CN100334218C - 使用生长素前体有效产生转基因植物 - Google Patents

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Abstract

一种产生转基因植物的方法，它包括：(A)将载体引入植物细胞，其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含：所需基因、含有编码酶的基因的可选标记基因，这种酶可由生长素前体合成生长素；(B)在生长素前体和/或其类似物存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及(C)培养将上述在(B)中选出的再分化组织以成再分化一种植物个体，和一种将基因引入植物的载体，所述载体包含：所需基因以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因，但没有色氨酸单加氧酶(iaaM)基因的可选标记基因。

Description

使用生长素前体有效产生转基因植物
(1)技术领域
本发明涉及一种用基因工程技术有效产生转基因植物的方法，以及用于此方法的载体。
(2)技术背景
当通过将所需基因引入感兴趣的植物来产生转基因植物时，通常需要以下三个步骤：(1)将所需基因引入植物细胞；(2)选择植物组织(已引入所需基因的组织)，所述组织含有已引入所需基因的细胞，以及(3)使植物由所选植物组织再分化。这些步骤中，在选择已引入所需基因的组织时，仅仅将所需基因的表达作为细胞培养阶段的指标不容易选择这种组织，因此将所需基因和可选标记基因一起引入植物细胞，这种可选标记基因的表达容易检测，并可根据存在或不存在可选标记基因的表达选择所述已引入所需基因的组织。所用可选标记基因实际上且通常包括与药物抗性有关的基因，如卡那霉素抗性基因(NPTII：新霉素磷酸转移酶基因)和潮霉素抗性基因(HPT：潮霉素磷酸转移酶基因)，它们可提供对抗生素的抗性，以及磺酰脲抗性基因(ALS：乙酰乳酸合酶基因)，它可提供对农药的抗性，等等。
当将与药物抗性有关的基因用作可选标记基因时，在引入基因后用含有此类药物的培养基培养细胞，这种药物可评定所述可选标记基因存在或不存在(即药物抗性)，并将评定结果作为指标进行选择。由于这种药物对植物细胞通常是有毒的，当用这种培养基培养时，未引入可选标记基因(故而也未引入所需基因)的植物细胞会死亡。然而，即便在这种情况下存在抗性，即即使植物细胞在这种药物存在时可以生长，这也是程度的问题，因此在这种药物存在时进行培养对植物细胞有不可避免的坏影响，这实际上造成了诸如生长率减少和伴随植物细胞活性降低产生的已引入所需基因的组织再分化率减少之类的问题。
为解决这些问题，在JP-A-9-154580中介绍了一种将基因引入植物的新型载体和用所述载体将基因引入植物的方法。当用上述载体和方法引入基因时，仅将基因引入后植物组织的形态学变化作为指标就可选出已引入所需基因的组织，而无需使用会降低植物细胞活性的药物。
在上述JP-A-9-154580揭示的载体和方法中，诱导形态学异常的基因，如植物激素合成基因被用作可选标记基因，在基因引入后，可以不定芽或不定根的形式由组织获得已引入所需基因的组织。然而，在用这种方式获得的不定芽或不定根中，存在相当大量的未引入所需基因的组织(以后也称为“逃逸组织(escape)”)。似乎细胞(已和所需基因一起引入了诱导形态学异常的基因)产生的植物激素等被转移到其周围的细胞中，因此造成了上述影响，同时，由受到影响的未引入基因的细胞分化和增殖的组织也显示出形态学异常。通常认为将基因引入植物是困难的，且不定芽最初在植物中有很低的再分化率。此外，由于存在这种逃逸组织，对已引入所需基因的组织的选择效率非常低，因此特别需要改进再分化率和选择效率。
(3)发明内容
本发明的目的是提供有效产生转基因植物的方法，它可选择已引入所需基因的组织而无需使用会降低植物细胞活性的药物，此外，它还有改进的选择效率。
本发明的另一个目的是提供用于此方法的载体。
本发明的这些目的和其它目的是通过产生转基因植物的方法实现的，所述方法包括：
(A)将载体引入植物细胞，
其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含：
所需基因，以及
含有编码酶的基因的可选标记基因，这种酶可由生长素前体合成生长素；
(B)在生长素前体和/或其类似物存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及
(C)将上述在(B)中选出的再分化组织培养成再分化的植物个体。
同时，本发明的这些目的和其它目的也可通过用来将基因引入植物的载体实现，所述载体包含：
所需基因，以及
含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因，但没有色氨酸单加氧酶(iaaM)基因的可选标记基因。
(4)附图说明
图1是显示pIAH6载体中将被整合到植物染色体的T-DNA区域的结构的示意图。
图2是显示pIPT10载体中将被整合到植物染色体的T-DNA区域的结构的示意图。
(5)具体实施方式
作为深入研究的结果，本发明人发现通过人工控制在已引入所需基因的细胞中合成生长素的量可实现上述目的，因此完成了本发明。
在本发明所述的方法(以后也可称为“本发明的方法”)中，生长素前体-生长素合成基因被用作可选标记基因。生长素是一种植物激素，已知它促进细胞伸长、增殖和分裂。例如，就植物病原体根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，此后称为“A.tumefaciens”)而言，通过色氨酸单加氧酶的氧化，色氨酸被转化成生长素前体吲哚乙酰胺(IAM)，然后IAM被吲哚乙酰胺水解酶水解，由此转变成天然的生长素吲哚乙酸(IAA)。在这种情况中，编码色氨酸单加氧酶的基因是iaaM基因，编码吲哚乙酰胺水解的基因是iaaH基因(D.Inze，M.VanMontagu，Mol.Gen.Genet.，194：265(1984))。当iaaH基因单独存在时不能合成生长素(Harry Klee，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：529-51(1991))。通过分析iaaH基因清楚得知，它在此过程中是作为生长素前体-生长素合成基因的，因此，那些精通此领域的技术人员将容易得到这种基因，且它是优选用于本发明的基因。
同样，除了生长素前体-生长素合成基因，其它植物激素合成基因(如上述iaaM基因)和作为植物激素的细胞因子合成基因(它可促进侧芽增殖和细胞分裂)也可用作可选标记基因。特别地，当使用细胞因子合成基因时，仅通过调节培养基中生长素前体和/或其类似物的浓度就有可能控制植物细胞(已通过本发明的方法引入所需基因)产生再分化组织。最典型的作为细胞因子合成基因的基因是ipt基因(A.C.Smigocki，L.D.Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5131(1988))。由于也已经清楚分析了ipt基因，那些精通此领域的技术人员将容易得到这种基因，且它是优选用于本发明的基因。
根据本发明的方法，含有这些作为植物激素基因的可选标记基因和所需基因一起被插入载体(已知是作为将基因引入植物的载体)并被引入植物细胞。可间接通过病毒或感染植物的细菌，或者直接通过物理和化学技术将所述载体引入植物细胞(I.Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205(1991))。
当通过病毒或感染植物的细菌引入载体时，例如，可以使用花椰菜花叶病毒、双粒病毒组、烟草花叶病毒和雀麦花叶病毒等病毒和根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根土壤杆菌(Agroba terium rhizogenes)等细菌。此外，通过物理和化学技术引入所述载体的方法包括微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、融合法、高速弹道穿透法等。
引入基因后，在生长素前体和/或其类似物存在的情况下培养该植物细胞，以产生不定芽之类的再分化组织。在这种情况下，生长素前体或其类似物是可通过表达作为可选标记基因引入的生长素前体-生长素合成基因转变成生长素的物质，或是可通过表达作为可选标记基因引入的生长素前体-生长素合成基因而具有类似于生长素的生理活性的物质(以后也可称为“生长素样物质”)。例如，当上述iaaH基因被表达时，吲哚乙酰胺水解酶被合成，除其原始底物IAM外，这种酶还可水解萘乙酸酰胺(NAM)，将其转变为合成的生长素萘乙酸(NAA)。因此，当iaaH基因在本发明中被用作生长素前体-生长素合成基因时，NAM也可被用作生长素前体的类似物，这与生长素前体IAM的情况类似。
同样，已知再分化组织如不定芽的产生主要是由细胞因子和生长素控制的。这就是说，当细胞因子/生长素的比例高时，芽的分化被诱导，而当细胞因子/生长素的比例低时，诱导根的分化(John D.HaMill，Aust.J.Plant Physiol.，20：405(1993))。
另一方面，生长素前体-生长素合成基因也可被作为可选标记基因引入本发明已引入所需基因的细胞。因此，通过补充有合适量生长素前体和/或其类似物(以后也可称为“生长素前体等”)和细胞因子的培养基培养已引入基因的植物细胞，可产生已引入所需基因的不定芽之类的再分化组织。由于通过生长素前体-生长素合成基因响应其所加量的作用，生长素前体等在已引入所需基因的植物细胞中被转变成生长素样物质，因此当用补充有合适量生长素前体等和细胞因子的培养基进行培养时，最终在已引入所需基因的植物细胞中提供了合适量的生长素和细胞因子，因此它们有最佳的细胞因子/生长素比例以再分化不定芽等。另一方面，未引入所需基因的细胞采取了不同于已引入所需基因的细胞的行动。这就是说，由于未将生长素前体-生长素合成基因引入细胞，此细胞将生长素前体等用作生长素的能力非常低，这样，在添加到培养基中的生长素前体等和细胞因子之中，它主要可单独使用细胞因子。
此外，如上所述，当将细胞因子合成基因和生长素前体-生长素合成基因一起用作本发明的可选标记基因时，使用培养基(其中，生长素前体和/或其类似物的浓度被适当设定)简单培养经引入基因处理的植物细胞就可使已引入所需基因的不定芽等再分化。这就是说，这种情况下，在已引入所需基因的细胞中，根据所添加的量，生长素前体等被转变为生长素样物质，且无需在培养基中加入细胞因子，细胞因子合成基因即可主动合成细胞因子，这样，当用已加入合适量的生长素前体等的培养基培养所述细胞时，所述已引入所需基因的细胞中细胞因子/生长素的比例就会变成最适合不定芽等再分化的值。另一方面，未引入所需基因的细胞采取了明显不同于已引入所需基因的细胞的行动。这就是说，由于未将生长素前体-生长素合成基因和细胞因子合成基因引入细胞，故很难产生这种植物激素。
通过上面的描述显见，根据本发明的方法，通过控制加到培养基中的生长素前体和/或其类似物和细胞因子的量可使所述已引入所需基因的不定芽等较好地再分化，由此可降低逃逸频率。特别地，当将细胞因子合成基因和生长素前体-生长素合成基因一起用作可选标记基因时，可得到较大的效果。
根据植物激素的种类和采用本发明的方法用来产生转化体的植物种类可任选地确定实际加到培养基中的生长素前体等和细胞因子的特定量。在确定这一量时，例如可用载体对用来产生转化体的植物采用基因引入处理，所述载体含有用于本发明的可选标记基因和和报道基因(如GUS(β-D-葡糖醛酸酶)基因)。在基因引入后，通过在几个步骤中改变培养基中生长素前体等和细胞因子的种类和数量以培养所述组织，这样可使不定芽等再分化以检测报道基因的表达。由于使表达报道基因的不定芽等再分化率最高的条件是最适合由已引入所需基因的植物细胞产生再分化组织的条件，因此，可通过用本发明的方法将所需基因引入植物，以根据产生转化体时生长素前体等和细胞因子的种类和数量采用这种条件。
同样，除生长素前体等和细胞因子外，可在上述培养基中加入植物细胞增殖和分化所必需的成分和/或植物细胞增殖和分化不必需的其它成分以产生再分化的组织，这些成分的加入量应不会破坏本发明的目的。所述培养基包括固体培养基，它是在基础培养基或经轻微修饰以适合所述植物产生转化体的基础培养基中加入生长素前体等和细胞因子、1-3w/v％蔗糖作为碳源和0.5-1.0w/v％琼脂或0.1-0.4w/v％吉兰糖胶作为凝固剂而制备的，上述基础培养基有MS(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15：473-497(1962))或WPM(Loyd和McCown，Prop.Int.PlantProp.Soc.，30：421-427(1980))。
根据本发明的方法，由此获得的再分化组织(如不定芽)被检测和选择，因此可用再分化的植物个体来产生其中已引入所需基因的转基因植物。因为被选择的组织是再分化组织如不定芽，所用可用肉眼进行检测和选择，而无需借助特殊的试剂和工具。此外，由于作为可选标记基因被引入的生长素前体-生长素合成基因和加到培养基中用于产生再分化组织的生长素前体和/或其类似物的协同作用，用这种方法选择的已引入所需基因的再分化组织的频率要高于通常情况中的频率。此外，由于对已引入所需基因的组织的选择效率非常出色，通过使由此得到的再分化组织再分化成植物个体，可有效产生其中已引入所需基因的转基因植物。
例如，当由此得到的再分化组织是不定芽时，可照其原样切开不定芽或待其长至一定程度后再将其切开，然后把它放在生根培养基中使其生根，这样可使它再分化成植物个体。在这种情况下，优选的培养温度为15-30℃，光照强度小于50μmol/m2/s。生根培养基包括通过在上述基础培养基中加入一种或多种生长素(如作为植物激素的NAA和吲哚丁酸)而制得的液体培养基或其稀释液，并进一步补充5-30g/l蔗糖作为碳源，或是通过用琼脂等固化而制得的固体培养基。
此外，如本发明所述的载体(以后称为“本发明的载体”)是将基因引入植物的载体，它在进入植物染色体的基因引入区包含所需基因以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因但没有色氨酸单加氧酶(iaaM)基因的可选标记基因。通过使用这种结构的载体可在较高水平实现本发明的方法。
除迄今所述基因外，用于本发明方法的载体和上述本发明的载体还含有其它基因和因子(具有特定功能的DNA序列)，只要这些基因和因子不会破坏本发明的目的。例如，如JP-A-9-154580中建议的，当将生长素前体-生长素合成基因和细胞因子合成基因与可除去的DNA元件结合使用时，在选择再分化组织后可将用作可选标记基因的基因除去，这样就有可能得到可选标记基因的影响被完全排除的转基因植物。可由转座子或位点特异性重组系统获得可除去的DNA元件。
对可施用本发明方法和载体的植物种类没有特殊的限制。然而，对被认为是难以产生转化体的植物如木本植物施用本发明的方法和载体会有特别大的效果。
此外，对用本发明的方法和载体引入的所需基因的种类也没有限制。可根据不同的目的自由选择，如可提供优良农业特性的基因和无法一直提供优良农业特性但是研究基因表达机制所必需的基因。
在植物组织培养中，植物激素生长素和细胞因子在将培养的组织再分化成植物个体的方法的各个步骤中有很大关系。再分化组织如不定芽等的产生也不例外。如上所述，不定芽等的产生是由细胞因子/生长素的比例控制的，当细胞中细胞因子/生长素的比例变为合适值时细胞可首次产生不定芽等。
所以，当仅用细胞因子合成基因和/或生长素合成基因作为可选标记基因时，得到已引入所需基因的再分化组织的频率低。这种情况下，通过可选标记基因的作用可在已引入所需基因的细胞中主动产生细胞因子和生长素，但这种生产率不能人工控制，因此已引入植物激素基因的细胞(即已引入所需基因的细胞)中细胞因子/生长素的比例不会一直是合适的值。因此，所述细胞不会一直较好地再分化其中未引入所需基因的细胞。
因此，根据本发明，生长素前体-生长素合成基因被用作可选标记基因，且已引入所需基因的细胞中合成的生长素的量受生长素前体等的协同作用人工控制。这就是说，将生长素前体-生长素合成基因和所需基因一起作为可选标记基因对植物组织引入基因，并用补充有生长素前体和/或其类似物的培养基培养植物组织。其结果是，在已引入所需基因的细胞中，作为对培养基中生长素前体等浓度的响应产生了生长素，这样也就可以通过控制添加到培养基中的生长素前体等的量控制细胞中生长素的量。这种情况下，当通过将预定量的细胞因子作为其它植物激素和生长素前体等一起添加到培养基中，或者通过将细胞因子合成基因和生长素前体-生长素合成基因一起引入细胞，以便用这种方法对已引入所需基因的细胞施加这种预定量的细胞因子时，同样可以控制细胞中细胞因子/生长素的比例。
根据本发明，已引入所需基因的细胞中细胞因子/生长素的比例被控制在最佳水平以使不定芽等再分化，从而加快从所述细胞中产生再分化组织，同时在引入基因后已引入所需基因的不定芽等可较好地从植物组织中再分化，从而降低逃逸组织的频率。据认为，当将细胞因子合成基因和生长素前体-生长素合成基因一起用作可选标记基因时可得到特别大的效果。这种情况下，与将生长素前体-生长素合成基因单独用作可选标记基因时的情况相比，已引入所需基因的细胞和未引入所需基因的细胞之间在与植物激素有关的胞内生理环境上存在很大差异。因此，据认为当通过在培养基中添加合适量的生长素前体等进行培养时，已引入所需基因的细胞显示了较好的分化不定芽的能力。
根据本发明，已引入所需基因的植物细胞中细胞因子/生长素的比例是可人工控制的。因此，已引入所需基因的植物细胞中细胞因子/生长素的比例可被控制在最适合产生不定芽等再分化组织、可加快细胞再分化同时可使细胞较好地再分化出不定芽等的水平。
因此，本发明降低了所谓逃逸的频率，从而改善了已引入所需基因的组织的选择效率并改进了转化体的获得比例。对被认为是难以产生转化体的植物施用时会有特别大的效果。因此，根据本发明，可有效产生转基因植物。
此外，根据本发明，作为将可选标记基因和可除去的DNA元件一起使用的结果，有可能产生出所用可选标记基因的影响被完全排除的转基因植物。
这就是说，即使在不便于产生转化体的植物中，也可有效产生转化体，此外根据本发明还可以产生出可选标记基因的影响被完全排除和仅引入所需基因的转基因植物。
下面根据实施例描述了本发明；然而，本发明不限于此。
实施例1
使用质粒pIAH6作为载体，将GUS基因作为所需基因的模型，并将ipt基因和iaaH基因作为可选标记基因，通过用本发明的方法将基因引入蓝桉(Eucalyptusglobulus，以后称为“E.globulus”)进行基因引入，由此可产生转化体。
图1显示在pIAH6的结构中，将被整合进植物染色体的区域(T-DNA区域)。在此图中，被圈起来的P和T分别代表ipt基因和iaaH基因的启动子和聚腺苷酸化信号，NOS-P代表胭脂氨酸合酶基因的启动子，T代表胭脂氨酸合酶基因的聚腺苷酸化信号，35S-P代表花椰菜花叶病毒的35S启动子。同样，图中两末端上的黑色箭头代表划分T-DNA区域的RB位点和LB位点。此质粒的T-DNA区域以外的其它部分与市售的植物基因引入载体pBI121(TOYOBO制造)的相对应部分有同样的结构。
质粒pIAH6已经被引入大肠杆菌JM109，所述大肠杆菌已于2003年7月16日被国际专利生物保藏所，国立先进工业科学和技术国立学院(InternationalPatent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial andTechnology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi  1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)作为FERM BP-8429保藏，保藏物称为大肠杆菌JM109(pIAH6)。
I.将质粒pIAH6引入土壤杆菌
将根瘤土壤杆菌EHA105接种在10ml YEB液体培养基中(5g/l牛肉提取物、1g/l酵母提取物、1g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、2mM MgSO4、pH7.2，温度为22℃)并在28℃培养直至OD630值达到0.4-0.6。以6,900×g，4℃将培养液离心10分钟以收集细胞，将由此收集的细胞悬浮于20ml的10mM HEPES(pH8.0)，并再以6,900×g，4℃离心10分钟以收集细胞，然后将由此收集的细胞悬浮于200μl YEB液体培养基，并将此细胞悬液用于引入质粒。
在0.5ml的容量试管(Assist制造)中将50μl由此制备的用于引入质粒的细胞悬液和3μl上述pIAH6混合，然后进行电穿孔(Gene Pulser II系统(BIORAD制造))，这样可将质粒pIAH6引入土壤杆菌。电穿孔后，在混合物中加入200μl YEB液体培养基，然后在25℃振荡培养1小时，并将由此获得的细胞接种在补充有50mg/l卡那霉素的YEB琼脂培养基(1.5 w/v％琼脂、其它成分如上所述)中28℃培养2天以得到根瘤土壤杆菌的细胞集落。用碱法从此集落的细胞中提取质粒，用限制性酶HindIII、SmaI和EcoRI消化此质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析消化液，确定pIAH6引入根瘤土壤杆菌EHA105。
II.将pIAH6引入桉树
将来自智利的蓝桉的种子在70％的乙醇中浸泡约1分钟消毒，然后在2％的次氯酸钠水溶液中浸泡并搅拌约4小时，用无菌水充分洗涤，接种在已加入0.5mg/l玉米素的MS琼脂培养基中，并在4℃冰箱中储存两天以促进萌发，然后在25℃用光强度约10μmol/m2/s的光照条件下进行培养以使其萌发。种子在萌发培养基中培养1-2周后，切除萌发的幼苗的顶芽、子叶和根以收集下胚轴，并将下胚轴切成约5mm的切片以作为基因引入的样品并进行以下试验。
将在上述项目中已引入质粒pIAH6的根瘤土壤杆菌EHA105在YEB液体培养基中培养过夜，然后用EG基础培养基稀释至OD630＝0.5，并将上面准备的下胚轴切片浸泡在所述细胞悬液中。然后在除去多余的细胞悬液后，将各个切片和土壤杆菌在琼脂培养基上(琼脂8.5g/l)于25℃在黑暗中共培养3天，所述琼脂培养基是通过在EG基础培养基中加入1.0mg/l玉米素、0.05mg/l NAA和40mg/l乙酰丁香酮(acetosyringone)制得的，这样可使已引入pIAH6的土壤杆菌感染各个切片。这时，经过改良的含有浓度比为1∶3的氨态氮/硝态氮(5mM NH4，15mM NO3)并补充有20g/l蔗糖的MS培养基被用作EG基础培养基。
感染培养后，将切片放在补充有500mg/l羧噻吩青霉素(ticarcillin)和1μM或10μM生长素前体类似物NAM的EG基础琼脂培养基(琼脂8.5g/l)中，并于25℃在光强度约30-40μmol/m2/s的光照条件下进行培养，同时每隔2周用同样的培养基传代培养。在这些切片中，较快的切片在土壤杆菌感染约2个月后即再分化出不定芽。
土壤杆菌感染3个月后，为检测用作所需基因模型的GUS基因的表达，按照Jefferson等的方法对再分化的不定芽进行GUS染色试验(Plant Mol.Biol.Rep.，5：387-405(1987))，然后通过检测被染色的不定芽的数目(表达所需基因的不定芽的数目)来判断已引入所需基因的不定芽形成的程度。结果显示在表1中。
表1
iaaH基因和添加NAM对产生蓝桉转化体的影响
NAM浓度(μM)   A  B  B/A  C C/B C/A
  测试样品(切片数) 分化的不定芽*1(切片数) 再分化率(％)  GUS+分化的不定芽*2(切片数) 选择效率(％) 基因引入率(％)
    1     60     21     35.0     8     38.1     13.3
    10     48     2     4.2     1     50.0     2.1
*1分化成不定芽的切片数目
*2分化成被GUS染色的不定芽的切片数目
如表1显见，当不定芽的再分化率、选择效率(所需基因引入再分化的不定芽的频率)和基因引入率(得到已引入所需基因的不定芽的比例)是基于作为基因引入样品的切片计算时，在NAM浓度为1μM时它们分别为35.0％、38.1％和13.3％，而在NAM浓度为10μM时它们分别为4.2％、50.0％和2.1％。
比较实施例1
以实施例1的相同方式进行蓝桉基因引入试验，不同之处是，在土壤杆菌感染后用补充有500mg/l羧噻吩青霉素和0μM、10μM NAA作为生长素的EG基础琼脂培养基(琼脂8.5g/l)培养下胚轴切片。结果显示在表2中。
表2
iaaH基因和添加NAM对产生蓝桉转化体的影响
NAA浓度(μM)     A  B B/A  C C/B  C/A
  测试样品(切片数) 分化的不定芽*1(切片数) 再分化率(％) GUS+分化的不定芽*2(切片数) 选择效率(％) 基因引入率(％)
    0     58     6     10.3     0     0     0
    1     62     9     14.5     2     22.2     3.2
    10     40     13     32.5     1     7.7     2.5
*1分化成不定芽的切片数目
*2分化成被GUS染色的不定芽的切片数目
由表2显见，在所有情况下选择效率是低的，即使在添加1μM NAA时也只有22.2％，而这已经是最高值。
比较实施例2
以实施例1或比较实施例1的相同方式进行蓝桉基因引入试验，不同之处是，作为可选标记基因的只有ipt基因的质粒pIPT10被用作载体。同样，所述载体也含有作为所需基因模型的GUS基因。
这里所用的pIPT10的T-DNA区的结构显示在图2中，将基因引入试验的结果显示在表3中。
表3
ipt基因对产生蓝桉转化体的影响
添加剂浓度(μM) A B  B/A C C/B C/A
测试样品(切片数) 分化的不定芽*1(切片数)  再分化率(％) GUS+分化的不定芽*2(切片数) 选择效率(％) 基因引入率(％)
    0     46     3     6.5     0     0     0.0
NAM     1     46     2     4.4     0     0     0.0
    10     46     0     0     0     0     0.0
NAA     1     44     9     20.5     1     11.1     2.3
    10     44     7     15.9     0     0     0.0
*1分化成不定芽的切片数目
*2分化成被GUS染色的不定芽的切片数目
由表3显见，在此情况下选择效率也是低的，即使添加1μM NAA时也只有11.1％，而这已经是最高值。
实施例2
用本发明的方法，以实施例1所用的pIAH6作为载体，通过将基因引入杂交华杨(Populus sieboldii)×大齿杨(Populus grandidentata)来产生基因重组体。
将Y-63杨杂交株(来自Akita Jujo Chemicals Co.，Ltd.的实验树林)无菌幼苗的茎切成长5mm的切片，使其不含有节点，然后沿纵向将其切成两半，并用已引入pIAH6的根瘤土壤杆菌LBA4404(购自CLONTECH)进行感染，从而将pIAH6引入Y-63杨杂交株。这就是说，将如实施例1同样方式得到的已引入pIAH6的根瘤土壤杆菌LBA4404在YEB液体培养基中培养过夜，然后用Y基础培养基稀释至OD630＝0.5，并将上面制备的下胚轴切片浸泡在此细胞悬液中。然后在除去多余的细胞悬液后，将各个切片和土壤杆菌在琼脂培养基上(琼脂8g/l)于25℃在黑暗中共培养3天，所述琼脂培养基是通过在Y基础培养基中加入40mg/l乙酰丁香酮制得的，这样可使已引入pIAH6的土壤杆菌感染各个切片。这时，补充有20g/l蔗糖的改良MS培养基(10mM NH4，30mM NO3)被用作Y基础培养基。
感染培养后，将切片放在补充有500mg/l羧噻吩青霉素和1μM、5μM或30μM生长素前体类似物NAM的Y基础琼脂培养基(琼脂8g/l)中，并于25℃在光强度约30-40μmol/m2/s的光照条件下进行培养，2周后，选择并分离再分化的不定芽，在同样的条件下继续培养此不定芽，然后，在2个月后(加入NAM开始培养4个月后)观察到培养组织的形态以判断所需基因是否被引入所选不定芽。这时，当所需基因被引入所选不定芽时，由于同时引入的可选标记基因(ipt基因)的作用在培养组织上有多个芽形成，但当所选基因未被引入时，即当所选不定芽是逃逸组织时，则培养组织没有多个芽形成。这就是说，由于ipt基因未被引入逃逸组织，不定芽仅仅是因为受到其附近存在的已引入所需基因的细胞的影响而再分化的。
结果显示表4中。
表4
iaaH基因和添加NAM对产生杂交杨转化体的影响
NAM浓度(μM)     A     B B/A     C  C/B  C/A
  测试样品(切片数) 分化的不定芽*1(切片数) 再分化率(％) GUS+分化的不定芽*2(切片数) 选择效率(％) 基因引入率(％)
    0     10     0     0     0     0     0
    1     10     7     70.0     5     71.4     50.0
    5     10     6     60.0     4     66.7     40.0
    30     10     0     0     0     0     0
*1分化成不定芽的切片数目
*2分化成在培养4个月后观察到有多个芽而被判断为不定芽的切片数目
如表4显见，在NAM浓度为1μM和5μM时得到了已引入所需基因的不定芽，且以切片为基础计算的选择效率在NAM浓度为1μM时为50.0％，在NAM浓度为5μM时为40.0％。就此而言，尽管未在表中显示，当NAM浓度为1μM时再分化的不定芽的总数为67，且所需基因已被引入其中的6个。同样，当NAM浓度为5μM时再分化的不定芽的总数为34，且所需基因已被引入其中的5个。
比较实施例3
以实施例2的相同方式进行杂交杨的基因引入试验，不同之处是，在土壤杆菌感染后用仅补充有500mg/l羧噻吩青霉素的Y基础琼脂培养基(琼脂8g/l)培养茎切片。结果显示在表4中。
如表4所述，这时没有再分化出不定芽，也没有得到其中已引入所需基因的再分化的个体。
实施例3
采用通过在实施例2的Y基础培养基中加入0.5mg/l玉米素制得的培养基，使来自智利的蓝桉高生根克隆的确定芽在无菌条件下生长，然后将伸长的茎切成5mm的切片，并将其作为样品以用实施例1同样的方式进行基因引入和用已引入质粒pIAH6的土壤杆菌感染。
感染培养后，将切片放在补充有500mg/l羧噻吩青霉素和1μM生长素前体类似物NAM的EG基础琼脂培养基(琼脂8.5g/l)中，并于25℃在光强度约30-40μmol/m2/s的光照条件下进行培养，同时每隔2周用同样的培养基传代培养。
土壤杆菌感染4个月后，按照上述Jefferson等的方法对再分化的不定芽进行GUS染色试验，并判断已引入所需基因的不定芽形成的程度。
其结果是，40个茎切片中有5个切片分化出不定芽，并确定所需基因已被引入其中3个切片的芽中。这就是说，基于作为基因引入样品的切片，不定芽的再分化率、选择效率和基因引入率分别为12.5％、60.0％和7.5％。当将克隆的蓝桉幼苗用作基因引入材料时，一个惊人的事实是，以已引入基因的样品为基础，以7.5％的频率得到已引入基因的不定芽。
比较实施例4
以质粒pIPT10作为载体，以实施例3同样的方式进行蓝桉高生根克隆的基因引入试验。然而，不定芽在这种情况下没有再分化，且没有得到已引入所需基因的再分化的个体。
虽然详细并参考具体实施例描述了本发明，本领域技术人员显然可对其进行各种改变和修改，而不违背其精神和范围。本文引用的全部文献完整引入以供参考。
本申请基于2002年7月26日提交的日本专利申请号2002-218978，在此完整引用以供参考。

Claims (3)

1.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(A)将载体引入植物细胞，
其中所述载体是用来将基因引入植物的，它包含：
所需基因，以及
含有编码吲哚乙酰胺水解酶的基因和细胞因子合成基因，但没有色氨酸单加氧酶基因的可选标记基因；
(B)在吲哚乙酰胺和/或萘乙酸酰胺存在时培养已通过上述载体引入所述基因的植物细胞，由此可制得再分化组织，检测并选择该再分化组织；以及
(C)培养上述在(B)中选出的再分化组织以再分化一种植物个体。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞因子合成基因是异戊烯转移酶(ipt)基因。
3.一种将基因引入植物的载体，其特征在于，所述载体包括：
所需基因，以及
含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和异戊烯转移酶(ipt)基因，但没有色氨酸单加氧酶(iaaM)基因的可选标记基因。
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