CN117305302A - 油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用 - Google Patents

油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用，属于植物基因工程技术领域；该启动子包括受缺硼表达的调控元件，该调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该启动子驱动目的基因BnaC4.BOR2在油菜中的表达，从而在油菜苗期根系发育、叶片发育、硼的运输能力以及生殖生长期油菜花的发育和种子产量方面，相比于发生基因BnaC4.BOR2突变型的油菜，均具有更优异的表现。因此，可以将该启动子利用于油菜的快速育种。

Description

油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用
技术领域
本申请涉及植物基因工程技术领域，具体涉及油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用。
背景技术
硼是植物生长发育所必需的微量营养元素，在植物维持细胞壁的结构和稳定、光合作用和碳水化合物运输、蛋白质和核酸代谢、花器官发育和产量品质形成等方面起着不可替代的作用。
我国是油菜生产大国，菜籽油在我国油料市场中占据很大比重。长江中下游是我国油菜的主要种植区，但该地区年均降水量较大，土壤缺硼严重，常导致油菜“花而不实”现象，严重阻碍油菜的生产量。目前，针对油菜中由于缺硼导致油菜减产的相关研究较少，而相关的响应基因及完整的功能研究则更少。
植物对土壤硼的吸收利用是受遗传基因调控的，此前，油菜中低硼响应基因BnaA03.NIP5；1及其响应机制和功能已被报道(Hua et al.，2016；He et al.，2021)，该基因编码了一种硼酸通道蛋白，对硼的吸收进行调控。然而，负责硼的长距离运输相关基因BnaC4.BOR2的响应机制及对应的启动子响应片段尚不可知，基因功能也不清楚。
发明内容
针对油菜中响应低硼胁迫基因的启动子序列不清楚的问题，本申请从基因BnaC4.BOR2的启动子中鉴定到低硼响应的启动子具体序列，属第一次明确了低硼响应基因的启动子序列信息。包含该启动子的基因BnaC4.BOR2为油菜低硼胁迫响应基因，在低硼胁迫中，基因BnaC4.BOR2突变型油菜材料与野生型油菜材料相比，在苗期根系发育、叶片发育、硼的运输能力以及生殖生长期油菜花的发育和种子产量上均表现出严重的劣势，因此，本申请提供的基因BnaC4.BOR2的启动子可以作为低硼胁迫特异遗传标记，从而利用遗传手段有效调控相关油菜硼营养性状。
为实现上述目的，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子，所述启动子包括受缺硼表达的调控元件，所述调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因BnaC4.BOR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述启动子的序列长度为875～2139bp。
进一步地，所述启动子的核苷酸序列为A～C的至少一种：
A.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
B.核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
C.核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
第二方面，实施例公开了用于扩增前述启动子的引物对，所述引物对为D～F的至少一种：
D.其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
E.其核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
F.其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
第三方面，实施例公开了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的表达载体的构建方法，所述基因BnaC4.BOR2包括前述启动子，所述构建方法包括如下步骤：
设计目标基因BnaC4.BOR2的第一引物对；
在第一引物对的两个引物序列前端分别加上同源壁序列，形成第二引物对；所述同源臂序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
以目标基因BnaC4.BOR2为模板，以第二引物对为扩增引物进行扩增，获得目标片段；以及
将目标片段与空载体骨架进行infusion连接，获得所述目标基因BnaC4.BOR2的表达载体。
进一步地，所述第一引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；所述第二引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。
进一步地，所述空载体为线性化的酵母pYES2空载体。
第四方面，实施例公开了前述启动子和/或前述引物对在油菜育种中的应用。
第五方面，实施例公开了前述启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。
第六方面，实施例公开了一种核酸分子，所述核酸分子包含前述启动子的序列。
第七方面，实施例公开了包含前述核酸分子的载体。
第八方面，实施例公开了包含前述载体的宿主细胞。
本申请提供了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用，与现有技术相比，至少具备以下优势：
本申请从基因BnaC4.BOR2的启动子中鉴定到了低硼响应的启动子具体序列，第一次明确了低硼响应的启动子序列信息。所述启动子驱动目的基因BnaC4.BOR2在油菜中的表达，从而在油菜苗期根系发育、叶片发育、硼的运输能力以及生殖生长期油菜花的发育和种子产量方面，相比于发生基因BnaC4.BOR2突变型的油菜，均具有更优异的表现。因此，可以将所述启动子利用于油菜的快速育种。
附图说明
图1为实施例提供的基因BnaC4.BOR2响应油菜低硼时的表达结果；其中，A为油菜经过15天缺硼处理后基因BnaC4.BOR2的表达结果；B为油菜经过0～72小时缺硼处理基因BnaC4.BOR2的表达结果。
图2为实施例提供的基因BnaC4.BOR2的组织表达分析结果；其中，A为不同长度启动子载体的结构示意图，B为全长2139bp长度的启动子片段的GUS表达结果，C为1356bp、875bp、607bp长度的启动子片段的GUS表达结果，D为全长2139bp长度的启动子启动BnaC4.BOR2的CDS片段的GFP表达结果。
图3为实施例提供的基因BnaC4.BOR2在酵母中的硼转运活性分析结果；其中，A为基因BnaC4.BOR2在不同硼浓度下的酵母培养基的生长表型，B为基因BnaC4.BOR2在酵母细胞中的硼浓度测定结果。
图4为实施例提供的油菜下胚轴的继代培养过程。
图5为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体的基因编辑信息。
图6为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期的缺硼表型和生物量统计结果；其中，A为缺硼表型，B为生物量统计结果。
图7为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期不同部位的硼浓度测定结果。
图8为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期木质部汁液硼浓度的测定结果。
图9为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10短期的同位素10B吸收结果。
图10为实施例提供的基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10成熟期的缺硼表型、生物量统计及硼浓度测定结果；其中，A为缺硼表型，B为生物统计量及硼浓度测定结果。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
在本申请中，术语“基因”是指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5’非编码区)和之后的调节序列(3’非编码区)。
在本申请中，术语“元件”是指包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒，以及距转录起始点更远的上游元件。
在本申请中，术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。
在本申请中，术语“表达载体”是指在克隆载体基本骨架(空骨架)的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。
在本申请中，术语“同源臂序列”是指一段同源序列，其作用为将扩增出的目标基因片段与线性化的质粒连接起来。连接过程中，由于同源序列的存在，会使目标序列与质粒DNA发生同源重组，将目标序列片段插入到质粒中。
在本申请中，术语“infusion连接”是指在表达载体构建中的一种无酶连接技术，主要来源于infusion酶的发现，infusion酶能够识别线性化的DNA片段5’-3’末端任意16碱基，使其形成粘性末端。目标质粒通过酶切或者PCR线性化后，也能被infusion酶识别。只需要载体和基因形成的黏性末端互补，通过退火的过程就能完成载体的构建。
在本申请中，术语“核酸分子”是指RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
实施例提供了一个低硼响应的基因BnaC4.BOR2，该基因位于油菜第四条C染色体上，具体位点是从chrC04:22286377到22289443，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，在NCBI中的ID号是：BnaC04g00360D。
实施例提供了基因BnaC4.BOR2在油菜低硼胁迫中响应的具体描述，在低硼胁迫中，基因BnaC4.BOR2突变型油菜材料与野生型油菜材料相比，在苗期根系发育，叶片发育，硼的运输能力以及生殖生长期油菜花的发育和种子产量上均表现出严重的劣势。因此本发明在低硼胁迫特异遗传标记创建中具有一定的应用价值，为其他作物硼养分研究提供了借鉴。
基于此，实施例提供了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子，所述启动子包括受缺硼表达的调控元件，所述调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，油茶低硼响应的基因BnaC4.BOR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施例中，所述启动子的序列长度为875～2139bp；在这些实施例中的某些实施例中，所述启动子的序列长度为875bp，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；在这些实施例中的某些实施例中，所述启动子的序列长度为1356bp，其具体核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；在这些实施例中的某些实施例中，所述启动子的序列长度为875bp，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
基于此，实施例公开了扩增前述启动子的引物对。
在一些实施例中，所述引物对包括的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示；其用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的启动子。
在一些实施例中，所述引物对包括的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示；其用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的启动子。
在一些实施例中，所述引物对包括的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示；其用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的启动子。
基于此，实施例公开了油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的表达载体的构建方法，所述基因BnaC4.BOR2包含前述启动子。
在一些实施例中，其构建方法包括如下步骤：(1)设计目标基因BnaC4.BOR2的第一引物对；其中，第一引物对包括两个引物(正向和反向引物)，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示；(2)在第一引物对的两个引物序列前端分别加上同源壁序列，形成第二引物对；其中，所述同源臂序列为：SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13；第二引物对包括两个引物(正向和反向引物)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；(3)以目标基因BnaC4.BOR2为模板，以第二引物对为扩增引物进行扩增，获得目标片段；(4)将目标片段与空载体骨架进行infusion连接，获得所述目标基因BnaC4.BOR2的表达载体。
在一些实施例中，所述空载体为线性化的酵母pYES2空载体。
基于此，实施例公开了前述启动子和/或前述引物对在油菜育种中的应用。
基于此，实施例公开了前述启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。
基于此，实施例公开了包含前述启动子的序列的核酸分子。
基于此，实施例公开了包含前述核酸分子的载体。
基于此，实施例公开了包含前述载体的宿主细胞。
下面结合更加具体的实施例对本发明作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本申请的限制。
1、基因BnaC4.BOR2响应油菜低硼时的表达
(1)油菜长期缺硼培养条件：挑选饱满一致的野生型油菜种子青油10(QY10)整齐地播种在含有0.5M CaCl2的超纯水的尼龙网格上；待种子破壳萌发7天后，挑选大小一致的油菜幼苗于0.25μM B和100μM B的霍格兰营养液中培养15天，每5天更换一次营养液，然后将油菜分不同部位进行收样(根、茎、子叶、第一片叶、第二片叶、第三片叶)，储存在-80℃冰箱中；其中，霍格兰营养液的具体配方如下表1所示：
表1
配方(Reagent) 浓度(Concentration)
KH2PO4 0.14g/L
KNO3 0.51g/L
Ca(NO3)2·4H2O 1.18g/L
MgSO4·7H2O 0.49g/L
EDTA-Fe 0.025g/L
MnCl2·4H2O 1.81mg/L
ZnSO4·7H2O 0.22mg/L
CuSO4·5H2O 0.08mg/L
NaMoO4·2H2O 0.09mg/L
(2)油菜短期缺硼培养条件：挑选饱满一致的野生型油菜种子QY10整齐地播种在含有0.5M CaCl2的超纯水中的尼龙网格上；待种子破壳萌发7天后，挑选大小一致的油菜幼苗于100μM B的霍格兰营养液中培养10天，每5天更换一次营养液；然后开始用无硼的霍格兰营养液培养，分别在无硼处理的第0，3，6，12，24，72小时和恢复供硼1天后取样(根系和地上部)，储存在-80℃冰箱中。
(3)定量分析过程：将储存在-80℃冰箱中的油菜样品(根、茎、子叶、第一片叶、第二片叶、第三片叶)研磨成粉末，再用TRIZOL试剂进行RNA的提取，核酸浓度及质量鉴定通过分光光度计仪器测定；若RNA 260/280的比值在1.8～2.2之间，则提取出的RNA质量较好，可用于下一步的逆转录，将质量较好的RNA样品用逆转录试剂盒进行cDNA的合成，合成后的cDNA样品用于荧光定量PCR分析。
如图1A所示，在长期(15天)缺硼营养液处理下，基因BnaC4.BOR2在油菜的根、第一片叶、第二片叶及第三片叶都受到低硼诱导表达，且在根系和第一片叶中表达量较高；如图1B所示，短期(0～72小时)缺硼营养液处理下，基因BnaC4.BOR2在根系和地上部均受不同程度下的低硼诱导表达，且根系受缺硼的诱导表达幅度更大。
2、低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子序列筛选及验证
(1)试验过程：利用基因BnaC4.BOR2的ID号在油菜数据库Brassica napus Genome Resources(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)查找基因信息，然后设计特异性引物将基因BnaC4.BOR2序列的上游2139bp的片段克隆出来，通过Infusion无缝克隆技术，将基因BnaC4.BOR2的启动子片段连接到带有GUS报告基因的DX2181载体(pBnaC4.BOR2::GUS)；为了进一步弄清其因BnaC4.BOR2的启动子受缺硼调控的分子机制，通过对启动子片段信息分析，将克隆出的全长启动子片段2139bp按照不同长度片段进行截断，截断长度分别为1356bp，875bp，607bp，随后设计特异性引物，将不同长度的片段克隆后连接到DX2181载体；最后，通过农杆菌介导的拟南芥沾花方法将构建好的表达载体导入野生型拟南芥Col-0。随后利用含有抗生素的生长培养基进行抗性筛选收获阳性苗，繁殖培养直至获得纯合体。
(2)PCR扩增引物设计
本实施例共设计四组引物对，其中，用于扩增2139bp全长片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10(F1)和SEQ ID NO.11(R1)所示；用于扩增1356bp长度片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8(F2)和SEQ ID NO.9(R2)所示；用于扩增875bp长度片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6(F3)和SEQ ID NO.7(R3)所示；用于扩增607bp长度片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18(F4)和SEQ ID NO.19(R4)所示。
(3)PCR反应体系及程序
PCR反应体系为：2X Phanta Max Master Mix，25μl、引物(F)，2μl、引物(R)，2μl、模板DNA(200ng)，1μl、ddH2O，20μl；
PCR扩增程序：95℃，3min；95℃，15sec、58℃，15sec、72℃，2min，设置35个循环；72℃，10min；22℃，2min。
(4)载体构建条件
将片段连接到DX2181载体条件为：目标片段，25-50ng；载体片段，10-25ngInfusion酶，0.5μl；ddH2O，加至5μl，50℃条件下反应20min。
图2为基因BnaC4.BOR2的组织表达分析结果，其中，图2A为不同长度启动子载体的结构示意图；如图2B、2D所示，正常硼条件处理下(100μM B)，在含有2139bp全长启动子的转基因材料中，基因BnaC4.BOR2主要在根尖和根系的维管组织中表达，地上部也有表达，然而，在缺硼条件处理下(0.1μM B)，基因BnaC4.BOR2在根尖、根系维管组织、地上部的表达水平显著上升，表达模式没有发生改变；将含有启动子片段1357bp，875bp，607bp的转基因材料进行了GUS染色，如图2C所示，含有1357bp和875bp长度的启动子片段的转基因材料的表达模式没有发生变化，且均受缺硼诱导表达，然而，在含有607bp启动子片段的转基因材料中，该材料表达量迅速下降，几乎没有表达。以上结果表明，基因BnaC4.BOR2受缺硼表达的调控元件位于上游启动子序列607bp～875bp之间。
3、基因BnaC4.BOR2在硼运输的活性分析
(1)酵母载体构建
选用无缝克隆法(infusion连接)进行酵母载体构建。酵母空载体选用pYES2空载体。用单酶切法将空载体线性化，然后根据载体线性化后的两端序列信息设计目标基因BnaC4.BOR2的引物，用已测序正确的CDS质粒作为模板，在目标基因BnaC4.BOR2的引物(第一引物对，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示)前端加上与载体连接的15bp同源臂序列(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示)形成第二引物对(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示)进行片段扩增，然后将扩增后的目标片段和线性化后的载体骨架进行infusion连接；在PCR仪上50℃条件下反应15min；最后将反应完全的混合液进行大肠杆菌转化。
(2)酵母片段连接(infusion)条件
目标片段，25～50ng；载体片段，10～25ng；Infusion酶，0.5μl；ddH2O，加至5μl，50℃条件下反应20min。
(3)酵母转化过程
取-80℃保藏的YNL菌液于冰上融化，划线于YPDA固体培养基中，30℃培养箱中倒放2天，长出单克隆菌落即可；随机挑取单克隆于YPDA液体培养基，于30℃，220rpm摇床中摇菌进行增殖培养；吸取1.5ml摇好的菌液于2ml EP管中，14400rmp离心1min；弃去上清，用灭菌的双蒸水重悬两次洗涤菌体，14400rmp离心1min；弃去上清，向离心管中加100μl onestep buffer试剂；混匀后，加6μl Carrier DNA和4μl自身基因质粒的混合液(Carrier DNA需要先在100℃金属浴中处理5min，放置冰上预冷2min，然后加4μl自身质粒与其混合)；42℃水浴30min；取100μl的反应液，涂板于SD-URA固体培养基；最后将涂好的培养皿倒放于30℃培养箱中3天，直到长出单克隆菌落算作转化成功；其中，YPDA液体培养基配方为：5g粉末+100ml纯水，灭菌，YPDA固体培养基在液体培养基配方基础上加入2％的琼脂(Agar)；onestep buffer试剂制作配方：100mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，0.7715g、乙酸锂(Lithium acetate，0.2N)，1.0202g、聚乙二醇(PEG3350)40％，20g依次溶解，用浓盐酸调整溶液pH至5.8，过滤灭菌；SD-URA固体生长培养基配方为：以100ml为例，酵母腈(Yeastnitrigen)，0.67g、URA DO(除尿氨酸的其他所有氨基酸和核苷酸等基本营养元素)，0.077g、葡萄糖(Glucose)，2g、琼脂(Agar)，2g。
(4)酵母硼浓度测定主要过程：
挑取之前转化好的单克隆菌体于SD-Galactose液体培养基中，30℃，220rmp，加500μl液体培养24h；取200～400μl菌液于10ml SD-Galactose液体培养基中扩大培养(30℃，220rmp，18～28h)；OD590测量菌液是否达到了1.0(先将菌液稀释4倍，即250μl cμltuer+750μl ddH2O)；若达到，在Excel中计算，在每个50ml离心管中加30ml灭菌水，然后对号入座加相应量的菌液使其在OD590测量达到1.0即可，计算公式：4C1*V1/(30+V1)＝1.0，V1＝30/(4C1-1)；取体积最小的那个菌液为所有菌液的目标体积，使各个菌液体积保持一致；离降(3000～4000rmp，5min)，弃上清，再加入10ml SD-Galactose液体培养基(含有浓度为100mM硼酸50μl)，220rmp，培养45～60min；提前4℃预冷离心机，离心(3000～4000rmp，4℃，8min)，弃上清；未离心样品置于冰上，加5～10ml预冷的H2O重悬沉淀，洗涤两次，弃上清；加750μl预冷的H2O冲洗沉淀，然后转移至1.5或2ml EP管中；离心管于99℃，30min电浴锅处理，破碎细胞，用封口膜封好离心管盖，以防冲出(用塑料封口膜在高温下能融化在管壁上，造成实验误差，可用重物压在管盖上)；15000rmp，20min离心；吸取上清液于一干净的10ml离心管中；用2％的优级纯HNO3稀释至3～10ml；将剩余的固体烘干称重(65或70℃烘箱，2天)，实验前应提前称重空离心管，记录数据；ICP-MS上机测硼浓度；提前配标准曲线0，2.5，5，10，20，50，100μg/L B(natural studio)；其中，SD-Galactose(半乳糖)液体培养基配方为：以100ml为例，酵母腈(Yeast nitrigen)，0.67g、URA DO(除尿氨酸的其他所有氨基酸和核苷酸等基本营养元素)，0.077g、半乳糖(Galactose)，2g，SD-Galactose(半乳糖)固体培养基在液体培养基配方上加上2g琼脂(Agar)。
图3为BnaC4.BOR2在酵母中的硼转运活性分析结果，图3A为基因BnaC4.BOR2在不同硼浓度下的酵母培养基的生长表型，图3B为基因BnaC4.BOR2在酵母细胞中的硼浓度测定，从图中显示的结果可以看出，基因BnaC4.BOR2具有硼转运活性。
4、基因BnaC4.BOR2克隆及其突变体功能分析
(1)基因BnaC4.BOR2克隆
设计基因BnaC4.BOR2的CDS片段特异引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20(F5)和SEQ ID NO.21(R5)所示；在以下PCR扩增体系和程序下进行扩增：
PCR扩增体系：Prime STAR Max Premix(2X)，25μl、引物1(F5)，1μl、引物2(R5)，1μl、模板DNA(<200ng)，2μl、dd H2O，2μl；
PCR扩增程序：98℃，2min；98℃，10sec、55℃，5sec、72℃，10sec，设置35个循环；72℃，5min；22℃，2min。
(2)基因BnaC4.BOR2突变体的创建
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行目标基因的敲除，利用CRISPR-P v2.0网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计基因BnaC4.BOR2目标靶点进行载体构建，然后通过油菜下胚轴遗传转化的方法获取阳性材料(如图4所示)，随后通过基因测序方法将阳性的材料进行鉴定目标序列是否发生编辑(如图5所示)。
(3)油菜下胚轴遗传转化方法
①灭菌：用75％酒精浸泡油菜种子2min，灭菌水洗净；再将油菜种子转移至1％NaClO试剂10～15min，灭菌水洗净；
②播种：用无菌镊子，将灭好菌的油菜种子播到M0培养基中，每皿播30～50粒种子；将播种好的M0放入无菌的培养箱中，黑暗处理5～7天；
③摇菌：在播种后第四天，将构建好的载体(农杆菌)划线于kan抗性的LB培养基上，28℃培养3天，待长出单克隆后，用无菌的牙签挑取单克隆于含有kan抗性LB培养基的2ml离心管中，然后在28℃，200rpm/min的摇床中培养一天；混后的菌液接种于含有30ml的kan抗性的LB的50ml灭菌离心管中进行扩大培养，菌液摇混即可；
④下胚轴侵染：将灭菌后的DM溶液倒入灭菌后的大圆皿中，然后用无菌镊子和无菌手术刀切生长7天的幼苗的下胚轴，将每个下胚轴一刀切取，使切口处平整，提高侵染效率，长度约为0.8～1cm；用灭好菌的DM液体(含10μM As，乙酰丁香酮)等体积重悬菌液，4000rpm/min离心15min，然后弃上清；待下胚轴全部切完后，将处理好的菌液倒入大圆皿中侵染下胚轴10～15min(侵染时间可根据菌液OD值大小调整)，菌液OD值处于0.8～1.0之间；
⑤转移至M1培养基中：侵染后的下胚轴必须迅速转移至灭菌的滤纸上，晾干下胚轴，然后将晾干的下胚轴整齐的移入M1培养基中培养，黑暗处理2天；将M1中的下胚轴转移至M2中，光照培养两周左右，24℃培养室；将M2中的下胚轴转移至M3中继代培养，每10～15天继代培养一次，直到长出绿叶；将M3中长出绿叶的下胚轴转移至M4培养基中继续培养，直至长出根系，大约需要2～4周。
(5)通过土壤盆栽试验分析了基因BnaC4.BOR2与野生型青油10号成熟期的农艺性状，每盆土壤重量为7kg，盆栽中肥料的组分及施用量如下表2所示：
表2
盆栽试验各肥料使用量 低硼(0.25mg/kg) 正常硼(1.0mg/kg)
硼酸(mL，母液500mg/L) 2.1 12.6
(NH4)2SO4(g) 6.6 6.6
KH2PO4(g) 2.01 2.01
KCl(g) 1.12 1.12
MgSO4·7H2O(g) 1.75 1.75
无硼Aron营养液(mL) 7.0 7.0
EDTA-Fe(25μg/L，mL) 35 35
图6为基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期的缺硼表型和生物量统计结果，如图6A、6B所示，苗期长期缺硼(0.25μM)处理下，相较于野生型QY10，基因BnaC4.BOR2突变体材料出现明显的缺硼症状，主要表现在根长的抑制，地上部叶片深绿，卷曲，地上部和根生物量显著下降；而苗期正常硼(100μM)处理下，突变体材料与野生型QY10没有显著的差异，均能正常地生长发育。
图7为基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期不同部位的硼浓度测定，如图7所示，通过测定突变体与野生型的硼浓度可知，缺硼处理下的突变体根系，子叶，茎，第一片叶，第二片叶，第三片叶的硼浓度显著低于野生型，但是基因BnaC4.BOR2突变体材料的第一片生物量与野生型QY10无差异，以上结果表明，基因BnaC4.BOR2参与了硼吸收的功能，影响了地上部不同部位的硼分配。
图8基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10苗期木质部汁液硼浓度的测定结果，如图8所示，通过测定木质部汁液的硼浓度发现，突变体材料中的硼浓度显著低于野生型，说明基因BnaC4.BOR2参与了硼从根系向地上部转运的过程。
图9基因BnaC4.BOR2突变体和野生型QY10短期的同位素10B吸收结果，如图9所示，通过短期的同位素吸收试验发现，突变体材料的根系硼浓度仍然显著低于野生型，进一步证明基因BnaC4.BOR2参与了硼的吸收过程。
图10为土壤盆栽试验中基因BnaC4.BOR2与野生型QY10成熟期的农艺性状结果，如图10A所示，在缺硼土壤中，相较于野生型QY10，基因BnaC4.BOR2突变体材料出现严重的只开花而不结果实的现象；在正常硼土壤中，突变体与野生型均能正常开花结果，无差异；在低硼土壤中的BnaC4.BOR2突变体茎秆、叶片和角果的干重均显著低于野生型QY10，如图10B所示，通过测定成熟期油菜的茎秆，叶片和角果中的硼浓度，相较于野生型QY10，基因BnaC4.BOR2突变体材料中的叶片和角果中的硼浓度显著降低，然而，在基因BnaC4.BOR2突变体中的茎秆硼浓度与野生型的茎秆硼浓度无差异；进一步分析硼在茎秆、叶片和角果中的硼分配情况，结果发现，相较于野生型QY10，基因BnaC4.BOR2突变体材料在茎秆中的硼分配更多，叶片和角果中的硼分配更少。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子，其中，所述启动子包括受缺硼表达的调控元件，所述调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因BnaC4.BOR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的启动子，长度为875～2139bp。
3.根据权利要求1所述的启动子，其中，所述启动子的核苷酸序列为A～C的至少一种：
A.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
B.核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
C.核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.扩增权利要求3所述启动子的引物对，其中，所述引物对为D～F的至少一种：
D.其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
E.其核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
F.其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
5.包含权利要求1所述启动子的基因BnaC4.BOR2的表达载体的构建方法，其包括如下步骤：
设计目标基因BnaC4.BOR2的第一引物对；所述第一引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示；
在第一引物对的两个引物序列前端分别加上同源壁序列，形成第二引物对；所述同源臂序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述第二引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示；
以目标基因BnaC4.BOR2为模板，以第二引物对为引物进行扩增，获得目标片段；以及
将目标片段与线性化的酵母pYES2空载体骨架进行infusion连接，获得所述目标基因BnaC4.BOR2的表达载体。
6.权利要求1～3任一项所述启动子和/或权利要求4所述引物对在油菜育种中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。
8.一种核酸分子，其包含权利要求1所述启动子的序列。
9.一种载体，其包含权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的载体。
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