CN1324402A - 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库 - Google Patents

在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库 Download PDF

Info

Publication number
CN1324402A
CN1324402A CN99812660A CN99812660A CN1324402A CN 1324402 A CN1324402 A CN 1324402A CN 99812660 A CN99812660 A CN 99812660A CN 99812660 A CN99812660 A CN 99812660A CN 1324402 A CN1324402 A CN 1324402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
polynucleotide
replication initiation
seq
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN99812660A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1197965C (zh
Inventor
杰斯珀·文德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26064518&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1324402(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN1324402A publication Critical patent/CN1324402A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1197965C publication Critical patent/CN1197965C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种通过使用以附加型复制的AMA1为基础的质粒载体,在丝状真菌细胞内构建和筛选目的多核苷酸序列文库的方法,从而获得高频转化和稳定而常规的一致的高水平基因表达。

Description

在丝状真菌细胞内构建和筛选目的DNA文库
发明领域
本发明涉及在丝状真菌细胞内构建和筛选目的多核苷酸序列文库的方法。
发明背景
丝状真菌已经被广泛用作多肽商业生产的宿主细胞。然而，当想要生产具有特殊变化特征例如，热稳定性，pH活性变化范围，比活性，底物特异性，Km,Vmax等等的多肽变异体时，由于在独立转化的丝状真菌细胞内转化频率低和拷贝数目的差异，变异体编码序列文库的构建和筛选通常需要使用中介宿主，例如，细菌细胞或酵母。
在酵母中构建目的多核苷酸序列文库的几种方法已经被公开，其中于转化相应生产宿主，如具有目的多核苷酸序列潜在变异体的丝状真菌前先在酵母中筛选文库。
然而经常是，在酵母或细菌中筛选鉴定的多核苷酸序列，当转化至相应生产型丝状真菌细胞时不能表达或以低水平表达。这可能由于很多原因，包括密码子使用的差异，mRNA水平的调节，易位装置，翻译后修饰机制(例如，半胱氨酸连接，糖基化和酰化模式)，等等。
第二，是否目的多核苷酸序列会在生产宿主中以商业性应用水平表达是不需预测的。例如，如果筛选文库时使用的生物是，例如，细菌或酵母的细胞，相应的生产型宿主细胞是丝状真菌细胞，那么蛋白酶的特点不同。因此，已经在酵母中被鉴定的编码一个或多个目的特征的序列可能被在产物相关性丝状真菌宿主细胞中的蛋白酶所降解。而且，为了通过改变调节蛋白或调节序列的功能而获得表达产物的最佳产量需要对生产宿主的直接操作。
A.Aleksenko和A.J.Clutterbuck(1997.真菌的遗传学和生物学(FungalGenetics and Biology)21:373-387)发表了使用自主复制载体，或自主复制序列(ARS)用于基因克隆和表达研究。AMA1(在曲霉属中自主维持)是所讨论的质粒复制子元件之一。它由被称为MATE1(曲霉属移动型转化增强子)的一种基因组重复单位以两个反向拷贝构成，其间由一段0.3kb的中心间隔臂分隔。AMA1启动质粒复制不需要重排，多聚体化(multimerization)或染色体整合。
发明概述
已经发现以AMA1为基础的质粒在丝状真菌中基因克隆时提供两个优点。第一是转化的高频率，这既增加了潜在文库的大小，也可排除在中介宿主例如大肠埃希菌中扩增文库的需要，因此可直接用连接混合物转化受体曲霉属菌株。第二，通过为基因表达提供稳定的和标准的环境，转化株的性质将是一致的。
本发明的一个目的是通过使用附加型复制的、DNA载体，提供用于在丝状真菌细胞中构建和筛选目的多核苷酸序列文库的改进方法，以提供在独立转化的细胞中的高频转化和基因表达的一致高水平。通过缩小在独立转化的细胞中拷贝数的差异，可以直接根据目的特征的表达鉴定目的多肽变异体。
相应地，本发明第一方面涉及在丝状真菌细胞内构建和挑选或筛选目的多核苷酸序列文库的方法，该方法包括：
(a)用DNA载体群转化真菌细胞，其中每个载体包括：
(ⅰ)编码真菌筛选标记和真菌复制起始序列的多核苷酸序列，其中所述标记和复制起始序列在群体中不变化；和
(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中DNA载体群包含所述多核苷酸序列的一种以上变异体；
(b)在选择压力下培养细胞；
(c)挑选或筛选一个或多个表达目的特征的转化株；和
(d)分离目的转化株。
其他方面，本发明涉及真菌复制起始序列在构建目的多核苷酸序列文库和筛选或挑选这类多核苷酸序列文库中的应用。
附图简述
图1表示质粒pENI1298的限制图谱，其构建在实施例1中描述；
图2表示质粒pENI1299的限制图谱，其构建在实施例1中描述；
图3表示实施例5中描述的质粒pDM156.2,pJRoy47和pDM222.A的限制图谱；和
图4表示实施例5中描述的质粒pJRoy44的限制图谱。
发明详述
在第一个实施方案中，本发明涉及在丝状真菌细胞内构建和挑选或筛选目的多核苷酸序列文库的方法，该方法包括：
(a)用DNA载体群转化真菌细胞，其中每个载体包括：(ⅰ)编码真菌筛选标记和真菌复制起始序列的多核苷酸序列，其中所述标记和复制起始序列在群体中不变化；和(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中DNA载体群包含所述多核苷酸序列的一种以上变异体；
(b)在选择压力下培养细胞；
(c)挑选或筛选一个或多个表达目的特征的转化株；和
(d)分离目的转化株。
术语，“目的多核苷酸序列文库”表示编码或具有相同目的功能或活性的多核苷酸序列的集合。文库可以是“目的多核苷酸序列的变异体的文库”，这里将其定义为变异体的集合，其中变异体因相对于亲本多核苷酸序列具有一个或多个修饰而不同于该亲本多核苷酸序列。方便地，所述多核苷酸序列或变异体由至少一个目的亲本多核苷酸序列经诱变产生，优选随机诱变，导致在集合中最少有4个且优选最少有25个不同多核苷酸序列。对引起亲本多核苷酸序列突变的各种有用方法在下面题为“随机诱变”和“定域随机诱变”部分描述。术语“修饰”意指在与突变体对比时，在序列中取代，插入和/或缺失一个或多个核苷酸，也可包括两个或多个不同亲本多核苷酸的杂合体。
多核苷酸序列或变异体也可以是亲本多核苷酸序列的天然等位基因变异的结果。等位基因变异体指占居相同染色体位置的基因的两个或多个替代形式之任一。等位基因的变异通过突变天然地引起且可导致群体内表型多态性。基因突变可以是静止的(例如，编码的多肽无变化)或可以编码有改变了的氨基酸序列的多肽。而且，此文库的多核苷酸序列并非从一个或多个亲本核苷酸序列产生，而是衍生于不同的来源，且编码来源各异，但具有相同活性或功能的高度相关的多肽。在此上下文中，“高度相关”是指多肽具有相同的活性或功能并且此外由具有在下面题为“DNA改组”部分定义的共享保守区的多核苷酸序列所编码。
术语“衍生于”意指多核苷酸序列从特定来源如微生物中分离。多核苷酸序列可以是从无法培养的生物产生的。多核苷酸序列可以是任何具有或编码目的生物活性或功能的多核苷酸序列，且包括至少六个核苷酸的亚序列以允许核苷酸序列变异体的产生。
关于文库中包含的多核苷酸序列所用的术语“相同活性或功能”意指多核苷酸序列编码具有相同或相似生物活性或功能(定性判定)的多肽或多核苷酸序列本身具有相同(定性的)活性或功能。例如，多核苷酸序列可具有启动子活性，即能启动转录，或可编码带有相同定性活性或功能的多肽，所述活性或功能如相同酶活性或功能，例如蛋白酶，脂肪酶或淀粉酶活性。
术语“DNA载体”是多核苷酸序列，其具有自主复制的能力且其能够包含目的序列。因此一个DNA载体包含复制起始序列，诸如起点(例如ColE1起点，F1起点，M13起点，2μ起点(酵母)，oriP(EB病毒)(pi))。例如DNA载体可以是质粒。
术语“其中DNA载体群包含多核苷酸序列的一种以上变异体”意指DNA载体群包含编码或具有目的生物功能或活性的不同的多核苷酸序列。
在一个优选实施方案中目的多核苷酸序列是多肽编码序列。术语“多肽”包括肽，寡肽，和蛋白质，因此不限于特定长度的编码产物。多肽可以是宿主细胞天然的或可以是异源的多肽。术语“异源的多肽”定义为宿主细胞的非天然多肽。多肽也可以是重组多肽，其为宿主细胞天然的多肽，被包含一个或多个外源控制序列的核酸序列编码，所述控制序列参与该多肽的生产。编码该多肽的核酸序列可以由下述的某种方式操作。多肽可以是野生型多肽，或经使用本发明方法产生的相应变异体。多肽也可以是杂合体多肽，其包含从至少两种不同多肽获得的部分或全部多肽序列的组合，其中这些多肽有一种或以上可以是对所述细胞而言异源的。多肽进一步包括上述多肽的天然等位基因变异和基因工程变异。
在另一个优选实施方案中，目的多核苷酸序列是通常与多肽编码序列相关的控制序列。控制序列包括与编码该多肽序列的核酸序列可操作连接的全部成分，或参与该多肽的生产的全部成分。这些控制序列包括但不局限于此处所述的启动子，信号序列，前肽序列，转录终止子，前导序列，启动子识别序列，增强子序列和poly-A序列。在另一个实施方案中，目的多核苷酸序列是多肽编码序列(或此序列的一部分)和a)控制序列(或此控制序列的一部分)或b)两种或多种控制序列(或这些控制序列的一部分)的组合。每种控制序列对编码序列而言可以是天然的或外源的。
在优选实施方案中，由目的多核苷酸序列编码的多肽是抗体或其一部分，抗原，凝血因子，酶，激素或激素变异体，受体或其一部分，调节蛋白，结构蛋白，报道蛋白(reporter)，或转运蛋白。
在更优选的实施方案中，所述酶是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，或连接酶。
在更优选的实施方案中，所述酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，角质素酶(cutinase)，脱氧核糖核酸酶，葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，卤过氧物酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，mutanase，氧化酶，果胶分解酶，过氧化物酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，谷氨酰胺转移酶，或木聚糖酶。脂肪酶的具体例子是Thermomyces lanuginosa的脂肪酶或该酶的变异体，例如WO97/04079所公开的已在成熟脂肪酶N-末端增加了延伸区的变异体。
在另一个实施方案中，所述多肽是人类胰岛素或其类似物，人类生长激素，促红细胞生成素，或促胰岛素激素。
在更优选的实施方案中，所述控制序列是启动子序列，优选真菌启动子，诸如从编码米曲霉TAKA淀粉酶的基因衍生的启动子，NA2-tpi(编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)和黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶的启动子。
在另一个更优选的实施方案中，所述控制序列是启动子识别序列，如amyR识别序列(WO94/01470),creA(94/13820)和areA(WO95/35385)。
与本发明有关的其它目的控制序列的例子列于下面题为“DNA载体和控制序列”的部分。
丝状真菌的筛选标记
术语“选择压力”在这里定义为在有效量筛选试剂存在或缺失的情况下，培养包含带有真菌筛选标记基因和目的多核苷酸序列的DNA载体的丝状真菌细胞。所述筛选试剂的有效量这里定义为足以从不包含筛选标记的细胞中挑选包含筛选标记的细胞的量。
在优选实施方案中，真菌筛选标记选自能提供对杀生物剂或病毒毒性的抗性，对重金属毒性的抗性或赋予营养缺陷型以原养型(prototrophy)的产物的编码基因。
在更优选的实施方案中，从酶获得所述原养型，此酶选自以下代谢途径：核苷酸合成，辅因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代谢，脯氨酸代谢，硫酸代谢，和硝酸代谢。
在更优选实施方案中，所述真菌筛选标记选自以下基因：argB(鸟氨酸转氨甲酰酶)，amdS(乙酰胺酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)，hemB(胆色素原合酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸盐还原酶)，prn(脯氨酸透性酶)，pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)，pyroA,riboB,sC(硫酸腺苷酰转移酶)，和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)。
在合适的培养基中并在适合筛选或挑选转化株的条件下培养真菌细胞，所述转化体包含带有或编码目的特征的目的多核苷酸序列变异体。可以按照本领域筛选多核苷酸序列文库的熟知的方法进行培养。
复制起始序列
在这里使用的术语“真菌复制起始序列”定义为能够支持染色体外分子如质粒等DNA载体在真菌宿主细胞内自主复制的核苷酸序列，通常没有该DNA载体的结构重排或整合入宿主细胞基因组。复制起始序列可以是任何来源只要它能够在真菌细胞内介导复制起始活性。例如复制起始序列可以是赋予质粒在曲霉属中复制的能力的人源端粒(telomer)(Aleksenko和Ivanova,Mol.Gen.Genet.260(1998)159-164)。优选地，复制起始序列从丝状真菌细胞获得，更优选曲霉属，镰孢霉属，或链格孢属的菌株，更优选构巢曲霉，米曲霉，黑曲霉，尖孢镰孢或互格链格孢的菌株。
真菌复制起始序列可以用本领域熟知的方法鉴定。例如，所述序列可以是目的生物体的基因片段中能够在酵母中维持自主复制的序列(Balance和Tumer，基因，36(1985),321-331)，在酵母中的自主复制是在丝状真菌细胞内自主复制能力的指征。特定序列在真菌内的复制起始活性也可以通过用所选质粒复制子转化真菌并挑选带有不规则形态的菌落来判定，不规则的形态意味着切割(sectorial)质粒的丢失，其将导致当挑选在此质粒上发现的基因时在选择培养基上无法生长(Gems等，基因，98(1991)61-67)。用此法分离了AMA1。分离复制起始序列的另一方法是分离天然质粒(例如由Tsuge等就互格链格孢的报道，遗传学，146(1997)111-120)。
真菌复制起始序列的例子包括但不局限于构巢曲霉的ANS1和AMA1序列，例如分别见Cullen,D.，等(1987，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)15:9163-9175)和Gems,D.，等(1991，基因，98:61-67)。
术语“复制起始活性”此处用它的传统意思，即指序列能够支持染色体外分子如质粒或DNA载体在真菌细胞内自主复制。
术语“没有质粒的结构重排”用在这里意思是质粒的任何部分既没有被缺失或被插入质粒的另一部分，也没有任何宿主基因组DNA插入该质粒。
优选地，本发明的方法中使用的复制起始序列是选自下组的核酸序列：
(a)至少50％相同于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列，并能够在真菌细胞内起始复制的核苷酸序列；
(b)能够起始复制的核苷酸序列，其在低严谨性条件下与下列两种物质杂交(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互补链，其中低严谨性条件定义为在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并变性的鲑精DNA，和25％甲酰胺中预杂交和杂交，洗涤条件定为50℃的2×SSC,0.2％SDS中30分钟；和
(c)(a)或(b)的亚序列，其中该亚序列能够在真菌细胞内起始复制。
在优选实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的核酸序列的相同程度至少50％，更优选约60％，更优选约70％，更优选约80％，更优选约90％，最优选约97％(此后称作“同源多核苷酸”)。同源多核苷酸也包括在真菌细胞内有复制起始活性的SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的亚序列。为达本发明的目的，相同程度可以使用本领域熟知的计算机程序适当判断，例如由GCG程序包提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-45)，多核苷酸序列的对比使用下列设置的GAP:GAP生成罚分为5.0,GAP延伸罚分为0.3。
杂交指用标准Southern印迹法，在严谨性由低到高条件下(即，预杂交和杂交条件为42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA，和分别对应于低，中和高严谨性的25,35或者50％甲酰胺)，将复制起始序列与来源于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列的寡核苷酸探针杂交。为了鉴别与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源的克隆或DNA，将杂交反应用2×SSC,0.2％SDS洗三次每次30分钟，优选洗涤温度至少50℃，更优选至少55℃，更优选至少60℃，更优选至少65℃，更优选至少70℃，最优选至少75℃。
寡核苷酸探针可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它们各自的亚序列。寡核苷酸探针还可以比完整序列短很多，但至少为15，优选至少25，更优选至少40个核苷酸长。既可以用DNA探针也可以用RNA探针。
通常将探针标记以检测相关基因(例如，用32P,3H,35S，生物素，或抗生物素蛋白标记)。例如，与32P-,3H-，或35S-标记的寡核苷酸探针杂交的分子可以用X-线胶片检测。
当分离本发明应用的复制起始序列时，从预计含有该序列的上述生物体制备基因组DNA,cDNA或组合型化学库，从中筛选与上述具有复制起始活性的寡核苷酸探针杂交的DNA。这类其他生物体的基因组DNA或其他DNA可以用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离。文库来源的DNA或分离的DNA可被转移和固定在硝酸纤维素膜或其他合适的载体物质上。然后可按照标准的Southern印迹方法鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2同源的克隆或DNA。
用于分离或克隆具有复制起始活性的核酸序列的技术是本领域所熟知的，包括从基因组DNA或cDNA中分离。从这样的DNA中克隆可受以下影响，例如应用基于聚合酶链式反应(PCR)的方法，检测具有共同结构特征的克隆的DNA片段(见，例如，Innis等，1990,PCR：方法及应用指南，AcademicPress,New York)。也可以用其他核酸扩增方法诸如连接酶链式反应(LCR)。
在优选实施方案中，复制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列，或它们各自的功能亚序列。例如，SEQ ID NO:1的功能亚序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中删除了5’和/或3’端的一个或多个核苷酸的核酸序列。优选地，序列包含至少100个核苷酸，更优选至少1000个核苷酸，最优选至少2000个核苷酸。在更优选的实施方案中，SEQ ID NO:1的序列至少包含SEQ ID NO:2表示的核酸序列。
DNA载体和控制序列
在包括编码真菌筛选标记的多核苷酸序列，真菌复制起始序列和目的多核苷酸序列的DNA载体中，所述多核苷酸序列可以编码一种多肽，该序列被可操作连接至一个或多个能指导该编码序列表达的控制序列。或者，所述多核苷酸序列是一种控制序列，通常根据所选控制序列的不同，将所示多核苷酸序列可操作连接到多肽编码序列上，以便估计该控制序列的活性(并因此能够挑选带有所需特征的亲本控制序列的变异体)。
用于连接DNA载体各元件的方法对本领域的技术人员是熟知的(例如，见，Sambrook等，1989，出处同上)。
术语“可操作连接”这里定义为一种构型，其中控制序列被放置在相对于所述多肽编码序列的相应位置，以便使该控制序列指导多肽的表达或参与多肽的生产。
在后面进一步详细讨论不同的控制序列。控制序列是那些被可操作连接到目的多核苷酸序列上者(当目的多核苷酸序列编码多肽时)，和那些组成目的多核苷酸序列者(当多核苷酸序列是控制序列时)。可以理解，一个或相同控制序列可作为目的多核苷酸序列(当文库是控制序列文库时)，或作为参与目的多核苷酸序列所编码多肽的生产的控制序列(当文库是编码多肽的目的多核苷酸序列库时)，下文中将要包括对控制序列的两类应用。
控制序列可以是合适的启动子序列，即由宿主细胞识别以便表达多肽编码序列的核酸序列。启动子序列包含调节多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何在指定宿主细胞内表现转录活性的核酸序列，其包括突变的，截断的，和杂合的启动子，并可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。
用于指导多肽编码核苷酸序列在丝状真菌宿主细胞内转录的合适启动子的例子有获自以下基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸的稳定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛菌霉葡萄糖淀粉酶(glaA),Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶，构巢曲霉乙酰胺酶，尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(美国专利第4,288,627号)，及其突变的，切断的，和杂合的启动子。用于丝状真菌宿主细胞的特别优选的启动子是TAKA淀粉酶，NA2-tpi(黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因启动子的杂合体)，和glaA启动子。
控制序列也可以是合适的转录终止序列，即被丝状真菌细胞识别而终止转录的序列。可将终止序列可操作连接到多肽编码核苷酸序列的3’末端。本发明中可以使用任何在丝状真菌细胞内有功能的终止子。
优选的终止子来自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
控制序列也可以是合适的前导序列，即对丝状真菌细胞翻译很重要的mRNA非翻译区。可将前导序列可操作连接到多肽编码核苷酸序列的5’末端。本发明中可以使用任何在丝状真菌细胞内有功能的前导序列。
优选的前导序列来自编码米曲霉TAKA淀粉酶，构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。
控制序列也可以是多聚腺苷化序列，即可操作连接到多肽编码核苷酸序列的3’末端的序列，当被转录时，由丝状真菌细胞识别为向转录的mRNA添加多聚腺苷化残基的信号。本发明可以使用在丝状真菌细胞内有功能的任何多聚腺苷化序列。
优选的多聚腺苷化序列来自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码连接到所述多肽氨基末端的氨基酸序列，该序列指导编码的多肽进入细胞分泌途径。所述多肽编码性核苷酸序列的5’-末端可天然含有信号肽编码区，且该区天然与编码分泌多肽的编码区片段连接在同一翻译读码框架中。或者，编码序列的5’-末端可以包含外源信号肽编码序列。在该编码序列不包含信号肽编码区时需要该外源信号肽编码区。或者，可仅将外源信号肽编码区代替天然信号肽编码区以便增强该多肽分泌。信号肽的编码区可获自曲霉属物种的葡萄糖淀粉酶或淀粉酶的基因，或Rhizomucor物种的脂肪酶或蛋白酶的基因。然而，在本发明中可以用指导表达多肽进入丝状真菌细胞分泌途径的任何信号肽编码区。
有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶基因，黑曲霉中性淀粉酶基因，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因，或Humicola lanuginosa纤维素酶基因获得的信号肽编码区。
控制序列也可以是前肽编码区，其编码定位于多肽氨基端的氨基酸序列。已知所得多肽是酶原或前多肽(或某些情况下为酶原)。前多肽一般是无活性的，催化或自催化切割可转变为成熟的有活性的多肽。前肽编码区可从Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因，或嗜热毁丝霉漆酶基因中获得(WO95/33836)。
信号肽和前肽区两者都存在于多肽的氨基末端，前肽区紧邻多肽的氨基末端，信号肽区紧邻前肽区的氨基末端。
多肽编码核苷酸序列也可以被可操作连接于一个或多个下述核酸序列，其编码有利于指导所述多肽表达的一个或多个因子，例如，转录活化因子(如，反式作用因子)，伴侣蛋白，和加工型蛋白酶。在本发明中可以使用任何在丝状真菌细胞内有功能的因子。编码一或多种这类因子的核酸并非必须与所述多肽编码核苷酸序列一前一后地排列。
活化因子是一种蛋白，其激活多肽编码核苷酸序列的转录(Kudoa等，1990，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO Journal)9:1355-1364；Jarai和Buxton,1994，当代遗传学(Current Genetics)26:2238-244；Verdier,1990，酵母6:271-297)。编码活化因子的核酸序列可以从编码酿酒酵母血红素活化因子蛋白1(hapl)，酿酒酵母半乳糖代谢蛋白4(gal4)，构巢曲霉氨调节蛋白(areA)，和米曲霉α-淀粉酶活化因子(amyR)的基因中获得。进一步的例子见Verdier,1990，出处同上和MacKenzie等，1993，普通分子生物学杂志(Joumal of General Microbiology)139:2295-2307。
伴侣蛋白是帮助另一种多肽正确折叠的蛋白质(Hartl等，1994,TIBS19:20-25；Bergeron等，1994；TIBS 19:124-128；Demolder等，1994，生物技术杂志(Joumal of Biotechnology)32:179-189；Craig,1993，科学260:1902-1903；Gething和Sambrook,1992，自然355:33-45；Puig和Gilbert,1994，生物化学杂志269:7764-7771；Wang和Tsou,1993,The FASEB Journal7:1515-11157；Robinson等，1994,Bio/Technology 1:381-384；Jacobs等，1993，分子微生物学(Molecular Microbiology)8:957-966)。编码伴侣蛋白的核酸序列可以从编码米曲霉二硫化蛋白异构酶或酿酒酵母钙联接蛋白，酿酒酵母BiP/GRP78，以及酿酒酵母Hsp70的基因中获得。进一步的例子参见Gething和Sambrook,1992，出处同上，和Hartl等，1994，出处同上。
加工型蛋白酶是切割前肽以产生成熟的具有生化活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak,1994，酵母10:67-79；Fuller等，1989，美国国家科学院院报(Proeedings of the National Academy of Sciences USA)86:1434-1438；Julius等，1984，细胞37:1075-1089；Julius等，1983，细胞32:839-852；美国专利第5,702,934号)。编码加工型蛋白酶的核酸序列可以从编码酿酒酵母二肽氨肽酶，酿酒酵母Kex2,Yarrowia lipolytica二元加工型蛋白内切酶(xpr6)，和尖孢镰孢金属蛋白酶(p45基因)的基因中获得。
添加调节序列也是可取的，所述调节序列能在丝状真菌细胞生长时调节所述多肽的表达。调节系统的例子是那些为应答化学或物理刺激，包括调节性化合物的存在而引起基因表达开启或关闭的系统。TAKAα-淀粉酶启动子，黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子，和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子可被用作调节序列。调节序列的其他例子是那些允许基因扩增的序列，例如，用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，所述多肽编码核苷酸序列将会与该调节序列可操作连接。
向丝状真菌细胞内导入DNA载体可以涉及一段包含原生质体形成，原生质体转化，和细胞壁以自身熟知的方式再生等的过程。曲霉属宿主细胞转化的合适方法在EP 238023和Yelton等，1984，美国国家科学院院报81:1470-1474中描述。转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等，1989，基因78:147-156或WO96/00787中描述。
真菌细胞
用DNA载体群转化的真菌细胞是丝状真菌细胞。
“丝状真菌”包括真菌亚门和卵菌亚门的所有丝状形式真菌(如Hawksworth等定义的，1995，出处同上)。这些丝状真菌特征在于菌丝体的壁包括壳多糖，纤维素，葡聚糖，脱乙酰壳多糖，甘露聚糖，和其他复杂的多糖。营养生长方式是菌丝的延长，碳分解代谢是专性需氧的。相对比，酿酒酵母等酵母的营养生长方式是单细胞菌体的芽生，并且碳代谢可以是发酵的。在优选实施方案中，所述丝状真菌细胞是，但不局限于以下物种的细胞：支顶孢属，曲霉属，镰孢属，腐质霉属，毛霉属，毁丝霉属，脉孢菌属，青霉属，柱顶孢属，梭孢壳属，Tolypocladium，和木霉属。
本发明使用的丝状真菌细胞通常根据目的多核苷酸序列选择。例如，如果目的多核苷酸为可在曲霉属细胞中应用的控制序列，那么丝状真菌细胞通常用曲霉属细胞。本发明使用的丝状真菌细胞的例子包括曲霉属细胞，支顶孢属细胞，镰孢属细胞，腐质霉属细胞，毛霉属细胞，毁丝霉属细胞，脉孢菌属细胞，青霉属细胞，梭孢壳属细胞，Tolypocladium细胞，和木霉属细胞。
更具体地，丝状真菌细胞是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，构巢曲霉，黑曲霉，或米曲霉细胞；
杆孢状镰孢，Fusarium certealis,Fusarium crookwellense，大刀镰孢，禾谷镰孢，禾赤镰孢，异孢镰孢，合欢木镰孢，尖孢镰孢，多枝镰孢，粉红镰孢，接骨木镰孢，肤色镰孢，拟分支孢镰孢，硫色镰孢，Fusariumtorulosum，类拟丝孢镰孢，或Fusarium venenatum细胞(Nirenberg sp.nov；humicola insolens细胞或humicola lanuginosa细胞；米赫毛霉细胞；嗜热毁丝霉细胞；粗糙脉孢菌细胞；产紫青霉菌细胞；土青霉菌细胞；或Trichodermaharzianum，康宁木霉，Trichoderma longibrachiatum,Trichoderma reesei，或绿色木霉。
挑选或筛选目的转化株文库
可以理解本发明方法中用于进行挑选或筛选步骤c)的方法取决于所选目的多核苷酸序列。步骤c)中“挑选或筛选一个或多个表达目的特征的转化株”表示进行筛选或挑选以鉴别包含被修饰的目的多核苷酸序列(已经于步骤b)的培养中在目的多核苷酸序列的基础上产生)的转化株，它具有如下例举的目的活性或功能并可任选具有其它目的特征。因此，如果目的多核苷酸序列编码具有特定活性或功能的多肽，那么所述筛选将只允许表达具有目的活性或功能的多肽的转化株生长。因此，如果目的多核苷酸序列编码具有特定活性或功能的多肽，那么将进行筛选以鉴定表达具有该目的活性或功能的多肽的转化株。例如，如果目的多核苷酸序列编码酶，如脂肪酶，那么将进行挑选或筛选步骤c)以鉴定表达脂肪酶活性的转化株。如果希望将脂肪酶作为特异性特征，诸如，强耐热性，那么筛选要在可鉴定具有所需高耐热性的脂肪酶的条件下(通常为温度)进行。
类似地，如果目的多核苷酸序列是控制序列诸如启动子序列，那么挑选或筛选步骤c)在可以评定启动子活性的情况下进行。通常，在文库中目的多核苷酸序列启动子被可操作连接于另一待转录序列(例如多肽编码序列)，从而使该启动子活性可参照该另一序列的转录来测定。
在细菌或酵母宿主中构建文库
本发明也涉及在丝状真菌细胞内构建和挑选或筛选目的多核苷酸序列文库的方法，包括：
(a)用DNA载体群转化细菌或酵母细胞的培养物，其中每种载体包括
(ⅰ)编码丝状真菌筛选标记，丝状真菌复制起始序列，细菌或酵母的相应筛选标记和细菌或酵母的相应复制起始序列的多核苷酸序列，它们在所述DNA载体群中均无实质的变动，和
(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中在该DNA载体群中包含一个以上该多核苷酸序列的变异体；
(b)在选择压力下培养细菌或酵母细胞；
(c)从(b)的转化株中分离DNA载体；
(d)用(c)的DNA载体转化丝状真菌细胞；
(e)在选择压力下培养(d)的丝状真菌细胞；
(f)挑选或筛选表达目的特征的一个或多个丝状真菌转化株；和
(g)分离目的丝状真菌转化株。
用酵母或细菌作中介宿主的优点是，转化频率比用曲霉属等丝状真菌细胞高100-1000倍，结果当第一次将改造并任选连接的DNA载体转化入酵母或细菌，然后将分离的超螺旋载体转化入丝状真菌细胞时得到更大的文库。
在优选实施方案中，目的多核苷酸序列文库通过对至少一个具有或编码上述目的生物功能的亲本多核苷酸序列进行随机诱变或天然等位基因变异而制备。
在另一个优选实施方案中，所述细菌细胞是大肠埃希菌菌株。
在另一个优选实施方案中，所述酵母细胞是酵母属的菌株，特别是，酿酒酵母或克鲁维糖酵母(Saccharomyces kluyveri)或裂殖酵母属的菌株。合适的酵母细胞的其它例子有克鲁维酵母属，诸如乳克鲁维酵母，汉逊酵母属，例如多形汉逊酵母，或毕赤酵母属，例如巴斯德毕赤酵母。
按照上面的方法，所述DNA载体包含筛选标记，其使对转化的细菌或酵母细胞的挑选很容易。细菌筛选标记的例子包括，但不局限于以下：抗生素抗性标记诸如氨苄青霉素，卡那霉素，红霉素，氯霉素或四环素抗性。而且，可通过共转化完成挑选，例如，如WO 91/09129中所述，其中筛选标记在单独的载体上。
对酵母宿主细胞合适的标记是ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1，和URA3。
在优选实施方案中，细菌或酵母的筛选标记提供对杀生物剂的抗性，其中所述杀生物剂选自氨苄青霉素，卡那霉素，四环素，氯霉素，新霉素，潮霉素，和氨甲喋呤。
在另一个优选实施方案中，细菌或酵母的筛选标记选自编码抗杀生物剂或抗病毒毒性，抗重金属毒性，或赋予营养缺陷型以原养型的基因。
在另一个优选实施方案中，所述原养型从选自以下代谢途径的酶获得，代谢途径包括核苷酸的合成，辅因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代谢，脯氨酸代谢，硫酸盐代谢，和硝酸盐代谢。
为自主复制，载体可进一步包含复制起点，其使该载体能够在所选细菌或酵母细胞中自主地复制。细菌复制起点的例子是允许在大肠埃希菌中复制的质粒pBR322,pUC19,pACYC177，和pACYC184的复制起点。
用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。
通过如使用感受态细胞，电穿孔，或细菌细胞的接合，可实施细菌或酵母细胞的转化(参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989,分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)。这些细胞在选择压力下的培养可以按照本领域已知的方法进行。
在此优选使用丝状真菌筛选标记，真菌复制起始序列和目的多核苷酸序列，例如见题为“丝状真菌筛选标记”和“复制起始序列”部分。
目的转化株的挑选或筛选可以如上面题为“转化株的挑选或筛选”所述方法进行。
目的多核苷酸序列
可以理解本发明对筛选或挑选任何类型的目的多核苷酸序列是有用的。更具体地，用在本发明方法中的目的多核苷酸序列可以从具有或编码目的生物活性或功能的亲本多核苷酸序列产生。例如，目的多核苷酸序列从编码目的多肽的基因经随机诱变产生。或者，目的多核苷酸序列是如上面定义的控制序列，例如，启动子序列。目的多核苷酸序列也可以从不同来源衍生，诸如上面深入描述的不同天然来源，如微生物。目的多核苷酸序列可以是多肽编码序列和控制序列的组合。
在优选实施方案中对亲本多核苷酸序列的修饰可如下进行，即使用物理或化学诱变剂，使用掺入(doped)寡核苷酸，DNA改组，或对所述核酸序列进行PCR诱变，或用它们的任意组合。
或者，目的多核苷酸序列可以通过将序列突变而获得，方法是使用易错聚合酶或使聚合酶在促进错误形成的亚最佳条件下工作，即易错PCR，从而造成核苷酸碱基的错误掺入。易错DNA合成可以在体外或体内完成，如通过使用各种增变菌株。
随机诱变
产生编码修饰的蛋白和酶的多核苷酸序列变体的一般方法以随机诱变为基础，例见美国专利4,894,331和WO 93/01285。这种方法也可以与本发明组合应用。例如，随机诱变时可使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸，或对多核苷酸序列进行PCR诱变。而且，进行随机诱变时可使用这些诱变剂的任意组合。诱变剂可以是，例如，诱导转换，易位，倒位，转频，缺失，和/或插入者。
适合本发明目的的物理或化学诱变试剂的例子包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),O-甲基羟胺，硝酸，乙基甲烷磺酸(EMS)，硫酸氢钠，甲酸，和核苷酸类似物。当使用这些试剂诱变时常将目的多核苷酸序列在选择的诱变试剂存在时在适于突变发生的条件下保温。
当通过使用寡核苷酸进行突变时，可在欲变化位置合成寡核苷酸时使寡核苷酸用三个非亲本核苷酸与所述寡核苷酸一起掺入。所述掺入可排除非必要氨基酸的相应密码子。可将掺入的寡核苷酸用任何已发表的技术掺入目的多核苷酸中，例如用PCR,LCR或任何认为合适的DNA聚合酶和连接酶。
优选地，用“恒定随机掺入”完成掺入，其中各位点的野生型和突变型比是预先定好的。而且，可通过所述掺入优先引入特定核苷酸，并因此优先引入一种或多种特定氨基酸残基。例如，可通过所述掺入在每个位置引入90％野生型和10％突变型。在选择掺入方案时还应考虑蛋白质结构限制和遗传限制。可以用DOPE程序实施掺入方案(参见Tomandl,D.，等，1997，计算机辅助分子设计杂志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)11:29-38；Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A.，和Kretzschmar,T.,1998，核酸研究26:697-702)，其特别确保避免停止密码子的引入。
当使用PCR产生突变时，在增加核苷酸错误掺入的情况下，对化学处理或者非处理的目的亲本多核苷酸进行PCR(Deshler,J.O.,1992，遗传分析，技术和应用(Genetic Analysis Techniques and Applications)9:103-106；Leung，等，1989，技术(Technique)1:11-15)。
大肠埃希菌(Fowler，等，1974,Molec.Gen.Genet.133:179-191)，酿酒酵母或任何其他微生物的突变株可用于目的亲本多核苷酸序列的随机诱变，例如通过将包含亲本多核苷酸序列的质粒转化至所述突变株，使带有质粒的突变株生长并从突变株中分离突变质粒。可以将突变质粒随后转化到表达生物体内。
待诱变的多核苷酸序列可以方便地出现在从包含此序列的生物体制备的基因组或cDNA文库中。或者，该序列可以出现在合适的载体如质粒或噬菌体中，所述载体可与诱变剂一起保温或暴露于该诱变剂。待诱变的多核苷酸序列可以是分离的形式。可以理解待随机诱变的多核苷酸序列优选是cDNA或基因组DNA序列。突变的DNA序列还可包括编码允许该突变DNA表达的功能的DNA序列。
DNA改组
按照本发明快速制备目的多核苷酸序列的变异体的另一方法包括体内或体外DNA改组方法，其中DNA改组被定义为在两个或多个同源多核苷酸之间发生核苷酸序列片段的体内或体外重组，导致相对于原有多核苷酸(即，进行改组的多核苷酸)新产生的多核苷酸(即，已经进行了改组的多核苷酸)包含许多交换的核苷酸片段。可以在体内或在体外通过本领域描述的方法在细胞内完成改组，改组的实例列于下面。
例如，H.Weber和Weissmann,C.(1983，核酸研究11:5661-5669)描述两个同源基因之间经体内重组而修饰基因的方法，其中将重组体用抗性标记鉴定和分离。
Pompon等，(1989，基因83:15-24)描述改组哺乳动物细胞色素P-450基因结构域的方法，其用具有粘性末端的线性化质粒及部分同源于该质粒末端的DNA片段转化酿酒酵母，从而在酿酒酵母中实施部分同源序列的体内重组。
在WO 97/07205中描述了一种方法，其中多肽变异体通过用质粒DNA作模板经体内重组，改组同源DNA序列的不同核苷酸序列而制备。
美国专利第5,093,257号(Genencor International,Inc.)公开了经体内重组生产杂交多肽的方法。
在优选实施方案中，目的变异体多核苷酸序列通过体内重组两个或多个同源的目的多核苷酸序列而获得，包括：
(a)鉴定目的多核苷酸序列之间的至少一个保守区；
(b)产生每个目的多核苷酸序列的片段，其中该片段包括(a)的保守区；和
(c)用保守区作为同源连接点重组(b)的片段。
优选地，目的多核苷酸序列编码多肽或其部分或上述控制序列或两者的任意组合。
术语“保守区”指一段亚序列，其优选至少10bp，为两个或多个序列共有，其中所述亚序列之间相同程度至少约50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，最优选地至少97％。
因为用所述保守区作为两序列之间“连接点”，故两序列上所述保守区的相同程度高至足以在上述的条件下使所述序列杂交，杂交中该保守区作为连接点。
一种体外改组同源DNA序列的方法如Stemmer描述(Stemmer,1994.美国国家科学院院报91:10747-10751；Stemmer,1994.自然370:389-391；Crameri,A.，等，1997.自然生物技术(Nature Biotechnology)15:436-438)。此方法涉及用体外PCR技术改组同源DNA序列。包含改组的DNA序列的阳性重组基因根据表达蛋白的功能改进而选自DNA文库。
上面的方法在WO 95/22625中也有描述，其涉及改组同源DNA序列。在此方法中重要的步骤是将同源的双链多核苷酸模板切割成所需大小的随机片段，随后将这些同源装配成全长的基因。
WO 98/41653公开了DNA改组的方法，其中重组的同源多核苷酸文库是通过在体外DNA合成期间诱导模板转变而从许多不同的亲本DNA模板和引物构建的。
定域随机诱变
随机诱变局限在目的多核苷酸序列的一部分上具有优势。例如，待修饰的序列可以是该基因产物活性必需的基因编码区或其一部分，或如上所述控制序列或其部分。这样的控制序列优选的例子是启动子序列，或其功能部分，即，足以影响核酸序列表达的部分。
例如，当目的多核苷酸序列某区已经被鉴定为特殊重要区时，定域随机诱变具有优势。例如，当目的多核苷酸序列编码多肽时，所述重要区可以是该多肽的指定特性必需的，预计该区的修饰导致一种此特性被改善的变异体。当亲本多肽的三级结构已经被阐明并与其功能相关时这些区可被正常地鉴定出来。类似地，当目的多核苷酸序列是控制序列，如启动子时，目的区可以是预期对启动子必需的或参与启动子活性的区域。
定域，或区特异性随机诱变通过用如上所述的PCR诱变技术或任何其他本领域已知的合适的技术可方便地进行。或者，分离编码待修饰的多核苷酸序列中一部分的核苷酸序列可如下修饰，例如插入合适的载体，随后将该部分用上述任一种突变方法进行诱变。
真菌复制起始序列的使用
在另一方面，发明涉及真菌复制起始序列在此处定义的于丝状真菌细胞内构建和挑选或筛选目的多核苷酸序列文库中使用。优选地，所述文库是用本发明第一或第二方面的方法构建的。在优选实施方案中真菌复制起始序列选自：
(a)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％同一性，并能够起始复制的复制起始序列；
(b)在低严谨性条件下与下列两种物质杂交的复制起始序列(ⅰ)SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互补链，其中低严谨性条件定义为在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切和变性的鲑精DNA，和25％甲酰胺中预杂交和杂交，洗涤条件定为50℃的2×SSC,0.2％SDS中30分钟；和
(c)(a)或(b)的亚序列，其中该序列具有复制起始活性。
优选地，复制起始序列来自丝状真菌细胞，特别是来自曲霉属菌株，如构巢曲霉。在最优选的实施方案中复制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2发表的核酸序列，或它们相应的功能亚序列。按照此方面使用的复制起始序列可以如上面题为“复制起始序列”部分所描述。
目的多核苷酸序列文库
在另一方面，本发明涉及目的多核苷酸序列文库，该文库包括用DNA载体群转化的丝状真菌细胞，其中每个载体包括：
(ⅰ)编码丝状真菌筛选标记和丝状真菌复制起始序列的基因，其中标记或复制起始序列在群体中均无变动，和
(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中在所述DNA载体群中包含一个以上所述多核苷酸序列的变异体。
在优选实施方案中该载体进一步包括编码细菌或酵母筛选标记以及细菌或酵母复制起始序列的核酸序列。优选地，按照本发明第一或第二方面的方法制备该文库。优选地，该文库的要素诸如DNA载体和它涉及的成分如这里所述。
本发明通过下面的实施例进一步描述，但不应局限于这些。
实施例
材料
用作缓冲液和底物的化学物质是至少为试剂级的商业产品。
质粒
pMT1505：如下面实施例1所述构建
pHelp1：包含米曲霉的pyrG基因作为筛选标记和在构巢曲霉中能够自主复制的AMA1序列，其如Gems,D.，等(1991.基因98:61-67)所述
pToC68：  如EP 0531372中所述(Novo Nordisk A/S)
pAHL：    如WO 92/05249中所述，包含脂肪酶编码序列
pSO2：    如WO 96/29391中所述，包含米曲霉pyrG基因
pENI1127：如下面实施例1所述构建
pENI1245：如下面实施例1所述构建
pENI1246：如下面实施例1所述构建
pENI1298：如下面实施例1所述构建
pENI1299：如下面实施例1所述构建
菌株
JaL250：米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已被灭活，如WO98/01470所述
DH5a：买自GIBCO BRL(Life Technologies,Inc.,Rockville MD)的大肠埃希菌宿主细胞
DLM15:Fusarium venenatum的衍生物，如下面实施例5所述
实施例1:pENI1298和pENI1299的构建
通过将来自pHelp1的SphⅠ/NarⅠ片段插入pToC68中构建pMT1466。用SphⅠ和StuⅠ消化pMT1466，然后重新连接以构建pMT1489。用AatⅡ和NarⅠ消化pMT1489并连接一接头构建pMT1500。用NheⅠ消化pMT1500并重新连接以构建pMT1504。将包含构巢曲霉基因组DNA的amdS编码基因的2.7kbXbaⅠ片段(Corrick,C.M.，等，1987，基因53:63-71)插入已经用NheⅠ切割的pMT1504中构建pMT1505。pMT1505用SalⅠ消化以除去一个AMA1重复序列和中心间隔区而构建pENI1127。
用HindⅢ切割pENI1127和pMT1505，结果分别得到2408bp和5253bp的片段，将其从1％琼脂糖凝胶中纯化并克隆到包含脂肪酶编码序列的pAHL载体的HindⅢ位点。所得的质粒分别称作pENI1245和pENI1246。
将包含pyrG基因的3527bp StuⅠ/BbuⅠ片段从pSO2中切下并插入pENI1245和pENI1246的StuⅠ/BbuⅠ位点。所得质粒分别称作pENI1298和pENI1299。pENI1298的限制酶图谱如图1所示，pENI1299的如图2所示。
实施例2：在独立生长的米曲霉转化株中脂肪酶的表达水平
使用标准方法用pENI1298和pENI1299转化JaL250，参见WO 98/01470所述。然后将细胞在Cove平板上于37℃培养。
保温三天后出现转化株，转化频率为104-105/μg DNA，其比AMA1序列缺失时的转化频率增加100-10,000倍。
将pENI1298和pENI1299的三十个独立转化株在Cove平板上分离并同时接种于96孔微滴板，其中每孔包含200μl基本培养基1*vogel,2％麦芽糖的(例如，酶学方法(Methods in Enzymology)，第17卷84页)。
于34℃保温三天后，测定在微滴板中培养液的脂肪酶活性。从每孔取一份10μl培养液加入微滴板中，每孔含200μl的脂肪酶底物0.018％对硝基苯丁酸酯，0.1％Triton X-100,10mM CaCl2,50mM Tris pH7.5。采用标准酶学方案(例如，酶动力学(Enzyme Kinetics),Paul C.Engel，编，1981,Chapman和Hall Ltd.)用动态微滴板读取仪(Molecular Device Corp.,SunnyvaleCA)，在五分钟里每隔15秒用分光光度测定法测定活性。简言之，用底物转化起始率检测产物形成，并将其规定为从5分钟里每隔15秒的405nm吸收值计算所得曲线斜率。将相对脂肪酶活性单位针对显示最高脂肪酶活性的转化体标准化。计算每组三十个转化株的平均值和标准差。
同时，已经在Cove平板上37℃培养三天的转化株如上述再于第二块Cove平板上分离并再次接种微滴板。又培养三天后将测定，再分离和再接种的程序重复一次。
结果总结于下表1中，显示产生脂肪酶的量，与转化六天后pENI1298转化株的产生量相比。标准差的值很小，说明这30个独立生长的转化株中脂肪酶表达水平几乎无差异。通常，当进行丝状真菌转化时，可见较大的相对标准差(70％-100％)，其原因为载体的随机整合入基因组和进行整合的载体数目不同。在最差的和最好的生产型真菌转化株中表达水平的差异可达100-1000倍。
表1．三十个独立生长的转化株相对于pENI1298转化六天后的脂肪酶平均表达水平及相应标准差。
   天数       质粒    ％表达    标准差
    66991212     pENI1298pENI1299pENI1298pENI1299pENI1298pENI1299     10062100558247     172017372757
实施例3：检测质粒的重排
将包含pENI1298或者pENI1299的Ja1250转化株在YPD培养基上过夜生长。
用QIAprepMiniprep试剂盒(QIAGEN,Venlo，荷兰)改良后从每个转化株制备DNA。简言之，将每个菌株在5ml YPD中生长三天。过滤收集菌丝体并用200ml水冲洗，然后转移至2ml小离心管中，并于60℃真空离心3小时冻干。然后将干燥的菌丝体磨碎并在1ml裂解缓冲液(100mMEDTA,10mM Tris pH8.0,0.1％Triton X-100,500mM盐酸胍，200mM氯化钠)中重悬，随后彻底混合。每管中加入20mg RNAse然后于37℃保温10分钟。加入100μg蛋白酶K，使反应于50℃保温30分钟。然后将每管在标准台式离心机上以最大速度离心15分钟。将上清上样于QIAprep离心柱，然后离心并弃去滤液。接着用所述试剂盒中提供的0.5ml PB洗柱并再离心1分钟。弃去过滤物，用试剂盒提供的0.75ml PE洗柱，然后再离心1分钟。让柱在空气中干燥，经加入100μl TE缓冲液接着最后一次离心1分钟而将DNA洗脱。
DNA被转化入大肠埃希菌DH5a中获得转化株，证实所述质粒在米曲霉中为附加体形式。按照制造商的说明，用QIAprepMiniprep试剂盒(QIAGEN)从所述细菌细胞中纯化质粒。
然后将纯化的质粒DNA用ScaⅠ消化，用标准琼脂糖凝胶分级分离技术分析限制酶图谱。
当与原始质粒的限制酶图谱对比时，结果显示在五个pENI1299 JaL250转化株中无重排，在八个pENI1298 JaL250转化株中仅一个有重排，显示质粒重排很少发生。
实施例4：筛选文库
为了鉴定具有改良功能特征的变异体多肽以可比于亲本多肽的水平表达，在米曲霉中构建并筛选多核苷酸序列变异体文库。用pENI1298作模板，下列每种引物2pmol/ml:oligo 19670作为第一引物，第二引物为掺入型oligo23701,23702或23703，如下所述，在下列条件下进行PCR:94℃,5分钟；30循环(94℃,30秒；50℃,30秒；72℃,1分钟)，和72℃,5分钟。Taq聚合酶产品AmpliTaq按供应商(Perkin-Elmer Corp.,Branchburg NJ,USA)的建议使用。
19670:SEQ ID NO:3
23701:SEQ ID NO:4
23702:SEQ ID NO:5
23703:SEQ ID NO:6
用小离心柱S300(Pharmacia-LKB,Uppsala SE)将所得产物纯化。使包括pENI1298 DNA的纯化产物进行第二轮PCR扩增，条件如下：94℃,5分钟；30循环(94℃,1分钟；50℃,10分钟；72℃,2分钟)，和72℃,7分钟，引物为：
19671:SEQ ID NO:7。
接着将产物用Dpn1消化以除去模板DNA，然后在94℃保温30分钟以灭活Dpn1酶。
用经Bal1和SgrA1消化以去除大多数脂肪酶编码序列的pENI1298 2μg，和源于23701,23702或23703掺入型oligo反应的PCR片段每种5μg转化JaL250。如WO 97/07205所述使载体和PCR片段在体内重组。JaL250细胞也用消化的pENI1298或每种PCR产物单独转化。当仅用载体转化细胞时得到一种转化株，用PCR产物单独转化时未得到转化株。
从23701,23702和23703文库中分别将15,12和26个转化株接种到含200μl的1*vogel,2％葡萄糖培养基的微滴板中，保温72小时。将JaL250的pENI1298转化株也保温作为对照。然后在Cove平板上划线分离所述培养物。培养物中的脂肪酶活性如实施例2中所述测定并在加去污剂的测定法中测定，后者在微滴板的孔中将10μl微滴板培养物加入200μl用商业洗衣去污剂制备的脂肪酶底物中。在405nm分光光度下测定活性并如上述实施例2所述计算。
将在包含去污剂的测定中显示活性的每种转化株再于Cove平板上分离。37℃保温72小时后每个Cove平板上取两个克隆，连同十个pENI1298转化株一起如上述接种于微滴板上，然后于34℃培养72小时。所有克隆在去污剂测定中显示活性，而pENI1298转化株无活性。而且，以独立复制型培养物形式生长的转化株显示出相对相似的活性。结果总结于下面表2。
             表2：对Pnp-丁酸酯和商业去污剂的脂肪酶活性
       Pnp-丁酸酯活性           去污剂活性
   文库  克隆  平均数  标准差  平均数  标准差
 PENI1298    96    16    3    80
 菌落1  菌落2  平均数  菌落1  菌落2   平均数
  23701   1    97    114   105.5    45    53    49
  2    60    87   73.5    12    19    15.5
  3    53    68   60.5    9    14    11.5
  23702   1    58    55   56.5    16    15    15.5
  2    62    71     66.5    16    21    18.5
  3    47    65     56    17    17    17
  4    49    45     47    16    17    16.5
  5    35    42     38.5    11    13    12
  6    34    40     37    17    14    15.5
  7    80    79     79.5    30    28    29
  8    49    56     52.5    17    23    20
  23703   1    111    122     116.5    28    28    28
  2    122    110     116    32    28    30
  3    106    98     102    32    29    30.5
  4    55    32     43.5    11    6    8.5
因为克隆23701.1在Pnp-丁酸酯和去污剂测定中都表现出良好的表达及作用，分离其DNA以测定推断的多肽N-末端序列，其为SPPRRPP。天然N-末端序列为SPIRRE，其编码被kex2样蛋白酶切割的前肽。对来自其他转化株的DNA测序，得到以下推断的N-末端序列：23701.2(SPPRRRR),23702.1(SPPRPRRR),23702.7(SPPRPRRP),23703.1(SPPRRRRRP)，和23703.4(SPPRRPRRR)。因此，在生产型宿主中鉴定了可以以相当于亲本多肽的表达水平表达的具有改良功能特征的多肽变异体。
此处所述和权利要求的发明不局限于这里公开的具体实施例，因为这些实施例意在说明本发明的几个方面。任何等价实施例是在本发明的范围内。事实上，除了这里展示和描述的那些外，本发明的各种改动对本领域的技术人员将是很明显的。这些改动也包含在附属的权利要求范围内。
本文提到的所有公开物均引入本文作为参考，以便描述和公开本发明所引用的具体信息。上述公开物仅作为本申请的申请日以前的现有技术。并非允许本发明人用在先申请使本文本的公开日期提前。
应理解本发明不限于所述具体方法和组合物，它们均可变化。还应理解本文所用命名法仅为描述具体实施方案，并非限制本发明，本发明将由所附权利要求书限定。
除非另有所指，本文所用的所有技术术语和学术术语均与本发明所属领域一般技术人员常规理解的含义相同。可用与本文所述类似或等同的材料或方法实施或检测本发明，但优选的方法和材料如本文所述。
实施例5:Fusarium venenatum菌株DLM15的构建
镰孢属菌株A3/5，现已重新分类为Fusarium venenatum(Yoder和Christianson,1998，真菌遗传学和生物学(Fungal Genetics andBiology)23:62-80；O’Donnell等，1998，真菌遗传学和生物学23:57-67)，它获自Anthony Trinci博士，University of Manchester，曼彻斯特，英国；或作为镰孢属ATCC 20334株获自美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA。命名为CC1-3的Fusarium venenatum A3/5的形态突变株(Weibe等，1992，真菌学研究(Mycological Research)96:555-562；Weibe等，1991，真菌学研究95:1284-1288；Weibe等，1992，真菌学研究96:555-562)是高度分支的菌落变异体。本试验用的MLY3株源于Fusarium venenatum A3/5的形态突变株CC1-3。它与CC1-3具有完全相同的互补作用特征。
培养基和溶液
每升基本培养基含有：6g NaNO3,0.52g KCl,1.52g KH2PO4,1ml COVE痕量金属溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4.7H2O,342.3g蔗糖，和20g Noble琼脂，pH6.5。
每升RA孢子形成培养基含有：50g琥珀酸，12.1g NaNO3,1g葡萄糖，20ml 50×Vogels，和0.5ml 10mg/ml NaMoO4原液，pH调至6.0。
每升YEPG培养基含有：10g酵母提取物，20g蛋白胨，和20g葡萄糖。
STC包含0.8M山梨醇，25mM Tris pH 8,25mM CaCl2。
SPTC包含40％PEG 4000,0.8M山梨醇，25mM Tris pH8,25mM CaCl2。
每升COVE痕量金属溶液含有以下组分：0.04gNaB4O7·10H2O,0.4gCuSO4·5H2O,1.2g FeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
每升50×COVE盐溶液包含下列组分：26g KCl,26g MgSO4·7H2O,76g KH2PO4，和50ml COVE痕量金属。
每升COVE顶层琼脂糖包含下列组分：20ml 50×COVE盐，0.8M蔗糖，1.5mM氯化铯，1.0mM乙酰胺，和10g低熔点琼脂糖，pH调至6.0。
每升COVE培养基包含以下组分：342.3g蔗糖，20ml 50×COVE盐溶液，10ml 1.0M乙酰胺，10ml 1.5MCsCl2，和25gNoble琼脂。
每升50×Vogels培养基包含下列组分：150g柠檬酸钠，250g KH2PO4,10g MgSO4·7H2O,10g CaCl2·2H2O,2.5ml生物素原液，和5.0ml AMG痕量金属溶液。
每升Vogel’s/乙酰胺琼脂包含以下组分：30g蔗糖，1×Vogel’s盐，10mM乙酰胺，15mM CsCl，和25gNoble琼脂。
每升氟乙酰胺培养基包含以下组分：12g醋酸钠，2g氯化钠，0.5gMgSO4,3g KH2PO4,0.3g尿素，2g氟乙酰胺，1ml 50×Vogels盐，和15g琼脂糖Ⅰ(Amresco；Solon,Ohio),pH6.1。
在Fusarium venenatum MLY3中缺失pyrG基因
在Fusarium venenatum表达宿主MLY3的基因组中缺失未标记的pyrG，方法是先缺失pyrG基因，代之以构巢曲霉的amds基因，其侧翼为分离自米曲霉pyrG基因上游区的重复DNA序列。然后在含氟乙酰胺的平板上培养分离物以筛选所述amdS基因治愈的分离物。
从Fusarium venenatum菌株ATCC 20334中克隆3.9kb的基因组EcoRⅠpyrG片段，插入pUC118的EcoRⅠ位点，从而构建质粒pDM156.2。该pyrG片段包含完整编码区，1.3kb的启动子和1.5kb的终止子(图3)。Fusariumvenenatum MLY3的天然pyrG基因经同源重组被4.4kb的片段置换，该4.4kb片段中已缺失pyrG的整个开放读码框，并代之以amdS基因，其侧翼230bp重复序列，见图3。
构建pJRoy47。首先构建pJRoy43，它包含用SwaⅠ位点置换了pacⅠ和XbaⅠ位点的pNEB193(New England Biolabs)。为完成此步，制备5’末端包含BamHⅠ位点、中间包含SwaⅠ位点、3’末端包含SalⅠ位点的接头，制备方法是使下列两种oligos退火而结合成双链：
引物1:SEQ ID NO:8。
引物2:SEQ ID NO:9。
将所得接头连接至BamHⅠ和SalⅠ消化的pNEB193，得pJRoy43。
接着，选择米曲霉pyrG基因上游的230bp区作为Fusarium venenatum中的重复序列。从米曲霉pyrG质粒pJaL335(WO 98/12300)中用下列两对引物(引物3和4，引物5和6)将此区扩增为两种不同产物：
引物3:SEQ ID NO:10。
引物4:SEQ ID NO:11。
引物5:SEQ ID NO:12。
引物6:SEQ ID NO:13。
用Dneasy Plant Mini试剂盒制备约40-50ng的基因组DNA作模板，准备扩增反应(50μl)。每个反应包含下列成分：40-50ng基因组DNA，引物3和4或引物5和6各50pmol,dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM,1×TaqDNA聚合酶缓冲液，和2.5单位Taq DNA聚合酶。反应在Perkin-Elmer 480型热循环仪中保温，其程序如下：循环1在94℃2.5分钟，72℃2.5分钟；循环2-26每个于94℃45秒，50℃45秒，和72℃2分钟；循环27在94℃45秒，50℃45秒，和72℃10分钟。
在1％琼脂糖凝胶上将反应产物分离，得约230bp片段。第一种PCR产物(大约230bp片段)在5’末端包含SwaⅠ位点和3’末端包含EcoRⅤ位点，而第二种产物(大约230bp片段)在5’末端包含EcoRⅤ位点和3’末端包含PmeⅠ位点。将两种纯化重复片段首先用EcoRⅤ消化并连接在一起。纯化(酚-氯仿抽提和乙醇沉淀)后，将连接产物用PmeⅠ和SwaⅠ消化产生大约500bp片段，将此片段用琼脂糖凝胶电泳和琼脂水解酶处理以纯化。
将所得片段克隆入PmeⅠ和SwaⅠ消化的pJRoy43以制成pJRoy44(图4)。这个载体包含两个230bp的重复片段，中间以EcoRⅤ位点分隔，侧翼为SwaⅠ和PmeⅠ位点。
将包含amdS基因和调节区的EcoRⅠ片段从p3SR2亚克隆中分离(Kelly和Hynes,1985，欧洲分子生物学组织杂志4:475-479)，用Klenow片段制成平端，并连接至EcoRⅤ消化的pJRoy44以制成pJRoy47(图3)。
从pJRoy47获得侧翼为230bp重复序列的amdS基因作为SwaⅠ/PmeⅠ片段，将其插入EcoRⅤ/StuⅠ消化的pDM156.2中以制得pDM222A(图3)。将pDM222.A用EcoRⅠ消化，将包含pyrG缺失盒的4.4kb EcoRⅠ片段于转化前用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)纯化。
从基本培养基平板上取三个1cm2的Fusarium venenatum MLY3菌丝体柱状样本接种于包含500ml RA产孢子培养基的烧瓶中，28℃150rpm保温2-3天，以形成孢子。用Miracloth(Calbiochem,San Diego,CA)收获孢子并在Sorvall RC-5B离心机(E.I.DuPont De Nemours and Co.,Wilmington,DE)上以7000rpm离心20分钟。将沉淀的孢子用无水蒸馏水洗两次，用少量水重悬，然后用血细胞计数器计数。
将4×107Fusarium venenatum MLY3的孢子接种在100ml YEPG培养基上并且在24℃,150rpm保温16小时，制得原生质体。将培养物在Sorvall RT6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.,Wilmington,DE)上以3500rpm离心7分钟。用30ml 1M MgSO4将沉淀洗两次，并用5mg/ml NOVOZYME234TM(批号PPM 4356,Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd，丹麦)的1M MgSO4溶液5ml重悬。将培养物在24℃,150rpm保温直至原生质体形成。向该原生质体消化液中加入35ml 2M山梨醇，所得混合物于2500rpm离心10分钟。将沉淀重悬，用STC洗两次，于2000rpm离心10分钟使原生质体沉淀。用血细胞计数器计数原生质体并在8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液中重悬使终浓度为1.25×107原生质体/ml。将原生质体在Nalgene Cryo 1℃冷冻箱(VWR Scientific,Inc.,San Francisco,CA)控制速率冷冻后，贮存在-80℃。
将冷冻的Fusarium venenatum MLY3原生质体在冰上溶解。将上述pDM222.A的4.4kb EcoRⅠ片段1μg和5μl肝素(5mg/ml的STC)加入50ml无菌聚丙烯试管。加入100μl原生质体，轻轻混合，并在冰上静置30分钟。加入1ml SPTC，室温保温20分钟。加入25ml 40℃的COVE顶层琼脂糖(其添加了10mM尿嘧啶核苷)后，将混合物倒在直径150mm包含COVE琼脂的平板上以挑选amdS基因的整合。
将Fusarium venenatum MLY3 pyrG基因的天然3.9kb EcoRⅠ片段经同源重组用4.4kb片段(其包含pyrG侧翼序列和侧翼有230bp重复序列的amdS基因)置换。这导致缺失整个pyrG编码区以及0.78kb的5’非翻译区和0.8kb的3’非翻译区。用Southern杂交确认缺失盒对天然pyrG基因的置换。Southem杂交可用制造商提供的Amersham(Arlington,IL)Vista和Rapid Hyb方案或者Boehringer Mannheim DIG System方案进行。假定缺失体的真菌基因组DNA用Dneasy Plant Mini Kit(Qiagen Chatsworth,CA)制备并用EcoRⅠ消化。用Magnagraph膜(Micron Separations,Inc；Westborough,MA)和标准分子生物学技术进行Southern印迹。按照制造商的说明将膜显影并用STORM 860(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)扫描荧光素标记探针或使胶片曝光以检查DIG标记探针。3.2kb的pyrG探针包含pyrG完整编码区，0.64kb的5’区，以及1.42kb的3’非翻译区。
在添加10mM尿苷的RA培养基中28℃,150rpm约3天使缺失体菌株形成孢子，用显微操作器分离单个孢子。将孢子分离物培养于添加10mM尿苷的Vogel’s/乙酰胺琼脂上。一份孢子分离物在添加10mM尿苷的RA培养基上形成孢子。将孢子培养物经Miracloth过滤以去除菌丝体。五个150mm平板均添加了10mM尿苷的氟乙酰胺培养基，在每个平板上接种经证实为pyrG标记缺失体的9.5×105孢子，以筛选amdS标记的缺失。这些平板在室温下保温最多2周。所得菌落在COVE平板和添加10mM尿苷的氟乙酰胺平板上进行亚克隆。对在氟乙酰胺上生长良好但在COVE上生长不良或根本不生长的菌落进一步分析。对其中三个菌株的孢子分离物进行Southern印迹分析。用EcoRⅠ切割基因组DNA并用上述pyrG探针探测。几个孢子分离物显示1.4kb的杂交带，其表示amdS“loop-out”。选择一个孢子分离物并命名为Fusarium venenatum DLM15。
实施例6：在独立生长的Fusarium venenatum DLM15转化株中脂肪酶的表达水平
使用如Royer等1995，生物技术13:1479-1483所述标准程序，但用硝酸钠(25mM)取代乙酰胺，从而以pENI1298(实施例2所述)转化实施例5描述的pyrG阴性Fusarium venenatum DLM15。然后将细胞于室温下在基本平板上培养。保温2周后出现转化株，转化频率为50-100/μg DNA，比无AMA1序列者转化频率增加10-100倍。在基本培养基平板上分离到20个转化株并在室温下再生长2周。将转化株接种于微滴板上的200μl vogel培养基(如实施例2)中，所述培养基加有20mM尿苷或不含尿苷，室温培养。添加了尿苷的转化株生长良好，但在无尿苷的基本培养基平板上分离时不能生长，表明包含pyrG基因的质粒已经丢失，故说明质粒是自主复制。在添加尿苷的培养基上生长的转化株未检测到脂肪酶活性。在未添加尿苷的基本培养基上生长的转化株中检测到脂肪酶活性。与独立生长的镰孢属转化株相比，平均相对活性为34.8，相对标准差为15％。因此这种质粒有有效用于镰孢属菌种文库的创建。
实施例7：检测PCR片段的共转化
进行以下实验以评估多PCR片段是否能在同一细胞中与切割载体(如实施例4)发生体内重组，并从同一克隆维持多种酶的表达。制备两种PCR片段，它们分别包含脂肪酶基因或AMG基因(包括启动子和终止子)，用标准PCR条件(94℃，分钟；30个循环(94℃,30秒；50℃,30秒；72℃,1分钟)，和72℃,5分钟),oligo 115120(SEQ ID NO:14),oligo 134532(SEQ IDNO:15)，以及pAHL衍生物(pAHL中脂肪酶变异体)或者pENI1543衍生物(AMG变异体)作为模板。构建pENI1543，方法是用oligo 139123(SEQ IDNO:16)和139124(SEQ ID NO:17)产生包含黑曲霉(EMBL:AC:X00548作为模板)的葡萄糖淀粉酶基因(cDNA)的PCR片段，用BglⅡ和SalⅠ将其切割并克隆到已经被BamHⅠ和XhoⅠ切割的pAHL中。
将每种PCR片段各约1μg连同已经被BalⅠ和SgrAⅠ切割并用小牛肠磷酸酶处理的pENI1299(1μg)转化到Ja1250中(如实施例4所述)。分离20个转化株并接种至基本培养基(如实施例4)。将培养基保温72小时后测定脂肪酶(pnp-丁酸酯活性)和葡萄糖淀粉酶(pnp-吡喃葡糖苷的活性)的存在。无一转化株同时表现出脂肪酶活性和葡糖淀粉酶活性，故表明同一细胞内多个变异体的共转化和表达很少见，并因此不会成为筛选丝状真菌文库时的问题。
实施例8:pJerS2801和pHPOD1的构建
将pENI1298的5.8kb BglⅡ/SphⅠ片段，pENI1298的4.0kb BssHⅡ/SphⅠ片段，pBANe6(WO 98/11203描述的TAKA/NA2/TPI启动子/AMG终止子)的0.75kb BssHⅠ/BglⅡ片段进行三片段连接，得pJers2801。将包含Curvulariaverruculosa之卤过氧物酶(专利WO974102-A1)的PCR片段用oligo 1029fwp(SEQ ID NO:18)和1029rev(SEQ ID NO:19)制备。用SwaⅠ和NotⅠ切割该PCR片段并克隆到用同样限制酶切割的pJers2801中，得pHPOD1。
实施例9：在独立生长的转化株中卤过氧化物酶的表达水平
将pHPOD1转化到实施例2所述的Ja1250中。得到与pENI1298(实施例2)几乎相同的转化频率。将10个独立的曲霉属转化株接种在96孔微滴板中，每孔含200μl G2-谷氨酸培养基，培养72小时。基本按照De Boer等[1987；包含溴过氧物酶的钒：在水相和有机相培养基中具有高度操作稳定性的氧化还原酶的例子，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)30:607-610]所述方法判定10个转化株中每个的卤过氧物酶的活性。平均表达水平为82.5±9.1(相对单位)。独立转化株表达水平间的相对标准差约为11％，出人意外的低。因此本发明不仅适用于脂肪酶，而且也适用于其他酶。
实施例10：编码两种不同酶的两种质粒共转化入Ja1250
进行实验以估价编码两种酶的两种质粒是否能转化并保留在生长中的同一细胞内，并因此可以导致一个以上的编码酶的质粒的细胞外共表达。
用0.1μg pENI1299和0.1μg pHPOD1共转化Ja1250(如实施例2)。分离到40个独立转化株，接种至基本培养基(如实施例4)。将培养基保温72小时后测定脂肪酶的存在(如实施例4)和卤过氧化物酶活性(如实施例8)。无一转化株同时表现脂肪酶活性和卤过氧化物酶活性，说明多个变异体在同一细胞内的共转化和供表达是非常低频的事件，这不是丝状真菌文库的筛选中的问题。
                            序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>在丝状真菌细胞内构建和筛选目的DNA文库<130>5579.204-WO PWL/LiIs<140><141><160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5259<212>DNA<213>构巢曲霉<400>1aagcttattt tttgtatact gttttgtgat agcacgaagt ttttccacgg tatcttgtaa 60aaatatatat ttgtggcggg cttacctaca tcaaattaat aagagactaa ttataaacta 120aacacacaag caagctactt tagggtaaaa gtttataaat gcttttgacg tataaacgtt 180gcttgtattt attattacaa ttaaaggtgg atagaaaacc tagagactag ttagaaacta 240atctcaggtt tgcgttaaac taaatcagag cccgagaggt taacagaacc tagaagggga 300ctagatatcc gggtagggaa acaaaaaaaa aaaacaagac agccacatat tagggagact 360agttagaagc tagttccagg actaggaaaa taaaagacaa tgataccaca gtctagttga 420caactagata gattctagat tgaggccaaa gtctctgaga tccaggttag ttgcaactaa 480tactagttag tatctagtct cctataactc tgaagctaga ataacttact actattatcc 540tcaccactgt tcagctgcgc aaacggagtg attgcaaggt gttcagagac tagttattga 600ctagtcagtg actagcaata actaacaagg tattaaccta ccatgtctgc catcaccctg 660cacttcctcg ggctcagcag ccttttcctc ctcattttca tgctcatttt ccttgtttaa 720gactgtgact agtcaaagac tagtccagaa ccacaaagga gaaatgtctt accactttct 780tcattgcttg tctcttttgc attatccatg tctgcaacta gttagagtct agttagtgac 840tagtccgacg aggacttgct tgtctccgga ttgttggagg aactctccag ggcctcaaga 900tccacaacag agccttctag aagactggtc aataactagt tggtctttgt ctgagtctga 960cttacgaggt tgcatactcg ctccctttgc ctcgtcaatc gatgagaaaa agcgccaaaa 1020ctcgcaatat ggctttgaac cacacggtgc tgagactagt tagaatctag tcccaaacta 1080gcttggatag cttacctttg ccctttgcgt tgcgacaggt cttgcagggt atggttcctt 1140tctcaccagc tgatttagct gccttgctac cctcacggcg gatctgccat aaagagtggc 1200tagaggttat aaattagcac tgatcctagg tacggggctg aatgtaactt gcctttcctt 1260tctcatcgcg cggcaagaca ggcttgctca aattcctacc agtcacaggg gtatgcacgg 1320cgtacggacc acttgaacta gtcacagatt agttagcaac tagtctgcat tgaatggctg 1380tacttacggg ccctcgccat tgtcctgatc atttccagct tcaccctcgt tgctgcaaag 1440tagttagtga ctagtcaagg actagttgaa atgggagaag aaactcacga attctcgact 1500cccttagtat tgtggtcctt ggacttggtg ctgctatata ttagctaata cactagttag 1560actcacagaa acttacgcag ctcgcttgcg cttcttggta ggagtcgggg ttgggagaac 1620agtgccttca aacaagcctt cataccatgc tacttgacta gtcagggact agtcaccaag 1680taatctagat aggacttgcc tttggcctcc atcagttcct tcatagtggg aggaccattg 1740tgcaatgtaa actccatgcc gtgggagttc ttgtccttca agtgcttgac caatatgttt 1800ctgttggcag agggaacctg tcaactagtt aataactagt cagaaactat gatagcagta 1860gactcactgt acgcttgagg catcccttca ctcggcagta gacttcatat ggatggatat 1920caggcacgcc attgtcgtcc tgtggactag tcagtaacta ggcttaaagc tagtcgggtc 1980ggcttactat cttgaaatcc ggcagcgtaa gctccccgtc cttaactgcc tcgagatagt 2040gacagtactc tggggacttt cggagatcgt tatcgttatc gcgaatgctc ggcatactaa 2100ctgttgacta gtcttggact agtcccgagc aaaaaggatt ggaggaggag gaggaaggtg 2160agagtgagac aaagagcgaa ataagagctt caaaggctat ctctaagcag tatgaaggtt 2220aagtatctag ttcttgacta gatttaaaga gatttcgact agttatgtac ctggagtttg 2280gatataggaa tgtgttgtgg taacgaaatg taagggggag gaaagaaaaa gtcgtcaaga 2340ggtaactcta agtcggccat tcctttttgg gaggcgctaa ccataaacgg catggtcgac 2400ttagagttag ctcagggaat ttagggagtt atctgcgacc accgaggaac ggcggaatgc 2460caaagaatcc cgatggagct ctagctggcg gttgacaacc ccaccttttg gcgtttctgc 2520ggcgttgcag gcgggactgg atacttcgta gaaccagaaa ggcaaggcag aacgcgctca 2580gcaagagtgt tggaagtgat agcatgatgt gccttgttaa ctaggtacca atctgcagta 2640tgcttgatgt tatccaaagt gtgagagagg aaggtccaaa catacacgat tgggagaggg 2700cctaggtata agagtttttg agtagaacgc atgtgagccc agccatctcg aggagattaa 2760acacgggccg gcatttgatg gctatgttag taccccaatg gaaacggtga gagtccagtg 2820gtcgcagata actccctaaa ttccctgagc taactctaag tcgaccatgc cgtttatggt 2880tagcgcctcc caaaaaggaa tggccgactt agagttacct cttgacgact ttttctttcc 2940tcccccttac atttcgttac cacaacacat tcctatatcc aaactccagg tacataacta 3000gtcgaaatct ctttaaatct agtcaagaac tagatactta accttcatac tgcttagaga 3060tagcctttga agctcttatt tcgctctttg tctcactctc accttcctcc tcctcctcca 3120atcctttttg ctcgggacta gtccaagact agtcaacagt tagtatgccg agcattcgcg 3180ataacgataa cgatctccga aagtccccag agtactgtca ctatctcgag gcagttaagg 3240acggggagct tacgctgccg gatttcaaga tagtaagccg acccgactag ctttaagcct 3300agttactgac tagtccacag gacgacaatg gcgtgcctga tatccatcca tatgaagtct 3360actgccgagt gaagggatgc ctcaagcgta cagtgagtct actgctatca tagtttctga 3420ctagttatta actagttgac aggttccctc tgccaacaga aacatattgg tcaagcactt 3480gaaggacaag aactcccacg gcatggagtt tacattgcac aatggtcctc ccactatgaa 3540ggaactgatg gaggccaaag gcaagtccta tctagattac ttggtgacta gtccctgact 3600agtcaagtag catggtatga aggcttgttt gaaggcactg ttctcccaac cccgactcct 3660accaagaagc gcaagcgagc tgcgtaagtt tctgtgagtc taactagtgt attagctaat 3720atatagcagc accaagtcca aggaccacaa tactaaggga gtcgagaatt cgtgagtttc 3780ttctcccatt tcaactagtc cttgactagt cactaactac tttgcagcaa cgagggtgaa 3840gctggaaatg atcaggacaa tggcgagggc ccgtaagtac agccattcaa tgcagactag 3900ttgctaacta atctgtgact agttcaagtg gtccgtacgc cgtgcatacc cctgtgactg 3960gtaggaattt gagcaagcct gtcttgccgc gcgatgagaa aggaaaggca agttacattc 4020agccccgtac ctaggatcag tgctaattta taacctctag ccactcttta tggcagatcc 4080gccgtgaggg tagcaaggca gctaaatcag ctggtgagaa aggaaccata ccctgcaaga 4140cctgtcgcaa cgcaaagggc aaaggtaagc tatccaagct agtttgggac tagattctaa 4200ctagtctcag caccgtgtgg ttcaaagcca tattgcgagt tttggcgctt tttctcatcg 4260attgacgagg caaagggagc gagtatgcaa cctcgtaagt cagactcaga caaagaccaa 4320ctagttattg accagtcttc tagaaggctc tgttgtggat cttgaggccc tggagagttc 4380ctccaacaat ccggagacaa gcaagtcctc gtcggactag tcactaacta gactctaact 4440agttgcagac atggataatg caaaagagac aagcaatgaa gaaagtggta agacatttct 4500cctttgtggt tctggactag tctttgacta gtcacagtct taaacaagga aaatgagcat 4560gaaaatgagg aggaaaaggc tgctgagccc gaggaagtgc agggtgatgg cagacatggt 4620aggttaatac cttgttagtt attgctagtc actgactagt caataactag tctctgaaca 4680ccttgcaatc actccgtttg cgcagctgaa cagtggtgag gataatagta gtaagttatt 4740ctagcttcag agttatagga gactagatac taactagtat tagttgcaac taacctggat 4800ctcagagact ttggcctcaa tctagaatct atctagttgt caactagact gtggtatcat 4860tgtcttttat tttcctagtc ctggaactag cttctaacta gtctccctaa tatgtggctg 4920tcttgttttt tttttttgtt tccctacccg gatatctagt ccccttctag gttctgttaa 4980cctctcgggc tctgatttag tttaacgcaa acctgagatt agtttctaac tagtctctag 5040gttttctatc cacctttaat tgtaataata aatacaagca acgtttatac gtcaaaagca 5100tttataaact tttaccctaa agtagcttgc ttgtgtgttt agtttataat tagtctctta 5160ttaatttgat gtaggtaagc ccgccacaaa tatatatttt tacaagatac cgtggaaaaa 5220cttcgtgcta tcacaaaaca gtatacaaaa aataagctt                        5259<210>2<211>2400<212>DNA<213>构巢曲霉<400>2aagcttattt tttgtatact gttttgtgat agcacgaagt ttttccacgg tatcttgtaa 60aaatatatat ttgtggcggg cttacctaca tcaaattaat aagagactaa ttataaacta 120aacacacaag caagctactt tagggtaaaa gtttataaat gcttttgacg tataaacgtt 180gcttgtattt attattacaa ttaaaggtgg atagaaaacc tagagactag ttagaaacta 240atctcaggtt tgcgttaaac taaatcagag cccgagaggt taacagaacc tagaagggga 300ctagatatcc gggtagggaa acaaaaaaaa aaaacaagac agccacatat tagggagact 360agttagaagc tagttccagg actaggaaaa taaaagacaa tgataccaca gtctagttga 420caactagata gattctagat tgaggccaaa gtctctgaga tccaggttag ttgcaactaa 480tactagttag tatctagtct cctataactc tgaagctaga ataacttact actattatcc 540tcaccactgt tcagctgcgc aaacggagtg attgcaaggt gttcagagac tagttattga 600ctagtcagtg actagcaata actaacaagg tattaaccta ccatgtctgc catcaccctg 660cacttcctcg ggctcagcag ccttttcctc ctcattttca tgctcatttt ccttgtttaa 720gactgtgact agtcaaagac tagtccagaa ccacaaagga gaaatgtctt accactttct 780tcattgcttg tctcttttgc attatccatg tctgcaacta gttagagtct agttagtgac 840tagtccgacg aggacttgct tgtctccgga ttgttggagg aactctccag ggcctcaaga 900tccacaacag agccttctag aagactggtc aataactagt tggtctttgt ctgagtctga 960cttacgaggt tgcatactcg ctccctttgc ctcgtcaatc gatgagaaaa agcgccaaaa 1020ctcgcaatat ggctttgaac cacacggtgc tgagactagt tagaatctag tcccaaacta 1080gcttggatag cttacctttg ccctttgcgt tgcgacaggt cttgcagggt atggttcctt 1140tctcaccagc tgatttagct gccttgctac cctcacggcg gatctgccat aaagagtggc 1200tagaggttat aaattagcac tgatcctagg tacggggctg aatgtaactt gcctttcctt 1260tctcatcgcg cggcaagaca ggcttgctca aattcctacc agtcacaggg gtatgcacgg 1320cgtacggacc acttgaacta gtcacagatt agttagcaac tagtctgcat tgaatggctg 1380tacttacggg ccctcgccat tgtcctgatc atttccagct tcaccctcgt tgctgcaaag 1440tagttagtga ctagtcaagg actagttgaa atgggagaag aaactcacga attctcgact 1500cccttagtat tgtggtcctt ggacttggtg ctgctatata ttagctaata cactagttag 1560actcacagaa acttacgcag ctcgcttgcg cttcttggta ggagtcgggg ttgggagaac 1620agtgccttca aacaagcctt cataccatgc tacttgacta gtcagggact agtcaccaag 1680taatctagat aggacttgcc tttggcctcc atcagttcct tcatagtggg aggaccattg 1740tgcaatgtaa actccatgcc gtgggagttc ttgtccttca agtgcttgac caatatgttt 1800ctgttggcag agggaacctg tcaactagtt aataactagt cagaaactat gatagcagta 1860gactcactgt acgcttgagg catcccttca ctcggcagta gacttcatat ggatggatat 1920caggcacgcc attgtcgtcc tgtggactag tcagtaacta ggcttaaagc tagtcgggtc 1980ggcttactat cttgaaatcc ggcagcgtaa gctccccgtc cttaactgcc tcgagatagt 2040gacagtactc tggggacttt cggagatcgt tatcgttatc gcgaatgctc ggcatactaa 2100ctgttgacta gtcttggact agtcccgagc aaaaaggatt ggaggaggag gaggaaggtg 2160agagtgagac aaagagcgaa ataagagctt caaaggctat ctctaagcag tatgaaggtt 2220aagtatctag ttcttgacta gatttaaaga gatttcgact agttatgtac ctggagtttg 2280gatataggaa tgtgttgtgg taacgaaatg taagggggag gaaagaaaaa gtcgtcaaga 2340ggtaactcta agtcggccat tcctttttgg gaggcgctaa ccataaacgg catggtcgac 2400<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物19670<400>3ccccatcctt taactatagc g                                           21<210>4<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物23701<400>4cgtggacggc cttggctagc cctcctcsac sacsacsagt ctcgcaggat ctg        53<210>5<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物23702<400>5ctgcgtggac ggccttggct agccctcctc sacsacsacs acsagtctcg caggatctgt 60ttaaccag                                                          68<210>6<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物23703<400>6tctctgcgtg gacggccttg gctagccctc ctcsacsacs acsacsacsa gtctcgcagg 60atctgtttaa ccag                                                   74<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物19671<400>7ctcccttctc tgaacaataa accc                                        24<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物1<400>8gatcgattta aat                                                    13<210>9<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物2<400>9tcgaatttaa atc                                                    13<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物3<400>10cgaatttcat atttaaatgc cgaccagcag acggccctcg                 40<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物4<400>11gcgatatcat gatctctctg gtactcttcg                            30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物5<400>12gcgatatcat cgaccagcag acggccctcg                            30<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物6<400>13gcgtttaaac atgatctctc tggtactctt cg                         32<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物115120<400>14gctttgtgca gggtaaatc                                        19<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物134532<400>15gagcaatatc aggccgcgca cg                                    22<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物139123<400>16cgcacgagat ctgcaatgtc gttccgatct cta                        33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物139124<400>17cagccggtcg actcacagtg acataccaga gcg                        33<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物1029fwp<400>18caactggatt taaatatgat ggggtccgtt acacc                      35<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：引物1029rev<400>19ctagatctgc ggccgctcga gttaattaat cactgg                     36

Claims (29)

1．一种在丝状真菌细胞内构建和挑选或筛选目的多核苷酸序列文库的方法，该方法包括：
(a)用DNA载体群转化所述真菌细胞，其中每种载体包括：
(ⅰ)编码真菌筛选标记和真菌复制起始序列的多核苷酸序列，其中所述标记和复制起始序列在该群体中不变化；和
(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中所述DNA载体群包含该多核苷酸序列的一种以上变异体；
(b)在选择压力下培养所述细胞；
(c)挑选或筛选一个或多个表达目的特征的转化株；和
(d)分离所述目的转化株。
2．权利要求1的方法，其中所述目的多核苷酸序列文库制备通过对具有或编码目的生物活性或功能的至少一个亲本多核苷酸序列进行随机诱变或天然等位基因变异而制备。
3．权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸序列编码多肽或控制序列；或者其中多核苷酸序列编码多肽或其一部分并进一步包括参与该多肽表达的控制序列或这样的控制序列的一部分。
4．权利要求3的方法，其中所述多肽是激素，酶，受体或其部分，抗体或其部分，或报道蛋白，或调节蛋白。
5．权利要求4的方法，其中所述酶是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，或连接酶。
6．权利要求4或5中任一项的方法，其中所述酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，角质素酶，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，mutanase，氧化酶，果胶分解酶，过氧化物酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，谷氨酰胺转移酶，或木聚糖酶。
7．权利要求1或2的方法，其中所述控制序列是增强子序列，前导序列，poly-A序列，前肽序列，启动子，复制起始序列，信号序列，转录终止子或翻译终止子。
8．权利要求7的方法，其中所述启动子来自米曲霉TAKA淀粉酶，NA2-tpi和黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶的编码基因。
9．权利要求1-8中任一项的方法，其中所述筛选标记选自编码杀生物剂抗性或病毒毒性抗性的基因，编码对重金属毒性的抗性的基因，或编码为营养缺陷型提供原养型的基因。
10．权利要求9的方法，其中从酶获得原养型，此酶由以下代谢途径中挑选，包括核酸合成，辅因子合成，氨基酸合成，乙酰胺代谢，脯氨酸代谢，硫酸代谢，和硝酸代谢。
11．权利要求9的方法，其中筛选标记选自以下基因：argB(鸟氨酸转氨甲酰酶)，amdS(乙酰胺酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)，hemB(胆色素原合酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸盐还原酶)，pm(脯氨酸透性酶)，pyrG(乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶)，pyroA,riboB,sC(硫酸腺苷酰转移酶)，和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)。
12．权利要求1-11的任一种方法，其中所述复制起始序列是选自下组的核酸序列：
(a)一种复制起始序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％的同一性并能够起始复制；
(b)一种复制起始序列，其与(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互补链在低严谨条件下杂交，其中所述低严谨条件定义为在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并变性的鲑精DNA，和25％甲酰胺中预杂交和杂交，洗涤条件定为50℃的2×SSC,0.2％SDS 30分钟；和
(c)(a)或(b)的亚序列，其中该亚序列具有复制起始活性。
13．权利要求12的方法，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示核酸序列的同一性至少为50％，优选约60％，更优选约70％，更优选约80％，更优选约90％，最优选约97％。
14．权利要求12的方法，其中所述复制起始序列从丝状真菌细胞获得。
15．权利要求14的方法，其中所述丝状真菌细胞是曲霉属菌株。
16．权利要求15的方法，其中所述曲霉属菌株从构巢曲霉菌株获得。
17．权利要求12-16的任一种方法，其中所述复制起始序列具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它们的相应功能亚序列。
18．权利要求2的方法，其中对亲本多核苷酸序列的修饰通过诱变进行，优选随机诱变，方式是使用物理或化学诱变剂，使用掺入型寡核苷酸，进行DNA改组，或通过对该核酸序列进行PCR诱变，或者使用它们的任意组合。
19．权利要求18的方法，其中所述目的多核苷酸序列通过编码多肽或调节序列或其组合的两个或多个同源核酸序列的体内重组产生，包括：
(a)鉴定所述目的多核苷酸序列中至少一个保守区；
(b)产生每个目的多核苷酸序列的片段，其中所述片段包括(a)的保守区；和
(c)用(a)的保守区作为同源连接点使(b)的片段重组。
20．权利要求1-19中任一项的方法，其中用DNA载体群转化的丝状真菌细胞来自支顶孢属，曲霉属，鬼伞，镰孢属，腐质霉属，毛霉属，毁丝霉属，脉孢菌属，青霉属，梭孢壳属，Tolypocladium，或木霉属。
21．权利要求20的方法，其中所述细胞是米曲霉，黑曲霉，构巢曲霉，Coprinus cinereus，尖孢镰孢，或Trichoderma reesei细胞。
22．在丝状真菌细胞内构建和筛选或挑选目的多核苷酸序列文库的方法，其中该方法包括：
(a)用权利要求1-21中任一项所述的DNA载体群转化细菌或酵母细胞的培养物，其中该载体还包括编码细菌或酵母筛选标记以及细菌或酵母复制起始序列的核酸序列；
(b)在选择压力下培养细菌或酵母细胞；
(c)从(b)的转化株中分离DNA构建体；
(d)用(c)的DNA构建体转化丝状真菌细胞；
(e)培养(d)的丝状真菌细胞；
(f)挑选或筛选表达所需特征的一个或多个丝状真菌转化株；和
(g)分离所需丝状真菌转化株。
23．权利要求22的方法，其中所述细菌或酵母的筛选标记选自编码杀生物剂抗性或病毒毒性抗性的基因，编码对重金属毒性的抗性的基因，或编码为营养缺陷型提供原养型的基因。
24．真菌复制起始序列在构建目的多核苷酸序列文库中的应用。
25．权利要求24的应用，其中所述真菌复制起始序列选自以下核酸序列：
(a)一种复制起始序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％的同一性并能够起始复制；
(b)一种复制起始序列，其与(ⅰ)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或(ⅱ)各自的互补链在低严谨条件下杂交，其中所述低严谨条件定义为在42℃的5×SSPE,0.3％SDS,200mg/ml剪切并变性的鲑精DNA，和25％甲酰胺中预杂交和杂交，洗涤条件定为50℃的2×SSC,0.2％SDS 30分钟；和
(c)(a)或(b)的亚序列，其中该亚序列具有复制起始活性。
26．权利要求25的应用，其中所述复制起始序列获自丝状真菌细胞，尤其曲霉属菌株，如构巢曲霉。
27．权利要求25或26的应用，其中所述复制起始序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列，或它们各自的功能亚序列。
28．一种目的多核苷酸序列文库，其包括用DNA载体群转化的丝状真菌细胞，其中每种载体包括：
(ⅰ)编码真菌筛选标记和真菌复制起始序列的基因，其中所述标记和复制起始序列在该群体中不变化；和
(ⅱ)目的多核苷酸序列，其中所述DNA载体群包含该多核苷酸序列的一种以上变异体。
29．权利要求28的文库，其中所述载体还包括编码细菌或酵母筛选标记以及细菌或酵母复制起始序列的核酸序列。
CNB998126608A 1998-10-26 1999-10-13 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库 Expired - Fee Related CN1197965C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA199801375 1998-10-26
DKPA199801375 1998-10-26
DKPA199900718 1999-05-25
DKPA199900718 1999-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1324402A true CN1324402A (zh) 2001-11-28
CN1197965C CN1197965C (zh) 2005-04-20

Family

ID=26064518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998126608A Expired - Fee Related CN1197965C (zh) 1998-10-26 1999-10-13 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1124949B1 (zh)
JP (1) JP5043254B2 (zh)
CN (1) CN1197965C (zh)
AT (1) ATE332968T1 (zh)
AU (1) AU6188599A (zh)
CA (1) CA2344619C (zh)
DE (1) DE69932345T2 (zh)
DK (1) DK1124949T3 (zh)
WO (1) WO2000024883A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102534811A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 深圳华大基因科技有限公司 一种dna文库及其制备方法、一种dna测序方法和装置
CN103068988A (zh) * 2010-06-25 2013-04-24 诺维信公司 具有启动子活性的多核苷酸
CN105734079A (zh) * 2006-07-19 2016-07-06 孟山都技术有限公司 提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用
CN108779155A (zh) * 2016-04-19 2018-11-09 诺维信公司 RlmA灭活的丝状真菌宿主细胞
CN108893486A (zh) * 2018-08-01 2018-11-27 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用
CN110551643A (zh) * 2019-07-19 2019-12-10 天津科技大学 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
CN114875046A (zh) * 2022-05-30 2022-08-09 福州大学 一种丝状真菌复制子

Families Citing this family (465)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5354401A (en) * 2000-04-13 2001-10-30 Emalfarb, Mark Aaron High-throughput screening of expressed DNA libraries in filamentous fungi
EP2287296A1 (en) 2000-06-26 2011-02-23 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
EP1352057B1 (en) 2001-01-10 2009-03-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variant
WO2002062973A2 (en) 2001-02-07 2002-08-15 Novozymes A/S Lipase variants
WO2003070956A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Novozymes A/S Expression cloning methods in filamentous fungi
WO2003089648A1 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Novozymes Biotech, Inc. Methods for preparing variants of a dna sequence in filamentous fungi
ATE439432T1 (de) 2002-08-30 2009-08-15 Novozymes Inc Verfahren zur herstellung von säugetier-trypsinen
CN100480391C (zh) 2002-11-18 2009-04-22 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子变体
US20060234340A1 (en) * 2003-02-06 2006-10-19 Novozymes A/S Human heavy chain antibody expression in flamentous fungi
US7413888B2 (en) 2003-05-02 2008-08-19 Novozymes, Inc. Variants of beta-glucosidases
PL1641932T3 (pl) 2003-06-25 2011-10-31 Novozymes As Sposób hydrolizy skrobi
MXPA06000212A (es) 2003-06-25 2006-03-21 Novozymes As Enzimas para procesar almidon.
ES2538824T3 (es) 2003-08-25 2015-06-24 Novozymes, Inc. Variantes de glucósido hidrolasas
WO2005047499A1 (en) 2003-10-28 2005-05-26 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
EP1687419B1 (en) 2003-10-28 2010-02-03 Novozymes North America, Inc. Hybrid enzymes
ES2469840T3 (es) 2004-01-30 2014-06-20 Novozymes Inc. Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican
CN101389645B (zh) 2004-02-12 2016-08-03 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
CN1993475A (zh) 2004-05-27 2007-07-04 诺维信股份有限公司 用dna文库转化和表达筛选丝状真菌细胞的方法
CN1969041B (zh) 2004-06-14 2012-06-20 诺维信公司 用于生产多肽的信号肽
CN101031643B (zh) 2004-06-29 2014-05-21 诺维信股份有限公司 具有α-葡糖苷酶活性的多肽及编码其的多核苷酸
EP2295555A3 (en) 2004-09-30 2011-08-10 Novozymes, Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encodig same
ES2614744T3 (es) 2004-10-04 2017-06-01 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de fitasa y polinucleótidos que codifican los mismos
AR050895A1 (es) 2004-10-04 2006-11-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de fitasa y polinucleotidos que los codifican
WO2006053565A2 (en) 2004-11-19 2006-05-26 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
EP1831385B1 (en) 2004-12-22 2015-04-22 Novozymes North America, Inc. Enzymes for starch processing
AP2007004141A0 (en) 2005-03-16 2007-08-31 Novozymes As Recombinant expression of defensins in filamentousfunti
DK1863834T3 (da) 2005-03-22 2010-11-01 Novozymes As Polypeptider og nukleinsyrer, der koder disse
CA2606475C (en) 2005-04-27 2015-06-16 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
SI1922333T1 (sl) 2005-08-26 2010-06-30 Novozymes Adenium Biotech As Polipeptidi z antimikrobno aktivnostjo in polinukleotidi ki kodirajo le te
NZ589570A (en) 2005-09-30 2012-06-29 Novozymes Inc Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
ES2368608T3 (es) 2006-03-20 2011-11-18 Novozymes, Inc. Polipéptidos con actividad endoglucanasa y polinucleótidos codifcando los polipéptidos.
BRPI0710217A2 (pt) 2006-03-30 2011-08-02 Novozymes Inc polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polinucleotìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo
EP2059590B1 (en) 2006-07-14 2014-12-31 Novozymes, Inc. Methods for producing secreted polypeptides having biological activity
CN101512001A (zh) 2006-07-14 2009-08-19 诺维信股份有限公司 提高真菌细胞中基因表达的方法
CA2658610A1 (en) 2006-07-21 2008-05-15 Novozymes, Inc. Methods of increasing secretion of polypeptides having biological activity
WO2008065200A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Novozymes A/S Dnase expression in recombinant host cells
ES2456960T3 (es) 2007-03-26 2014-04-24 Novozymes A/S Fitasa de Hafnia
DE102007016139A1 (de) 2007-03-30 2008-10-02 Jenabios Gmbh Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen
JP5497632B2 (ja) 2007-05-09 2014-05-21 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 関心対象のポリペプチドを産生するライブラリークローンの選択に適した発現クローニング法
US8609386B2 (en) 2007-09-18 2013-12-17 Novozymes A/S Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same
EP2215224B1 (en) 2007-11-27 2013-10-16 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
CN101909461B (zh) 2007-12-06 2015-10-07 诺维信公司 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
KR20100105849A (ko) 2007-12-19 2010-09-30 노보자임스 에이/에스 셀룰로오스 가수분해 향상 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
ES2667812T3 (es) 2008-11-20 2018-05-14 Novozymes Inc. Polipéptidos que tienen actividad potenciadora amilolítica y polinucleótidos que codifican los mismos
EP2373788A1 (en) 2008-12-04 2011-10-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US9493759B2 (en) 2008-12-12 2016-11-15 Novozymes, Inc. Polypeptides having aspartic endopeptidase activity and polynucleotides encoding same
WO2010068650A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2010074972A1 (en) 2008-12-15 2010-07-01 Novozymes, Inc. Polypeptides having catalase activity and polynucleotides encoding same
WO2010074955A1 (en) 2008-12-16 2010-07-01 Novozymes, Inc. Polypeptides having carboxypeptidase activity and polynucleotides encoding same
WO2010077775A1 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having alpha-mannosidase activity and polynucleotides encoding same
EP3141609A1 (en) 2008-12-19 2017-03-15 Novozymes, Inc. Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material in the presence of cellobiose dehydrogenase
CN102325893A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 在过氧化物酶存在下增加纤维素材料酶法水解的方法
US8337663B2 (en) 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material
US8338121B2 (en) 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for determining cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
ES2561427T3 (es) 2008-12-23 2016-02-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polipéptidos con actividad de xilanasa
WO2010084086A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Novozymes A/S Polypeptides having esterase activity and nucleic acids encoding the same
WO2010088387A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2010088463A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having expansin activity and polynucleotides encoding same
WO2010088447A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2010091221A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2010106068A1 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Novozymes A/S Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same
CA2752007A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novozymes A/S Polypeptides having acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same
EP2248893A1 (en) 2009-05-06 2010-11-10 Novozymes A/S DFPase Enzymes from Octopus Vulgaris
CA2763031A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
EP2438163B1 (en) 2009-06-02 2015-01-21 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8945826B2 (en) 2009-06-26 2015-02-03 Novozymes A/S Heat-stable carbonic anhydrases and their use
WO2011005867A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity activity and polynucleotides encoding same
US20120100250A1 (en) 2009-07-24 2012-04-26 Novozymes A/S Carbohydrate Oxidases
WO2011014458A1 (en) 2009-07-28 2011-02-03 Novozymes, Inc. Polypeptides having phytase activity and polynucleotides encoding same
WO2011015633A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Novozymes A/S Method of producing a sweet protein
US8409830B2 (en) 2009-08-21 2013-04-02 Novozymes A/S Polypeptides having isoamylase activity and methods of use
CA2772695A1 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Novozymes, Inc. Methods for improving malic acid production in filamentous fungi
EP3805348A3 (en) 2009-09-17 2021-07-14 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2011035029A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2011036263A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Novozymes A/S Subtilase variants
WO2011036264A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Novozymes A/S Use of protease variants
ES2560805T3 (es) 2009-09-29 2016-02-22 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad mejoradora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
WO2011041405A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN102666846A (zh) 2009-09-30 2012-09-12 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
DK2483296T3 (en) 2009-09-30 2015-11-02 Novozymes Inc Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding them
US8541651B2 (en) 2009-10-23 2013-09-24 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2011059740A1 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK3222716T3 (da) 2009-11-06 2020-11-16 Novozymes Inc Sammensætninger til saccharificering af cellulosemateriale
CA2780198A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
US9267125B2 (en) 2009-11-06 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2011066560A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
AU2010276468B2 (en) 2009-11-30 2015-05-14 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
WO2011068803A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
WO2011067349A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Novozymes A/S Variants of a polypeptide with lipolytic activity and improved stability
CN102753023A (zh) 2009-12-09 2012-10-24 诺维信公司 产生gh8木聚糖酶变体的方法
MX350399B (es) 2009-12-18 2017-09-06 Novozymes Inc Metodos para producir polipeptidos en mutantes de trichoderma deficientes en proteasa.
US20120220513A1 (en) 2009-12-29 2012-08-30 Novozymes A/S Polypeptides Having Detergency Enhancing Effect
US8900848B2 (en) 2010-01-04 2014-12-02 Novozymes A/S Stabilization of alpha-amylases towards calcium depletion and acidic PH
WO2011104284A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity
CN102884182A (zh) 2010-03-03 2013-01-16 诺维信股份有限公司 木聚糖酶变体及编码其的多核苷酸
MX2012011153A (es) 2010-03-31 2012-11-29 Novozymes Inc Variantes de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
ES2565060T3 (es) 2010-04-14 2016-03-31 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
WO2011153317A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Novozymes, Inc. C4 dicarboxylic acid production in filamentous fungi
US8835604B2 (en) 2010-06-12 2014-09-16 Adenium Biotech Aos Antimicrobial peptide variants and polynucleotides encoding same
US8158395B2 (en) 2010-06-21 2012-04-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having C4 dicarboxylic acid transporter activity and polynucleotides encoding same
EP2582829B1 (en) 2010-06-21 2016-11-30 Novozymes, Inc. Methods for improved c4-dicarboxylic acid production in filamentous fungi
WO2011161206A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novozymes A/S Polynucleotides having leader sequence function
EP2585601A1 (en) 2010-06-25 2013-05-01 Novozymes A/S Polynucleotides having promoter activity
US8581042B2 (en) 2010-06-30 2013-11-12 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
CA2806899C (en) 2010-07-30 2018-05-15 Cleanvantage Llc Aspergillus containing beta-glucosidase, beta-glucosidases and nucleic acids encoding the same
WO2012021408A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a dioxy compound and uses thereof
US20130149771A1 (en) 2010-08-24 2013-06-13 Novozymes A/S Heat-Stable Persephonella Carbonic Anhydrases and Their Use
US9267126B2 (en) 2010-08-30 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
DK2735611T3 (en) 2010-08-30 2019-01-28 Novozymes As POLYPEPTIDES WITH CELLULOLYSE INCREASING ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030858A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having hemicellulolytic activity and polynucleotides encoding same
DK2622070T3 (en) 2010-09-30 2016-11-21 Novozymes Inc Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
DK2622068T3 (en) 2010-09-30 2016-10-17 Novozymes Inc Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
BR112013004743A2 (pt) 2010-10-01 2016-06-07 Novozymes As polipeptídeo isolado com atividade de endopeptidase, composição, método para produzir o polipeptídeo, preparar um hidrolisado de proteína, e para preparar um hidrolisado de proteína alimentar, e, usos do polipeptídeo ou da composição, e de uma endopeptidase do tipo tripsina derivada de uma bactéria
WO2012045088A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Combinatorial design of highly efficient heterologous pathways
EP3023492B1 (en) 2010-10-01 2018-01-24 Novozymes, Inc. Beta-glucosidase variants and polynucleotides encoding same
WO2012058293A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Novozymes North America, Inc. Methods of saccharifying sugarcane trash
WO2012058566A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Novozymes A/S Polypeptides having succinyl-coa:aceto acetate transferase activity and polynucleotides encoding same
AU2011320329B2 (en) 2010-10-29 2015-03-12 Novozymes A/S Recombinant n-propanol and isopropanol production
EP2635689B1 (en) 2010-11-02 2015-04-15 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
US9212354B2 (en) 2010-11-04 2015-12-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activitiy and polynucleotides encoding same
US9732332B2 (en) 2010-11-08 2017-08-15 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
WO2012064350A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Novozymes A/S Polypeptides Having Glucoamylase Activity and Polynucleotides Encoding Same
MX356647B (es) 2010-11-12 2018-06-07 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de fosfolipasa c y polinucleotidos que codifican los mismos.
DK2638153T3 (en) 2010-11-12 2017-10-16 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH ENDOGLUCANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
EP2640833B1 (en) 2010-11-18 2016-08-24 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
KR20140018851A (ko) 2010-11-24 2014-02-13 노파르티스 인터내셔널 파마슈티칼 리미티드 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 융합 효소
CN103339259B (zh) 2010-11-30 2016-01-13 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
US8927235B2 (en) 2010-12-06 2015-01-06 Novozymes A/S Methods of hydrolyzing oligomers in hemicellulosic liquor
WO2012078712A2 (en) 2010-12-07 2012-06-14 Vnomics Corp. System and method for measuring and reducing vehicle fuel waste
BR112013014869A2 (pt) 2010-12-16 2017-06-06 Novozymes Inc método para produzir um polipeptídeo, promotor isolado, construção de ácido nucleico, e, célula hospedeira recombinante
EP2665745A1 (en) 2011-01-21 2013-11-27 The Board Of Trustees Of The UniversityOf Illinois Enhanced fermentation of cellodextrins and beta-d-glucose
WO2012103350A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
MX337985B (es) 2011-01-26 2016-03-30 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
DK2668266T3 (en) 2011-01-26 2018-03-26 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH CELLOBIO HYDROASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
MX337942B (es) 2011-01-26 2016-03-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de endoglucanasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
DK2668270T3 (en) 2011-01-26 2019-01-07 Novozymes Inc Polypeptides with cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them
WO2012134626A2 (en) 2011-01-31 2012-10-04 Novozymes North America, Inc. Processes for enzymatic refining of pretreated cellulosic material for saccharification
CA2826570A1 (en) 2011-02-07 2012-08-16 The Regents Of The University Of California Enhanced cellodextrin metabolism
EP2678427A2 (en) 2011-02-23 2014-01-01 DuPont Nutrition Biosciences ApS Method for producing recombinant enzymes capable of hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative
EP2678352B1 (en) 2011-02-23 2017-12-06 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8722387B2 (en) 2011-02-28 2014-05-13 Novozymes, Inc. Microorganisms for C4-dicarboxylic acid production
EP3339442B1 (en) 2011-03-09 2022-05-11 Novozymes A/S Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
US9409958B2 (en) 2011-03-10 2016-08-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP3333258A3 (en) 2011-03-25 2018-07-25 Novozymes A/S Method for degrading or converting cellulosic material
WO2012135719A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes, Inc. Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
CN103649308A (zh) 2011-04-28 2014-03-19 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN103797126A (zh) 2011-04-29 2014-05-14 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料的降解或转化的方法
WO2012159009A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
US20140141471A1 (en) 2011-05-19 2014-05-22 Novozymes, Inc. Methods for Enhancing the Degradation of Cellulosic Material with Chitin Binding Proteins
EP2527448A1 (en) 2011-05-23 2012-11-28 Novozymes A/S Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies in filamentous fungi
EP2527432A1 (en) 2011-05-23 2012-11-28 Novozymes A/S Bi-directional cytosine deaminase-encoding selection marker
CN103620029B (zh) 2011-06-24 2017-06-09 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
WO2013001078A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
CN103703124B (zh) 2011-06-30 2021-01-15 诺维信公司 用于筛选α-淀粉酶的方法
WO2013006756A2 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novozymes A/S Alpha amylase variants and polynucleotides encoding same
CN103827298A (zh) 2011-07-15 2014-05-28 诺维信公司 脂肪酶变体及其编码多核苷酸
BR112013032861A2 (pt) 2011-07-22 2017-01-24 Novozymes North America Inc métodos para aumentar a atividade da enzima celulolítica durante a hidrólise do material celulósico, para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, para a produção de um produto da fermentação, e para a fermentação de um material celulósico pré-tratado
EP2739728B1 (en) 2011-08-04 2017-07-12 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP3091073B2 (en) 2011-08-04 2023-03-08 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN102286524B (zh) * 2011-08-08 2014-04-23 安徽农业大学 一种植物转化载体及其构建方法和应用
WO2013021065A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
US9382559B2 (en) 2011-08-10 2016-07-05 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021059A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021060A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021062A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021064A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
CN103732740B (zh) 2011-08-10 2018-07-31 诺维信公司 具有过氧化酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
MX2014001594A (es) 2011-08-15 2014-04-25 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de celulasa y polinucleotidos que los codifican.
ES2641039T3 (es) 2011-08-19 2017-11-07 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de proteasa
WO2013028512A1 (en) 2011-08-19 2013-02-28 Novozymes, Inc. Recombinant microorganisms for production c4-dicarboxylic acids
DK2748314T3 (en) 2011-08-24 2017-03-20 Novozymes Inc CELLULOLYTIC ENZYME COMPOSITIONS FROM ASPERGILLUS FUMIGATUS AND APPLICATIONS THEREOF
IN2014CN02100A (zh) 2011-08-24 2015-05-29 Novozymes Inc
CA2846690A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
DK2748315T3 (en) 2011-09-06 2018-02-05 Novozymes North America Inc GLUCOAMYLASE VARIETIES AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
EP2748189B1 (en) 2011-09-09 2017-11-15 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
BR112014005564A2 (pt) 2011-09-13 2017-03-21 Novozymes North America Inc método para degradar um material celulósico pré-tratado
US20140308705A1 (en) 2011-09-20 2014-10-16 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
EP2751266B1 (en) 2011-09-22 2017-03-29 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
WO2013089889A2 (en) 2011-09-30 2013-06-20 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US20150031091A1 (en) 2011-09-30 2015-01-29 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
JP2014528726A (ja) 2011-09-30 2014-10-30 ノボザイムス，インコーポレイティド デヒドロゲナーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド
DK2766476T3 (en) 2011-10-11 2017-08-28 Novozymes As GLUCOAMYLASE VARIETIES AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2013059326A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Xylitol production from cellulosic biomass
MX355356B (es) 2011-10-17 2018-04-17 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
WO2013057143A2 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
DK2773656T3 (da) 2011-10-31 2019-09-09 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
EP2780449B1 (en) 2011-11-18 2018-04-11 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
DK3219794T3 (da) 2011-11-21 2019-12-16 Novozymes Inc GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem
WO2013075644A1 (en) 2011-11-22 2013-05-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
EP2782593B1 (en) 2011-11-25 2017-04-26 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same
WO2013079015A1 (en) 2011-12-01 2013-06-06 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US9404093B2 (en) 2011-12-02 2016-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013079531A2 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
DK2791330T3 (da) 2011-12-16 2017-11-06 Novozymes Inc Polypeptider med laccaseaktivitet og polynukleotider, som koder for dem
WO2013091547A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having catalase activity and polynucleotides encoding same
EP2794869B1 (en) 2011-12-20 2017-10-04 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP2798062B1 (en) 2011-12-28 2018-02-21 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity
MX2014008764A (es) 2012-01-26 2014-08-27 Novozymes As Uso de polipeptidos que tienen actividad proteasa en alimentos para animales y detergentes.
WO2013116261A2 (en) 2012-02-03 2013-08-08 The Procter & Gamble Company Compositions and methods for surface treatment with lipases
MX353911B (es) 2012-02-03 2018-02-02 Novozymes As Variantes de lipasa y polinucleotidos que las codifican.
BR112014018876A2 (pt) 2012-02-20 2017-07-04 Novozymes As polipeptídeo isolado com atividade endoglicanase, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, método de produção de um polipeptídeo
US9909109B2 (en) 2012-04-02 2018-03-06 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2013155481A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Improved cellodextrin transport and mixed sugar fermentation
EP2841570B1 (en) 2012-04-23 2017-12-20 Novozymes A/S Polypeptides having glucuronyl esterase activity and polynucleotides encoding same
WO2013160248A2 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
EP2841567B1 (en) 2012-04-27 2017-07-26 Novozymes, Inc. Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
US9458441B2 (en) 2012-05-07 2016-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
US9487767B2 (en) 2012-05-31 2016-11-08 Novozymes A/S of Krogshoejvej 36 Selection in fungi
US9512413B2 (en) 2012-05-31 2016-12-06 Novozymes A/S Polypeptides having organophosphorous hydrolase activity
WO2013189972A2 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
CN104471048B (zh) 2012-07-12 2018-11-16 诺维信公司 具有脂肪酶活性的多肽及编码它的多核苷酸
BR112015003257A2 (pt) 2012-08-17 2017-11-14 Novozymes As variante de asparaginase, métodos para produção de um produto alimentar a partir de um material alimentar, para produção de uma variante de asparaginase e para obtenção de uma variante de asparaginase, polinucleotídeo isolado, constructo de ácido nucleico, vetor de expressão, e, célula hospedeira
CN104603269A (zh) 2012-08-17 2015-05-06 诺维信公司 用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法及其应用
CN104603266B (zh) 2012-08-22 2017-11-10 诺维信公司 来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶
EP2888361A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 Novozymes A/S Metalloprotease from exiguobacterium
DK2893012T3 (en) 2012-09-05 2018-12-03 Novozymes As Polypeptides with protease activity
WO2014092832A2 (en) 2012-09-19 2014-06-19 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
CN104755617B (zh) 2012-10-08 2019-01-01 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN104718286B (zh) 2012-10-12 2018-10-30 诺维信公司 具有过氧合酶活性的多肽
WO2014056920A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
WO2014056916A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
WO2014056919A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
EP2906686B1 (en) 2012-10-12 2018-08-29 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
CN104704115B (zh) 2012-10-12 2018-11-02 诺维信公司 具有过氧合酶活性的多肽
WO2014056921A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
WO2014066141A2 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2014076232A2 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Novozymes A/S Isopropanol production by recombinant hosts using an hmg-coa intermediate
US20150307871A1 (en) 2012-12-07 2015-10-29 Novozymes A/S Method for generating site-specific mutations in filamentous fungi
BR112015013399B1 (pt) 2012-12-11 2023-02-14 Novozymes A/S Uso de polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase c e método para redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em um óleo comestível
CN104870639A (zh) 2012-12-14 2015-08-26 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN104854238B (zh) 2012-12-17 2021-04-27 诺维信公司 α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸
US20150337280A1 (en) 2012-12-19 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
MX363360B (es) 2012-12-21 2019-03-21 Novozymes As Polipéptidos que poseen actividad proteasa y polinucleótidos que los codifican.
BR112015014624A2 (pt) 2012-12-24 2017-10-10 Novozymes As polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, método para tratamento de têxtil
CN112458069A (zh) 2013-01-03 2021-03-09 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
WO2014122161A2 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity
CN105164254B (zh) 2013-03-08 2019-06-28 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
EP2976416B1 (en) 2013-03-21 2018-05-16 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
BR112015024119B1 (pt) 2013-03-21 2022-12-27 Novozymes A/S Polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase a e polinucleotídeos que os codificam
DK2986701T3 (en) 2013-04-18 2019-01-14 Novozymes As Polypeptides with protease activity and polynucleotides encoding them
US10550374B2 (en) 2013-04-30 2020-02-04 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
WO2014177541A2 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
WO2014182990A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN105209612A (zh) 2013-05-14 2015-12-30 诺维信公司 洗涤剂组合物
CN105209613A (zh) 2013-05-17 2015-12-30 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
CN105264058B (zh) 2013-06-06 2022-03-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
RU2015156280A (ru) 2013-07-04 2017-08-09 Новозимс А/С Полипептиды, обладающие эффектом против переосаждения, и полинуклеотиды, кодирующие их
WO2015004102A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
CA2915336C (en) 2013-07-17 2024-03-12 Novozymes A/S Pullulanase chimeras and polynucleotides encoding same
WO2015022429A1 (en) 2013-08-15 2015-02-19 Novozymes A/S Polypeptides having beta-1,3-galactanase activity and polynucleotides encoding same
WO2015059133A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Novozymes A/S Cellobiose dehydrogenase variants and polynucleotides encoding same
CN111851077A (zh) 2013-10-25 2020-10-30 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
EP2876156A1 (en) 2013-11-26 2015-05-27 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives New enzymes and method for preparing hydroxylated L-lysine or L-ornithine and analogs thereof
US20170166939A1 (en) 2013-11-26 2017-06-15 Novozymes A/S Enzyme Compositions and Uses Thereof
CN105793418A (zh) 2013-11-29 2016-07-20 诺维信公司 过氧合酶变体
PT3080254T (pt) 2013-12-11 2024-07-30 Novozymes As Variantes cutinase e polinucleótidos que codificam o mesmo
EP2886656A1 (en) 2013-12-18 2015-06-24 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives New enzyme and method for preparing 4-hydroxyl benzyl alcohol and derivatives thereof
EP3083954B1 (en) 2013-12-20 2018-09-26 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CN105960457B (zh) 2014-01-22 2021-09-03 诺维信公司 普鲁兰酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3113609B1 (en) 2014-03-05 2019-07-31 Novozymes A/S Methods for improving post-harvest properties of agricultural crops
US20170073890A1 (en) 2014-03-05 2017-03-16 Novozymes A/S Compositions and Methods for Functionalizing and Linking Materials
US20160333292A1 (en) 2014-03-05 2016-11-17 Novozymes A/S Compositions and Methods for Improving Properties of Cellulosic Textile Materials with Xyloglucan Endotransglycosylase
MX2016011413A (es) 2014-03-05 2017-02-28 Novozymes As Formulaciones que comprenden xiloglucano polimérico como portador para agentes agronómicamente beneficiosos.
EP3114219A1 (en) 2014-03-05 2017-01-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
EP3117001B1 (en) 2014-03-12 2019-02-20 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
CN106103708A (zh) 2014-04-01 2016-11-09 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
EP3129478B1 (en) 2014-04-10 2019-03-27 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CA2943029C (en) 2014-04-11 2022-09-20 Novozymes A/S Detergent composition
US10030215B2 (en) 2014-04-15 2018-07-24 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
EP3760713A3 (en) 2014-05-27 2021-03-31 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
EP3878957A1 (en) 2014-05-27 2021-09-15 Novozymes A/S Methods for producing lipases
BR112016027884B1 (pt) 2014-05-30 2023-05-02 Novozymes A/S Variante de uma xilanase da família 11 de gh genitora, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos de produção de uma variante de xilanase da família 11 de gh e de degradação de um material contendo xilana
CN106488982A (zh) 2014-06-06 2017-03-08 诺维信公司 酶组合物及其用途
WO2015200659A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novozymes A/S Xylanase variants and polynucleotides encoding same
CN106795504A (zh) 2014-08-20 2017-05-31 诺维信公司 木葡聚糖内糖基转移酶变体以及编码其的多核苷酸
BR122023022768A2 (pt) 2014-09-05 2023-12-12 Novozymes A/S Variante de celobiohidrolase, polipeptídeo híbrido tendo atividade celulolítica, composição, método de produção de uma variante de celobiohidrolase ou de um polipeptídeo híbrido, método de degradação de um material celulósico e método de produção de um produto de fermentação
AR102419A1 (es) 2014-10-23 2017-03-01 Novozymes As Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que las codifican
EP3221447A1 (en) 2014-11-20 2017-09-27 Novozymes A/S Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same
WO2016090059A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Novozymes A/S Laccase variants and polynucleotides encoding same
US10457921B2 (en) 2014-12-05 2019-10-29 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN107002049A (zh) 2014-12-16 2017-08-01 诺维信公司 具有n‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽
US20170362613A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 Novozymes A/S Recombinant Host Cells For The Production Of 3-Hydroxypropionic Acid
AU2015366380B2 (en) 2014-12-19 2021-07-22 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having xylanase activity and polypeptides having arabinofuranosidase activity
EP3262165B1 (en) 2015-02-24 2020-06-03 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN107406821B (zh) 2015-02-27 2021-10-15 诺维信公司 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
US20180355404A1 (en) 2015-04-07 2018-12-13 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having lipase activity
US20180073017A1 (en) 2015-04-07 2018-03-15 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having enhanced activity
US10519520B2 (en) 2015-05-27 2019-12-31 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP3310908B1 (en) 2015-06-16 2020-08-05 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
US10676727B2 (en) 2015-06-18 2020-06-09 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products
US10392742B2 (en) 2015-06-26 2019-08-27 Novozymes A/S Biofinishing system
WO2016207373A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
AU2016282355B2 (en) 2015-06-26 2020-04-09 Novozymes A/S Method for producing a coffee extract
EP3929285A3 (en) 2015-07-01 2022-05-25 Novozymes A/S Methods of reducing odor
US10945449B2 (en) 2015-07-02 2021-03-16 Novozymes A/S Animal feed compositions and uses thereof
EP3950939A3 (en) 2015-07-06 2022-06-08 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2017019490A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Novozymes Inc. Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
EP3341475A1 (en) 2015-08-24 2018-07-04 Novozymes A/S Beta-alanine aminotransferases for the production of 3-hydroxypropionic acid
CN108350443B (zh) 2015-09-17 2022-06-28 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
EP3353195B1 (en) 2015-09-22 2021-11-10 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN116064474A (zh) 2015-10-07 2023-05-05 诺维信公司 多肽
EP4324919A3 (en) 2015-10-14 2024-05-29 Novozymes A/S Polypeptide variants
US10494685B2 (en) 2015-10-14 2019-12-03 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
EP3362558A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
WO2017075426A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Novozymes A/S Polynucleotide constructs for in vitro and in vivo expression
CN108473974A (zh) 2015-11-24 2018-08-31 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
US10870838B2 (en) 2015-12-01 2020-12-22 Novozymes A/S Methods for producing lipases
CA3006403A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Institut National De La Recherche Agronomique New peptides having antimicrobial activity and new enzyme capable of converting l-configured residue in d-configured amino acid in a peptide
WO2017112847A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Albumedix A/S Improved protein expression strains
US11407986B2 (en) 2015-12-30 2022-08-09 Novozymes A/S Enzyme variants and polynucleotides encoding same
EP3408386A1 (en) 2016-01-29 2018-12-05 Novozymes A/S Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
US11685911B2 (en) 2016-02-16 2023-06-27 Monaghan Mushroom S Group Fungal polypeptides having lysozyme activity
US20190048413A1 (en) 2016-02-23 2019-02-14 Novozymes A/S Improved next-generation sequencing
EP4410974A2 (en) 2016-03-02 2024-08-07 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP3433358B1 (en) 2016-03-24 2022-07-06 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US20190161786A1 (en) 2016-04-07 2019-05-30 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having protease activity
WO2017186943A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3452497B1 (en) 2016-05-03 2021-02-17 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding the same
MX2018013556A (es) 2016-05-09 2019-03-14 Novozymes As Polipeptidos variantes con rendimiento mejorado y uso de los mismos.
EP3246401A1 (en) 2016-05-20 2017-11-22 Commissariat À L'Énergie Atomique Et Aux Énergies Alternatives New fatty acid decarboxylase and its uses
MX2018014434A (es) 2016-05-24 2019-03-28 Novozymes As Composiciones que comprenden polipeptidos que tienen actividad galactanasa y polipeptidos que tienen actividad beta-galactosidasa.
US10808268B2 (en) 2016-05-24 2020-10-20 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-galactosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2017202997A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having galactanase activity and polypeptides having beta-galactosidase activity
US11058129B2 (en) 2016-05-24 2021-07-13 Novozymes A/S Animal feed additives
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2017211803A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Novozymes A/S Co-expression of heterologous polypeptides to increase yield
EP3263698B1 (en) 2016-06-30 2021-03-24 Fornia BioSolutions, Inc. Novel phytases and uses thereof
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
CA3028535A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Novozymes A/S Pectate lyase variants and polynucleotides encoding same
CN109312353A (zh) 2016-07-06 2019-02-05 诺维信公司 通过crispr-抑制来改善微生物
AU2017294067A1 (en) 2016-07-08 2019-01-17 Novozymes A/S Xylanase variants and polynucleotides encoding same
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
BR112019000125A2 (pt) 2016-07-08 2019-07-09 Novozymes As grânulo, polipeptídeo isolado, composição, aditivo de ração animal, ração animal peletizada, métodos de aprimoramento de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, de preparação de uma ração animal, para aprimorar o valor nutricional de uma ração animal, de solubilização de xilana a partir do material à base de planta e de produção do polipeptídeo, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, uso do grânulo
WO2018011277A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Novozymes A/S Bacillus cibi dnase variants
CN109790525A (zh) 2016-07-18 2019-05-21 诺维信公司 脂肪酶变体、编码其的多核苷酸及其用途
CN109477083B (zh) 2016-07-20 2023-06-06 诺维信公司 热稳定性宏基因组碳酸酐酶及其用途
EP3487996B1 (en) 2016-07-21 2024-04-10 Novozymes A/S Serine protease variants and polynucleotides encoding same
EP3272767B1 (en) 2016-07-21 2020-11-25 Fornia BioSolutions, Inc. G24 glucoamylase compositions and methods
WO2018017105A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Fornia Biosolutions, Inc. G24 glucoamylase compositions and methods
CA3029479A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Novozymes A/S Serine protease variants and polynucleotides encoding same
EP3487873B1 (en) 2016-07-22 2021-03-31 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US9598680B1 (en) 2016-08-05 2017-03-21 Fornia Biosolutions, Inc. G16 glucoamylase compositions and methods
AU2017317563B8 (en) 2016-08-24 2023-03-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent compositions comprising xanthan lyase variants I
CA3031609A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Novozymes A/S Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
KR102507692B1 (ko) 2016-08-24 2023-03-09 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 Gh9 엔도글루카나제 변이체 i을 포함하는 세제 조성물
CN109844110B (zh) 2016-08-24 2023-06-06 诺维信公司 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
WO2018050666A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Novozymes A/S Genomic integration of dna fragments in fungal host cells
EP3532592A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Novozymes A/S Detergent compositions
CN110100011A (zh) 2016-11-21 2019-08-06 诺维信公司 Dna分子的酵母细胞提取物辅助构建
WO2018167153A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cell
WO2018172155A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cells
US11149233B2 (en) 2017-03-31 2021-10-19 Novozymes A/S Polypeptides having RNase activity
CN110651041A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 诺维信公司 具有dna酶活性的多肽
EP3601549A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
EP3607039A1 (en) 2017-04-04 2020-02-12 Novozymes A/S Polypeptides
EP3607040A1 (en) 2017-04-04 2020-02-12 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
WO2018185181A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Glycosyl hydrolases
CA3057896A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
EP3619304A1 (en) 2017-05-05 2020-03-11 Novozymes A/S Compositions comprising lipase and sulfite
EP3401385A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain
WO2018206535A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Novozymes A/S Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same
BR112019027397A2 (pt) 2017-06-20 2020-07-14 Albumedix Ltd cepas de expressão de proteína melhoradas
WO2018234465A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novozymes A/S XYLANASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME
BR112019027861A2 (pt) 2017-06-28 2020-09-15 Novozymes A/S polipeptídeo, composição, formulação de caldo integral ou composição de cultura celular, polinucleotídeo, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, e, processo de produção de um produto de fermentação.
ES2971299T3 (es) 2017-07-24 2024-06-04 Novozymes As GH5 y GH30 en la molienda húmeda
US10081800B1 (en) 2017-08-03 2018-09-25 Fornia Biosolutions, Inc. Lactonase enzymes and methods of using same
BR112020002115A2 (pt) 2017-08-08 2020-08-11 Novozymes A/S polipeptídeo variante de trealase, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, método de produção de uma variante de trealase, e, processo de produção de um produto de fermentação
CN111344404A (zh) 2017-08-24 2020-06-26 诺维信公司 黄原胶裂解酶变体以及编码其的多核苷酸
WO2019038060A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Henkel Ag & Co. Kgaa DETERGENT COMPOSITION COMPRISING XANTHANE LYASE II VARIANTS
EP3673056A1 (en) 2017-08-24 2020-07-01 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising gh9 endoglucanase variants ii
US11525128B2 (en) 2017-08-24 2022-12-13 Novozymes A/S GH9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
JP7515396B2 (ja) 2017-09-01 2024-07-12 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む動物用飼料添加物及びその使用
AU2018322865B2 (en) 2017-09-01 2023-11-09 Novozymes A/S Animal feed additives comprising polypeptide having protease activity and uses thereof
MX2020003779A (es) 2017-09-27 2020-08-03 Procter & Gamble Composiciones detergentes que comprenden lipasas.
CN117448299A (zh) 2017-09-27 2024-01-26 诺维信公司 脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物
CN111417725A (zh) 2017-10-02 2020-07-14 诺维信公司 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
EP3692148A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
EP3701017A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Novozymes A/S Dnase variants
HUE057471T2 (hu) 2017-10-27 2022-05-28 Procter & Gamble Polipeptid-variánsokat tartalmazó mosószerkészítmények
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
WO2019092042A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
WO2019096903A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Novozymes A/S New galactanases (ec 3.2.1.89) for use in soy processing
EP3485734A1 (en) 2017-11-21 2019-05-22 Technische Universität München Method for preparing food products comprising rye
EP3488854A1 (en) 2017-11-22 2019-05-29 Technische Universität München Method for preparing xyloglucan-oligosaccharides
EP3488860B1 (en) 2017-11-28 2022-01-19 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Chimeric protein with high antimicrobial activity
EP3720954A1 (en) 2017-12-04 2020-10-14 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
EP3502242A1 (en) 2017-12-20 2019-06-26 Technische Universität München New xylanase with improved thermostability and increased enzyme activity on arabinoxylan
US20210017544A1 (en) 2017-12-22 2021-01-21 Novozymes A/S Counter-Selection by Inhibition of Conditionally Essential Genes
WO2019154954A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
CN111868239A (zh) 2018-02-08 2020-10-30 诺维信公司 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物
CN112004931A (zh) 2018-03-26 2020-11-27 诺维信公司 真菌伴侣蛋白
CA3096900A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
CN118530973A (zh) 2018-04-19 2024-08-23 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
WO2019201783A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
CN108949726B (zh) * 2018-06-15 2021-11-16 河南农业大学 一种改组纤维素酶基因及其表达载体和应用
WO2020002575A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Novozymes A/S Polypeptides having pectin lyase activity and polynucleotides encoding same
US20210301285A1 (en) 2018-08-02 2021-09-30 Novozymes A/S Preparation of Combinatorial Libraries of DNA Constructs
US11473076B2 (en) 2018-08-31 2022-10-18 Novozymes A/S Animal feed additives and compositions comprising an S8 serine protease
WO2020070199A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same
EP3864136A1 (en) 2018-10-09 2021-08-18 Novozymes A/S Modified filamentous fungal host cell
US20220010305A1 (en) 2018-10-31 2022-01-13 Novozymes A/S Genome Editing by Guided Endonuclease and Single-stranded Oligonucleotide
US20220025423A1 (en) 2018-11-28 2022-01-27 Novozymes A/S Modified Filamentous Fungal Host Cells
WO2020112911A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cells
EP3894551A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3894565A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Novozymes A/S Methods for increasing the productivity of a filamentous fungal cell in the production of a polypeptide
US11535836B2 (en) 2018-12-21 2022-12-27 Fornia Biosolutions, Inc. Variant G6P G7P glucoamylase compositions and methods
FI3898985T3 (fi) 2018-12-21 2023-05-05 Novozymes As Proteiinien tandemekspressio
WO2020127796A2 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
WO2020144371A1 (en) 2019-01-11 2020-07-16 River Stone Biotech Aps Recombinant host cells with improved production of l-dopa, dopamine, (s)-norcoclaurine or derivatives thereof.
CN111699252B (zh) 2019-01-16 2024-04-30 福尼亚生物处理股份有限公司 内切葡聚糖酶组合物和方法
WO2020173817A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Novozymes A/S Calcite binding proteins
EP3737751A1 (en) 2019-03-21 2020-11-18 Fornia BioSolutions, Inc. Additional phytase variants and methods
US20220169953A1 (en) 2019-04-03 2022-06-02 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
CN113874499A (zh) 2019-04-10 2021-12-31 诺维信公司 多肽变体
WO2020208056A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novozymes A/S Stabilized glycoside hydrolase variants
US20220275354A1 (en) 2019-05-15 2022-09-01 Novozymes A/S TEMPERATURE-SENSITIVE RNA- Guided Endonuclease
CA3141928A1 (en) 2019-05-27 2020-12-03 Octarine Bio Ivs Genetically modified host cells producing glycosylated cannabinoids
WO2020260061A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Novozymes A/S Counter-selection by inhibition of conditionally essential genes
CN114207123A (zh) 2019-07-02 2022-03-18 诺维信公司 脂肪酶变体及其组合物
EP4004211A1 (en) 2019-07-25 2022-06-01 Novozymes A/S Filamentous fungal expression system
CN114555777A (zh) 2019-07-26 2022-05-27 诺维信公司 经修饰的丝状真菌宿主细胞
US20220331377A1 (en) 2019-09-09 2022-10-20 River Stone Biotech Isg Aps Delivery vehicle for in situ delivering of pharmaceutical agents
CA3152952A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same
US20220340843A1 (en) 2019-10-03 2022-10-27 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
WO2021122867A2 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Novozymes A/S Xylanase variants and polynucleotides encoding same
WO2021123307A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
BR112022014573A2 (pt) 2020-01-24 2022-10-04 Novozymes As Mutantes de uma célula fúngica filamentosa com produtividade aumentada na produção de um polipeptídeo
EP4097226A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2021152123A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
BR112022015805A2 (pt) 2020-02-10 2022-10-11 Novozymes As Variante de alfa-amilase de uma alfa-amilase genitora, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, uso de uma alfa-amilase variante, processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido e de um produto de xarope, e, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta
WO2021163015A1 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Novozymes A/S Process for producing ethanol from raw starch using alpha-amylase variants
WO2021163030A2 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
EP4110909A1 (en) 2020-02-26 2023-01-04 Novozymes A/S Polypeptide variants
CN115427560A (zh) 2020-03-12 2022-12-02 诺维信公司 使用无催化活性rna指导的内切核酸酶的crispr-aid
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
MX2022011948A (es) 2020-04-08 2022-10-21 Novozymes As Variantes de modulos de union a carbohidratos.
EP4139431A1 (en) 2020-04-21 2023-03-01 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
JP2023538740A (ja) 2020-08-25 2023-09-11 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ファミリー４４キシログルカナーゼの変異体
US20230323330A1 (en) 2020-08-28 2023-10-12 Novozymes A/S Polyester degrading protease variants
EP4229189A1 (en) 2020-10-13 2023-08-23 Novozymes A/S Glycosyltransferase variants for improved protein production
JP2023547450A (ja) 2020-10-29 2023-11-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼ変異体及びそのようなリパーゼ変異体を含む組成物
CN116583534A (zh) 2020-11-02 2023-08-11 诺维信公司 前导肽和编码其的多核苷酸
BR112023008361A2 (pt) 2020-11-02 2023-12-12 Novozymes As Variantes de glucoamilase e polinucleotídeos codificando as mesmas
US12071644B2 (en) 2020-12-17 2024-08-27 Fornia Biosolutions, Inc. Xylanase variants and methods
US11987824B2 (en) 2020-12-22 2024-05-21 Fornia Biosolutions, Inc. Additional endoglucanase variants and methods
AR124921A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Novozymes As Polipéptidos inactivos que contienen hemo
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2022194673A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Novozymes A/S Dnase variants
MX2023005793A (es) 2021-03-15 2023-05-29 Procter & Gamble Composiciones de limpieza que contienen variantes de polipeptido.
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
AU2022270929A1 (en) 2021-05-07 2023-10-19 River Stone Biotech Aps Glycosylated opioids
EP4347813A1 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Novozymes A/S Transcriptional regulators and polynucleotides encoding the same
WO2022268885A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
LU501894B1 (en) 2022-04-21 2023-10-23 Acies Bio D O O Novel polypeptides having lactate dehydrogenase activity
WO2024100063A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 River Stone Biotech Aps Genetically modified benzylisoquinoline alkaloid-producing host cells with modified efflux transporter gene expression

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4288627A (en) 1980-02-12 1981-09-08 Phillips Petroleum Company Oxidation of thiols employing cobalt molybdate/triethylamine catalyst
DE3688920T4 (de) 1985-07-03 1995-08-31 Genencor Int Hybride Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung.
US4894331A (en) 1985-09-27 1990-01-16 Amgen Inc. Partial marker cassette mutagenesis of xylose isomerase
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
DK639689D0 (da) 1989-12-18 1989-12-18 Novo Nordisk As Indfoering af dna i celler
ES2068586T5 (es) 1990-05-09 2004-12-01 Novozymes A/S Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
KR930702514A (ko) 1990-09-13 1993-09-09 안네 제케르 리파제 변체
GB9114734D0 (en) 1991-07-09 1991-08-28 Univ London Process for modifying proteins
DE69332030T2 (de) 1992-12-10 2002-10-02 Dsm N.V., Heerlen Herstellung von heterologen proteinen in filamentösen fungi
DK52293D0 (zh) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JPH07115976A (ja) * 1993-10-27 1995-05-09 Oozeki Kk アスペルギルス属糸状菌の新規プロモーター
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
CN1192108C (zh) 1994-06-03 2005-03-09 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 纯化的毁丝霉属漆酶及编码该酶的核酸
AU2733895A (en) 1994-06-17 1996-01-15 Novo Nordisk A/S A fungus wherein the area gene has been modified and an area gene from aspergillus oryzae
EP0777737B1 (en) 1994-06-30 2005-05-04 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
US5861280A (en) 1995-03-20 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Host cell expressing reduced levels of a metalloprotease and methods using the host cell in protein production
JPH08275780A (ja) * 1995-04-07 1996-10-22 Meiji Milk Prod Co Ltd β−ガラクトシダーゼ遺伝子
JPH0970292A (ja) * 1995-07-04 1997-03-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 食品微生物染色体へ外来遺伝子を導入する方法、外来遺伝 子導入用ベクターおよび外来遺伝子が導入された形質転換 体
AU721122B2 (en) 1995-07-14 2000-06-22 Novo Nordisk A/S Haloperoxidases from curvularia verruculosa and nucleic acids encoding same
DE69633825T2 (de) 1995-07-14 2005-11-10 Novozymes A/S Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität
WO1997007206A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Okkels, Jens, Sigurd Method for preparing polypeptide variants
ATE307828T1 (de) * 1996-07-05 2005-11-15 Novozymes As Alpha-amylase transkriptionsfaktor
US5958727A (en) 1996-09-13 1999-09-28 Novo Nordisk Biotech, Inc Methods for modifying the production of a polypeptide
JP4091119B2 (ja) 1996-09-19 2008-05-28 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規な宿主細胞およびタンパク質生産方法
AU739641B2 (en) * 1996-12-05 2001-10-18 Astra Aktiebolag Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori and vaccine compositions thereof
CA2284253A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Jesper Vind An in vitro method for construction of a dna library
US6153410A (en) * 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
ATE505543T1 (de) * 1997-04-16 2011-04-15 Millennium Pharm Inc Zusammensetzung, umfassend einen antikörper, der selektiv an ein cysteinreiches sekretiertes protein (crsp) bindet

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734079A (zh) * 2006-07-19 2016-07-06 孟山都技术有限公司 提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用
CN103068988A (zh) * 2010-06-25 2013-04-24 诺维信公司 具有启动子活性的多核苷酸
CN102534811A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 深圳华大基因科技有限公司 一种dna文库及其制备方法、一种dna测序方法和装置
CN108779155A (zh) * 2016-04-19 2018-11-09 诺维信公司 RlmA灭活的丝状真菌宿主细胞
CN108893486A (zh) * 2018-08-01 2018-11-27 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用
CN110551643A (zh) * 2019-07-19 2019-12-10 天津科技大学 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
CN114875046A (zh) * 2022-05-30 2022-08-09 福州大学 一种丝状真菌复制子
CN114875046B (zh) * 2022-05-30 2023-07-18 福州大学 一种丝状真菌复制子

Also Published As

Publication number Publication date
CN1197965C (zh) 2005-04-20
CA2344619C (en) 2012-01-03
EP1124949A1 (en) 2001-08-22
EP1124949B1 (en) 2006-07-12
DK1124949T3 (da) 2006-11-06
JP2002528076A (ja) 2002-09-03
WO2000024883A1 (en) 2000-05-04
ATE332968T1 (de) 2006-08-15
CA2344619A1 (en) 2000-05-04
AU6188599A (en) 2000-05-15
JP5043254B2 (ja) 2012-10-10
DE69932345D1 (de) 2006-08-24
DE69932345T2 (de) 2007-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1324402A (zh) 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库
CN105586355B (zh) 在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法
EP0758020B1 (en) amdS gene from Aspergillus niger coding for an acetamidase
CN101128581B (zh) 突变aox1启动子
CN1230986A (zh) 新的宿主细胞和生产蛋白质的方法
CN1307642A (zh) 通过改变基因拷贝数制备多肽的方法
CN100344765C (zh) 用于调节转录的dna序列
CN1151762A (zh) 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子
CN1367838A (zh) 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
CN101679993A (zh) 适于选择产生目标多肽的文库克隆的表达克隆方法
CN1922314A (zh) 真菌细胞壁降解酶
CN1179178A (zh) 表达降低水平的金属蛋白酶的宿主细胞和在蛋白质产生中使用该宿主细胞的方法
CN1875029A (zh) 蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达
JP2002526112A (ja) ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子
CN1253575C (zh) 用共有翻译起始区序列制备多肽的方法
CN1204370A (zh) 其中areA、pepC和/或pepE基因已被灭活的真菌
CN1341149A (zh) 草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞
CN1380905A (zh) 丝状真菌中dna表达文库的高通量筛选
CN1125466A (zh) 生产酶的方法
CN1342204A (zh) 用于在真菌细胞中生产多肽的方法
CN1284998A (zh) 多拷贝基因在霉菌中的定点整合方法
EP4347813A1 (en) Transcriptional regulators and polynucleotides encoding the same
IE61984B1 (en) Penicillium transformants and methods for their production
EP3775222B1 (en) Fungal chaperone proteins
US6767701B1 (en) Methods of constructing and screening a DNA library of interest in filamentous fungal cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050420

Termination date: 20171013