30<212>DNA<213>米曲霉<400>9atttaaatga tgaggagctc ccttgtgctg                                           30<210>10<211>29<212>DNA<213>米曲霉<400>10ttaattaact agagtcgacc cagccgcgc                                            29<210>11<211>24<212>DNA<213>米曲霉<400>11atgcatctgg aaacgcaacc ctga                                                 24<210>12<211>24<212>DNA<213>米曲霉<400>12atgcattcta cgccaggacc gagc                                                 24<210>13<211>13<212>DNA<213>米曲霉<400>13catttaaatg atg                                                             13<210>14<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>14ccacagaagg catttaattg atgaggagct cccttg                                    36<210>15<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>15caagggagct cctcatcaat taaatgcctt ctgtgg                                    36<210>16<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>16ccacagaagg catttaactg atgaggagct cccttg                                    36<210>17<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>17caagggagct cctcatcagt taaatgcctt ctgtgg                                    36<210>18<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>18ccacagaagg catttaagtg atgaggagct cccttg                                    36<210>19<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>19caagggagct cctcatcact taaatgcctt ctgtgg                                    36<210>20<211>21<212>DNA<213>米曲霉<400>20agagtgacta ggggcggaaa t                                                    21<210>21<211>21<212>DNA<213>米曲霉<400>21ccggtgacat cgcccactcc a                                                    21<210>22<211>16<212>DNA<213>米曲霉<400>22catttaaatg ttgatg                                                          16<210>23<211>16<212>DNA<213>米曲霉<400>23catttaaatg ctgatg                                                          16<210>24<211>16<212>DNA<213>米曲霉<400>24catttaaatg gtgatg                                                          16<210>25<211>21<212>DNA<213>米曲霉<400>25ggtccagaca actcccagaa c                                                    21<210>26<211>21<212>DNA<213>米曲霉<400>26cgaggcgtgc gtagtaggtc t                                                    21<210>27<211>50<212>DNA<213>米曲霉<400>27gcccgggatc gatgcatcta gatatctaga tgcatcgatc ccgggctgca                     50<210>28<211>29<212>DNA<213>米曲霉<400>28ggaacgatgg acccggaagg tttaaaagc                                            29<210>29<211>13<212>DNA< 213>米曲霉<400>29gggatccacc atg                                                             13<210>30<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>30ccccacagaa gggatccact atgaggagct cccttg                                    36<210>31<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>31caagggagct cctcatagtg gatcccttct gtgggg                                    36<210>32<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>32ccccacagaa gggatccatc atgaggagct cccttg                                    36<210>33<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>33caagggagct cctcatgatg gatcccttct gtgggg                                    36<210>34<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>34ccccacagaa gggatcctcc atgaggagct cccttg                                    36<210>35<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>35caagggagct cctcatggag gatcccttct gtgggg                                    36<210>36<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>36ccccacagaa gggatctacc atgaggagct cccttg                                    36<210>37<211> 36<212>DNA<213>米曲霉<400>37caagggagct cctcatggta gatcccttct gtgggg                                    36<210>38<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>38ccccacagaa gggatctttt atgaggagct cccttg                                    36<210>39<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>39caagggagct cctcataaaa gatcccttct gtgggg                                    36<210>40<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>40ccccacagaa gtccttcacc atgaggagct cccttg                                    36<210>41<211>36<212>DNA<213>米曲霉<400>41caagggagct cctcatggtg aaggacttct gtgggg                                    36<210>42<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>42ggatccacca tg                                                              12<210>43<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>43ggatccacta tg                                                              12<210>44<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>44ggatccatca tg                                                              12<210>45<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>45ggatcctcca tg                                                              12<210>46<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>46ggatctacca tg                                                              12<210>47<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>47ggatctttta tg                                                              12<210>48<211>12<212>DNA<213>米曲霉<400>48tccttcacca tg                                                              12

Claims (31)

1.制备多肽的方法，其包括：

(a)在有益于制备多肽的培养基内培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞含有编码多肽的第一核酸序列，其可操作地连接至包含共有翻译起始区序列的第二核酸序列，该共有翻译起始区序列对第一核酸序列是外源的，该共有翻译起始区序列3’末端紧靠第一核酸序列的起始密码子的上游，且该共有翻译起始区序列包含序列5’-NYCNNBCACC-3’(SEQ ID NO.1)，其中N是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸；Y是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)；而B是选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸；和

(b)从培养基中分离多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述共有翻译起始区序列包含SEQ IDNO.2的核酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述共有翻译起始区序列包含SEQ IDNO.3的核酸序列。

4.权利要求1的方法，其中所述共有翻译起始区序列包含SEQ IDNO.4的核酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞含有一个或多个拷贝的第一核酸序列。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞含有一个拷贝的第一核酸序列。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中第一核酸序列编码对真菌宿主细胞异源的多肽。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述多肽是激素或激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。

9.权利要求8的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。

10.权利要求9的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述核酸序列包含在真菌宿主细胞的染色体内。

12.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述核酸序列位于染色体外因子上。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌或酵母细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述丝状真菌细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属细胞。

15.权利要求13的方法，其中所述酵母细胞是念珠菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉细胞。

16.权利要求13的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。

17.权利要求要求13的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是镰孢属细胞。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约25％的多肽。

19.权利要求18的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约50％的多肽。

20.权利要求19的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约75％的多肽。

21.权利要求20的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约100％的多肽。

22.权利要求21的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约200％的多肽。

23.权利要求22的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约300％的多肽。

24.权利要求23的方法，其中相对于含有可操作地连接至编码多肽的核酸序列的非共有翻译起始区序列的真菌细胞，在同样的制备条件下培养时，所述真菌宿主细胞多产生至少约400％的多肽。

25.分离的共有翻译起始区序列，其包含序列5’-NYCNNBCACC-3’，其中N是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸；Y是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)；而B是选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷酸。

26.权利要求25的分离的共有翻译起始区序列，其中该共有翻译起始区序列包含SEQ ID NO.2的核酸序列。

27.权利要求25的分离的共有翻译起始区序列，其中该共有翻译起始区序列包含SEQ ID NO.3的核酸序列。

28.权利要求25的分离的共有翻译起始区序列，其中该共有翻译起始区序列包含SEQ ID NO.4的核酸序列。

29.核酸构建体，其包含可操作地连接至权利要求25-28中任一项的共有翻译起始区序列的编码多肽的核酸序列。

30.重组表达载体，其包含权利要求29的核酸构建体。

31.重组宿主细胞，其包含权利要求30的核酸构建体。

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