CN114277053B - 水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过农杆菌介导的转基因体系在水稻中定点突变感病OsHPP04基因，以获得OsHPP04功能缺失的水稻纯合突变植株，将纯合突变植株进行根结线虫的抗性测定，抗性测定表明纯合突变植株能显著提高水稻根结线虫的抗性。本发明方法可以实现方便高效的水稻基因编辑，获得的突变植株对根结线虫的抗性显著提高，克服现有水稻抗性资源不足，提供一种应用定点编辑提高根结线虫病抗性的方法，以获得OsHPP04功能缺失的抗根结线虫病水稻新品系，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻的方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)作为世界上主要的粮食作物之一，为全球一半以上的人口提供主食。而拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)会引起水稻根结线虫病，是最重要的线虫病害之一，会导致水稻至少20％的损失。该线虫寄生于水稻根部，在根尖产生根结，影响水稻根系统中水分和养分的吸收及运输，导致地上部分矮小、黄化和萎蔫等症状。由于该症状与缺素症状类似，极易被忽视，一旦确认是线虫危害时，该病害已经发生严重，对水稻产量造成了严重的影响，甚至绝收。
目前，培育和种植抗性品种是防治根结线虫病最经济、有效和环保的措施；尽管科学家已经发现了抗拟禾本科根结线虫的自然水稻种质，如亚洲稻中花11，然而其主效的抗病基因至今未确定。因此，应用抗病基因培育抗病品种仍然面临着一定的挑战。
而植物感病基因(S gene)对病原菌的成功入侵及与宿主建立亲和互作关系必不可少，至今已报道的感病基因的作用机制主要可以分成3种类型：第一种为有利于病原物识别和侵入宿主，如白粉病感病基因MLO；第二种为负调控宿主植物免疫信号，如拟南芥的泛素连接酶PUB22、PUB23和PUB24；第三种为有利于病原菌获取营养和繁殖的感病基因，如SWEET家族基因。突变这些感病基因可以干扰病原菌和宿主之间的亲和互作，从而使植物产生广谱和持久的抗病能力。近年来，通过基因操作突变一些重要作物上的感病基因，已经实现了作物抗病性的提高。然而，植物感病基因通常具有多效性，当感病基因功能完全缺失时，导致抗病植株的生长受到影响。因此，如何使作物能够兼顾高产又能抵抗病原菌的侵害，是培育抗病育种的关键所在。
最近，CRISPR/Cas9技术已经成功应用于水稻上感病基因的编辑，实现了广谱抗性水稻品系的培育。如Ni等人利用CRISPR/Cas9技术精确编辑水稻品种桂红1号和中花11的感病基因OsSWET11、OsSWEET14和OsSULTR3；6的EBEs，筛选和鉴定到的基因编辑水稻品系GT0105(来自桂红1号)和ZT0918(来自中花11)不仅对白叶枯病和条斑病的抗性显著提高，而且其它生物学性状与亲本一致(Ni Z,Cao Y,Jin X,et al.Engineering Resistance toBacterial Blight and Bacterial Leaf Streak in Rice[J].Rice,2021.)；随后Tao等人同时编辑水稻品种日本晴Pi21、Bsr-d1和Xa5三个感病基因，获得pbxcas9三突变植株同时表现出对稻瘟病和白叶枯病的广谱抗性，且与对照相比，pbxcas9三突变植株的株高和千粒重等农业性状无明显变化(Tao,H.,Shi,X.,He,F.et al.Engineering broad-spectrumdisease-resistant rice by editing multiple susceptibility genes.Journal ofintegrative plant biology,63(9),1639–1648(2021).)。然而，目关于突变感病基因从而提高水稻抗根结线虫病的方法还鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有水稻抗性资源不足，提供一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻的方法，以获得OsHPP04功能缺失的抗根结线虫病水稻新品系。
本发明的目的是提供水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用。
本发明另一目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本课题组前期研究发现，拟禾本科根结线虫效应子MgMO289中的互作蛋白——重金属伴侣蛋白(OsHPP04)与水稻对线虫的敏感性紧密相关，在日本晴水稻中过表达OsHPP04显著增强了植株对线虫的敏感性，显示OsHPP04为水稻根结线虫病的感病基因，然而突变OsHPP04能否增强水稻对根结线虫的抗性还有待进一步的研究。因此，本发明拟在此研究基础上，进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻OsHPP04基因进行编辑，通过定点敲除水稻感病基因OsHPP04，获得了OsHPP04基因纯合突变植株。结果显示，敲除OsHPP04基因不仅不会影响水稻植株的生长表型，且能显著提高水稻根结线虫的抗性。
因此，本申请首先请求保护关于OsHPP04基因的以下应用：
水稻感病基因OsHPP04在提高水稻根结线虫病抗性或在培育抗根结线虫病水稻中的应用，其特征在于，定点突变水稻中的OsHPP04基因，获得OsHPP04基因纯合突变；所述OsHPP04基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选地，所述定点突变采用CRISPR/Cas9技术。
本发明还提供一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04提高根结线虫病抗性的方法，构建含OsHPP04基因sgRNA序列的CRISPR/Cas9植物表达载体，通过农杆菌介导的转基因体系在水稻中定点突变OsHPP04基因，获得OsHPP04功能缺失的水稻植株，该植株对根结线虫的抗性显著提高。
具体的，上述方法包括以下几个步骤：
S1.设计敲除OsHPP04基因的靶点sgRNA序列；
S2.将步骤S1中得到的sgRNA序列构建到CRISPR/Cas9植物表达载体中；
S3.将步骤S2中得到的植物表达载体通过根癌农杆菌整合到水稻基因组中；
S4.通过步骤S3将农杆菌介导的水稻愈伤组织转化，获得的愈伤组织进行抗性愈伤组织筛选和分化，获得转基因水稻植株；
S5.将步骤S4中获得的转基因水稻植株进行筛选和鉴定，确定突变体植株；
S6.将步骤S5获得的突变体植株进行脱靶检测，筛选出无脱靶效应的纯合突变植株；
S7.将步骤S6获得的纯合突变植株进行根结线虫抗性测定，即能筛选出抗根结线虫病的水稻植株。
优选地，步骤S1中采用靶点sgRNA包含gRNA1和gRNA2，其序列依次如SEQ ID NO.16～17所示。
优选地，步骤S2中CRISPR/Cas9植物表达载体的构建方法为：采用OverlappingPCR的方法，第一轮PCR分别以pYLsgRNA-U6a和pYLsgRNA-U6b为模板，将gRNA1引入OsU6a启动子下游和sgRNA序列的上游、gRNA2引入OsU6b启动子下游和sgRNA序列的上游；第二轮PCR分别以稀释10倍后的第一轮PCR产物为模板，将启动子、靶点和sgRNA骨架构建成完整的表达盒，gRNA1表达盒引物组合为Pps-R/Pgs-2，gRNA2表达盒引物组合为Pps-2/Pgs-L；接着再将gRNA1和gRNA2表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体上，获得重组植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO。
优选地，步骤S2中采用的引物为：U-F、gR-R、OsHPP04-gRT1、OsHPP04-OsU6aT1、OsHPP04-gRT2、OsHPP04-OsU6bT2、Pps-R、Pgs-2、Pps-2和Pgs-L，所述引物序列依次为SEQID NO.1～10所示。
优选地，步骤S2中使用的载体为pYLsgRNA-OsU6a/OsU6b和pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H。
优选地，步骤S4中水稻愈伤组织转化的黑暗培养条件为25～35℃，2～25d。
优选地，步骤S6中的脱靶检测是采用高保真酶扩增各潜在脱靶位点区域片段，将纯化后的PCR产物进行测序分析脱靶情况。
优选地，所述突变株为无脱靶效应的纯合突变植株。
优选地，步骤S7中所述的根结线虫抗性测定方法是采用活体接种法。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术通过农杆菌介导的转基因体系在水稻中定点突变感病OsHPP04基因，以获得OsHPP04功能缺失的水稻纯合突变植株，将纯合突变植株进行根结线虫的抗性测定，抗性测定表明纯合突变植株能显著提高水稻根结线虫的抗性。采用本发明方法可以实现方便，高效的水稻基因组编辑，且筛选出的突变植株对根结线虫的抗性显著提高，克服现有水稻抗性资源不足，提供一种应用定点编辑提高根结线虫病抗性的方法，以获得OsHPP04功能缺失的抗根结线虫病水稻新品系，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。
附图说明
图1为OsHPP04基因结构及guide RNA靶标序列；
图2为pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO载体T-DNA结构示意图；
图3为PCR筛选含有Cas9基因的阳性转基因植株；
图4为突变株Line H4和Line H6的OsHPP04基因靶序列突变及其氨基酸变化比对结果；
图5为靶点sgRNA1和sgRNA2的潜在脱靶位点脱靶结果；
图6为OsHPP04突变植株和日本晴植株表型观察；
图7为突变株Line H4和Line H6接种拟禾本科根结线虫后线虫侵染和发育统计结果，以野生型日本晴为对照；*表示t-test检验有显著差异(P<0.05)；**表示t-test检验有极显著差异(P<0.01)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1基于CRISPR/Cas9技术定点敲除水稻感病基因OsHPP04
(1)gRNA靶位点设计
根据OsHPP04基因的序如SEQ ID NO.18所示，在OsHPP04基因的第二个外显子上设计了两个靶位点gRNA1和gRNA2，其序列依次如SEQ ID NO.16～17所示(如图1所示)。
(2)植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO的构建
以Overlapping PCR的方法将靶点序列导入sgRNA表达盒中，采用引物为：U-F、gR-R、OsHPP04-gRT1、OsHPP04-OsU6aT1、OsHPP04-gRT2、OsHPP04-OsU6bT2、Pps-R、Pgs-2、Pps-2和Pgs-L(上述引物序列依次为SEQ ID NO.1～10)。
第一轮PCR分别以pYLsgRNA-U6a和pYLsgRNA-U6b为模板，将gRNA1引入OsU6a启动子下游和sgRNA序列的上游(引物组合U-F和OsHPP04-gRT1、OsHPP04-OsU6aT1和gR-R)、gRNA2引入OsU6b启动子下游和sgRNA序列的上游(引物组合U-F和OsHPP04-gRT2、OsHPP04-OsU6bT2和gR-R)。
第二轮PCR分别以稀释10倍后的第一轮PCR产物为模板，将启动子、靶点和sgRNA骨架构建成完整的表达盒，gRNA1表达盒引物组合为Pps-R/Pgs-2，gRNA2表达盒引物组合为Pps-2/Pgs-L。接着再通过“GoldenGate”方法将gRN A1和gRNA2表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体上，获得重组植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO。图2为OsHPP04-CRISPR/Cas9-KO载体T-DNA结构示意图。
所述载体pYLsgRNA-U6a，pYLsgRNA-U6b和pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H来源于华南农业大学刘耀光实验室，已在文献《Xingliang Ma,Qunyu Zhang,Qinlong Zhu,et al.2015,ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants.Molecular Plant,8(8):1274-1284》中公开。
(3)重组载体热激法导入根癌农杆菌EHA105
参考EHA105感受态转化方法，将(2)中的重组植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO通过热激法转化进入根癌农杆菌EHA105菌株中，转化后挑取单克隆进行PCR检测，阳性克隆命名为EHA105/OsHPP04-CRISPR/Cas9-KO。
(4)农杆菌介导的水稻愈伤组织转化
根癌农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化所需培养基及配制成分如下表1所示，以下培养基需要提前3天准备。
表1根癌农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化所需培养基
农杆菌介导的水稻愈伤组织转化具体方法如下：
S1.将水稻种子经表面消毒后接种于诱导培养基，放于30℃恒温暗培养1个月左右，将诱导产生的愈伤组织接种于新的继代培养基上，1周后可作为农杆菌转化的材料；
S2.采用上述(3)中制备的重组载体，从-80℃冰箱中取出EHA105/OsHPP04-CRISPR/Cas9-KO原管菌液，在含有50μg/mL利福平和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上划线培养，28℃暗培养2d后，用移液枪吸取1mL的粳稻悬浮培养基，洗下平板上的农杆菌，将其加入到含50mL悬浮液的三角瓶中，置于28℃恒温摇床摇菌1-2h，调至OD值为1.0左右，置于超净工作台上备用；
S3.挑选淡黄色表面干爽结构致密的愈伤组织，放于农杆菌悬浮液中侵泡浸泡30min，然后转移到固体共培养基上，25℃黑暗条件下共培养3d；
S4.将共培养后的愈伤组织用无菌水洗3遍，然后用无菌滤纸吸干水分转移到筛选培养基中，30℃暗培养，20d后将抗性愈伤转入新的筛选培养基进行第二次筛选；
S5.将筛选出来的抗性愈伤组织转移至分化培养基，置于光照培养箱中培养，条件为：28℃，16hr光照/8hr黑暗，光照度约12000LX。分化1个半月左右，可获得转基因植株。
实施例2转基因水稻突变位点检测
采用CTAB法提取实施例1(4)中的转基因水稻的叶片基因组DNA，以检测Cas9编码序列的引物Cas9-F和Cas9-R(引物序列依次为SEQ ID NO.11～12)进行PCR扩增。
扩增后的电泳结果如图3所示，第1泳道为DNA分子Marker，条带大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；第2泳道为以ddH2O为模板的阴性对照；第3泳道为以pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO质粒为模板的阳性对照；第4-13泳道为转基因植株。
再以Cas9检测为阳性植株的DNA为模板，用引物OsHPP04-Pf和OsHPP04-Pr(引物序列依次为SEQ ID NO.13～14)扩增OsHPP04靶区域507bp的片段，进行纯化。
将上述纯化后的PCR产物进行Sanger测序，测序引物为OsHPP04 KO-cx-F(SEQ IDNO.15)，测序结果通过在线软件DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)进行解码，分析转基因植株的突变位点情况。
结果如图4a所示为Line H4和Line H6转基因植株sgRNA靶序列突变的结果，图4b为缺失突变引起编码氨基酸变化的结果。突变结果显示，两个转基因植株的OsHPP04基因均为缺失突变，缺失碱基为两个靶点双缺口之间的序列。株系Line H4为缺失29bp的纯合突变，株系Line H6为缺失31bp的纯合突变，它们均能产生移码突变使基因提前终止，导致基因完全突变。
实施例3突变水稻脱靶效应检测
突变水稻的靶点sgRNA1和sgRNA2潜在脱靶位点情况如下表2所示，潜在脱靶位点PCR扩增及测序引物如下表3所示。
表2靶点sgRNA1和sgRNA2的潜在脱靶位点情况
表3潜在脱靶位点PCR扩增及测序引物
使用高保真酶扩增各潜在脱靶位点区域650bp左右的片段，将纯化后的PCR产物进行Sanger测序，分析株系Line H4和Line H6的脱靶情况。结果如图5所示，株系Line H4和Line H6中6个潜在的脱靶位点均未检测到脱靶。
实施例4OsHPP04纯合突变株系对根结线虫抗性测定
以野生型水稻日本晴为对照材料，把刚孵化的拟禾本科根结线虫2龄幼虫(J2s)分别接种到日本晴和OsHPP04各突变株水稻的根部。用于接种的拟禾本科根结线虫为本实验室保存种群，该种群(HN1)采自海南文昌。
首先，制备拟禾本科根结线虫J2s接种悬浮液，挑取水稻根中根结放于培养皿中，采用浅盘法对线虫进行分离，3-5天后，将新鲜孵化出来的J2s收集于500mL的烧杯中，用磁力搅拌器将线虫搅拌均匀，然后用移液枪吸取200μl悬浮液，滴于玻璃培养皿中，在解剖镜下进行计数，重复5次，调节悬浮液的线虫数量为100条/mL。
拟禾本科根结线虫接种的具体方法为：水稻经过10d的育苗，移栽到含石英砂的PVC管中，每隔3d浇一次霍格兰培养液，两周后，接种2mL拟禾本科根结线虫悬浮液，每个处理接种15棵水稻，接种后每隔2-3天浇一次水。水稻生长条件为：温度27℃，光/黑暗周期为14h/10h，光照强度为11000Lx。
拟禾本科根结线虫接种后14d用酸性品红染色统计线虫的侵染数量及发育情况，最后取多棵水稻的平均值，做T-test差异分析(P<0.05)。结果如图7所示，与日本晴水稻相比，Line H4和Line H6的总虫数和雌虫数均显著减少，明显增强了对拟禾本科根结线虫的抗性。而且，表型比较显示OsHPP04突变植株与野生型植株没有明显差异(结果如图6所示)，说明敲除OsHPP04不会影响水稻植株的生长表型。
由此，利用本发明提供的含2个sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统能有效突变水稻感病基因OsHPP04，抗性测定表明突变OsHPP04能显著提高水稻根结线虫的抗性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaaagatcg tgataaaggg ttttagagct agaaat 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctttatcac gatcttttgc ggcagccaag ccagca 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcgacaagt gcaggtcgag ttttagagct agaaat 36
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgacctgca cttgtcgcac aacacaagcg gcagc 35
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcagaggtc tctaccgact agtcacgcgt atggaatcgg cagcaaa 47
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcgtgggtc tcgctcgacg cgtatccatc cactccaagc 40
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actggaggca gcttctcaac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagcgatgag cttgtccgag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatctcactc atccacgcca 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttcttgacc tcgccgac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgagctaat tcccaagc 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcaaaagatc gtgataaagg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgcgacaag tgcaggtcga 20
<210> 18
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgggacagg acagcatcag ctcctatata aaggagcgca gccctggaga ctctcttatc 60
tcactcatcc acgccaagct gagctaattc ccaagctagt gaagagtaca aaatcacaca 120
attcgatcag ggttttgcta attagtagcc tccgatctcg ttcctgccaa gaaattaagc 180
aaagcaatgg ccaaggtacc taattactac acatcacttg cttctcatag tttcttacag 240
cttaatttgg tttcgatcgc tgtgtgtgcc gaaagcctga aactgaattt tctgaaacaa 300
actggaactg aatttggttg tgtttgataa tttgatttgc agcaaaagat cgtgataaag 360
gtggagatgt cgtgcgacaa gtgcaggtcg aaggcgatgg cgctggtggc ggcgacggga 420
ggggtggact cggtggcgct ggccggggac ggcaaggatc aggtggtggt ggtcggcgac 480
ggcgtcgact ccatcaagct caccgccgcg ctgcgcaaga aggtcggcca cgccacgctc 540
gtgaccgtcg gcgaggtcaa gaaggaggag aagaagccgg agcccgccgc cgccgccgtc 600
gagtacccgt ggagctacca cccggcctac acctacgcgc cgccggcgca gcacgtcttc 660
taccagcagt atccagccag ctcgccgtgg tggtgctaag tgcttaacta ctcgtattag 720
ataaaatcaa tcaatctggt ccgttggatc gaaaagatca agatacgtgg cgtccatgtt 780
tctcggatta aaagtgtata aagtaggatg gtctgggttg tttaggacag atcgctgaga 840
gatcagcatg tcgtcccccc ctccctctca tttttggtga tttaaattga ttcagagaag 900
attttggctt tgtgcatctc aaattttcgt gactgtcccg ttgtccgttg attggtgata 960
aattaagcct ctatattt 978
Claims (10)
1.水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用，其特征在于，定点突变水稻中的OsHPP04基因，获得OsHPP04功能缺失的水稻植株；所述OsHPP04基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述定点突变采用CRISPR/Cas9技术。
3.一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻的方法，其特征在于，构建含OsHPP04基因sgRNA序列的CRISPR/Cas9植物表达载体，通过农杆菌介导的转基因体系在水稻中定点突变OsHPP04基因，获得OsHPP04功能缺失的水稻植株。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1. 设计敲除OsHPP04基因的靶点sgRNA序列；
S2. 将步骤S1中得到的sgRNA序列构建到CRISPR/Cas9植物表达载体中；
S3. 将步骤S2中得到的植物表达载体通过根癌农杆菌整合到水稻基因组中；
S4. 通过步骤S3将农杆菌介导的水稻愈伤组织转化，获得的愈伤组织进行抗性愈伤组织筛选和分化，获得转基因水稻植株；
S5. 将步骤S4中获得的转基因水稻植株进行筛选和鉴定，确定突变体植株；
S6. 将步骤S5获得的突变体植株进行脱靶检测，筛选出无脱靶效应的纯合突变植株；
S7. 将步骤S6获得的纯合突变植株进行根结线虫抗性测定，即能筛选出抗根结线虫病的水稻植株。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中采用的靶点sgRNA包含gRNA1和gRNA2，其序列依次如SEQ ID NO.16~17所示。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中CRISPR/Cas9植物表达载体的构建方法为：采用Overlapping PCR的方法，第一轮PCR分别以pYLsgRNA-U6a和pYLsgRNA-U6b为模板，将gRNA1引入OsU6a启动子下游和sgRNA序列的上游、gRNA2引入OsU6b启动子下游和sgRNA序列的上游；第二轮PCR分别以稀释10倍后的第一轮PCR产物为模板，将启动子、靶点和sgRNA骨架构建成完整的表达盒，接着再将gRNA1和gRNA2表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体上，获得重组植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中采用的引物为：U-F、gR-R、OsHPP04-gRT1、OsHPP04-OsU6aT1、OsHPP04-gRT2、OsHPP04-OsU6bT2、Pps-R、Pgs-2、Pps-2和Pgs-L，所述引物序列依次为SEQ ID NO.1~10所示。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S4中水稻愈伤组织转化的黑暗培养条件为25~35℃，2~25d。
9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S6中脱靶检测是采用高保真酶扩增各潜在脱靶位点区域片段，将纯化后的PCR产物进行测序分析脱靶情况。
10.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S7中根结线虫抗性测定方法是采用活体接种法。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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