CN108018332A - 一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，包括以下步骤：步骤(1)、检测筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响；步骤(2)、抗性基因‑筛选剂组合的筛选。本发明通过筛选获得了适合于进行叶绿体转化的水稻材料，该改良具有以下特征：具有高频的再生能力；诱导产生的II性愈伤组织，在长期(大于6个月)继代培养后仍具有良好的分化能力。另外，通过比较证明了潮霉素比常用的壮观霉素及其它筛选剂(抗生素或除草剂)更适合于作为水稻叶绿体转化的筛选剂。

Description

一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法

技术领域

本发明涉及一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法。

背景技术

植物叶绿体是一种半自主性的细胞器，拥有自己的基因组，因而是可以转化的。叶绿体转化通常是基因枪法或者PEG法通过直接转化实现的，虽然有过通过农杆菌介导法转化的报道，但是没有得到重复。叶绿体转化是外源基因DNA直接输送到叶绿体，然后通过同源重组的方法把外源基因定点整合到叶绿体基因组上，是随着基因枪法的发明而逐步确立的。

叶绿体转化的研究比细胞核转化起步晚，Boynton等用野生型衣藻叶绿体DNA转化了atpB基因突变体细胞，使该突变体完全恢复光合作用能力，是叶绿体转化开始的标志。1990年Svab等实现了高等模式烟草叶绿体的稳定转化，从而开启了高等植物叶绿体转化的新纪元。到目前为止，除烟草以外，已在拟南芥、马铃薯、番茄、油菜、棉花、甘蓝、胡萝卜、莴苣、矮牵牛、大豆、杨树、甜菜、茄子和紫花苜蓿等植物上获得了稳定的叶绿体转基因植株。

然而，上述实现叶绿体转化的植物都属于双子叶植物，单子叶植物的叶绿体转化一直没有获得成功，而许多重要的作物，如水稻、玉米、小麦和高粱等，都是单子叶植物。目前仅仅在水稻上获得了非同质化的叶绿体转基因植株，要获得同质化的叶绿体转基因植株，还有很多的难关需要攻克。如如何选择适合于进行叶绿体转化的水稻材料也是难点。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，为实现水稻成功叶绿体转化和叶绿体基因工程改良在水稻育种中的应用打下技术基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)、检测筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响；

步骤(2)、抗性基因-筛选剂组合的筛选。

优选的是，步骤(1)中的筛选剂包括壮观霉素、潮霉素B、草丁膦、草甘膦中的至少两种。

上述任一方案优选的是，所述步骤(1)的检测方法为：将愈伤组织放置在的筛选培养基上，培养后称量愈伤组织的重量，计算不同种类和浓度的筛选剂对愈伤组织重量增长的影响。

上述任一方案优选的是，筛选培养基为按照水稻继代培养基配方同水稻幼穗愈伤组织诱导培养基配方添加不同种类、不同浓度的筛选剂配制而成。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)的筛选方法为：

(5.1)、提取携带不同抗性基因的载体，根据载体中已知的 pCAMBIA1301中的HPT基因、pCAMBIA3301中的bar基因和pCAMBIA330E 中的EPSPS基因设计引物，引物两端分别添加Pvu II酶切位点，通过 PCR扩增获得该三个基因的片段；

(5.2)、三个抗性基因的PCR产物回收后连接到原核表达载体 pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间，将抗性基因正确插入到原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间的阳性克隆命名为pSYNTH-HPT、pSYNTH-bar、pSYNTH-soilA；

(5.3)、将含有载体pSYTH-HPT、pSYTH-bar、pSYTH-soilA的大肠杆菌Mach1菌液分别接种于含有与其相对应的筛选剂的M9液体培养基和添加L-脯氨酸的液体培养基上，并将含有载体pEASY-synth的大肠杆菌Mach1细胞作为对照，分析其OD值的变化；

(5.4)、选择能够耐受10倍浓度以上筛选剂用量且筛选效果不受培养基成分中L-脯氨酸影响的抗性基因和筛选剂的组合。

上述任一方案优选的是，所述步骤(1)之前还包括适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立。

上述任一方案优选的是，所述适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立方法包括：水稻幼穗愈伤组织的诱导；愈伤组织的分化；分析多轮继代培养对其分化的影响；再生植株生根与移栽。

上述任一方案优选的是，所述水稻幼穗愈伤组织的诱导方法为：在水稻进入孕穗期后，将水稻茎秆拔出，灭菌，取出幼穗，接种于愈伤组织诱导培养基上，观察愈伤诱导情况，计算诱导率，鉴别愈伤组织的类型。

上述任一方案优选的是，所述愈伤组织的分化方法为：取II型水稻愈伤组织，分别置于分化培养基上进行分化培养，计算分化率和高频分化率。

上述任一方案优选的是，分析多轮继代培养对其分化的影响方法为：将筛选出的多个品系的愈伤组织，放置在水稻诱导培养基上，每隔20天左右继代一次，连续继代10次，然后分别置于最适的分化培养基上分化培养40天，照相记录，分析多轮继代培养对其分化的影响，统计分化率和高频分化率。

上述任一方案优选的是，再生植株生根与移栽方法为：将筛选出的水稻品系的愈伤组织连续继代10次后分化出的再生植株移至MS 培养基上进行生根培养，直至幼苗长高后，室温炼苗，移栽至含有蛭石的腐殖土中培养。

本发明的有益效果是：本发明提供一种水稻叶绿体遗传转化方法，

首次获得了同质化的水稻叶绿体转基因愈伤组织和植株材料，并得到了相关分子证据。

其次，通过筛选获得了适合于进行叶绿体转化的水稻材料，该改良具有以下特征：具有高频的再生能力；诱导产生的II性愈伤组织，在长期(大于6个月)继代培养后仍具有良好的分化能力。

另外，通过比较证明了潮霉素比常用的壮观霉素及其它筛选剂(抗生素或除草剂)更适合于作为水稻叶绿体转化的筛选剂。

附图说明

图1、可高频诱导II型愈伤组织的水稻基因型，A-F：依次为水稻品系17、19、58、239、501和808。

图2、不同培养基对不同水稻品系分化的影响，A：不同品系的分化率；B：不同品系中个别品系的高频分化率。

图3、多轮继代对愈伤组织再生能力的影响，A：品系808；B：品系58；C：品系19。

图4、水稻品系19再生植株的生根与移栽结实，A：生根；B：炼苗；C：移栽；D：结实。

图5、不同筛选剂对水稻愈伤组织增值的影响，A:不同壮观霉素浓度情况下，含和未含L-脯氨酸对愈伤组织增殖的差别；B:不同草甘膦浓度情况下，含和未含L-脯氨酸对愈伤组织增殖的差别；C:不同草丁膦浓度情况下，含和未含L-脯氨酸对愈伤组织增殖的差别；D：不同潮霉素浓度情况下，含和未含L-脯氨酸对愈伤组织增殖的差别。

图6、表达抗性基因大肠杆菌对相应筛选剂耐受能力，A:不同草丁膦浓度情况下，培养基中添加和未添加L-脯氨酸的差别；B:不同草甘膦浓度情况下，培养基中添加和未添加L-脯氨酸的差别；C: 不同潮霉素浓度情况下，培养基中添加和未添加L-脯氨酸的差别。

图7、水稻叶绿体同源片段的获得，A:以植物总DNA为模板，扩增出的约4138bp的叶绿体同源大片段16S-trnI-trnA-23S，M： Trans15K DNA Marker；1-2：PCR产物；B:叶绿体同源片段比对结果。

图8、水稻叶绿体表达框结构图。

图9、载体pWYP23151的构建，A:以pEASY-synth为模板，扩增出的约2.9kb的Prrn-MSI99-smGFP-HPT-Trps16表达框，M：100bp Plus DNA Ladder；1-2：PCR产物；B:以质粒pWYP23151为模板，扩增出的约4kb的特异性条带；M：100bp Plus DNA Ladder；1-2，PCR 产物；C:插入片段测序结果比对；D:GFP在大肠杆菌中表达情况，1： pEASY-Os；2：pUC57-Osynth；3：pWYP23151；E:载体pWYP23151的构建示意图。

图10、水稻叶绿体转化抗性愈伤的获得、GFP检测和同质化植株的分化，A：水稻叶绿体转化抗性愈伤组织的获得；B：抗性愈伤组织在自然光和紫外光下观察结果；C：同质化的水稻愈伤组织在含有 500mg/L潮霉素的水稻分化培养基上分化；D：生根培养；E：移栽；WT：野生型植株；1-2：水稻叶绿体转基因植株。

图11、载体pWYP23151对水稻叶绿体基因组的整合。

图12、抗性再生植株分子检测，A：利用引物MSI99检测F/R对抗性愈伤组织中目的基因MSI99进行PCR检测；M：200bp marker；-，未转化的水稻植株；+：重组质粒pWYP23151；1-8，部分抗性愈伤组织；B：利用引物GFP检测F/R对抗性愈伤组织中目的基因GFP进行 PCR检测；M：200bp marker；-，未转化的水稻植株；+：重组质粒 pWYP23151；1-8，部分抗性愈伤组织；C：利用引物HPT检测F/R对抗性愈伤组织中目的基因HPT进行PCR检测；M：100bp Pluslandder； -，未转化的水稻植株；+：重组质粒pWYP23151；1-8：部分抗性愈伤组织；D：利用引物Os检测F/R对经过大约300d连续筛选后的水稻愈伤组织进行PCR检测其同质化水平；M：Trans15K DNA Marker； -：未转化的水稻植株；+：重组质粒pWYP23151；1-8：部分抗性愈伤组织；E：利用引物Os检测F/R对分化的水稻叶绿体转基因植株进行同质化水平的PCR检测；M：Trans8K DNA Marker；WT：未转化的水稻植株；+：重组质粒pWYP23151；1-2：水稻叶绿体转基因植株； F：用EcoRI酶切的叶绿体DNA做的Southern Blot分析，以水稻叶绿体trnI和trnA基因间的片段为探针(见F)；M：Trans8K DNA Marker；WT：未转化的水稻植株；1-2：水稻叶绿体转基因植株。

图13、绿色荧光检测，A-D：野生型和转基因水稻植株在自然光和紫外光下的发光情况，分别表示野生型植株在自然光(A)，和紫外光(B)以及转叶绿体转基因植株在自然光(C)和紫外光(D)下的情况；E-H，共聚焦显微分析结果，分别表示转基因植株叶片原生质体在自然光下(E)、叶绿素自发荧光(F)、绿色荧光蛋白激发荧光(G)和荧光叠加(H)后的情况。

图14、转基因水稻植株蛋白表达分析，M，Blue Plus II Protein Marker；CK，野生型植株；1-2，水稻叶绿体转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料

供试的试验材料为20份早熟水稻品系(代号为：12、14-17、15、 17、19、35、37-14、47、58、111、117、198、201、239、450、501、 808、848、1471、Z291)，由吉林农业大学水稻育种实验室选育。

1.1.2质粒和菌种

设计水稻叶绿体表达所需的 Prrn-T7g10-MSI99-smGFP-HPT-Trps16表达盒。Prrn启动子和Trps16 终止子分别为16S rRNA的启动子和3'端成熟序列(GenBank登录号：BA000010.8)；所包含的三个基因MSI99、smGFP、HPT均利用DNA2.0 软件根据水稻叶绿体密码子偏好性进行密码子优化。在smGFP基因上游、HPT基因下游分别插入同源重组酶识别的attP位点和attB位点用于切除筛选标记基因。该片段交由金斯特生物服务有限公司合成，合成后插入到质粒pUC57的Hind III酶切位点后命名为 pUC57-Osynth。

质粒pEASY-syth、pCAMBIA1301、pCAMBIA3301、pCAMBIA330E和大肠杆菌(Escherichia coli)菌种Mach1为本实验室保存。

1.1.3工具酶

TransStart FastPfu DNA聚合酶、TransStart Taq DNA聚合酶、 pEASY-BluntSimple克隆试剂盒、凝胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extracion Kit及PCR产物回收试剂盒EasyPure PCR Purification Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；内切酶NsiI、EcoRI、StyI、KpnI，蛋白酶K，购自美国Promega公司；T4DNA 连接酶购自大连宝生物公司。

1.1.4试剂盒

重组克隆试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司； Branford蛋白定量试剂盒购自上海杰瑞生物技术有限公司；DNA杂交试剂盒(DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I)购自瑞士Roche公司。

1.1.5培养基及缓冲液

细菌培养

M9培养基：

12.8g Na₂PO₄·7H₂O、3.0g KH₂PO₄、0.5g NaCl、1.0g NH₄Cl、2g葡萄糖、0.492gMgSO₄、0.02191g CaCl₂，加双蒸水至1000mL，120℃灭菌。

LB液体培养基：

10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加600mL H₂O溶解，调节pH值至7.0，加H₂O至1L，120℃高温灭菌。4℃冰箱保存，60 天有效。

LB固体培养基：

10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加600mL H₂O溶解，调节pH值至7.0，1.5％的琼脂粉，加H₂O至1L，120℃高温灭菌。4℃冰箱保存，60天有效。

CCMB80缓冲液(1L)

11.8g CaCl₂·2H₂O，4g MnCl₂·4H₂O，2g MgCl₂·6H₂O，加600mL H₂O 溶解，100mL甘油，10mL 1M KOAc(pH 7.0)，用1N的HCl调至pH 值为6.4，抽滤灭菌，60天有效。

植物培养

愈伤组织诱导培养基：

MS盐+B5有机+2.0mg/L 2,4-D+2g/L的L-脯氨酸+3％蔗糖。

愈伤组织分化培养基：

SF1：N6盐+B5有机+1mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.2mg/L ZT +0.5mg/L KT+3％蔗糖。

SF2：N6大量+MS微量+B5有机+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA +3％蔗糖。

SF3：MS盐+B5有机+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+3％蔗糖。

高渗培养基：

MS盐+B5有机+2.0mg/L 2,4-D+2g/L L-脯氨酸+6％山梨醇 +3％蔗糖。

真菌培养基

PDA培养基

马铃薯200g/L，20g/L蔗糖，0.8％琼脂pH值为5.8。

缓冲液

卡那霉素(Kanamycin，Kan)、壮观霉素(Spectinomycin，Spe)、潮霉素(hygromycin，Hyg)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、500 mM IPTG溶液和20mg/mL X-gal溶液等购自北京鼎国生物技术服务有限公司。

植物总DNA提取缓冲液：

1.DNA提取缓冲液(DNA extraction buffer)(500mL)：31.85g 山梨糖醇(0.35M)；加400mL H₂O溶解，50mL 1M Tris-HCl，pH7.5 (0.1M)；10mL 0.5M EDTA，pH8.0(25mM)，调节pH值到8.0，加 H₂O至500mL。室温保存，60天有效。

2.核裂解缓冲液(Nuclei lysis buffer)(500mL)：10g CTAB 加400mL H₂O溶解，100mL 1M Tris-HCl，pH7.5(0.2M)；10mL 0.5M EDTA，pH8.0(25mM)；200mL 2M NaCl(2M),调节pH值到8.0，加H₂O至500mL。室温保存，60天有效。

3.5％十二烷基肌氨酸钠(100mL)：5g十二烷基肌氨酸钠加 80mL H₂O溶解，调节pH值到8.0，加H₂O至100mL。室温保存，60天有效。

叶绿体DNA提取缓冲液：

1、缓冲液A(500mL)：3.025g Tris-HCl(50mM)；4.65g EDTA (25mM)；36.55g NaCl(1.25M)；22g抗坏血酸(0.25mM)用固体NaOH调至pH3.6；加H₂O至500mL。4℃保存，30天有效。

2、缓冲液B(pH8.0)：3.025g Tris-HCl(50mM)；4.65g EDTA (25mM)；36.55g NaCl(1.25M)；0.5g BSA(0.1％W/V)；0.7mL β-巯基乙醇(10mM)调至pH3.6；加H₂O至500mL。4℃保存，五年有效。

3、缓冲液C(pH8.0)：4.386g NaCl(150mmol/L)；18.6g EDTA (100mM)调至pH3.6；加H₂O至500mL。4℃保存，五年有效。

4、缓冲液D(pH8.0)：3.025g Tris-HCl(50mM)；4.65g EDTA (25mM)调至pH3.6；加H₂O至500mL。4℃保存，五年有效。

5、10％十二烷基硫酸钠(SDS)和10％十二烷肌氨酸钠：10g固体药品加水定容至100mL。

50×TAE电泳缓冲液：

242g Tris；400mL H₂O；100mL 0.5M EDTA(pH8.0)；57.1mL冰醋酸调pH值至8.0；加H₂O至1L。室温保存，五年有效。使用时，稀释成1×TAE溶液，室温保存，一年有效。

Southern杂交相关溶液

去嘌呤液(0.125N HCl，5L)：

3000mL H₂O；55ml浓HCl；加H₂O至5L。室温保存，五年有效。

变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl，5L)：

100g NaOH；438.3g NaCl；加H₂O至5L。室温保存，五年有效。

中和液(0.5M Tris-HCl，pH7.0，1.5M NaCl，5L)：

302.8g Tris；438.3g NaCl；加H₂O至4000mL；浓HCl调pH值至7.0；加H₂O至5L。室温保存，五年有效。

20×SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0，10L)：

1753g NaCl；882g柠檬酸钠；加H₂O至8L；NaOH调pH至7.0；加H₂O至10L。室温保存，五年有效。

马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH7.5)：

11.61g马来酸，8.77g NaCl，NaOH固体调pH至7.5，用H₂O定容至1000mL。室温保存，五年有效。

20％SDS(1L)：

200g SDS；加H₂O至1L。室温保存，五年有效。

洗膜液I(0.1％SDS，2×SSC)：

5mL 20％SDS；100mL 20×SSC；用H₂O定容1L。室温保存，五年有效。

洗膜液II(0.1％SDS，0.5×SSC)：

5mL 20％SDS；25mL 20×SSC；用H₂O定容1L。室温保存，五年有效。

其他溶液

CPW缓冲液：

27.2mg/L KH₂PO₄，101.0mg/L KNO₃，1480.0mg/L CaCl₂·2H₂O， 246.0mg/LMgSO₄·7H₂O，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，pH5. 8。

原生质体离解液：

1.0％纤维素酶、0.2％果胶酶、0.4mol/L山梨醇，用CPW缓冲液配制。

PBS缓冲液：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄， 2mmol/LKH₂PO₄。

氨苄青霉素贮存液：

称取氨苄青霉素粉末10g溶解于100mL去离子水中，用0.22μ m滤器过滤，分装成小份，-20℃保存。

硫酸卡那霉素贮存液：

称取硫酸卡那霉素粉末5g溶解于100mL去离子水中，用0.22 μm滤器过滤，分装成小份，-20℃保存。

壮观霉素素贮存液：

称取壮观霉素粉末125g溶解于90mL去离子水中，定容至100mL，用0.22μm滤器过滤，分装成小份，-20℃保存。

潮霉素素贮存液：

称取潮霉素粉末5g溶解于100ml去离子水中，用0.22μm滤器过滤，分装成小份，-20℃保存。

X-gal贮存液：

取1g X-gal粉末，溶解于40ml二甲基酰胺中，定容至50ml，分装成小份，-20℃避光保存。

IPTG贮存液：

取1.2g IPTG溶解于50ml去离子水中，用0.22μm滤器过滤，分装成小份，-20℃保存。

乙酰丁香酮贮存液：

称取1.96g乙酰丁香酮晶体，溶解于100ml二甲基亚砜中，分装成小份，-20℃避光保存。

1.1.6引物

用引物设计软件Primer Premier 5.0设计用于扩增水稻叶绿体基因组中的16S-trnI-trnA-23S片段的引物(OsynthF，OsynthR)，用于检测选择性标记基因GFP的引物(GFP检测F，GFP检测R)，检测选择性标记基因HPT的引物(HPT检测F，HPT检测R)，检测目的基因MSI99的引物(MSI99检测F，MSI99检测R)，检测同质化程度的引物 (Nt检测F，Nt检测R)，Southern杂交探针引物(Os probeF，Os probeR)。以下为个对引物的的序列，划线部分为引入的酶切位点，并在序列后的括号内注明，小写字母表示保护碱基。以上引物由北京六合华大基因公司合成。

OsF：5′-ACAGAGGATGCAAGCGTTAT-3′

OsR：5′-CACTGAGCGATCATTTAGGG-3′

GFP检测F：5′-GTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3′

GFP检测R：5′-AGATTGTGTGGACAGGTAATGGTTG-3′

HPT检测F：5′-CGACATCATTCCGTGGCGTTATCC-3′

HPT检测R：5′-ACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACG-3′

MSI99检测F：5′-AGCATTGCCCGAGGAT-3′

MSI99检测R：5′-TCAGCTCTTAGCAGACATTG-3′

Os检测F：5′-GGTCGGAACAAGTTGATAG-3′

Os检测R：5′-CAGTAGAGTCTTTCAGTGGC-3′

Os probeF：5′-AATGGAGCACCTAACAACGCATCTTC-3′

Os probeR：5′-TAATGCGTTCCACTTATTGAACAGGG-3′

Osynth F：5′-AATGGAGCACCTAACAACGCATCTTC-3′

Osynth R：5′-TAATGCGTTCCACTTATTGAACAGGG-3′

Os probeF：5′-AATGGAGCACCTAACAACGCATCTTC-3′

Os probeR：5′-TAATGCGTTCCACTTATTGAACAGGG-3′

HPT重组F：5′-tagcCAGCTGAATGGAGCACCTAACAACGCAC-3′

HPT重组R：5′-tagcCAGCTGTAATGCGTTCCACTTATTGAAC-3′

bar重组F：5′-tagcCAGCTGAATGGAGCACCTAACAACGCATC-3′

bar重组R：5′-tagcCAGCTGTAATGCGTTCCACTTATTGAACG-3′

EPSPS重组F：5′-tagcCAGCTGAATGGAGCACCTAACAACGCAC-3′

EPSPS重组R：5′-tagcCAGCTGTAATGCGTTCCACTTATTGAG-3′

1.2试验方法

1.2.1适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立

1)水稻幼穗愈伤组织的诱导

在水稻进入孕穗期后，将水稻茎秆拔出，在超净台中用75％酒精擦拭表面灭菌，直接用镊子取出幼穗，选取长度为8-15mm左右的幼穗，将整根幼穗切割成长度约3-5mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放9个外植体，设置4次重复。置于恒温培养室培养，培养条件为温度26℃，光照强度为1500-2000lx，16h光照 8h黑暗。培养20天后观察愈伤诱导情况，计算诱导率(诱导率＝诱导愈伤组织外植体数/接种外植体数)，鉴别愈伤组织的类型。

2)愈伤组织的分化

取直径约为5mm的II型水稻愈伤组织，分别置于分化培养基SF1、 SF2和SF3上进行分化培养，20天后统计出现绿色不定芽愈伤的块数，计算分化率(分化率＝分化的愈伤组织块数/接种愈伤组织块数)。再经过10-20天的培养，统计每块愈伤组织上分化的不定芽数量，记录分化出10个以上不定芽的愈伤组织数量，计算高频分化率(高频分化率＝能分化多于10个不定芽的愈伤组织块数/接种愈伤组织块数)。

3)愈伤组织的多轮继代与分化率

将编号为19、58和808的三个品系的愈伤组织，放置在水稻诱导培养基上，每隔20天左右继代一次，连续继代10次，然后分别置于最适的分化培养基上分化培养40天，照相记录，分析多轮继代培养对其分化的影响，统计分化率和高频分化率。

4)再生植株生根与移栽

将水稻品系19的愈伤组织连续继代10次后分化出的再生植株移至MS培养基上进行生根培养，直至幼苗长到10cm高后，打开培养瓶盖子，室温炼苗3天后，移栽至含有30％蛭石的腐殖土中培养。

1.2.2水稻叶绿体转化筛选策略的选择

1)筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响

按照水稻继代培养基配方同水稻幼穗愈伤组织诱导培养基配方，经过120℃高温灭菌冷却至70-80℃后，按照表1添加不同种类、浓度的筛选剂配制成含有不同筛选剂的筛选培养基。用精密天平在超净工作台中精确称取0.25g由水稻品系19的幼穗诱导出的愈伤组织，放置在的上述配制好的筛选培养基上。置于植物组织培养室内28℃，光照强度为1500～2000lx，16h光照8h黑暗条件下，培养20天后观察愈伤诱导情况，称量愈伤组织的重量，计算不同种类和浓度的筛选剂对愈伤组织重量增长的影响。生长率(％)＝(第二次称量的愈伤组织重量 -0.25)/0.25×100％。

表1四种筛选剂的筛选浓度

2)抗性基因-筛选剂组合的筛选

利用质粒小量提取法，提取携带不同抗性基因的载体，根据载体中已知的基因序列(pCAMBIA1301中的HPT基因、pCAMBIA3301中的bar 基因和pCAMBIA330E中的EPSPS基因)设计引物，引物两端分别添加Pvu II酶切位点，通过PCR扩增获得上述三个基因的片段。

HPT基因PCR检测的体系与条件如表2所示：

表2

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸45sec,30个循环；72℃后延伸5min。

bar基因PCR检测的体系与条件如表3所示：

表3

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸25sec,30个循环；72℃后延伸5min。

EPSPS基因PCR检测的体系与条件如表4所示：

表4

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸1min,30个循环；72℃后延伸5min。

所获得的三个抗性基因的PCR产物用全式金公司的EasyPure PCR PurificationKit试剂盒进行纯化，回收后连接到经限制性内切酶 Pvu II消化的原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间，转化大肠杆菌Mach1感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素和 50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基的平板上，37℃培养过夜。次日挑取单菌落进行PCR鉴定，将鉴定抗性基因正确插入到原核表达载体 pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间的阳性克隆命名为 pSYNTH-HPT(含有HPT基因)、pSYNTH-bar(含有bar基因)、 pSYNTH-soilA(含有EPSPS基因)。

将含有载体pSYTH-HPT(含有HPT基因)、pSYTH-bar(含有bar 基因)、pSYTH-soilA(含有EPSPS基因)的大肠杆菌Mach1菌液(OD 值为0.5)分别按照1:200的比例，分别接种于含有与其相对应的筛选剂的M9液体培养基和添加2g/L的L-脯氨酸的M9液体培养基上，并将含有载体pEASY-synth的大肠杆菌Mach1细胞进行同样处理作为对照，分析培养12h后其OD值的变化。即将含有载体pSYNTH-HPT(含有HPT基因) 大肠杆菌和对照含有载体pEASY-synth的大肠杆菌接种于含有0、100、 200、300、400、500mg/L潮霉素的M9液体培养基和添加2g/L的L-脯氨酸的M9液体培养基上，培养12h后测定其OD值；将含有载体 pSYNTH-bar(含有bar基因)大肠杆菌和对照含有载体pEASY-syNth 的大肠杆菌接种于含有0、25、50、75、100、125mg/L草丁膦的M9 液体培养基和添加2g/L的L-脯氨酸的M9液体培养基上，培养12h后测定其OD值；将含有载体pSYNTH-soilA(含有EPSPS基因)大肠杆菌和对照含有载体pEASY-synth的大肠杆菌接种于含有0、100、200、300、 400、500mg/L草甘膦的M9液体培养基和添加2g/L的L-脯氨酸的M9液体培养基上，培养12h后测定其OD值。

选择能够耐受10倍浓度以上筛选剂用量，且筛选效果不受培养基成分中L-脯氨酸的影响的抗性基因和筛选剂的组合。

1.2.3水稻叶绿体表达载体的构建

水稻总DNA的提取

1、称取6g水稻种子，在种子研磨器中研磨成粉末置于50ml离心管中。

2、加入16mL CTAB提取缓冲液和80-100μg RNase A，颠倒混匀，65℃水浴孵育25-35min，期间混匀2-3次。

3、从水浴中取出样品，冷却至室温。

4、加入16mL氯仿/异戊醇(24:1)。颠倒混匀5min。20-25℃， 16000g离心5min，转移上清液到新管中。

5、可重复步骤4，进一步除去样品残渣和蛋白。

6、加入1.6mL 10％CTAB溶液，颠倒混匀。加入16mL氯仿/异戊醇(24:1)。颠倒混匀5min。20-25℃，16,000g离心5min，转移上清液到新管中。

7、加入15mLCTAB沉淀缓冲液，轻缓颠倒混匀，室温放置50-70min (可4℃过夜放置)。20-25℃，16,000g离心9-11min。

8、弃上清。加入2mL高盐TE缓冲液，35-60℃孵育，轻缓振荡，直到DNA溶解。也可适当增加高盐TE缓冲液用量。DNA溶液可在4℃保存7天。

9、若有未溶解的残渣，20-25℃，23000g离心2min。

10、转移上清液至13mL离心管。加入1/10体积3M NaAc溶液 (pH5.2)和2倍体积无水乙醇，颠倒混匀。根据步骤8加入的高盐 TE缓冲液体积确定NaAc溶液和无水乙醇用量。

11、沉淀DNA。

(1)10,000g离心5min，弃上清。

(2)加入0.5-2mL 70％乙醇溶液，20-25℃，10,000g离心5min，弃上清。

以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。

12、干燥DNA。真空干燥≤10min，空气干燥≤2h，DNA过度干燥会导致难以溶解。

13、加入500-1,000μL TE缓冲液溶解DNA。也可适当增加TE 缓冲液用量，或将DNA溶液置于70℃孵育1-4h，促进DNA溶解。

14、DNA溶解完全后，将溶液转入1.5ml离心管。

15.移液器吸取5μL提取的水稻总DNA上样，进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，以便检测所提取的DNA质量。

16.取1μL提取的水稻总DNA置于Nano Drop2000微量核酸测定仪的检测触点上测定DNA的浓度。

水稻叶绿体同源重组片段的获得

将所提取的水稻总DNA稀释至浓度为100ng/μL作为PCR扩增的模板，根据Genbank上登陆的水稻叶绿体序列(GenBank登录号: BA000010.8)设计引物OsF、OsR扩增水稻叶绿体基因组中的 16S-trnI-trnA-23S片段，作为叶绿体转化载体中的侧翼同源序列。 PCR反应采用TransStart FastPfu DNA聚合酶。PCR反应体系如表5 所示：

表5

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec， 72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸10min。

配制0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用购自全式金公司的EasyPure PCRPurification Kit试剂盒进行纯化，将经PCR纯化回收试剂盒纯化回收的水稻16S-trnI-trnA-23S的PCR回收片段连接到pEASY-Blunt Simple上，转化大肠杆菌Mach1感受态细胞，取8μ L，500mM IPTG和40μL，20mg/mL X-gal混合后均匀地涂于准备好的含有50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基的平板上，在37℃放置30分钟，直至IPTG，X-gal被完全吸收，取 100μL菌液涂于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。次日挑取单菌落进行PCR鉴定，在无菌操作台中，用经过120℃高温灭菌过的移液器枪头小心吸取100μL 菌液于1.5mL离心管中，10,000×g离心1-2分钟，去除残留的LB 液体培养基后用等体积的TE溶液重悬菌体，并置于沸水中5min，取出离心管冷却至室温作为PCR反应的模板，以通用引物M13F和M13R 进行PCR鉴定，筛选出重组克隆。

PCR反应体系如表6所示：

表6

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，55℃退火40sec, 72℃延伸2min,30个循环；72℃后延伸10min。

重组质粒交由北京六合华大基因有限公司测序验证后命名为pEASY Bs-Os。

HPT基因密码子优化及表达框设计

使用DNAWORKS3.0(http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/)及 Synthetic GeneDesigner按照水稻叶绿体基因组密码子使用偏好性，设计水稻叶绿体表达所需的Prrn-T7g10-MSI99-GFP-HPT-Trps16表达盒。Prrn启动子和Trps16终止子分别为水稻叶绿体(GenBank登录号：NC_001320.1)16S rRNA的启动子和3'端成熟序列；所包含的三个基因MSI99、GFP、HPT均利用DNA2.0软件根据水稻叶绿体密码子偏好性进行密码子优化。在GFP基因上游、aadA基因下游分别插入同源重组酶识别的attP位点和attB位点用于切除筛选标记基因。该片段交由金斯特生物服务有限公司合成，合成后插入到质粒 pUC57的Hind III酶切位点后命名为pUC57-Osynth。

载体pWYP23151的构建

线性化载体的准备

将质粒pEASY-Os用限制性内切酶Nsi I进行消化反应，使得水稻叶绿体基因组同源序列16S-trnI-trnA-23S的trnI和trnA之间的非编码区域发生断裂，为在该位置插入化学合成的 Prrn-T7g10-MSI99-GFP-HPT-Trps16水稻叶绿体表达盒做准备。取1 μg质粒pEAZY-Os，用Nsi I酶切，酶切体系如表7所示：

表7

10×HBuffer	5μL
		NsiI	5μL
pEASY-Os	1μg
		ddH2O	补足至50μL

37℃反应2h。用PCR回收试剂盒(具体方法见2.2.1.4.1)回收酶切产物，该酶切产物即载体片段2。

插入片段的准备

根据化学合成的Prrn-T7g10-MSI99-GFP-HPT-Trps16表达盒序列设计引物“synth重组F”和“synth重组R”并在两引物的5’端各添加15bp同源序列(pEAZY-Os被Nsi I酶切位点的两端)，以确保通过PCR扩增的表达框两端各还有与pEASY-Os被Nsi I酶切开的两端15bp的同源序列，可以通过金斯特生物公司的重组克隆试剂盒进行重组反应，实现无缝连接。质粒DNA小量提取法提取质粒pEASY-Osynth，将其浓度稀释至50ng/μL后为模板，利用 TransStart FastPfu HS DNA polymerase进行PCR扩展目的片段，所获得的PCR产物经PCR回收试剂盒回收，即为插入片段2。

PCR反应体系如表8所示：

表8

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸4min,30个循环；72℃后延伸10min。

0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

重组载体的无缝连接

上述获得的载体片段2和插入片段2，用购自金斯特生物公司的重组克隆试剂盒建立表9所示的连接体系：

表9

载体片段2(100-200ng/μl)	6μL
		插入片段2(100-200ng/μl)	3μL
10×CloneEZBuffer	2μL
		CloneEZEnzyme	2μL
ddH2O	7μL

用移液枪轻轻吸打溶液充分混合后，16℃孵育1h，并置于冰上终止反应，将重组的混合液体按照热激法转化大肠杆菌感受态细胞 Mach1，并涂于含50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单菌在含抗生素的LB培养液中，37℃振荡过夜培养。

将获得的菌液在含有50μg/mL壮观霉素的LB平板上划线37℃过夜培养，鉴定大肠杆菌抗性，并将两者在紫外灯下进行观察，检测绿色荧光活性。同时将获得的菌液用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒并稀释至浓度为50ng/μL后作为模板，设计引物“Os检测F”、“Os检测R”进行PCR鉴定。PCR反应体系如表10所示：

表10

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸4min,30个循环；72℃后延伸10min。

交与上海生物有限公司测序正确后，即获得水稻叶绿体表达载体 pWYP23151。

1.2.4水稻叶绿体转化与同质化筛选

A.水稻叶绿体转化

叶绿体转化按照Daniell的方法操作并略作修改。用PDS 1000/He 基因枪(美国Bio-Rad公司)进行：金粉颗粒直径为0.6μm，轰击距离为9cm，可裂膜采用1100psi，金粉微弹按每毫克金粉用0.2μg质粒DNA包裹。具体如下：

1)水稻外植体准备

选取已经建立起适合水稻叶绿体转化的水稻高频再生体系的水稻品种19种植在水稻试验田或装有蛭石的水稻种植桶中，当水稻进入孕穗期，将水稻茎秆拔出，用75％酒精擦拭表面灭菌，在超净台中直接用镊子取出幼穗，选取长度为8-15mm左右的幼穗，将整根幼穗切割成长度约3-5mm的小段，接种于水稻幼穗愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放9个外植体。置于恒温培养室培养，培养条件为温度26℃，光照强度为1500-2000lx，16h光照8h黑暗。培养20天后观察愈伤诱导情况，选取生长迅速、分化能力强的II型愈伤组织在水稻诱导培养基继代，直至获得的愈伤组织状态稳定且足够试验所需。

2)微弹的制备和金粉的包裹

使用碱裂解法提取水稻表达载体pWYP23151，按照金粉包埋的实验操作将其包埋于直径0.6um的金粉颗粒上。

3)基因枪轰击

在无菌操作台中，用镊子小心选取直径3-5mm大小的II型水稻愈伤组织，将其小心接种于水稻高渗培养基上，暗环境下培养6小时。用镊子将水稻愈伤组织从水稻高渗培养基转移到含有水稻恢复培养基的植物组织培养皿中间大约为直径2.5的区域内，水稻愈伤组织彼此之间紧密摆放，尽量不留有空隙。

按照Daniell的方法操作并略作修改，用PDS 1000/He基因枪 (美国Bio-Rad公司)进行，轰击距离分为6cm、9cm、12cm三组进行，采用1100psi可裂膜。

B.水稻叶绿体转化的愈伤组织同质化筛选

完成基因枪轰击后的水稻愈伤组织在恒温培养室或人工气候箱中，25℃黑暗环境下，恢复培养72hr，转移到含有500mg/L潮霉素的水稻筛选培养基上进行筛选，为保证筛选效果15cm×15cm的植物组织培养皿中，进行筛选的愈伤组织数目不超过30块。在恒温培养室或人工气候箱中培养，光周期为16小时光照、8小时黑暗，培养温度为25℃，每20天更换新鲜的水稻筛选培养基。当产生抗性愈伤组织后，将新产生的抗性愈伤组织和未进行转化的野生型水稻愈伤组织在共聚焦显微镜下观察是否检测到绿色荧光，如果能够检测到绿色荧光则保留并进行其他检查，如果不能则直接舍弃。用镊子夹取少量能够产生绿色荧光的愈伤组织，用CTAB法提取总DNA，PCR检测选择性标记基因GFP基因、HPT基因以及目的基因MSI99基因。

将经过PCR鉴定含有GFP基因、HPT基因和MSI99基因，且能够发出绿色荧光的水稻愈伤组织，用镊子分割成5mm×5mm大小，继续在水稻筛选培养基上培养。在恒温培养室或人工气候箱中培养，光周期为16小时光照、8小时黑暗，培养温度为25℃，每20天更换新鲜的水稻筛选培养。每更换一次水稻筛选培养，用镊子夹取少量能够产生绿色荧光的愈伤组织，用CTAB法提取总DNA作为PCR扩增的模板， PCR检测其同质化程度。将同质化水平最高的愈伤组织继续筛选，而同质化水平较低的水稻愈伤组织舍弃，直至获得同质化的水稻愈伤组织。

C.同质化水稻叶绿体转化愈伤组织的分化

将经过PCR鉴定为同质化的转基因水稻愈伤组织，分成两部分，一部分移至高渗培养基上进行高渗处理，暗环境下培养6小时，再用镊子将水稻愈伤组织从水稻高渗培养基转移到含有500mg/L潮霉素的水稻分化培养基上进行分化处理；另一部分直接移到含有500mg/L 潮霉素的水稻分化培养基上进行分化处理，比较两者的分化能力。将分化出的水稻幼苗转移到含有500mg/L潮霉素的水稻生根培养基上壮苗和生根。取非转基因的水稻再生苗作为对照与水稻同质化转基因再生植株分别在可见光和紫外光下拍照观察是否能检测到绿色荧光信号，提取转基因植株和对照植株的总DNA和可溶性总蛋白进行分子检测。

1.2.5分子检测

A.目的基因和选择性标记基因的PCR检测

将经过筛选获得的能够产生绿色荧光的水稻抗性再生愈伤组织用CTAB法提取总DNA，设计引物通过PCR检测选择性标记基因GFP、 HPT以及目的基因MSI99。

a.MSI99基因的PCR检测

由于目的基因MSI99仅有72bp，不利于进行PCR检测，所以试验中我们利用软件Primer Premier 5.0根据MSI99基因序列和与之相连的Prrn启动子序列设计用于PCR检测Prrn-MSI99片度是否整合到水稻叶绿体基因组中所需的引物“MSI99检测F”和“MSI99检测R”(“MSI99检测F”位于Prrn启动子序列内和“MSI99检测R”位于MSI99基因序列内)，两条引物之间的距离为218bp，使用 TransStart FastPfu DNA polymerase进行PCR检测。

MSI99基因PCR检测的体系与条件如表11所示：

表11

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸25sec,30个循环；72℃后延伸5min。

b.GFP基因的PCR检测

利用软件Primer Premier 5.0根据GFP基因序列设计用于PCR 检测GFP基因是否整合到水稻叶绿体基因组中所需的引物“GFP检测 F”和“GFP检测R”，两条引物之间的距离为596bp，使用TransStart FastPfu DNA polymerase进行PCR检测。

GFP基因PCR反应体系如表12所示：

表12

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸40sec,30个循环；72℃后延伸5min。

c.HPT基因的PCR检测

利用软件Primer Premier 5.0根据HPT基因序列设计用于PCR 检测GFP基因是否整合到水稻叶绿体基因组中所需的引物“HPT检测F”和“HPT检测R”，两条引物之间的距离为451bp，使用TransStart FastPfu DNA polymerase进行PCR检测。

HPT基因PCR检测的体系如表13所示：

表13

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸40sec,30个循环；72℃后延伸5min。

B.同质化进程的PCR检测

将经检测确定为转基因的水稻愈伤组织，继续在水稻筛选培养基上培养，每20天继代一次，同时将不同来源的愈伤组织进行编号，并用镊子夹取一部分愈伤组织用CTAB法(操作步骤见2.2.1.1)提取总DNA，在叶绿体基因组的trnI和trnA基因之间设计引物“Os检测F”和“Os检测R”通过PCR检测经300d筛选所获得的水稻抗性愈伤组织的同质化程度。当以“Os检测F”和“Os检测R”为引物，以野生型水稻叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增可以获得长度为 1.2kb的目的条带，而以水稻叶绿体表达载体pWYP23151或者水稻叶绿体转基同质化愈伤组织的基因组DNA(含有质体DNA)为模板进行PCR扩增可以获得长度为4.4kb的目的条带，而当转基因植株处于异质化状态下可以获得1.2kb和4.4kb两条扩增条带。据此可以判断转基因植株是否已经通过长期筛选达到同质化水平。

PCR反应体系如表14所示：

表14

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸1min,30个循环；72℃后延伸5min。

C.Southern blot分析

a.转基因再生植株的叶绿体DNA提取

1、向小研钵中加入0.2g水稻叶绿体转基因植株叶片和1mL缓冲液A，在冰上迅速研磨匀浆，转移至1.5mL离心管中。

2、室温条件下，50g(约800rpm)离心3min，转移上清液到新管中，并在实体显微镜下检测是否完全除去样品中的细胞核。

3、重复步骤2直到完全除去样品中的细胞核。

4、4℃，800g(约3,000rpm)离心5min，弃上清。

5、向离心管中加入1mL缓冲液B轻缓悬浮沉淀，4℃，800g(约 3,000rpm)离心5min，弃上清。

6、重复步骤5直到完全除去样品中的核DNA及线粒体。

7、向离心管中加入0.4mL缓冲液D悬浮沉淀，同时加入1/20体积的10％十二烷基硫酸钠(SDS)，1/5体积的10％十二烷肌氨酸钠及 1/200体积的10mg/mL蛋白酶K，充分摇匀，37℃孵育3h，期间不断轻轻摇匀。

8、向离心管中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。颠倒混匀2min。20-25℃，12,000g离心5min，转移上清液到新管中。

9、封装到1.5mL离心管中，加入1/10体积3M NaAc溶液(pH5.2) 和2.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀，于-20℃下放置至少1小时。

10、20-25℃，10,000g离心30min，弃上清。

11、向离心管中加入1mL 70％乙醇溶液，室温放置15min。20-25℃， 12,000g离心5min，弃上清。

12、室温风干10min，加入20μL ddH₂O逐管溶解DNA。

b.叶绿体基因组DNA的限制性内切酶消化

1、计算各反应组分的用量，用作Southern杂交的酶切反应推荐使用500μL酶切体系。

取1μgλ噬菌体DNA，用BamH I和Hind III酶切，作为分子量标准，酶切体系如表15：

表15

10×DBuffer	50μL
		BamHI	25μL
HindIII	25μL
		水稻叶绿体DNA	2μg
ddH2O	补足至500μL

2、按H₂O，10×缓冲液、DNA、酶的顺序依次加入1.5ml离心管。 DNA用量为5ug，对于Southern杂交，需10ug基因组DNA，用作阳性对照的转化质粒DNA用量应根据需要进行计算，常使用1个拷贝即 15pg。酶的推荐用量为50-100U/500μL酶切体系。

3、用吸头轻缓混匀，或用手指轻弹混匀，不可涡旋。孵育之前，用离心机稍微离心(3,000rpm，5sec)。剧烈混合易造成酶活性下降。

4、在最佳酶切温度(一般为37℃)，孵育30min至过夜(6-8h 即可)。

5、酶切结束后，有时需要65℃加热10-20min，或加入0.5M EDTA 至终浓度为10mM，以使酶失活。

6、可选：加入适量辅助沉淀剂，如糖原。

7、酶切结束后，颠倒混匀。加入1/10体积(50μL)3M NaAc 溶液(pH5.2)和2倍体积(1mL)无水乙醇，颠倒混匀。

8、-20℃放置1h以上或-80℃放置30min以上。也可在4℃过夜放置，或更长时间。

9、13000g，离心10-30min，弃上清。用1ml 70％乙醇洗涤沉淀， 13,000g，离心2-15min，弃上清。13,000g离心2min，用吸头彻底吸除残留乙醇。

10、干燥DNA沉淀。真空干燥≤10min，空气干燥≤30min，DNA 过度干燥会导致难以溶解。

11、加入适量TE缓冲液或H2O，溶解沉淀(一般用20-40μL，根据原始DNA用量及电泳上样量确定，用于Southern杂交的，推荐用36μL)。

12、室温放置≤6h，或70℃加热2-10min，促进溶解。可置于4℃直到电泳。

c.琼脂糖凝胶电泳

配制浓度为0.8％的琼脂糖凝胶，采用低电压，过夜电泳，如30V， 15h，直到第二指示带(200bp)到接近凝胶底部。电泳结束后，关闭电源，从制胶板上取下凝胶，放入装有足够H₂O(完全覆盖凝胶)的适当容器中，加入10-50μL EB溶液(10mg/mL)染色，EB终浓度为 1μg/mL，室温，低速振荡10-15min。染色结束后，倒掉染色液，用 H₂O清洗凝胶，在紫外凝胶成像仪上观察。若DNA酶切图谱未达标准，应查找原因，重新进行酶切反应。

d.带DNA的硝酸纤维素膜的准备

配制0.8％琼脂凝胶，待30V电泳15个小时后，琼脂糖凝胶经过去嘌呤、变性、复性后，用20×SSC作为转膜液，把DNA转移到硝酸纤维素膜上，紫外交联两次，每次30秒，间隔2分钟。DNA固定后，若不立即进行杂交，应用保鲜膜将膜包好，4℃保存。

e.探针制备

(一)目的基因片段和分子量标准的获得

以野生型水稻叶绿体DNA为模板，利用Os probeF和Os probeR 为引物，进行PCR扩增，获得的片段作为Southern blot的探针，PCR 反应体系如表16：

表16

PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，50℃退火40sec, 72℃延伸1min,30个循环；72℃后延伸5min。

PCR产物用EasyPure PCR Purification Kit试剂盒回收，按说明书操作。回收片段即为待标记的目的基因片段；取200μl分子量标准Trans8K同样利用EasyPurePCRPurification Kit试剂盒回收，回收产物即为待标记的目的分子量标准，保存在-20℃冰箱中备用。

(二)DIG标记DNA探针

取1μg探针，按时间和说明书操作，标记探针。

f.杂交

按试剂盒说明书操作。

D.GFP荧光检测

经过分子鉴定确定已获得水稻叶绿体转基因的同质化植株后，选择生长周期相近的野生型水稻无菌苗作为对照植株进行壮苗与炼苗。在经过炼苗准备移栽之前，将野生型水稻植株和叶绿体转基因水稻植株置于暗室中，分别用白炽灯和365nm的紫外灯照射植株，观察野生型水稻植株和叶绿体转基因水稻植株在不同光源照射下的差异，并利用数码相机拍摄照片记录。紫外观察后，将转基因植株与对照移栽至装有蛭石的营养钵中，在弱光环境下继续培养1周，再移至正常光照环境下生长。

把转基因植株的叶片用手术刀将叶片切成细丝浸泡于13％的甘露醇溶液中。高渗处理1h后，将水稻叶片细丝捞出，浸泡在原生质体离解液中，并置于摇床上28℃，60rpm黑暗处理8hr，分离原生质体。把原生质体滴在盖玻片上，用激光共聚焦扫描显微镜(FV1000-IX81) (日本Olympus公司)进行检查。并在激光模式设置界面中选择，自然光滤光片、绿色荧光蛋白滤光片、叶绿素荧光滤光片，并设置自然光通道、绿色荧光通道、叶绿素荧光通道、荧光融合通道，扫描并记录不同通道下的镜检结果。

E.外源蛋白表达分析

将野生型水稻植株与经分子鉴定确定的水稻叶绿体转基因植株分别提取总可溶性蛋白(total soluble protein,tsp)，经提 Branford等方法测定总蛋白浓度后取一定量的蛋白进行SDS电泳及 western检测分析外源基因在植物叶绿体中的表达情况。具体方法如下：

1、取非转化水稻植株和叶绿体转基因水稻植株的叶片剪下，精确称量0.5g在液氮中研磨成粉末，装入经预冷的离心管中。

2、按1：2(W/V)的比例向每个离心管中添加1mL PBS缓冲液，并置于冰上直至完全融化。

3、在震荡混匀器上漩涡30sec；

4、在4℃条件下15,000g离心20min，所获得的上清液即总可溶性蛋白，可暂时在4℃冰箱中保存。

5、用Branford法，依照海杰瑞生物技术有限公司Branford蛋白定量试剂盒说明书进行操作。测定可溶性总蛋白浓度，并添加适量PBS 缓冲液将样品之间的浓度调整至浓度相同

6、根据测定的蛋白浓度取约100μg待测样品总蛋白在沸水中保持5min后，上样于15％的SDS-PAGE凝胶，120V电压下直至溴酚蓝跑出凝胶。

7、用考马斯亮蓝法进行染色。

2.结果与分析

2.1适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立

A.愈伤组织的诱导

以20个水稻早熟品系为材料，叶鞘灭菌后直接取幼穗按照前述方法放置在诱导培养基上培养，统计愈伤诱导的结果。由于幼穗的部位特殊性，无需采用传统的升汞、次氯酸钠和过氧化氢等方法对幼穗进行灭菌即可达到无菌的要求。统计结果表明(见表17)，除了水稻品系35、117和1471未能诱导出愈伤组织外，其余品系的诱导率均大于50％，有10个品系的出愈率大于90％，但是其中仅有17、19、 58、239、501和808的愈伤组织主要为II型愈伤(见图1)，故选择这几个品系继续进行下一步试验。

表17

*ND_t未检测

B.愈伤组织的分化

将上述6种基因型诱导的II型愈伤组织块移至3种不同的分化培养基上分化培养，结果如图2所示。我们发现，3种不同培养基对 6种基因型水稻愈伤组织的分化再生影响各异，其中品系808的最适分化培养基为SF1，品系17、58、239和501的最适分化培养基均为SF2，而品系19最适分化培养基则为SF3。其中19、58和808三个品系在各自最适培养基上的高频分化率均在70％以上，具备作为叶绿体转化受体的潜力。同时，选择取此三个品系进行下一步的多轮继代并分析其再生能力。

C.继代时间对愈伤组织再生的影响

本试验表明，经多次继代培养后，愈伤组织的分化能力明显下降。水稻品系808的愈伤组织经连续继代8次后，在其最适分化培养基 SF1上的分化率为48.7％(见图3A)。全部56块愈伤组织中仅有2 块分化出了10株以上的再生植株，高频分化率为3.6％，且出现了较多的白化苗，因此该品系不适合多次继代；水稻品系58(见图3B) 在最适分化培养基SF2上再生的愈伤组织均可分化出10株以上的再生植株，但由于分化率下降严重，仅仅为14.7％，同样也不适合多轮继代试验；水稻品系19(见图3C)在最适分化培养基SF3上的分化率为77.8％，高频分化率为36.1％，分化率和分化频次都是叶绿体转化过程中高压多轮筛选所必备的基本条件，是今后水稻叶绿体转基因研究潜在的受体材料。

D.再生植株生根与移栽

将水稻品系19的分化植株移至不含任何激素的MS培养基上，培养10天左右可以生根(如图4A)，再经过20天左右的培养植株长至10cm，经过炼苗后(如图4B)，移栽到土壤中(如图4C)，再生植株能够正常生长并结实(如图4D)。

2.2水稻叶绿体转化筛选策略的选择

A.筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响

由图5可知，壮观霉素对水稻品系19的愈伤组织的增值影响不明显，尽管其浓度范围由0～500mg/L之间发生变化，但对水稻愈伤组织增值比例差异较小，且增值比例的高低与添加的壮观霉素浓度没有相关性。因此，壮观霉素不适合作为水稻叶绿体转化的筛选剂。尽管当不含L-脯氨酸的水稻继代培养基中草甘膦浓度达到20mg/L即对水稻愈伤组织的增值产生明显的抑制作用，但当添加了L-脯氨酸后，即使浓度达到50mg/L水稻愈伤组织对草甘膦仍不敏感，故如果使用草甘膦作为水稻叶绿体转化的筛选剂，那么水稻继代培养基中不可以添加L-脯氨酸，而L-脯氨酸对水稻愈伤组织的保持有非常重要的作用，因此，草甘膦不是水稻叶绿体转化的首选筛选剂。草丁膦和潮霉素分别在达到5mg/L和20mg/L对愈伤组织的增值抑制作用最为显著，且不受培养基中L-脯氨酸的影响。因此，草丁膦和潮霉素是水稻叶绿体转化的首选筛选剂,如图6所示。

B.抗性基因-筛选剂组合的适用性评价

通过亚克隆，成功的将三个抗性基因插入到原核表达载体 pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间，成功的构建了原核表达载体pSYNTH-HPT(含有HPT基因)、pSYNTH-bar(含有bar基因) 和pSYNTH-soilA(含有EPSPS基因)。通过在含有与之相对应的筛选剂的培养基上进行了抗性试验发现，在添加2g/L的L-脯氨酸的M9液体培养基上，即使没有相应的抗性基因表达大肠杆菌Mach1细胞也能在含有较高浓度的草甘膦和草丁膦的M9培养基上生长，这说明尽管草甘膦和草丁膦弄够在不同条件下抑制水稻愈伤组织的增殖，但是它们对原核细胞(质体)的抑制作用明显受L-脯氨酸的影响；而无论是否添加L-脯氨酸在没有抗性基因HPT存在的情况下，大肠杆菌Mach1细胞都潮霉素的抑制，同时HPT基因可以赋予大肠杆菌Mach1细胞，耐受高达 500mg/L潮霉素的能力。

上述试验结果表明，壮观霉素和aadA基因最不适合作为水稻叶绿体转化的筛选剂和筛选基因；而草甘膦和EPSPS基因以及草丁膦和 bar基因除非在水稻筛选培养基中不添加L-脯氨酸的情况下才可以作为水稻叶绿体转化的筛选剂和筛选基因，但是考虑到叶绿体转化需要进行长时间多轮筛选，而L-脯氨酸对水稻愈伤组织的保持有非常重要的作用，因此，最适合作为水稻叶绿体转化的筛选剂和筛选基因是潮霉素和HPT基因。

2.3水稻叶绿体同源重组片段的获得与序列分析

如图7A所示，以提取的水稻总DNA为模板进行PCR扩增反应。成功的获得了长度与预期相符的PCR产物条带，且同源大片段的PCR 扩增产物为单一条带，因此不需要进行琼脂糖胶回收，可直接采用PCR回收试剂盒回收便可用于TA载体连接。将获得的重组质粒交由北京华大基因有限公司测序，测序引物为M13F和M13R。所获得的同源大片段与NCBI上登录的水稻叶绿体基因组16S-trnI-trnA-23S基因序列进行比对结果如图7B所示，同源率100％，为下一步构建水稻叶绿体表达载体带来依据。将该质粒命名为：pEASY-Os。

2.4HPT基因的密码子优化及表达框设计

经Genscript Rare Codon Analysis Tool分析结果表明，载体 pUC57-Nsyth中的MSI99基因、smGFP基因均满足CAI值大于0.7的要求，不需要进一步优化。因此，仅将HPT基因按照codon usage databases数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) 中提供的水稻叶绿体基因组密码子偏好性，进行优化，其CAI值由 0.74上升到0.94。优化后的序列替换pUC57-Nsyth序列中aadA基因序列。

并使用水稻来源的Prrn启动子、Trps16终止子序列替换 pUC57-Nsyth中的启动子和终止子设计 Prrn-T7g10-MSI99-smGFP-HPT-Trps16表达盒交给上海杰瑞生物技术有限公司合成，合成后置于pUC57载体上，命名该质粒为 pUC57-Osynth，如图8所示。

2.5载体pWYP23151的构建

如图9A所示，通过PCR反应成功的将 Prrn-T7g10-MSI99-smGFP-HPT-Trps16表达盒扩增分离出来，且由于引物“Osynth重组F”和“Osynth重组R”的5’端各添加15bp同源序列(载体pEASY-Os被Nsi I酶切位点两端)，使得PCR产物两端含有与pEASY-Os被NsiI酶切开的两端15bp的同源序列，可以通过金斯瑞生物公司的重组克隆试剂盒进行无缝连接。由于目的条带单一，故通过通过PCR纯化试剂盒进行回收并用Nano Drop2000 核酸测定仪测定回收后的载体浓度为324ng/μL，经重蒸水稀释到浓度为164ng/μL后与所获得的线性化载体片段进行重组连接反应，并将反应产物转化大肠杆菌。

对所获得的转化子用“Os检测F”和“Os检测R”作为引物进行 PCR检测，结果如图9B所示证明表达框 Prrn-T7g10-MSI99-smGFP-HPT-Trps16已成功连入载体pEASY-Os的限制性内切酶NsiI的识别位点中。将该载体交由上海生工测序，测序结果进一步证实了该片段已成功连入载体，插入方向与预先设计的一致，如图9C所示，将重组载体命名为：pWYP23451。

如图9D所示，将携带pEASY-Os、pUC57-Osyth和pWYP23151的三种载体的大肠杆菌细胞在LB固体培养基上划线，分别在自然光和紫外光下检测，发现携带重组载体pUC57-Osyth和pWYP23451的大肠杆菌具有绿色荧光，说明GFP基因在Prrn启动子的驱动下得到表达，间接证明MSI99基因也能获得表达，为下一步进行水稻叶绿体转化工作提供了可行性证据。

2.6叶绿体转化植株的获得及分子检测

经基因枪轰击过的水稻愈伤组织在含有500mg/L潮霉素的水稻筛选培养基上进行筛选，每20天更换一次培养基。第8次更换培养基(约180d)后，如图10A所示出现了抗性愈伤组织。载体pWYP23151 对水稻叶绿体基因组的整合如图11所示

提取DNA进行PCR检测，结果图12所示，所获得的全部抗性愈伤组织中均检测到与GFP基因、HPT基因和MSI99基因对应的扩增片段。

经统计，共计获得49块抗性愈伤组织，其中21块愈伤组织来源于进行基因枪轰击前进行高渗处理的水稻愈伤组织，而仅有28块愈伤组织来源于未进行高渗处理的水稻愈伤组织。由此可见高渗处理没有对提高水稻叶绿体转化效率起到作用。不同轰击距离之间差异则较为明显，当轰击距离为9cm时，经筛选获得的抗性愈伤组织块数最多，共计44块。轰击距离为6cm和12cm的水稻愈伤组织经筛选仅获得4 块和1块抗性愈伤。

继续筛选至第14次更换培养基(约300d)后，所获得的抗性愈伤组织用Os检测F和Os检测R作为引物进行PCR扩增，除了样品3 之外的其他样品仅得到4.4kb的条带(图12-D)。Southern Blot分析结果(图12-F)证实此时的愈伤组织绝大多数已经通过高压多轮筛选最终获得了同质化。在超净工作台中，用镊子取部分抗性愈伤组织进行GFP荧光活性检测结果如图10-B所示，获得的抗性愈伤组织在紫外光照射下能发出强烈的绿色荧光。将抗性愈伤组织置于分化培养基上，约30d左右成功分化出了2株再生植株。全部再生植株均来自经高渗处理的水稻抗性愈伤组织，由此可以认为分化前的高渗处理是十分必要的。

2.7GFP荧光检测

在获得的水稻叶绿体转基因植株移栽至土壤中之前，分别在自然光和紫外光下进行观察，结果发现，尽管在自然光下野生型水稻植株 (图13A)和转基因植株(图13B)叶片颜色、形态等方面没有明显区别。而在紫外灯下，野生型水稻植株(图13C)的因叶绿素受到紫外光激发出红色荧光，而水稻叶绿体转基因植株(图13D)则发出绿色荧光。由此可知smGFP基因，在水稻叶绿体中获得了大量表达，其经紫外激发出的绿色荧光完全遮盖了叶绿素发出的红色荧光。

共聚焦显微镜检测结果(图13E-H)表明，一方面GFP蛋白等外源蛋白表达后一直集中存在于水稻叶绿体中；另一方面，外源基因在水稻叶绿体中的表达量十分巨大。

2.8转基因水稻外源蛋白表达分析

将获得的2株水稻叶绿体转基因植株和阴性对照(野生型水稻植株)分别用PBS缓冲液提取植物总可溶性蛋白，并用Branford法测定其可溶性总蛋白浓度，添加适量稀释至10mg/mL，各取5μL进行 SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE分析结果如图14所示，在所有2个转基因植株的可溶性蛋白中，均有27KD特异性的绿色荧光蛋白GFP条带(约27KD，右侧箭头所示)，而野生型植株在相应的位置没有该条特异性带，显示 GFP获得大量表达。

3.结论

首先，本研究首次获得了同质化的水稻叶绿体转基因愈伤组织和植株材料，并得到了分子证据。

其次，通过筛选获得了适合于进行叶绿体转化的水稻材料，该改良具有以下特征：具有高频的再生能力；诱导产生的II性愈伤组织，在长期(大于6个月)继代培养后仍具有良好的分化能力。

另外，通过比较证明了潮霉素比常用的壮观霉素及其它筛选剂(抗生素或除草剂)更适合于作为水稻叶绿体转化的筛选剂。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、检测筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响；

步骤(2)、抗性基因-筛选剂组合的筛选。

2.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的筛选剂包括壮观霉素、潮霉素B、草丁膦、草甘膦中的至少两种。

3.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)的检测方法为：将愈伤组织放置在的筛选培养基上，培养后称量愈伤组织的重量，计算不同种类和浓度的筛选剂对愈伤组织重量增长的影响。

4.根据权利要求3所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，筛选培养基为按照水稻继代培养基配方同水稻幼穗愈伤组织诱导培养基配方添加不同种类、不同浓度的筛选剂配制而成。

5.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)的筛选方法为：

(5.1)、提取携带不同抗性基因的载体，根据载体中已知的pCAMBIA1301中的HPT基因、pCAMBIA3301中的bar基因和pCAMBIA330E中的EPSPS基因设计引物，引物两端分别添加PvuII酶切位点，通过PCR扩增获得该三个基因的片段；

(5.2)、三个抗性基因的PCR产物回收后连接到原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间，将抗性基因正确插入到原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间的阳性克隆命名为pSYNTH-HPT、pSYNTH-bar、pSYNTH-soilA；

(5.3)、将含有载体pSYTH-HPT、pSYTH-bar、pSYTH-soilA的大肠杆菌Mach1菌液分别接种于含有与其相对应的筛选剂的M9液体培养基和添加L-脯氨酸的液体培养基上，并将含有载体pEASY-synth的大肠杆菌Mach1细胞作为对照，分析其OD值的变化；

(5.4)、选择能够耐受10倍浓度以上筛选剂用量且筛选效果不受培养基成分中L-脯氨酸影响的抗性基因和筛选剂的组合。

6.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立。

7.根据权利要求6所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立方法包括：水稻幼穗愈伤组织的诱导；愈伤组织的分化；分析多轮继代培养对其分化的影响；再生植株生根与移栽。

8.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述水稻幼穗愈伤组织的诱导方法为：在水稻进入孕穗期后，将水稻茎秆拔出，灭菌，取出幼穗，接种于愈伤组织诱导培养基上，观察愈伤诱导情况，计算诱导率，鉴别愈伤组织的类型。

9.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述愈伤组织的分化方法为：取II型水稻愈伤组织，分别置于分化培养基上进行分化培养，计算分化率和高频分化率。

10.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，分析多轮继代培养对其分化的影响方法为：将筛选出的多个品系的愈伤组织，放置在水稻诱导培养基上，每隔20天左右继代一次，连续继代10次，然后分别置于最适的分化培养基上分化培养40天，照相记录，分析多轮继代培养对其分化的影响，统计分化率和高频分化率。