CN102181474B - 一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法，该载体的T-DNA区含有一个基因盒，由CaMV 35S启动子、Xba I、Bam HI和XmaI核酸限制性酶酶切位点、异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase，ipt)和nos终止序列组成。构建该载体的方法是以双元载体pBI121为基础，用ipt基因替换gus基因，通过Bsu 36I和Xba I酶切位点删除npt II基因，重新将CaMV 35S启动子连接到T-DNA区。采用本发明提供的技术方案，在含适量低浓度细胞分裂素类生长调节剂的培养基上可诱导再生转基因植株，所获得的转基因植株就是目的基因表达的转基因植株，可减少鉴定目的基因是否表达的步骤，并避免抗生素标记基因的潜在风险性。

Description

一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术中植物转基因的技术，具体而言，涉及一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

在植物遗传工程中，植物表达载体上的选择标记基因可分为负向选择标记基因和正向选择标记基因。负向选择标记基因主要是一类抗生素标记和除草剂标记基因，虽然现有资料并未发现这些标记基因在相关物种之间以可检测到的频率转移或产生危害，但人们依然关注抗生素和除草剂标记基因在转基因植物中的潜在风险性。正向选择标记主要是利用毒性和非毒性药物、代谢类似物或碳源为选择剂，一般属于安全性选择标记。正向选择标记还包括无条件的正向选择标记，即选择培养基中不加入标记基因编码酶的底物，如异戊烯基转移酶基因等。ipt基因编码异戊烯基转移酶，该酶在细胞分裂素生物合成过程的第一步起催化作用，催化二甲基烯丙基二磷酸与腺苷三磷酸或腺苷二磷酸或腺苷单磷酸形成N⁶-(Δ²-异戊基)腺苷-5′-三磷酸或N⁶-(Δ²-异戊基)腺苷-5′-二磷酸或N⁶-(Δ²-异戊基)腺苷-5′-单磷酸，由此形成不同的细胞分裂素，例如N⁶-(Δ²-异戊基)腺嘌呤和玉米素。因此，转ipt基因细胞在降低或无细胞分裂素类生长调节剂的培养基上能分裂生长和分化，从而可利用ipt基因作为正向选择标记基因。将ipt作为选择标记基因和避免ipt基因强表达引起植物生长发育异常的技术特点表现在以下几方面。

(1)ipt基因作为选择标记基因影响植物生长发育。Medford等(1989)将ipt基因编码序列与玉米热诱导启动子hs 70连接，发现在热诱导下ipt基因过表达导致转基因烟草植株的内源细胞分裂素含量增加，引起节间伸长不良，叶片面积减小，根系发育不良。Smigochi和Owens(1989)也报道，携带ipt基因的转基因植株不能生根或根系生长不良。Endo(2001)以ipt基因为选择标记基因，构建携带35S-ipt的植物表达载体，在无激素培养基上筛选烟草叶盘再生的转基因植株，所得到的转化率是利用卡那霉素筛选的2.7倍，表明植物表达载体以ipt基因为选择标记基因是可行的。但是，该研究没有解决ipt基因过表达引起的转基因植株形态异常的问题。

(2)控制转基因植物中ipt标记基因的表达或删除该基因。为了克服ipt基因表达对转基因植物生长发育的不良影响，以ipt基因作为选择标记基因的技术得到进一步发展。Kunkel等(1999)利用地塞米松(dexamethasone)诱导系统显著ipt基因表达，将与农杆菌共培养后的烟草叶盘培养在含地塞米松的培养基中，诱导转基因植株再生；转基因植株在无地塞米松的条件下ipt标记基因不能表达，从而使转基因植株形态和生长发育正常。Ebinuma和Komamine(2001)发展了多重自主转化(Multi-Auto-Transformation)载体系统，该系统将35S-ipt插入在识别位点序列(Rs)之间，与重组酶基因(R)连接；在转基因植株中诱导重组酶基因表达，使基因组中两侧具有识别位点序列的ipt基因和R基因片段被删除，得到无ipt标记基因且形态、生长发育正常的转基因植株。该技术构建上述载体的难度较大。

(3)共表达基因中ipt基因作为第二基因，其表达量降低。Kozak(1978)指出，在同一启动子驱动下，第一基因转录产物的翻译活性比第二基因强。我们实验室利用根癌土壤杆菌胭脂碱型Ti质粒的ipt基因，将其构建为第一基因和第二基因构建植物表达载体转化烟草细胞，用ELISA方法分析转基因烟草植株叶片的内源玉米素核苷(ZR)和异戊烯基腺苷(IPA)水平，发现ipt为第一基因的3个转基因株系中ZR和IPA平均含量是野生型烟草3.93倍，而ipt为第二基因的3个转基因株系中ZR和IPA平均含量是野生型烟草1.88倍，说明ipt作为第二基因的表达量明显低于作为第一基因的表达量，而且前者茎端出现丛生叶等异常形态，后者无此异常形态(李朝霞等，2009)。郭建春等(Guo等，2010)报道了转基因拟南芥中来源于章鱼碱型Ti质粒的ipt基因表达差异，也指出转基因植株中以ipt基因作为第一基因的表达量比作为第二基因的表达量高，其内源细胞分裂素含量分别为607.8～880.2和503.6～690.8ρmol/g鲜重。此外，ipt基因作为第二基因有助于提高转基因植株的抗病毒抗性(殷娴等，2010)和抗冷与抗旱性(Guo等，2010)。目前，尚没有将ipt基因以第二基因表达的方式作为标记基因的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服ipt作为标记基因引起转基因植物形态和生长发育异常，避免抗生素标记的潜在风险，而提出一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法。通过这种方法构建植物表达载体的特点是：(1)植物表达载体结构简单，转化序列中只有1个基因盒，构建方法简单易行；(2)ipt基因既可以作为标记基因，又可以作为报告基因，在含适量低浓度细胞分裂素类生长调节剂的培养基上，可诱导再生转基因植株，且该转基因植株就是目的基因表达的转基因植株，可减少检测目的基因表达的工作量；(3)ipt基因在植物表达载体中作为第二基因，其表达比作为第一基因表达水平弱，所以转基因植物中内源细胞分裂素增加量不大，不影响转基因植物的生长发育，从而不需要设计复杂的实验方案删除转基因植物中的ipt标记基因。

本发明所提供的技术方案是：

一种无抗生素标记的植物载体及其构建方法，用于有关植物的遗传转化，适用于离体条件下可被细胞分裂素类生长调节剂诱导器官发生的植物。本技术方案所包含的步骤如下：

(1)PCR扩增根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒的ipt基因序列，将其连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，筛选克隆菌，提取质粒，酶切与DNA测序，鉴定克隆的ipt基因序列。

(2)利用Xma I和Sac I限制性内切酶删除pBI121质粒上的gus基因片段，将两端具有Xma I和Sac I限制性内切酶位点的ipt基因连接到该质粒的T-DNA区，得到携带ipt基因的pBI121质粒。

(3)利用Bsu 36I和Xba I限制性内切酶酶切删除携带ipt基因的pBI121质粒上的35S启动子、npt II基因和nos启动子3’端-120bp，回收的10 487bp片段，将两端具有Bsu 36I和Xba I限制性内切酶位点的35S启动子连接到pBI121的10 487bp片段上，得到无抗生素标记的植物表达载体，将其命名为pBI201。

(4)利用Xba I、Bam HI和Xma I限制性酶酶切位点，将目的基因重组到pBI201表达载体的T-DNA区，得到携带目的基因的植物表达载体。

(5)设计含不同浓度细胞分裂素类生长调节剂的培养基，确定细胞分裂素类生长调节剂不能诱导外植体愈伤组织分化不定芽的最高浓度。

(6)冻融法将携带目的基因的pBI201质粒导入农杆菌。通过农杆菌介导遗传转化植物细胞。在不含或含低浓度细胞分裂素类生长调节剂的培养基上筛选转基因细胞，诱导转基因植株再生。利用PCR扩增鉴定转基因植株，获得目的基因表达的转基因植株。

本发明有如下优点：(1)本发明提供的植物表达载体构建方法，没有抗生素基因标记，避免了转基因植物中抗生素标记基因的潜在风险，有助于提高转基因植物的安全性；(2)避免了植物表达载体中ipt作为第一基因的过表达引起内源细胞分裂素过量增加，使转基因植株形态和生长发育受到不利影响的结果；(3)ipt基因既可以作为标记基因，又可以作为报告基因，在筛选培养基上诱导再生的转基因植株，也是目的基因表达的转基因植株，可减少检测转基因植株中目的基因是否表达的工作；(4)转基因植株中ipt基因的弱表达可使内源细胞分裂素有所增加，可促进植株生长发育，提高转基因植株对环境胁迫的抗逆性。

附图说明

图1为无抗生素标记的植物表达载体pBI201 T-DNA区的物理结构示意图，图中括号内数字为碱基顺序数。

图2为pBI201质粒酶切鉴定的电泳结果。泳道1为用Bsu 36I和Xba I双酶切pBI201质粒的产物，第一条带长度为10 487bp(含ipt基因)，第二条带长度为891bp(含35S启动子)；泳道2为未酶切的pBI201质粒；M表示核酸分子量标记D016-2。

图3为MS2培养基上诱导转基因细胞分化不定芽。A表示农杆菌感染的外植体，在筛选培养基上分化不定芽；CK表示无农杆菌感染的对照外植体，在筛选培养基上无不定芽分化。

具体实施方式

实施例1，ipt基因和35S启动子的克隆

(1)ipt基因克隆

根据Wood等(2001)报道的根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒上的ipt基因序列(GenBank登录号：NC_003065)设计ipt基因编码序列的PCR扩增引物，正义引物序列(5’-CCCGGGATGGATCTGCGTCTAATTTT-3’)和反义引物序列(5’-GAGCTCCTAATACATTCCGAATGGAT-3’)5’端分别具有XmaI和Sac I酶切位点，扩增产物片段长度为735bp。以根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒为模板。在50μl反应体系中加入高保真pfu聚合酶2U，Ti质粒20ng，dNTP 200μmol/L，引物浓度各为20ρmol/L和10×pfu扩增缓冲液5μl，超纯水补足到50μl。扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30次循环，最后在72℃下保温10分钟。

在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶板中电泳PCR扩增产物后，于长波紫外光下，切取含有DNA片段的凝胶，用上海申能博彩生物科技有限公司3S核酸纯化试剂盒纯化DNA片段。按照Promega公司pGEM-T Easy试剂盒使用指南，将扩增的DNA片段连接到pGEM-T载体上，用3μl连接转化产物与大肠杆菌菌株JM109感受态细胞50μl混合，再将转化处理的JM109细胞涂布于含有X-gal80mg/L、IPTG 100mg/L和氨苄青霉素100mg/L的LB培养基上。过夜培养后，挑选白色菌落，碱裂解法提取质粒。在20μl反应体系中，加入质粒DNA 0.1μg，10×Eco RI酶缓冲液2μl与Eco RI 10U，37℃恒温水浴中酶切反应4小时。电泳酶切产物，鉴定出携带含有插入目的DNA片段的pGEM-T载体的JM109细胞克隆，然后在上海生工生物技术有限公司对该载体插入的DNA序列测序，将测序结果与NCBI基因库中ipt基因序列比对，确定克隆得到ipt基因序列正确，将其命名为T-ipt质粒。

(2)35S启动子的克隆

根据Chen等(2003)报道的双元载体pBI121质粒的DNA序列(GenBank登录号：AF485783.1)设计35S启动子PCR扩增引物，正义和反义引物5’端分别具有Bsu 36I和Xba I位点，即5’-CCTAAGGCATGATTACGCCAAGCTTG-3’和5’-TCTAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’，扩增序列长度为891bp。以本实验室保存的pBI121质粒为PCR扩增模板，PCR扩增、载体连接和克隆细胞鉴定方法与本实施例中的(1)相同。将克隆的35S启动子命名为T-35S。

实施例2，构建无抗生素标记的植物表达载体

(1)用Xma I和Sac I核酸限制性内切酶双酶切T-ipt质粒和双元载体pBI121质粒。具体做法是，使用Fermentas公司的Xma I和Sac I核酸限制性内切酶，在20μl反应体系中加入T-ipt质粒DNA 0.5μg，10×Tango双酶切反应缓冲液2μl与Xma I和Sac I各10U，37℃恒温水浴中酶切反应4～6小时。电泳酶切产物，于长波紫外光下，快速切取含有DNA片段的凝胶，用上海申能博彩生物科技有限公司3S核酸纯化试剂盒纯化ipt基因片段。用同样的酶切和纯化酶切产物方法，得到长度为12 868bp的pBI121片段。

(2)ipt基因与双元载体pBI121质粒连接。在10μl连接反应体系中，加入2×T₄ DNA连接酶缓冲液5μl，ipt基因片段3μl，质粒pBI121片段1μl和T₄ DNA连接酶1μl，4℃下连接过夜。3μl连接转化产物与大肠杆菌菌株JM109感受态细胞50μl混合，将转化处理的大肠杆菌菌株JM109细胞涂布在含有卡那霉素100mg/L的LB培养基上，过夜培养。选取单菌落，碱裂解法提取质粒，按照本实施例中(1)的方法，用Xma I和Sac I酶双酶切，电泳酶切产物，鉴定出携带含有ipt基因的pBI121质粒的克隆细胞。将含有ipt基因的质粒命名为pBI121-ipt。

(3)Bsu 36I和Xba I双酶切酶切删除pBI121-ipt质粒上的npt II基因、35S启动子和nos启动子3’端-120bp。根据Gynheung An等(1986)研究，删除nos启动子3’端-64bp以上，nos启动子驱动下游基因表达活性基本消失。按照本实施例(1)中的方法，用Bsu 36I和Xba I双酶切pBI121-ipt和T-35S质粒，电泳纯化，得到无npt II基因、35S启动子和nos启动子3’端部分序列，长度为的10 647bp的pBI121-ipt片段。同样地，用Bsu 36I和Xba I双酶切T-35S质粒的35S启动子片段。按照本实施例(2)中的方法，用2×T₄ DNA连接酶连接pBI121-ipt片段和35S启动子片段，转化大肠杆菌JM109，在含100mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选克隆菌，酶切鉴定阳性克隆质粒。将得到无抗生素标记的植物表达载体命名为pBI201。附图1表示pBI201质粒T-DNA区的物理结构示意图，附图2表示pBI201质粒的双酶切鉴定。

(4)将目的基因连接到pBI201。利用35S与ipt基因之间的Xba I、Bam HI和Xma I酶切位点，可将目的基因作为第一基因连接到pBI201质粒上。本实施例中使用的目的基因是色氨酸单氧化酶基因(tryptophan 2-monooxygenase，iaaM)编码序列，在T-载体上该序列两端分别具有Xba I和Bam HI酶切位点。具体做法是，在20μl反应体系中加入具有iaaM基因的T-质粒0.5μg，10×Tango双酶切反应缓冲液2μl与Xba I和Bam HI内切酶10U，37℃恒温水浴中酶切反应4～6小时。按照本实施例(1)中的方法电泳纯化酶切产物。同样，用Xba I和Bam HI内切酶双酶切和纯化酶切产物方法，得到pBI201片段。按照本实施例中(2)的方法，将iaaM基因片段连接到pBI201质粒中、转化大肠杆菌JM109，在含100mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选克隆菌，酶切鉴定，得到携带目的基因iaaM的pBI201质粒。

实施例3，农杆菌介导的遗传转化和转基因再生植株的筛选

(1)农杆菌LBA4404的遗传转化。用携带目的基因iaaM的pBI201质粒0.1μg与100μl农杆菌LBA4404感受态细胞混合，冻融法转化农杆菌。然后，在含有80mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的YEB培养基上培养24～48小时，分别取单菌落于2ml的YEB液体培养基中扩大培养，碱裂解法微量提取质粒，用Bsu 36I和Xba I酶双酶切后电泳观察鉴定，确定携带含有iaaM基因的pBI201质粒的农杆菌细胞克隆。

(2)以烟草K326品种为材料，确定叶外植体不能分化不定芽的最高细胞分裂素类生长调节剂的浓度。具体做法是，在MS培养基(含0.01mg/L α-萘乙酸，3％蔗糖和0.65％琼脂，pH5.8)中分别加入0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/L苄氨基腺嘌呤。取3月龄植株上的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台上，将叶片放入无菌烧杯中，用70％酒精浸泡叶片30秒，然后用10％次氯酸纳对叶片表面消毒6分钟，无菌水清洗5次。然后，将无菌叶片剪切成0.5～1.0cm²大小，接种到含不同浓度苄氨基腺嘌呤的MS培养基上，在温度26±1℃、光照强度2000lx、16小时光照和8小时黑暗下培养。培养4周后，在苄氨基腺嘌呤浓度为0和0.02mg/L的MS培养基上，叶外植体上没有不定芽的分化，在含苄氨基腺嘌呤其他浓度的MS1培养基上叶外植体的愈伤组织能分化不定芽，并随着浓度升高，不定芽分化的频率增加。因此，确定MS培养基中苄氨基腺嘌呤浓度为0.02mg/L是的烟草K326品种叶外植体不能分化不定芽的最高浓度。由于本实施例中使用的目的基因iaaM的表达产物能促进细胞内生长素的合成，所以在本实施例中的筛选转基因产物所用的MS培养基中不添加α-萘乙酸，仅添加0.02mg/L苄氨基腺嘌呤，将此培养基命名为MS2培养基。

(3)烟草叶片的遗传转化。按照本实施例中(2)的方法进行叶外植体的表面消毒，将无菌叶片剪切成0.5～1.0cm²大小，用于感染农杆菌。

取YEB液体培养基中过夜培养的农杆菌菌液2ml，加入到20ml同一培养基中，在28℃、每分钟180转的条件下震荡培养4～6小时。将叶外植体放入OD₆₀₀＝0.2～0.5的菌液中，在每分钟80转的摇床上震荡感染10分钟。然后，在超净工作台内，用无菌滤纸上吸除叶外植体上多余的菌液后，将叶片接种在MS2培养基上，在26±1℃、黑暗条件下共培养3天。同时将未感染农杆菌的叶片培养在相同的培养基上，作为对照。

(4)筛选抗性愈伤组织与诱导植株再生。将共培养后的叶外植体和对照转移到含羧苄青霉素100mg/L的MS2培养基上培养。每隔3～4天将叶外植体转移到同一新配制的培养基上培养，培养条件同本实施例中(2)采用的方法。经过3～4周的培养后，从农杆菌感染的叶外植体边缘个别部位形成小愈伤组织，再经过1～2周培养，从愈伤组织上分化出不定芽(附图3)，而对照叶没有不定芽分化。无菌苗生长到2cm左右长时，将无菌苗从茎基部切离，转移到1/2MS生根培养基(1/2大量元素浓度的MS基本培养基+羧苄青霉素100mg/L+1％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8)中诱导生根，培养条件同上。10天后，从无菌苗茎基部产生多条幼根。根长达到1～2cm长后，取出生根苗，小心清除幼苗根系的琼脂，移栽到土壤中。移栽初期，用塑料薄膜遮盖，保持相对湿度90％以上，温度20～25℃。移栽苗恢复生长后，逐步降低相对湿度，直到与自然环境的相对湿度一致。

(5)转基因植株的PCR扩增鉴定。取再生植株幼叶0.1g，在液氮中快速研磨成粉，迅速转入预冷的1.5ml离心管中，立即加入65℃预热的2×十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)提取缓冲液0.5ml，在65℃水浴中提取30分钟。然后，加入等量的氯仿/异戊醇(24:1)，来回颠倒抽提。每分钟12000转离心10分钟。取上清液0.4ml，加入-20℃预冷的异丙醇0.8ml，来回颠倒混匀，溶液中出现丝状DNA物质。挑出丝状DNA物质，用76％乙醇(含10mmol/L乙酸铵)漂洗20分钟后，稍微干燥，用0.5ml TE缓冲液溶解。进一步纯化DNA的步骤与Williams等(1990)描述的相同(Nucleic Acids Res.18：6531-6535，1990)。

设计用两种DNA序列的PCR扩增引物，一种是35S启动子片段，其正义引物为5’-CACAGATGGTTAGAGAGGCT-3’，反义引物为5’-TTACGGCGAGTTCTGTTAGG-3’，扩增产物长度为315bp；另一种是ipt基因片段，其正义引物和反义引物分别为5’-GCGGGCTTATTCTTGAGGGA-3’和5’-ATTTCTGTTCTTGTCGGCGT-3’，扩增产物长度为390bp。在50μl PCR扩增体系中，各加入叶片总DNA 100ng，Tag DNA聚合酶3U，dNTP 200μmol/L，正义和反义引物浓度各为20ρmol/L，10×Tag DNA酶缓冲液5μl，超纯水补足到50μl。扩增条件同实施例一(1)中的方法相同。同时，用pBI201质粒和非转基因植株叶片总DNA为模板，分别作为阳性和阴性对照。电泳扩增产物，利用凝胶成像仪观察电泳结果，阳性对照和转基因植株的PCR产物出现长度为315bp和390bp的DNA条带，而阴性对照无这些DNA条带。

Claims (1)

1.一种无抗生素标记的植物表达载体，其特征是：其中T-DNA含有一个基因盒，该基因盒从5’到3’端依次由花椰菜花叶病毒RNA基因35S（CaMV35S）启动子、目的基因、ipt筛选标记基因和nos终止序列组成；

所述的无抗生素标记的植物表达载体的构建方法，包括下列步骤：

（1）利用Xma I和Sac I限制性内切酶删除pBI121质粒上的gus基因片段，将两端具有Xma I和Sac I限制性内切酶位点的ipt基因连接到该质粒的T-DNA区，得到携带ipt基因的pBI121质粒；

（2）利用Bsu36I和Xba I限制性内切酶酶切删除携带ipt基因的pBI121质粒上的35S启动子、npt II基因和nos启动子3’端-120bp，回收10487bp片段，将两端具有Bsu36I和Xba I限制性内切酶位点的35S启动子连接到pBI121的10487bp片段上，得到无抗生素标记的植物表达载体，将其命名为pBI201；

（3）利用Xba I、Bam HI和Xma I限制性酶酶切位点，将目的基因重组到pBI201表达载体的T-DNA区，得到携带目的基因的植物表达载体；

所述的ipt基因编码序列是从根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒中克隆的，克隆方法为：PCR扩增根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒的ipt基因序列，将其连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，筛选克隆菌，提取质粒，酶切与DNA测序，鉴定克隆的ipt基因序列，碱基数量为723bp，其编码序列如SEQ NO：2所示的氨基酸序列。

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