CN102286524B - 一种植物转化载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了本发明提供一种植物转化载体及其构建方法和应用，该载体用红色荧光蛋白UPMT和抗性筛选alad基因作为转染植物的报告基因及选择标记。两者功能类似并优于如抗生素和绿色荧光蛋白融合标记在水稻叶绿体转化中既用于筛选，又用于亚细胞器定位。由此，这两种基因作为转基因植物的筛选标记，不仅可以指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位，也可以促进植物光合作用效率及营养物质累积。在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用背景，有望发展成为植物转化中主导选择标记系统。

Description

一种植物转化载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学及细胞生物学领域，尤其涉及一种可用于植物（亚）细胞定位的靶基因特异性表达，具有红色荧光蛋白示踪及新型安全的抗性筛选标记的植物转化载体及其构建方法和应用。
背景技术  
目前，用于转染及转化植物研究和谷类作物生长发育的大约55个标记基因已经被证实其有效性，安全性及科学研究和商业化应用。广泛应用于转基因植物中的标记基因分为两种：一种筛选标记；另一种方法是利用标记基因消除体系在细胞内剔除筛选标记，但是这种技术较为复杂，需要构建新的转基因载体，转基因作物繁殖2-3代才能剔除筛选标记。虽然人们设计利用了许多功能各异的标记基因，用于植物转化研究并取得了巨大进步，但也发现了这些标记基因的缺点与不足。人们担心抗生素基因在肠道转染细菌，影响抗生素治疗的有效性，给人类健康带来潜在风险。一些国家如德国已禁止种植含有抗生素基因的转基因农作物。同时有些专家认为(抗除草剂基因）可能逃逸到杂草中，造成生态灾难。此外，它们会影响转化细胞再生和多次转化。目前的解决办法有：对筛选标记风险评估，这个过程既昂贵又繁琐，且评估的安全结果不被公众所接受，迫切需要研究开发新的更加高效的标记基因或筛选体系。
标记基因依据筛选方法不同分为：选择标记基因（selectable marker gene）和报告基因（reporter gene）。前者通常指抗生素和除草剂抗性基因，后者报告基因指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
传统绿色荧光蛋白GFP在显微镜观察下易淬灭，导致信噪比大，信号定位不清晰，本身激发光及发射光波长长，产热大，易造成所观察的细胞及组织的损伤。
选择标记基因依据非转化细胞在选择培养基上的生长状况分为两类：正向和负向选择标记基因。前者定义为不仅具有选择作用且可以促进转染组织的生长，而后者会导致被转染组织的死亡。抗生素抗性基因、抗除草剂抗性基因和能接触化合物毒性（或胁迫）的基因均属于负向选择体系。常见的正向选择标记体系如下：激素代谢如异戊烯基转移酶基因ipt、β-葡糖糖苷酸酶基因gus；糖类代谢如木糖异构酶基因xylA、磷酸甘露糖异构酶编码基因pmi；氨基酸代谢如天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧基合酶编码基因dhps；嘧啶代谢如大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；解除化合物毒性（或胁迫）基因主要包括甜菜碱醛脱氢酶基因badh、有机汞裂解酶基因基因merB和汞离子还原酶基因merA、谷氨酸-1-半醛转氨酶基因gsat；叶绿素合成相关酶如原卟啉原氧化酶编码基因ppox，能产生某些荧光物质的蛋白酶类基因如荧光素酶编码基因luc和绿色荧光蛋白编码基因gfp等，这些筛选基因仍有不足，如在单子叶和双子叶植物中显示筛选效果的差异性，或筛选试剂对植物生长发育有毒性，或某些基因来源于病原细菌等，具有潜在的风险，转基因植物在全世界范围内一些国家仍然明令禁止种植，开发新的安全高效的选择标记基因对于转基因植物的推广和应用具有举足轻重的地位。
高等植物的四吡咯分子代谢是一种多途径分支代谢过程，如图1所示主要是4个分支代谢途径产生4类四吡咯分子：叶绿素（chlorophyll）、血红素（heme）、维生素B12（Vitamin B12）和西罗血红素（siroheme）。它们作为酶或蛋白的辅基，在植物生命活动中起重要作用。抑制某些酶的表达会导致前3种卟啉化合物不能合成，导致细胞死亡。因此，它们合成的相关酶如谷氨酸-1-半醛转氨酶作为安全的筛选标记，Gough等将光合细菌编码的该酶基因作为选择标记转化烟草，用3-氨基-2,3-二氨基苯甲酸作为筛选试剂，非转基因后代显示白化苗或死亡，而转基因植株显示绿色，Rosellini等将此基因作为筛选标记转化苜蓿，转化频率比卡那霉素标记的频率高。Rando等发现3-氨基-2,3-二氨基苯甲酸毒害人类神经，抑制人类神经递质的合成，作为筛选试剂的专一性差。原卟啉原IX氧化酶编码基因是另外一个筛选标记，Li等利用拟南芥该酶的突变体编码基因作为筛选标记转化玉米，用二苯醚类除草剂筛选，转基因植株呈现绿色，非转基因植株呈现白化现象，抗除草剂基因的危害前文已有叙述，二苯醚类除草剂已属于淘汰产品，原因是它们在自然界不易降解，数个研究小组发现二苯醚类除草剂毒性很大，导致人类罹患恶性肿瘤。
因此，目前迫切需要发展既可作为转基因植物的来源安全、高效的筛选标记替代目前具有争议的标记基因如抗除草剂标记基因，也可作为指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位的报告基因替代传统的绿色荧光蛋白基因gfp、红色荧光蛋白基因asred及荧光素酶基因luc等，但目前国际没有文献及专利报道。
发明内容
本发明提供一种植物转化载体及其构建方法和应用，该载体用红色荧光蛋白UPMT和抗性筛选alad基因作为转染植物的报告基因及选择标记。这两种基因作为转基因植物的筛选标记，不仅可以指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位，也可以促进植物光合作用效率。
为实现发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种植物转化载体，名称为pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP，所述载体用红色荧光蛋白UPMT和抗性筛选alad基因作为转染植物的报告基因及选择标记，红色荧光蛋白UPMT为能用于微生物、植物和动物稳定表达的尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA；抗性筛选alad基因为5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad。
所述植物转化载体的主要构件是复制起始原点－卡那霉素抗性基因－泛素启动子Ubi promoter-5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad－CaMV 35S启动子－尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。
该植物转化载体适用于农杆菌介导的植物转基因，包括原核复制起点ori、5'-3'依次含有pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因及农杆菌转染时能够进入植物细胞的T-DNA区域；MCS多克隆位点下游泛素启动子Ubi promoter，该启动子下游含有5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad；含有CaMV 35S组成型表达启动子，该启动子下游有尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。
所述植物转化载体的基础构架载体为pCAMBIA1301。
一种构建上述植物转化载体的方法，包括以下步骤，
1）报告基因cobA和抗性筛选标记alad基因的克隆；
2）将原始载体pCAMBIA1301载体经Nco I和BstE II酶切去除β-葡糖糖苷酸酶基因的线性化载体，与经Nco I和BstE II限制性酶消化所得编码尿卟啉原III甲基化酶UPMT的cobA基因片段按照分子生物学手段连接获得pC1301pUP载体；
3）将pC1301pUP载体经Xho I消化及去磷酸化与bar基因片段连接获得载体pC1301BpUP载体； 
4）原始载体pCAMBIA1301载体用限制性酶Xho I消化及去磷酸化反应后，回收纯化并自连接，获得无潮霉素抗性选择标记的载体pC131；
5) 将N端带有泛素启动子Ubi promoter、终止子Nos及含叶绿体导肽的alad基因片段插入经限制性酶EcoR I和Hind III消化的p131载体，获得载体pC1301Ubi-ZmpBtAD；
6）pC1301Ubi-ZmpBtAD载体经Nco I和BstE II酶切消化后，与经同样酶切的含cobA基因的片段连接构成pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体；
或者pC1301pUP载体经EcoR I和Hind III酶切消化后，与经同样酶切的含alad基因的片段连接构成双选择标记pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体。
一种上述植物转化载体在植物转化中的应用。所述的植物为转基因水稻或烟草。
本发明构建的载体可用于转基因植物如水稻、烟草及玉米的作物转化，申请者将筛选标记alad基因和报告基因cobA基因共转化植物，ALAD的催化产物在生物体内转化，促进UPMT底物生成并且提高了UPMT的产物积累。在四吡咯分子代谢中，UPMT的底物三甲基咕啉和西罗叶绿三酸易氧化并在紫外光下显示强烈的红色荧光。
一方面，alad基因和cobA基因两者均参与四吡咯分子代谢途径，ALAD与UPMT过表达，合成途径流向于维生素B12及西罗血红素合成方向。西罗血红素是硫同化及氮同化关键螯合酶和分解重金属盐相关酶的辅因子，能够促进植物本身营养物质的积累和对环境氮、硫的利用率，以及抵抗重金属盐如碲酸盐的能力。ALAD过表达不仅能促进下游叶绿素、F430、光敏色素发色团的合成，提高植物对光敏性、光合作用效率、抗逆性，也能促进植物对生物能源利用效果。如甜菜碱醛脱氢酶编码基因既能作为筛选标记，又能提高植物的抗逆性。
另一方面，目前已发现可以抵抗SA作用的ALAD来源有浑球红细菌和哺乳动物，如申请者选择牛科动物的ALAD，其作为抗性基因来源安全。SA存在于人体并不影响人类机体代谢，并且人体内ALAD对SA也具有抵抗作用。和传统的遗传转化选择方法相比，使用δ-氨基酮戊酸脱水酶（ALAD）作为抗性选择标记系统，非转化细胞中植物来源的ALAD受到琥珀酰丙酮的竞争性抑制作用，导致该酶不能正常与专一性底物ALA结合，叶绿素合成、血红素合成和Vitamin B12合成的分支途径受到抑制，因此导致非转化细胞不能正常生长和分化导致逐渐衰老及死亡，而非杀死。所以选择培养有利于转基因组织的生长和再生。该选择标记系统具有来源安全（动、植物）、选择试剂使用量少、选择过程简单、对选择试剂的敏感性高（μM级别），而且并不影响转化植物的代谢平衡，转基因植株生长旺盛，筛选效果显著等特点；UPMT来源于高等植物大麦，安全并避免对人类及环境造成毒害作用。
再者，申请者人工合成ALAD并通过定点突变克服密码子偏爱性问题，不仅提高了ALAD的表达量，同时也保证ALAD可以整合到高等植物体内；UPMT来源于大麦，与水稻同源性分析比对高达95%以上，所以可提高获得转基因植物的转化效率及整合率。传统GFP在显微镜观察下易淬灭，导致信噪比大，信号定位不清晰。红色荧光蛋白AsRed本身激发光及发射光波长长，产热大，易造成所观察的细胞及组织的损伤。而新型红色荧光蛋白UPMT可以克服这两个缺陷，过表达积累产物并稳定存在。产物在激发光波长354nm和发射光波长620nm下显示强烈的红色荧光，产热少，对细胞和组织伤害小。而高表达UPMT可以大量积累荧光产物，并且当积累量达到一定阈值时可见光下也可观察到。
总之，两者功能类似并优于如抗生素和绿色荧光蛋白融合标记在水稻叶绿体转化中既用于筛选，又用于亚细胞器定位。由此，这两种基因作为转基因植物的筛选标记，不仅可以指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位，也可以促进植物光合作用效率及营养物质累积。在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用背景，有望发展成为植物转化中主导选择标记系统。
附图说明
图1为高等植物四吡咯分子代谢途径。
图2为本发明中含泛素启动子及终止子pUC19Ubi载体的构建示意图。
图3为本发明中单报告基因cobA的pC1301pUP载体的构建示意图。
图4为本发明中含bar基因的pC1301BpUP载体构建示意图。
图5为本发明中单抗性标记alad基因的pC1301Ubi-ZmpBtAD载体的构建示意图。
图6为本发明中复合筛选标记pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体构建示意图。
图7为本发明中δ-氨基酮戊酸脱水酶ALAD及尿卟啉原III甲基化酶UPMT性质研究 。
图8为本发明中cobA和alad基因的构建植物表达载体图谱。
图9为本发明中水稻叶片对琥珀酰丙酮（SA）的抗性实验示意图。
图10为本发明中瞬时转化烟草荧光显微镜下观察亚细胞定位的示意图。
图11为本发明中cobA和alad基因的特异性检测引物进行PCR检测扩增的结果示意图。
具体实施方式
实施例1 具有红色荧光蛋白示踪和新型抗性筛选标记的pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体的构建。
一、报告基因cobA和抗性筛选标记alad基因的克隆
1. 克隆编码大麦（Hordeum vulgare）红色荧光蛋白UPMT的cobA基因
(1)大麦幼苗的生长培养
选取大小均一、颗粒饱满的大麦（皖麦1号）种子，用10%的过氧化氢表面消毒后，放置于内有润湿纱布的培养皿中培养。在培养过程中，周期性喷洒0.1%的硝酸盐溶液，28℃恒温培养，光照16h，大约生长一周后出苗。
(2) 大麦幼叶总RNA的提取   
待长至三叶期时，取新鲜叶片1-2g。采用Trizol法提取大麦幼叶总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳分析,测定OD260/OD280=1.8~2.0。
(3) RT-PCR扩增大麦cobA基因
采用Promega公司的AMV反转录试剂盒的使用说明，反转录反应体系：20μl反应体系1500U AMV反转录酶，2500U重组RNasin核糖核酸酶抑制剂，0.5 μg/μl Oligo(dT)15引物，25mM MgCl2，反转录1×缓冲液，10mM dNTPmix，5μg total RNA左右；循环程序：42℃，15min；95℃，5min；0-5℃放置5min，OD260/OD280=1.8~2.0。
以反转录的cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，克隆大小1152bp的cobA基因，引物设计时，上游引物不加限制性酶切位点，下游引物加限制性内切酶位点和保护碱基。其中，PCR扩增引物为：
Forward primer (BU1):         5’-CATGGCTCTCGCCCTTCGAGCGCCCCGCTTTC-3’;
Reverse primer (Hind III-BU2):  5’-TCTAAGCTTATACAGGAAAAATTGTTGGACTC-3’;
PCR扩增反应体系为：50μl反应体系5U Taq polymerase，0.2mmol/L dNTPs，1×Taq buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性2min，(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；) ×30，72℃最后延伸4 min。进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。所述大麦尿卟啉原III甲基化酶基因cobA在NCBI网站Genbank登录号：GU214797。
2. 人工合成牛科动物（Bos taurus）来源δ-氨基酮戊酸脱水酶ALAD的alad基因
根据NCBI的Blast工具比对不同来源的alad基因，获得牛科动物来源的alad基因。同时，为了提高在大肠杆菌重组表达体系中ALAD蛋白的表达量，根据密码子偏爱性，利用定点突变技术设计引物，采用重叠PCR（over-lapping PCR）方法，人工合成该基因，然后采用不同浓度SA筛选ALAD突变体，获得高耐SA的ALAD突变体
无模板PCR分段扩增该基因，克隆大小1010bp的alad基因，第二次突变引物设计时， 上下游引物均加入限制性酶切位点Nco I和Hind III。PCR扩增引物分别为：
Over-lapping PCR
A1                5’-ATGCACCCTCAGTCCGTCCTCCACTCCGGCTACTTCCACCCACTGCTC-3’
A2-A33            not mentioned
A34               5’-CTTACTCCTTCAGCCACTGGAGGAGCTGAGGGTGTAG-3’
First mutation
AL1               5’-CACCCCTCAGCTCCTCCAGTGGCTGAAG-3’
AL2               5’-TAGTAGGTGATGATGACATCGGCACCTG-3’
Second mutation
NcoI-ALA1         5’-TAGACCATGGGACACCCTCAGTCCGTCCTC-3’
HindIII-ALA2       5’-TAGAAGCTTACTCCTTCAGCCACTGGAGGAG-3’
PCR扩增反应体系为：50μl反应体系5U Pfu polymerase，0.2mmol/L dNTPs，1×Taq buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性2min，(94℃，30s；55℃，30s；72℃，500bp/min) ×30，72℃最后延伸4 min。进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。
二、含有cobA及alad基因的植物复合筛选标记表达载体pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP的构建
1. 含泛素启动子Ubi载体构建（图2）
泛素启动子（Ubiquitin promoter）及终止子（Nos）定向插入pUC19载体中。
2. 单报告基因cobA的pC1301pUP载体的构建（图3）
(1) 原始载体pCAMBIA1301载体经Nco I和BstE II限制性酶消化以去除β-葡糖糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因，回收纯化获得线性开环载体pC1301。
(2) 将含有叶绿体导肽编码尿卟啉原III甲基化酶(UPMT)的cobA基因片段经Nco I和BstE II限制性酶消化，回收纯化，与（1）步骤的纯化后的线性质粒用T4连接酶连接获得pC1301pUP载体。
3. 含bar基因的 pC1301BpUP载体构建（图4）
(1) 去除潮霉素抗性基因
将pC1301pUP载体用限制性酶Xho I消化及去磷酸化反应，回收纯化。
(2) 草丁膦抗性基因（bar）代替潮霉素抗性基因
将(1)步骤的纯化片段与大小为550bp的bar基因（抗除草剂基因）片段连接获得载体pC1301BpUP载体。
4. 单抗性标记alad基因的pC131Ubi-ZmpBtAD载体的构建（图5）
(1) 将原始载体pCAMBIA1301载体用限制性酶Xho I消化及去磷酸化反应后，回收纯化并自连接，获得无潮霉素抗性选择标记的载体pC131。
(2) 将N端带有泛素启动子（Ubi promoter）、终止子（Nos）及含叶绿体导肽的alad基因片段插入经限制性酶EcoR I和Hind III消化的p131载体，T4连接酶连接获得载体pC1301Ubi-ZmpBtAD，alad基因插入多克隆位点替代潮霉素抗性基因。  
5. 复合筛选标记pC131Ubi-ZmpBtAD-pUP载体构建（图6）
将pC1301Ubi-ZmpBtAD载体Nco I和BstE II限制性酶切消化，回收纯化。将同样酶切的含叶绿体导肽cobA基因片段与载体连接最终获得双选择标记pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体。
或者pC1301pUP载体EcoRI和Hind III限制性酶切消化，回收纯化。将含泛素启动子及叶绿体导肽（Ubi）的alad基因同样酶切片段与载体连接获得pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体。如图6所示，cobA和alad基因插入载体的情况及载体构建图谱。
上述内容所述植物表达载体构建方法可适用于任意一种可在水稻中表达外源基因的植物表达载体，如pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1300等，而申请者优先选用植物双元表达载体pCAMBIA1301便于载体构建，从而避免插入的目的基因本身含有的限制性酶切位点与载体重复。
表1.1 例如Nco I-BstE II双酶切反应及电泳体系
    质粒载体DNA        20.0μl
     Nco I (10U/μl)         1.0μl
    BstE II (10U/μl)         1.0μl
10×反应缓冲液         3.0μl
ddH2O  to          30.0μl
在37℃条件下保温3至6小时，然后用1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸， 0.01 mol/L EDTA）电泳缓冲液配置1.5%的琼脂糖凝胶，加入EB（溴化乙锭）至终浓度0.5μg/ml，电泳。
表 1.2  连接反应体系
DNA片段1               2.0μl
DNA片段2 (vector)        1.5μl 
    T4 Ligase (5 weiss U/μl)      0.5μl
T4 Ligase 缓冲液 (10×)     1.0μl     
在16℃条件下连接反应过夜。
实施例2 大肠杆菌转化子的获得
   E. coli DH5α/BL21（DE3）感受态细胞的制备：
(1) 将DH5α/BL21（DE3）的单菌落接入5mL不含抗生素的LB液体培养基（见表2.1）中，37℃，振荡过夜；
(2) 按1%（v/v）的量转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡至）OD600=0.3~0.6；
(3) 取50-100mL菌液分别加入两个无菌离心管中，在冰上放置30min；
(4) 在4℃、4500rpm离心10min，取上清液，将菌体悬浮于2mL预冷的0.1% CaCl2溶液悬，冰浴30min。
(5) 在4℃、4500rpm离心10min，弃上清液，将菌体悬浮于2mL预冷的0.1% CaCl2溶液，再加入300μl的无菌甘油，混匀。50-100μl分装于1.5mL EP管，于-70℃保存。
取实施例1中的连接产物（单选择标记载体及双元复合筛选标记植物表达载体）各5μl，加入刚好融化的大肠杆菌DH5α/BL21（DE3）感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30 min；42℃水浴热激1-2 min。加LB液体培养基至1mL于EP管中混匀菌体，37℃培养30-60 min。涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养培养16-24小时。挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。碱裂解法提取质粒，经PCR和酶切检测后，挑出阳性质粒，保存阳性菌株，即为转化子，该转化子可用于扩增和提取载体。将已验证阳性质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中，结果如图7所示，A为转入大肠杆菌重组表达体系中，cobA基因所编码的蛋白UPMT经0.4mM IPTG诱导及与同一代谢上游的alad基因编码蛋白ALAD（不加诱导剂）共表达都可以在紫外光下显示红色荧光，随时间改变呈不断积累的过程；B为改造后的UPMT蛋白可见光下根据颜色可区分菌斑是否为重组斑，可见光下红色的为重组菌斑；C所示为12h后UPMT及与ALAD共表达的荧光值；D所示UPMT的荧光扫描光谱，354和378nm各有一个吸收峰，荧光产物经检测主要是三甲基咕啉和西罗叶绿三酸。我们通过定点突变技术及随机突变技术，改造红色荧光蛋白UPMT的性质。目前已经筛选到在可见光下肉眼可见的红色菌落，这是高表达的UPMT积累产物的结果。UPMT的优点：荧光迟滞时间短，12小时后就可产生菌落荧光；荧光强度强，对比度高，申请者通过蛋白工程技术，获得高荧光强度的UPMT。E所示为大肠杆菌重组系统下，经Ni-NTA纯化UPMT和ALAD的可溶性表达结果。另外，申请者已测定ALAD的酶活力为510mU/mg。
表2.1 LB液体培养基成分
细菌培养用的胰化蛋白胨      10g
细菌培养用的酵母提取物       5g
NaCl                        10g
去离子水                至800mL
（配置固体培养基则按15g/L的量加入琼脂。）
完全溶解后用5mol/L NaOH调pH7.2，再加入去离子水至1L，高压灭菌即可。
实施例3 根瘤农杆菌的转化
实施例1构建的植物表达载体可通过使用农杆菌介导法、瞬时转化法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或者脂质体融合法等方法转化水稻外植体，申请者优先选择农杆菌介导法和瞬时转化法；所述农杆菌可为任意一种根瘤农杆菌或发根农杆菌，申请者优选为根瘤农杆菌EHA105和GV3101。
根瘤农杆菌EHA105或GV3101感受态细胞的制备：
(1) 从含有利福平（Rif）、卡那霉素（kana）或庆大霉素（Cef）的YEP固体培养基（见表3.1）平板上挑取EHA105或GV3101单菌落，接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基（按表3.1，不加琼脂）中，28℃，200 rpm震荡过夜；
(2) 用YEP液体培养基稀释至50mL，然后28℃, 200rpm培养6-12小时，至OD600值为0.6左右；
(3) 置于冰上5min，然后于4℃，200 rpm离心min；
(4) 取1mL浓度为20mM 冰冷的CaCl2溶液重悬沉淀，混匀；
(5) 分装，100μl/1.5mLEP管，-70℃保存。
转化时，取质粒5μl加入刚融化的感受态细胞，37℃，水浴5min，之后加入1ml YEP液体培养基，28℃，200rpm培养2-3小时。涂布在YEP+Rif/Cef+Km平板上。24-28小时左右时，挑取单菌落（进行酶切验证及PCR检测，确认为阳性质粒载体），摇菌过夜，培养至OD600值为0.4-0.6时用于感染。
表3.1 YEP固体培养基成分
细菌培养用胰化蛋白胨     5g/L
细菌培养用牛肉膏         5g/L
NaCl                    10g/L
调pH值为7.2，按16g/L的量加入琼脂。
实施例4含植物复合筛选标记的pC1301Ubi-ZmpBtA-pUP载体瞬时转化烟草
(1)从含有利福平（Rif）或庆大霉素（Cef）的YEP固体培养基（见表3.1）平板上挑取EHA105或GV3101单菌落，接种于相应抗生素的5mLYEP液体培养基中，28℃，200 rpm震荡过夜。
(2)取5mL菌液分别加入两个无菌1.5mL EP管中，4℃、12000rpm离心2min弃上清液，用无菌双蒸水重悬活化菌体。
用1mL的注射针头吸取定量的菌液，手指轻轻抵住一边，另一端注射针头轻压烟草叶背面，将菌液缓缓注入叶片内。（注：瞬时转化所用的烟草品种由中科院植物生理生态研究所提供。）
(3)注射完毕后放于温室培养两天后，剪刀剪取注射后留下印记周围的叶片部分，荧光显微镜下观察侵染结果，即细胞学状态。
观察结果图10的A所示，pCAMBIA1301为阴性对照，质粒载体pC131-pUP瞬时转化后叶绿体表达情况，图中显示相对于对照而言，UPMT在细胞学定位于叶绿体；B所示为复合选择标记载体pC131Ubi-zmBtALAD-pUP细胞学定位主要集中于叶绿体、细胞壁及气孔（含叶绿体）处。其中气孔附近的信号最强烈，因为受叶绿体本身背景值影响小。
实施例5  植物转化载体pC1301Ubi-ZmpBtA-pUP以农杆菌转染水稻
5.1水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养
水稻的品种可以是多种多样的，如日本晴、皖粳1号、中花11和Dong-Jin等，申请者优选为日本晴、皖粳1号或Dong-Jin作为材料。
取大小均一、颗粒饱满的成熟种子，剥去外壳，用70%乙醇浸泡1-2min，然后用加有几滴Tween-20的2.5%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡30min，进行表面灭菌。（灭菌时要经常搅拌）用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上吸干水分备用。用镊子将水稻成熟胚置于固体NB诱导培养基（表5.1）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约10-15天剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织后转入新鲜配制的NB继代培养基（表5.2）上，在相同条件下继代培养4-5天左右，如图9的A、B所示挑选继代培养、色泽淡黄颗粒状的愈伤组用于共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）。
注意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2 农杆菌的培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YEP平板（表3.1）上划线，28℃黑暗培养2-3天。挑取阳性农杆菌单菌落,含50mg/L kanamycin5mL的液体YEP培养基，28℃，220rpm培养2天。按1:200扩繁于200mLYEP液体培养基中，4℃，4000rpm离心30min。去上清将沉淀转于共培养CM液体培养基（表5.3）中，调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
5.3 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
仔细挑选无菌、状态较好（继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基（表5.4）上（将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置，愈伤应摆放整齐，相互之间最好不要叠放，25℃黑暗培养2-3天，如图9的C显示。
5.4 抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织（也可以水洗除菌后）放在含有相应抗生素的筛选培养基（表5.5，外加10μM SA）上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
现象：愈伤组织在选择培养基上出现脓状现象，导致培养失败。减少菌量和共培养后水洗并不能消除这一现象。
对策：需要从两方面把关：从继代培养开始，精心挑选愈伤组织，杜绝染菌的愈伤组织。另一方面，严把农杆菌关：农杆菌不应该多次传代，坚持用单菌落的农杆菌划线。
5.5 抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有相应抗生素的分化培养基上（表5.6），先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过
15-25天左右，有绿点出现，30-40天后进一步分化出小苗。
只要愈伤组织的质量符合要求，预分化并非必需。我们省略了预分化，将抗性愈伤组织直接转到分化培养基上，不但节省了能源及大大降低了成本，而且使转基因的时间缩短了10天，如图9的D所示。5.6 生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上（表5.7），培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准），如图9的E所示。
A．再生的转基因苗要适时移到生根培养基上，保证转基因苗在试管中生长正常。
B．对过于细小的苗通过剪根、剪叶和再次转培，使转基因苗强壮。
C．选苗高约10-15cm，根系旺盛的试管苗，选择时机直接移栽入土。
D．平整土地，保持水位，适当遮阴。 
注意事项：
1．试管苗根系发达，株高约10cm；
2．选择天气：春夏季选阴天、傍晚移栽；冬季选晴天移栽，连续阴雨天不适合移栽。
3．洗根时的水温要与土温基本一致；
4．洗根和移栽时不要将成丛的试管苗分开；
5．平整土地，控制水面，水不能淹没植株；
经过转基因植株的整株材料的鉴定，如图9的F所示UPMT蛋白的表达主要在根部积累。UPMT的终产物高效积累，与正常嫩白的根部对比可见光下可以肉眼观察深红色。
表5.1 NB基本培养基成分
KNO3                                        2830 mg/L
(NH4)2SO4                                    463 mg/L
KH2PO4                                       400 mg/L
MgSO4·7H2O                      185 mg/L
CaCl2·2H2O                                   166 mg/L
FeSO4·7H2O                       27.8mg/L
Na2EDTA                         37. 5 mg/L
MnSO4·4H2O                       10 mg/L
H3BO3                                              3 mg/L
ZnSO4·7H2O                        2 mg/L
Na2MoO4·2H2O                    0.25 mg/L
CuSO4·5H2O                     0.025 mg/L
CoCl2·6H2O                      0.025 mg/L
KI                                0.75 mg/L
盐酸硫胺素                         10 mg/L
盐酸吡哆醇                          1 mg/L
烟酸                                1 mg/L
肌醇                              100 mg/L
Casein Enzymatic Hydrolysate （CH）    0.6g/L
水解酪蛋白                        300 mg/L
谷氨酰胺                          500 mg/L
脯氨酸                            500 mg/L
蔗糖                           30,000 mg/L 
PHytagel                           2.6 mg/L
pH 5.9
表5.2 水稻愈伤诱导及继代培养基（粳稻）成分
NB g/L
2,4-D 0.002
L-Glutamine 0.5
Proline 0.5
Casein 0.3
Sucrose 30
Gelrite 2.6
pH 5.8  
表5.3 CM液体培养基成分
NB基本培养基(不包括谷氨酰胺和脯氨酸，加10克葡萄糖/升)
2,4-D       2 mg/L
CH         0.8g/L
pH 5.4
表5.4 共培养培养基成分
NB基本培养基（不包括谷氨酰胺和脯氨酸，加10克葡萄糖/升） 
2,4-D       2 mg/L
肌醇        2 mg/L
pH 5.6
AS(acetosyringone,乙酰丁香酮) 100μM 10-20毫克/升
注释：AS于用前溶化的培养基放至55℃左右时加入；共培养液体培养基中不加2,4-D。
5.5 抗性筛选培养基配方
NB基本培养基
2,4-D                     2 mg/L
cefotaxine(头孢霉素)     500 mg/L
succinyl acetone          0.3μmol/L
pH 5.8
二筛时可适当降低头孢浓度。
5.6 水稻分化培养基（粳稻）
NB g/L
6-BA 0.002
NAA 0.0005
Sucrose 30
Gelrite 3.5-2.6
pH5.8还要加头孢300毫克/升，增加培养基的硬度和渗透压.  
5.7水稻长根壮苗培养基（粳稻）
1/2 NB 无机盐  
1/2 B5 有机  
Sucrose 10-15 g/L
Gelrite 2.6 g/L
pH 5.8  
表 5.8 水稻基本培养基及母液的配置成分
（1） 20×N6大量元素母液
KNO3 56.6 g /L
(NH4)2SO4 9.26 g /L
KH2PO4 8 g /L
MgSO4·7 H2O 3.7 g /L
CaCl2·2H2O 3.32 g /L
（2） 100×B5 有机母液
Inositol （肌醇） 10 g/L
Nicotinic Acid（VB5） 100 mg/L
Pyridoxine（VB6） 100 mg/L
Thiamine（VB1） 1 g/L
注意：棕色瓶4℃保存，每次配100毫升为好，肌醇在配置培养基时直接加到培养基中。  
（3）100×B5微量元素母液
H3BO3 300 mg/L
MnSO4·H2O 1000 mg/L
CoCl2·6H2O 2.5 mg/L
CuSO4·5H2O 2.5 mg/L
ZnSO4·7H2O 200 mg/L
Na2MoO4·H2O 25 mg/L
KI 75 mg/L
（4）100×MS Fe盐溶液
FeSO4·7H2O 2.78 g/L
Na2·EDTA 3.75 g/L
（5）20×MS大量元素母液
MSMgSO4·7H2O 3.7 g/L
KH2PO4 1.7 g/L
KNO3 19 g/L
NH4NO3 16.5 g/L
CaCl2·2H2O 4.4 g/L
（6）100×MS微量元素母液
H3BO3 0.62 g/L
MnSO4·4H2O 1.56 g/L
CoCl2·6H2O 0.0025 g/L
CuSO4·5H2O 0.0025 g/L
ZnSO4·7H2O 0.86 g/L
NaMoO4·H2O 0.025 g/L
KI 0..83g/L
 (7) 100×MS有机元素母液
Myoinositol 10 g/L
Nicotinic Acid（VB5） 0.05 g/L
Pyridoxine（VB6） 0.05 g/L
Thiamine（VB1） 0.1 g/L
培养基和激素母液配制方法
（1）100×MS Fe盐溶液
称取2.78g FeSO4·7H2O溶于水（A液）；
称取3.75g Na2·EDTA溶于热水（B液）；
混合A液B液，加水接近1000ml；
把混合液置于微波炉内加热煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温；
定容到1L后置于棕色试剂瓶内4℃保存。
（2）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法
称取100mg 2,4-D，置于小烧杯内；
加少量无水乙醇使之完全溶解；
把2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配置；
定容至200ml，4℃保存。
（3）0.5mg/ml α-NAA母液的配法
称取100mgNAA置于小烧杯内；
用1N的KOH溶液溶解NAA；
用水定容至200ml，4℃保存。
（4）0.5mg/ml 6-BA母液的配法
称取100mg 6-BA置于小烧杯中；
加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；
用水稀释并定容至200ml，4℃保存。
（5）100mM乙酰丁香酮（As）的配制
称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，并定容至10ml，分装入无菌的小管，-20℃冰冻保存。
（6） 5mg/ml KT的配法
称取100mg kenetin，用少量1N KOH溶解，用水稀释定容至20ml。过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃冰冻保存。
实施例6  转基因水稻的分子检测
取实例5 获得的水稻再生植株的幼嫩叶片0.2g，用CTAB法提取叶片的基因组DNA并以此为模板，两对引物验证。引物序列分别为：
BU1：  5’-CATGGCTCTCGCCCTTCGAGCGCCCCGCTTTC-3’;
Hind III-BU2：   5’-TCTAAGCTTATACAGGAAAAATTGTTGGACTC-3’;
NcoI-ALA1：    5’-TAGACCATGGGACACCCTCAGTCCGTCCTC-3’
HindIII-ALA2：  5’-TAGAAGCTTACTCCTTCAGCCACTGGAGGAG-3’
PCR扩增pcobA和zmBtalad基因，PCR反应条件为：先94℃ 5min；然后94℃ 30sec，再55℃ 40sec，72℃ 1min 30sec，共35个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示，扩増出约为1176bp及3000bp DNA 片段的为转基因植株，大量提取物的基因组DNA，以非转基因植株DNA及无菌双蒸水为阴性对照，以质粒载体pC131Ubi-zmBtALAD-pUP DNA为阳性对照。说明pcobA和zmBtalad整合到转基因水稻所选植株中。
由此说明：ALAD及UPMT可作为一种优良的复合筛选标记，申请者通过实验证明本发明的植物转化载体不仅应用于方便、高效、安全的筛选，也有利于植物对营养元素的利用率，提高植物体内物质积累，间接促进生长发育的作用，同时有利于提供一个安全性标记基因开发的潮流。就是既可以指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位，也可以促进植物光合作用效率，而且可以有效地转入水稻植株中，为今后开发更安全及有效地选择标记基因奠定了基础。

Claims (5)

1.一种植物转化载体，其特征在于：所述载体用红色荧光蛋白UPMT和抗性筛选alad基因作为转染植物的报告基因及选择标记，红色荧光蛋白UPMT为能用于微生物、植物和动物稳定表达的尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA；抗性筛选alad基因为5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad，所述植物转化载体的基础构架载体为pCAMBIA1301。
2.根据权利要求1所述的植物转化载体，其特征在于：所述植物转化载体的主要构件是复制起始原点－卡那霉素抗性基因－泛素启动子Ubi promoter-5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad－CaMV 35S启动子－尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。
3.根据权利要求1所述的植物转化载体，其特征在于：该植物转化载体适用于农杆菌介导的植物转基因，包括原核复制起点ori、5'-3'依次含有pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因及农杆菌转染时能够进入植物细胞的T-DNA区域；MCS多克隆位点下游泛素启动子Ubi promoter，该启动子下游含有5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad；含有CaMV 35S组成型表达启动子，该启动子下游有尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。
4.一种构建权利1所述的植物转化载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，
1）报告基因cobA和抗性筛选标记alad基因的克隆；
2）将原始载体pCAMBIA1301载体经Nco I和BstE II酶切去除β-葡糖糖苷酸酶基因的线性化载体，与经Nco I和BstE II限制性酶消化所得编码尿卟啉原III甲基化酶UPMT的cobA基因片段按照分子生物学手段连接连接获得pC1301pUP载体；
3）将pC1301pUP载体经Xho I消化及去磷酸化与bar基因片段连接获得载体pC1301BpUP载体； 
4）原始载体pCAMBIA1301载体用限制性酶Xho I消化及去磷酸化反应后，回收纯化并自连接，获得无潮霉素抗性选择标记的载体pC131；
5) 将N端带有泛素启动子Ubi promoter、终止子Nos及含叶绿体导肽的alad基因片段插入经限制性酶EcoR I和Hind III消化的pC131载体，获得载体pC1301Ubi-ZmpBtAD；
6）pC1301Ubi-ZmpBtAD载体经Nco I和BstE II酶切消化后，与经同样酶切的含cobA基因的片段连接构成pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体；
    或者pC1301pUP载体经EcoR I和Hind III酶切消化后，与经同样酶切的含alad基因的片段连接构成双选择标记pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体。
5.一种权利要求1~3中任意一项所述的植物转化载体在转基因水稻或烟草转化中的应用。
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