CN116574714A - 一种番茄磷脂酶SlPLDδ及其在耐低钾胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种番茄磷脂酶SlPLDδ，所述番茄磷脂酶SlPLDδ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了所述番茄磷脂酶SlPLDδ在耐低钾胁迫中的应用，通过过表达以及RNA干扰技术调控了SlPLDδ在番茄中的表达水平，改变了番茄植株在低钾胁迫下根系以及叶片的生长，进而影响番茄果实品质。本发明通过克隆番茄磷脂酶SlPLDδ并构建过表达以及沉默转基因材料，揭示了磷脂酶SlPLDδ对番茄低钾耐性的调控作用，为提高番茄等果菜类蔬菜的低钾耐性提供了一条有效途径，对于丰富蔬菜作物耐低钾性状遗传调控网络、改良蔬菜耐低钾性具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种番茄磷脂酶SlPLDδ及其在耐低钾胁迫中的应用。
背景技术
钾是植物生长发育所必需的大量元素之一，是植物体内含量最丰富的一价阳离子。土壤钾是植物钾素最主要的来源，我国土壤普遍缺钾，缺钾土壤总面积约4.5亿亩，占可耕作土壤的近1/3。我国钾肥的自给率仅有58％，缺口极大，需从国外进口。因此，土壤缺钾以及钾肥短缺已经成为制约我国农业生产发展的重要限制因子之一。番茄是需钾量大的蔬菜作物，生产中常因缺钾而大量减产和降低品质，据研究表明，增施钾肥可使番茄增产10％～30％，但大量施用钾肥，不仅增加生产成本、加速钾资源枯竭，并造成水体富营养化等环境污染问题。因此，阐明作物钾利用效率的遗传基础，培育耐低钾和高效利用钾的作物对于提高农业生产和保护生态环境都具有重要意义。
目前植物钾吸收转运的机制研究主要集中在模式植物拟南芥中，然而，拟南芥中已明确的低钾响应的吸收转运作用机制在番茄中都不起作用，而且番茄耐低钾存在品种间差异，因此培育钾素高效利用番茄品系极为重要。
磷脂酶D作为一类磷脂水解酶，主要水解结构脂质，形成磷脂酸PA。根据基因序列和结构域的不同，PLD分为6个亚家族(α,β,γ,δ,ε,ζ)。在植物中，PLD及其代谢产物PA，参与许多生理过程，包括生长发育、脂质代谢和生物/非生物胁迫反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种番茄磷脂酶SlPLDδ及其在耐低钾胁迫中的应用。本发明利用高代自交系杂交的F2群体，定位了番茄耐低钾的一个主效QTL位点。经鉴定，定位区间内不含已知的钾转运吸收的离子通道和钾转运体，说明该区间存在新的控制番茄耐低钾的主效基因；利用序列和表达差异分析，确定SlPLDδ为该耐低钾性状的功能基因。本发明还提供了磷脂酶SlPLDδ在番茄耐低钾胁迫中的应用，利用过表达技术和番茄稳定遗传转化方法，将SlPLDδ基因在低钾敏感型番茄JZ18中超量表达，提高对低钾胁迫的耐受性；同时利用RNA干扰技术和番茄稳定遗传转化方法，抑制SlPLDδ在耐低钾番茄JZ34中表达，来抑制植株根系以及叶片发育。本发明对番茄低钾耐性的分子机制研究，以及高抗逆性品种选育具有重要的理论及实际意义。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种番茄磷脂酶SlPLDδ，所述番茄磷脂酶SlPLDδ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述番茄磷脂酶SlPLDδ的应用，所述磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控。
本发明还提供了一种磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控的方法，该方法为：利用过表达技术和番茄稳定遗传转化方法，将SlPLDδ基因在低钾敏感型番茄JZ18中过表达，提高对低钾胁迫的耐受性；
所述过表达方法中的过表达重组载体为pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ；
所述过表达重组载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ的制备方法如下：提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，扩增SlPLDδ的目的片段；将扩增产物经限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，连接至pCAMBIA3301/Luc载体中，得到SlPLDδ过表达的重组载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ；
所述扩增引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-OE-F：SEQ ID NO.2
SlPLDδ-OE-R：SEQ ID NO.3。
本发明还提供了另一种磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控的方法，该方法为：利用RNA干扰技术和番茄稳定遗传转化方法，抑制SlPLDδ在耐低钾番茄JZ34中表达，抑制植株根系以及叶片发育；
所述RNA干扰方法中RNA干扰SlPLDδ的重组载体为沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ；
所述沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ的制备方法如下：提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，扩增SlPLDδ的目的片段；利用gateway技术，先将扩增产物与中间载体TOPO载体连接，再将目的片段转入终载体pB7GWIWG2载体中，得到沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ；
所述扩增引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-RNAi-F：SEQ ID NO.4
SlPLDδ-RNAi-R：SEQ ID NO.5。
本发明还提供了一种包含所述磷脂酶SlPLDδ基因的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
本发明的低钾环境中钾离子含量为0.5mM，正常环境中钾离子含量为4mM。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明公开了一种番茄SlPLD家族成员SlPLDδ在番茄耐低钾胁迫中的应用，通过过表达以及RNA干扰技术调控了SlPLDδ在番茄中的表达水平，改变了番茄植株在低钾胁迫下根系以及叶片的生长，进而影响番茄果实品质，对于丰富蔬菜作物耐低钾性状遗传调控网络、改良蔬菜耐低钾性具有重要价值。
2、本发明通过农杆菌介导的方法将重组载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ和pB7GWIWG-SlPLDδ转入到番茄植株中调控SlPLDδ的表达，以此技术改变了番茄叶片颜色以及根系生长，并对果菜类蔬菜的生长发育以及逆境抗性产生了重要影响。
3、本发明对研究番茄低钾耐性的分子机制，以及选育高抗逆性品种具有重要的理论及实际意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的SlPLDδ基因的系统进化树。
图2是本发明实施例2的过表达载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ构建过程的电泳检测图。
图3是本发明实施例2的番茄遗传转化流程图。A.接种；B.共培养；C.生芽；D.生芽；E.生根；F.移栽。
图4是本发明实施例2的SlPLDδ过表达转基因植株电泳检测图。
图5是本发明实施例2的SlPLDδ过表达植株的表达量及表型分析。
图6是本发明实施例3的沉默载体pB7GWIWG2-SlPLDδ构建过程的电泳检测图。
图7是本发明实施例3的SlPLDδ沉默转基因植株电泳检测图。
图8是本发明实施例3的SlPLDδ沉默植株的表达量分析。CK：野生型植株；1-8：沉默转基因植株；*表示差异达显著水平(P<0.05)，**表示差异极显著水平(P<0.01)。
图9是本发明实施例3的野生型JZ34和SlPLDδ沉默转基因植株叶片和根系发育对比图。
图10是本发明实施例3的野生型JZ34和SlPLDδ沉默转基因植株叶片叶绿素含量对比图。
具体实施方式
实施例1
本实施例为番茄磷脂酶SlPLDδ目的基因的克隆。
取番茄三叶一心时期的根系，利用Trizol试剂盒法(Invitrogen，USA)提取植物总RNA，具体操作方法如下：取0.1g样品加入液氮冷却后研磨成粉，转移至1.5mL离心管中，吸取1mLTRIZOL提取液加入，混匀；室温放置5min后，在4℃，12000rpm的条件下离心10min；吸取上清液转移至另一个1.5mL的离心管中，加200μL氯仿，剧烈震荡后室温下静置10min，然后在4℃、12000rpm离心10min；吸取上清液转移至另一个1.5mL的离心管中，吸取等体积的异丙醇加入，室温下放置10min，再4℃、12000rpm离心10min；上清液倒在废液瓶中，吸取1mL预冷的75％乙醇水溶液加入离心管中进行洗涤沉淀；然后4℃、12000rpm离心5min；倒掉上清液，室温将离心管内残留的酒精晾干，用RNase-Free水溶解RNA，上下颠倒使总RNA充分溶解，-80℃冰箱中保存，备用。
用反转录试剂盒(FastQuantcDNA，TIANGEN)合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，设计特异引物，选择TaKaRa高保真酶(TAKARA，中国，大连)扩增SlPLDδ基因CDS序列。
特异引物的核苷酸序列如下：
SlPLDδ-F：SEQ ID NO.6；
SlPLDδ-R：SEQ ID NO.7。
扩增反应体系为：25μL高保真酶，2.5μL正向引物，2.5μL反向引物，5μL模版cDNA，15μLddH2O。
扩增程序为：98℃预变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸5min。
将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，有单一且条带大小与SlPLDδ基因大小一致，并送去公司测序，得到测序正确的番茄磷脂酶SlPLDδ的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
本实施例中得到的番茄磷脂酶SlPLDδ基因的系统进化树如图1所示，证明了克隆得到的SlPLDδ是番茄磷脂酶D基因家族成员。
实施例2
本实施例为过表达SlPLDδ基因在提高番茄低钾胁迫耐性中的应用，方法为：利用过表达技术和番茄稳定遗传转化方法，将SlPLDδ基因在低钾敏感型番茄JZ18中超量表达，提高对低钾胁迫的耐受性。
(1)过表达载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ的构建
提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，通过DNAMAN设计特异性引物，扩增SlPLDδ的目的片段；
所述特异性引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-OE-F：SEQ ID NO.2
SlPLDδ-OE-R：SEQ ID NO.3。
将扩增产物经限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，连接至pCAMBIA3301/Luc载体中，得到过表达载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ；
将过表达载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ转化入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，测序比对获得正确阳性克隆。将获得的阳性克隆转化入GV3101农杆菌感受态中，用于后续的番茄遗传转化。
图2是本实施例中过表达载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ构建过程的电泳检测图。由图2A可知，扩增SlPLDδ的目的片段大小为2520bp；图2B是限制性内切酶SacI和PstI双酶切pCAMBIA3301/Luc的电泳图；图2C获得的PCR正确的阳性克隆的电泳图；图2D是转化成功的农杆菌电泳检测图。
(2)番茄的遗传转化
以栽培番茄JZ18作为遗传转化材料，取200粒饱满完整的种子利用农杆菌介导的叶盘法进行遗传转化。待培养基中的番茄幼苗生长至子叶完全舒展时(图3A)，切取0.5cm长的子叶放置于预培养基中暗培养2d后，用D600达到0.6-0.8的农杆菌浸染番茄子叶，浸染后叶背面朝上放置于共培养基中(图3B)，暗培养2d后，将外植体转移到抑菌培养基中培养。当外植体在其中生长两周后，转入生芽培养基中培养(图3C)，之后间隔两周更换一次培养基。当不定芽生长至2～3cm时，从茎基部切下不定芽，放入生根培养基中培养(图3D)。待不定芽生根后，将完整的植株从培养瓶中取出置于山崎营养液中炼苗(图3E)，当植株适应外界环境后移植在营养钵中培养，获得SlPLDδ过表达转基因番茄植株(图3F)。
(3)过表达转基因番茄阳性植株的鉴定
提取上述SlPLDδ过表达转基因番茄叶片(编号：1～8)的DNA，对筛选出的SlPLDδ过表达转基因植株进行PCR鉴定。SlPLDδ过表达转基因植株使用pCAMBIA3301/Luc载体质粒上的Kana基因位点设计特异引物(Kana-F：SEQ ID NO.8；Kana-R：SEQ ID NO.9)进行检测。以DNA为模板进行PCR扩增并进行电泳检测，检测到特异性片段长度为704bp。结果发现8个过表达株系均检测到特异性片段(图4)，而阴性对照(ddH2O和未转化野生型CK)未扩增出任何条带。这些株系均为过表达转基因阳性植株(OE)，可以用于后续的试验分析。
(4)过表达转基因番茄SlPLDδ的表达量及表型分析
为了明确SlPLDδ过表达转基因株系中SlPLDδ的表达水平，我们取已鉴定的阳性植株的嫩叶，以正常JZ18番茄为对照，提取RNA并反转录为cDNA。使用SlPLDδ的实时定量引物(qPLD-F：SEQ ID NO.10；qPLD-R：SEQ ID NO.11)，以Actin基因为内参，进行qRT-PCR分析。
对前期筛选转基因阳性株系进行初步的表型鉴定，选取经过PCR鉴定的过表达T0代株系(OE)和JZ18野生型(WT)进行指标测定。从图5可知，低钾敏感番茄JZ18野生型的根系在低钾环境(0.5mM)下长势受到抑制，而过表达株系受低钾导致的根系生长抑制的影响较小(图5A)；低钾胁迫导致JZ18野生型的叶片边缘发生黄化，转基因番茄未出现低钾导致的叶片边缘黄化表型(图5B)；过表达转基因株系OE4、OE6、OE9号叶片中的表达量与对照相比均显著升高(图5C)，表明SlPLDδ过表达载体已成功转化入番茄中，能够促进叶片中SlPLDδ的表达；测量总根长发现过表达株系总根长显著高于野生型(图5D)；进一步对叶绿素含量进行测定发现，低钾处理后，SlPLDδ过表达转基因株系叶片叶绿素含量显著高于野生型(图5E)，证明了将SlPLDδ基因在低钾敏感型番茄JZ18中超量表达，可以显著提高植株对低钾胁迫的耐受性。
实施例3
本实施例为抑制SlPLDδ基因表达在抑制番茄植株根系生长及叶片发育中的应用，方法为：利用RNA干扰技术和番茄稳定遗传转化方法，抑制SlPLDδ在耐低钾番茄JZ34中表达，来抑制植株根系以及叶片发育。
(1)沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ的构建
利用gateway技术构建沉默载体，所述沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ为RNA干扰SlPLDδ的重组载体，制备方法如下：提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，利用DNAMAN设计特异性引物，扩增沉默目的片段；
所述特异性引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-RNAi-F：SEQ ID NO.4
SlPLDδ-RNAi-R：SEQ ID NO.5。
利用gateway技术，通过TOPO反应，将目的片段与中间载体TOPO载体连接，通过大肠杆菌转化获得中间克隆；再利用LR反应将目的片段转入终载体pB7GWIWG2中，得到重组质粒，命名为pB7GWIWG-SlPLDδ；
将沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ转化入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，测序比对获得正确阳性克隆。将获得的阳性克隆转化入GV3101农杆菌感受态中，用于后续的番茄遗传转化。
图6是本实施例的沉默载体pB7GWIWG2-SlPLDδ构建过程的电泳检测图。由图6A可知，扩增沉默目的片段大小为223bp；图6B是得到的TOPO-SlPLDδ阳性克隆电泳图；图6C是得到pB7GWIWG2-SlPLDδ阳性大肠杆菌的电泳图；图6D是得到pB7GWIWG2-SlPLDδ阳性农杆菌的电泳检测图。
(2)番茄的遗传转化
以栽培番茄JZ34作为遗传转化材料，取200粒饱满完整的种子利用农杆菌介导的叶盘法进行遗传转化。待培养基中的番茄幼苗生长至子叶完全舒展时，切取0.5cm长的子叶放置于预培养基中暗培养2d后，利用OD600达到0.6-0.8的农杆菌浸染番茄子叶，浸染后叶背面朝上放置于共培养基中，暗培养2d后，将外植体转移到抑菌培养基中培养。当外植体在其中生长两周后，转入生芽培养基中培养，之后间隔两周更换一次培养基。当不定芽生长至2～3cm时，从茎基部切下不定芽，放入生根培养基中培养。待不定芽生根后，将完整的植株从培养瓶中取出置于山崎营养液中炼苗，当植株适应外界环境后移植在营养钵中培养，获得SlPLDδ沉默转基因番茄植株。
(3)沉默转基因番茄阳性植株的鉴定
提取上述沉默转基因番茄叶片(编号1～9)的DNA，对筛选出的SlPLDδ沉默转基因植株进行PCR鉴定。SlPLDδ沉默转基因植株使用pB7GWIWG2载体质粒上的Bar基因位点设计特异引物(Bar-F：SEQ ID NO.12；Bar-R：SEQ ID NO.13)进行检测。以DNA为模板进行PCR扩增并进行电泳检测，检测到特异性片段长度为439bp。结果发现9个沉默转基因株系均检测到特异性片段(图7)，而阴性对照(ddH2O和未转化野生型CK)未扩增出任何条带。这些株系均为沉默转基因阳性植株，可以用于后续的试验分析。
(4)沉默转基因番茄SlPLDδ的表达量及表型分析
为了明确SlPLDδ沉默转基因株系中SlPLDδ的表达水平，我们取已鉴定的阳性植株的嫩叶，以正常JZ34番茄为对照，提取RNA并反转录为cDNA。使用SlPLDδ的实时定量引物(qPLD-F：SEQ ID NO.10；qPLD-R：SEQ ID NO.11)，以Actin基因为内参，进行qRT-PCR分析。如图8所示，其中，CK为野生型JZ34植株；1-8为沉默转基因植株；*表示差异达显著水平(P<0.05)，**表示差异极显著水平(P<0.01)。由图可知，沉默转基因株系叶片中的表达量与对照相比均显著降低，降低了62％-86％，表明SlPLDδ沉默载体已成功转化入番茄中，能够抑制叶片中SlPLDδ的表达。其中3、5、7号株系呈现极显著差异，与对照相比，3号株系SlPLDδ表达量下降了80％左右，4号株系下降了86％，7号株系表达量则下降了84％；因此选择这三个沉默效率较高的株系进行后续试验。
对筛选转基因阳性株系进行初步的表型鉴定，选取经过PCR鉴定的转基因阳性T1代株系(PLD-RNAi)和野生型JZ34进行指标测定，如图9和图10所示，其中CK为正常环境(4mMK+)，LK为低钾环境(0.5mM K+)。从图9可知，低钾处理后转基因番茄叶片边缘黄化程度高于野生型对照；进一步对叶绿素含量进行测定发现，低钾处理后，SlPLDδ沉默转基因株系叶片中的叶绿素含量显著低于野生型(图10)；野生型番茄JZ34的根系在低钾环境下长势较强，而沉默株系的根系较弱。证明了抑制SlPLDδ基因在耐低钾番茄JZ34中的表达，可以抑制植株根系以及叶片发育。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (6)
1.一种番茄磷脂酶SlPLDδ，其特征在于，所述番茄磷脂酶SlPLDδ的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种番茄磷脂酶SlPLDδ的应用，其特征在于，所述磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控。
3.根据权利要求2所述的一种番茄磷脂酶SlPLDδ的应用，其特征在于，所述磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控的方法为：利用过表达方法和番茄稳定遗传转化方法，将SlPLDδ基因在低钾敏感型番茄JZ18中过表达，提高对低钾胁迫的耐受性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述过表达方法中的过表达重组载体为pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ，所述过表达重组载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ的制备方法如下：提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，扩增SlPLDδ的目的片段；将扩增产物经限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，连接至pCAMBIA3301/Luc中，得到重组载体pCAMBIA3301/Luc-SlPLDδ；
所述扩增引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-OE-F：SEQ ID NO.2；
SlPLDδ-OE-R：SEQ ID NO.3。
5.根据权利要求2所述的一种番茄磷脂酶SlPLDδ的应用，其特征在于，所述磷脂酶SlPLDδ用于番茄耐低钾胁迫调控的方法为：利用RNA干扰方法和番茄稳定遗传转化方法，抑制SlPLDδ在耐低钾番茄JZ34中表达，抑制植株根系以及叶片发育。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述RNA干扰方法中RNA干扰SlPLDδ的重组载体为沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ，所述沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ的制备方法如下：提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，扩增SlPLDδ沉默目的片段；利用gateway方法，先将扩增产物与中间载体TOPO载体连接，再将目的片段转入终载体pB7GWIWG2中，得到沉默载体pB7GWIWG-SlPLDδ；
所述扩增引物的核苷酸序列为：
SlPLDδ-RNAi-F：SEQ ID NO.4
SlPLDδ-RNAi-R：SEQ ID NO.5。
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