CN104630162A - 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，所述蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明除草剂耐受性蛋白质特别适合在植物中表达，尤其定位于叶绿体中表达，可以增强对麦草畏除草剂的耐受性，且应用前景广。

Description

除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途

技术领域

本发明涉及一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种对除草剂麦草畏具有耐受性的蛋白质、其编码基因及用途。

背景技术

杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。尽管目前可以得到耐受除草剂草甘膦、草丁膦、2,4-D和其它除草剂处理的转基因植物，但是还存在空白区域，如所控制的杂草范围、开发额外的除草剂耐受性作物等。此外，耐受上述除草剂的杂草的出现(尽管通常是局部的和可变的)造成了对额外或备选的杂草控制措施的需要。

已经证明耐受除草剂性状在商业上是有价值的，因此需要增加耐受其它除草剂的植物和管理难以控制的杂草种类的选项，以避免过度依赖任何单一除草剂，尤其需要针对环境友好的并且在控制杂草方面高度有效的除草剂而开发除草剂耐受性。麦草畏是有效且环境友好的除草剂之一，其已经被农民使用40多年了，麦草畏可用于控制玉米、高粱、小米、牧草、干草、牧场、甘蔗、芦笋、草皮和草籽作物中一年生和多年生阔叶杂草和几种窄叶杂草；与此同时，麦草畏可以伤害许多商业作物和双子叶植物，如大豆、棉花、豌豆、马铃薯、向日葵和油菜，上述作物/植物对于低水平的麦草畏都是特别敏感的。尽管如此，麦草畏在控制杂草生长中仍然是有效的，并且是重要的。

已报道从嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)分离了编码麦草畏单加氧酶(DMO)的基因，其为铁氧还蛋白依赖型并赋予对麦草畏的耐受性。DMO参与将除草剂麦草畏(3,6-二氯-邻-茴香酸)转化为无毒的3,6-二氯水杨酸(DCSA)，表达DMO基因的植物具有对麦草畏的耐受性。

由于目前发现的麦草畏耐受型基因均及其相似，所以需要更多新型的麦草畏耐受型基因以避免过度依赖一种麦草畏耐受型基因，使麦草畏-麦草畏耐受型作物在商业上具有更广阔的应用空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，本发明旨在提供一种新的DMT50基因，所述DMT50蛋白在植物中对麦草畏除草剂具有较高的耐受性。

为实现上述目的，本发明提供了一种蛋白质，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

为实现上述目的，本发明提供了一种基因，包括：

(a)编码所述蛋白质的核苷酸序列；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

(c)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

(d)具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

为实现上述目的，本发明还提供了一种组合蛋白，包括至少由第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码，所述第一核苷酸序列编码所述蛋白质。

进一步地，所述第二核苷酸序列编码甲基四氢叶酸还原酶、甲酰四氢叶酸脱甲酰酶和/或次甲基环化酶。

更进一步地，所述甲基四氢叶酸还原酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述次甲基环化酶具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

优选地，所述第二核苷酸序列具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

具体地，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。

更具体地，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述基因或编码所述组合蛋白的核苷酸序列。

进一步地，所述调控序列为叶绿体转运肽，所述叶绿体转运肽与所述除草剂耐受性基因有效连接。

优选地，所述叶绿体转运肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种增加耐受除草剂范围的方法，包括：将所述蛋白质、所述组合蛋白或所述表达盒编码的蛋白质在植物中与至少一种不同于所述蛋白质、所述组合蛋白或所述表达盒编码的蛋白质的第二种蛋白质一起表达。

进一步地，所述第二种蛋白质为草甘膦耐受性蛋白质、草铵膦耐受性蛋白 质、α酮戊二酸双加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。

在本发明中，DMT50除草剂耐受性蛋白质在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个草甘膦耐受性蛋白质和/或草铵膦耐受性蛋白质的表达。这种超过一种的除草剂耐受性蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达DMT50除草剂耐受性蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达草甘膦耐受性蛋白质和/或草铵膦耐受性蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括：用所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂为麦草畏。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括：对种植植物的大田施用有效剂量的麦草畏除草剂，所述植物包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：将所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受麦草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，包括：将所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体导入植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦耐受性杂草的方法，包括：对种植草甘膦耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘膦耐受性植物包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列、所述表达盒或所述重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生麦草畏耐受性植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒，以产生麦草畏耐受性植物。

具体地，所述产生麦草畏耐受性植物的方法包括：通过将亲本植物自交或与第二种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植物包含所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传了来自所述亲本植物和/或第二种植物的所述基因、编码所述组合蛋 白的核苷酸序列或所述表达盒。

为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的方法，包括：

种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒；

使所述植物种子长成植株；

用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。

在上述技术方案的基础上，优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。

为实现上述目的，本发明还提供了一种好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶耐受麦草畏除草剂的用途。

将所述的基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

本发明可以增加植物对于氧化应激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麦草畏或麦草畏单加氧酶所介导代谢的产物或其类似物，以改善植物的除草剂耐受性，例如，通过将麦草畏代谢为DCSA。

本发明“麦草畏”(Dicamba)是指3,6-二氯-邻-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸及其酸和盐。其盐包括异丙胺盐、二甘醇铵盐、二甲胺盐、钾盐和钠盐。麦草畏的商业制剂包括但不限于，(作为DMA盐)、(BASF，作为DGA盐)、VEL-58-CS-11^TM和(BASF，作为DGA盐)。

目前已经报道的含甲氧基芳烃化合物脱甲基酶有4种，分别是(1)RHOs(Rieske非血红素型氧化酶)，降解麦草畏的DMO(GenBank:AY786443.1)属于三组份RHO类型的氧化酶；(2)细胞色素P450，是一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，很多含甲氧基芳烃化合物脱甲基酶就是这一类型；(3)厌氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶，发现于厌氧细菌如热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)中，参与木质素降解中间产物如丁香酸和香草酸的厌氧降解，也有研究发现厌氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶也可以厌氧降解麦草畏；(4)好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶(Sphingomonas paucimobilis SYK-6)，参与木质素降解中间产物如丁香酸和香草酸的厌氧降解，但目前还没有这类好氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶能降解麦草畏的报道。

本发明所述基因用于植物表达后具有允许在植物中使用麦草畏除草剂的特性，所述植物中固有耐性不存在或不足以允许使用麦草畏除草剂。此外，本发 明所述DMT50基因可以在天然耐性不足以允许选择性时在植物中提供对麦草畏除草剂的防护。向田地使用的施用量是大约0.0025磅/英亩(lb/a)到大约20lb/a麦草畏，更通常从0.25lb/a至12lb/a。在同一大田里(连续或罐混组合地)组合不同化学类别和具有不同作用模式和范围的除草剂可以提供对大多数需要除草剂控制的潜在杂草的控制。

草甘膦被广泛地使用，因为它控制非常广谱的阔叶和禾本科杂草物种。然而，在草甘膦耐性作物和非作物应用中重复使用草甘膦已经(而且仍将继续)选择使杂草演替为天然更具有耐性的物种或草甘膦耐受性生物型。多数除草剂耐受性管理策略建议使用有效用量的罐混除草剂伴侣作为延缓出现耐受性杂草的方法，所述除草剂伴侣提供对同一物种的控制，但具有不同的作用模式。将DMT50基因与草甘膦耐性性状(和/或其他除草剂耐受性性状)叠加可通过允许对同一作物选择性使用草甘膦和麦草畏而实现对草甘膦耐受性作物中草甘膦耐受性杂草物种(被麦草畏控制的阔叶杂草物种)的控制。这些除草剂的应用可以是在含有不同作用模式的两种或更多除草剂的罐混合物中同时使用、在连续使用(如种植前、出苗前或出苗后)中单个除草剂组合物的单独使用(使用的间隔时间范围从2小时到3个月)，或者备选地，可以在任何时间(从种植作物7个月内到收获作物时(或对于单个除草剂为收获前间隔，取最短者))使用代表可应用每种化合类别的任意数目除草剂的组合。

在控制阔叶杂草中具有灵活性是很重要的，即使用时间、单个除草剂用量和控制顽固或耐受性杂草的能力。作物中与草甘膦耐受性基因/DMT50基因叠加的草甘膦应用范围可以从250至2500g ae/ha；麦草畏可按照从0.25lb/a至12lb/a。这些应用的时间的最佳组合取决于具体的条件、物种和环境。

除草剂制剂(如酯、酸或盐配方或可溶浓缩剂、乳化浓缩剂或可溶液体)和罐混添加剂(如佐剂或相容剂)可显著影响给定的除草剂或一种或多种除草剂的组合的杂草控制。任意前述除草剂的任意化学组合均在本发明的范围内。

本领域技术人员所熟知的，两种或更多作用模式的组合在提高受控杂草谱和/或天然更具耐受性物种或耐受性杂草物种上的益处还可扩展到通过人工(转基因或非转基因)在作物中产生除草甘膦耐性作物外的除草剂耐性的化学品。事实上，可以单独或以多重组合叠加编码以下耐受性的性状以提供有效控制或防止杂草演替对任意前述类别的除草剂的耐受性的能力：草甘膦耐受性(如耐受性植物或细菌EPSPS、GOX、GAT)、草铵膦耐受性(如PAT、Bar)、苯氧基生长素耐受性(如2,4-D、二甲四氯耐受性基因如AAD-1、AAD-12等)乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂耐受性(如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其它化学品耐受性基因如AHAS、Csrl、SurA等)、溴草腈耐受性(如Bxn)、对HPPD(4-羟苯基丙酮酸双加氧酶)酶抑制剂的耐受性、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的耐受性、对光系统Ⅱ抑制性除草 剂的耐受性(如psbA)、对光系统Ⅰ抑制性除草剂的耐受性、对原卟啉原氧化酶Ⅸ(PPO)抑制性除草剂耐受性(如PPO-1)、对苯脲除草剂的耐受性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。

关于其他除草剂，一些其它优选的ALS抑制剂包括三唑嘧啶磺苯胺(氯酯磺草胺、双氯磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和嘧啶并三唑类磺胺)、嘧啶硫代苯甲酸和氟唑磺隆。一些优选的HPPD抑制剂包括甲基磺草酮、异恶唑草酮和磺草酮。一些优选的PPO抑制剂包括丙炔氟草胺、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵和乙氧氟草醚)。

此外，可以将DMT50基因单独或与其它除草剂耐受作物特征叠加后再与一种或多种其它输入(如昆虫耐受性、真菌耐受性或胁迫耐性等)或输出(如提高的产量、改进的油量、提高的纤维品质等)性状叠加。因此，本发明可用于提供以灵活且经济地控制任何数目的农学害虫的能力和提高作物品质的完整农学解决方案。

本发明DMT50基因能降解麦草畏除草剂，是重要的除草剂耐受作物和选择标记物特征可能性的基础。

本发明可进行转基因表达，可以控制几乎所有阔叶杂草的除草剂组合。DMT50基因可作为优秀的除草剂耐受作物性状与例如其它除草剂耐受作物性状(如草甘膦耐受性、草铵膦耐受性、苯氧基生长素耐受性、ALS抑制剂(如咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类)耐受性、溴草腈耐受性、HPPD抑制剂耐受性、PPO抑制剂耐受性等)和昆虫耐受性性状(Cry1Ab、Cry1F、Vip3、其它苏云金芽孢杆菌蛋白质或非芽孢杆菌属来源的昆虫耐受性蛋白等)叠加。此外，DMT50基因可作为选择标记物辅助选择用另一个基因或基因群遗传改造的植物的原代转化体。

本发明的除草剂耐性作物性状可用在与其它除草剂耐性作物性状(包括但不限于草甘膦耐性)的新组合中。由于对除草剂(如草甘膦)的新获得的耐受性或固有的耐性，这些性状组合产生控制杂草物种的新方法。因此，除了除草剂耐性作物性状，本发明的范围包括使用除草剂控制杂草的新方法，其中通过转基因作物中的所述酶产生对所述除草剂的耐性。

本发明可应用于多种植物中，如拟南芥、烟草、大豆、棉花、稻、玉米和芸薹。本发明还可用于多种其它单子叶(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和双子叶作物(如苜蓿、三叶草、乔木物种等)。类似的，麦草畏(或其它DMT50底物)可更积极地用于耐性适中的禾本科作物中，由此性状得到的提高的耐性将为种植者提供能以更有效的用量和更广的施用时间来使用这些除草剂而无作物损伤风险的可能性。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述“耐受性”是可遗传的，并允许植物在除草剂对给定植物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域技术人员所认可的，即使植物受到除草剂处理的一定损伤程度明显，植物仍可被认为“耐受性”。本发明中术语“耐性”比术语“耐受性”更广泛，并包括“耐受性”，以及特定植物具有的抵抗除草剂诱导的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的除草剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物损伤。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本发明中所述“组合蛋白”是指用基因重组技术将不同的核苷酸序列重组后表达产生的蛋白，所述组合蛋白可以为一个或多个蛋白。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述DMT50基因的调节序列。

所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。

所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，包括但不限于拟南芥叶绿体转运肽AtCTP2，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列。

所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病 毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。

对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。

所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素耐受性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

本发明可赋予植物新除草剂耐受性性状，并且未观察到对表型包括产量的不良影响。本发明中植物能耐受住如至少一种受试除草剂1倍的应用水平。这些耐性水平的提高在本发明的范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的优化和进一步发展，以增加给定基因的表达。

本发明中，所述除草剂耐受性蛋白质为DMT50氨基酸序列，如序列表中 SEQ ID NO:2所示。所述除草剂耐受性基因为DMT50核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述除草剂耐受性基因为用于植物，除了包含由DMT50核苷酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予昆虫耐受性的蛋白质的编码区。

本发明中DMT50除草剂耐受性蛋白质对麦草畏除草剂具有耐性。本发明中的植物，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含DMT50核苷酸序列，通过表达有效量的该蛋白而保护其免受除草剂的威胁。有效量是指未损伤的或轻微损伤的剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。

植物材料中除草剂耐受性蛋白质的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码除草剂耐受性蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的除草剂耐受性蛋白质的量。

本发明提供了一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，具有以下优点：

1、本发明首次分离到具有除草剂耐受性的菌株，所述菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2014550。

2、对除草剂耐受性强。本发明DMT50基因可以降解麦草畏除草剂，优化DMT50基因采用玉米和大豆的偏好密码子，使其特别适合在植物中表达；优化DMT50基因可以赋予转基因植物麦草畏除草剂耐受性，且相比于在胞质中表达，所述优化DMT50基因定位于叶绿体中表达可以增强转基因植物对麦草畏除草剂的耐受性。

3、应用前景广阔。本发明除草剂耐受性蛋白质DMT50为好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶，其不同于已知的麦草畏耐受型基因，因此可以扩大麦草畏耐受型在植物上应用范围。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的菌株Ndbn-20在固体培养基上的菌落图和电镜图；

图2为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的菌株Ndbn-20降解麦草畏的高效液相色谱图和质谱检测图；

图3为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的脱甲基酶系基因簇示意图；

图4为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的DMT50基因在表达宿主菌BL21(DE3)中表达的蛋白SDS-PAGE电泳图；

图5为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的MTHFR50基因 在表达宿主菌BL21(DE3)中表达的蛋白SDS-PAGE电泳图；

图6为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的诱导表达的蛋白1小时内降解麦草畏的高效液相色谱图；

图7为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化DMT50核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图8为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100985构建流程图；

图9为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100986结构示意图；

图10为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有天然DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100986N结构示意图；

图11为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的转基因拟南芥T₁植株除草剂耐受性效果图；

图12为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN-HT120050构建流程图；

图13为本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的含有天然DMT50核苷酸序列重组表达载体DBN-HT120050N结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途的技术方案。

第一实施例、菌株的分离和鉴定

1、菌株的分离 

麦草畏降解菌株的富集基质取自麦草畏生产厂周围的生化污泥、堆肥、海洋滩涂、新疆盐土、森林土壤、农田土壤等，用含有一定浓度麦草畏的培养基进行分离。取土样在500mg/L麦草畏的低氯基础盐培养基(磷酸氢二钾1.3g/L、磷酸二氢钾0.87g/L、硫酸铵0.66g/L、硫酸镁0.097g/L、一水合硫酸锰0.025g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L和硫酸钙1.26mg/L，pH 7.0；固体培养基加15g/L琼脂)上培养5天(温度30℃，转速180r/min)，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次。

通过紫外扫描仪检测第4代富集液是否有降解效果，对有降解效果的富集液进行梯度稀释，取10^-4―10^-7稀释浓度的富集液各0.1mL涂布于加有浓度为2.25mM麦草畏的固体培养基平板上，温度30℃培养5天后，挑取长出的单菌落，使用划线法，进一步纯化，挑取纯化后的单菌落接种于含浓度为2.25mM麦草畏的低氯基础盐培养基中，在温度30℃、转速180r/min摇床培养3天，通过紫外扫描仪验证其降解效果。

从富集液中，分离到一株麦草畏降解菌，命名为Ndbn-20。菌株Ndbn-20在固体培养基上生长3天后，菌落表面光滑，边缘整齐，隆起，呈淡黄色，经过负染，在透射电子显微镜下该菌呈杆状，无鞭毛，无荚膜，不形成芽孢(如图1所示)，革兰氏阴性细菌(G－)，菌体为短杆状，大小为0.4-0.66×0.9-1.5μm，好氧生长。

以菌株Ndbn-20的基因组DNA为模板，用细菌16s rDNA基因序列的通用引物，通过PCR扩增获得长度约为1359bp的16S rRNA基因序列(Genbank：KP064570)。通过序列比对并结合菌株形态和生理生化特征，鉴定所述菌株Ndbn-20为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编430072)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014550，保藏日期为2014年11月5日。

2、菌株Ndbn-20降解麦草畏的效果评估和代谢产物分析

降解效果的验证方法：将菌株Ndbn-20接种至LB液体培养基上，温度30℃培养至对数期，低速离心收集菌体，菌体用新鲜、无菌低氯基础盐培养液冲洗2遍，重悬于低氯基础盐培养液中，细胞浓度约为1.0×108cfu/mL，按1％(v/v)接种量，接种到50mL含2.25mM麦草畏的低氯基础盐培养基上培养64小时(温度30℃)。

取1mL培养液冷冻干燥，干燥物加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤，采用高效液相色谱进行检测。液相色谱条件为：流动相为乙腈:甲醇:水:乙酸(31.7:7.5:58.4:2.4，V/V)，Zorbax C218ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长为319nm，进样量为20μL，流速为0.8mL/min。外标法按峰面积定量。代谢产物的鉴定通过HPLC-MS(高效液相色谱和质谱联用)，条件为：流动相为乙腈:甲醇:水:乙酸(31.7:7.5:58.4:2.4，V/V)，Zorbax XDB-C18，5cm×0.46cm 1.8mm反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，流速为0.25mL/min。MS分析使用ESI模式，检测器为Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer。

结果表明所述菌株Ndbn-20能够降解麦草畏，培养64小时后，所述菌株Ndbn-20对浓度为2.25mM的麦草畏降解率可以达到90％左右。HPLC-MS/MS(二级质谱)检测结果表明麦草畏降解的第一步是脱甲基生成中间产物3,6-二氯水杨酸(DCSA)，如图2所示。

第二实施例、DMT50基因的分离和测序

1、菌株Ndbn-20基因组总DNA的制备

将所述菌株Ndbn-20大量培养后，采用高盐结合CTAB法提取高纯度、大片段的所述菌株Ndbn-20的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于温度-20℃保藏，具体方法参考《精编分子生物学实验指南》(F·奥斯伯等编)。

2、基因组测序及结果分析

(1)DNA样品寄送与检测

细菌基因组测序要求DNA样品的OD值在1.8-2.0之间，浓度不低于30ng/μL，精细图至少需要样品量30ug。将符合要求的足量DNA样品在干冰保温下寄送至上海美吉生物医药科技有限公司(北京分公司)。

样品检测采用：A、浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；B、OD260/280和OD260/230检测方法：NanoDrop。

(2)菌株Ndbn-20基因组草图测序及结果分析

DNA样品检测合格后建库、测序，并运用相关软件对数据进行基本分析和生物信息分析。

基因组测序结果表明，所述菌株Ndbn-20基因组草图大小为5,351,429bp，127个scaffold，大于1000bp的scaffold有111个，通过de novo预测共4911个开放阅读框(ORF)。

采用OMIGA3.0将已报道的4种类型脱甲基酶与所述菌株Ndbn-20中111个scaffold一一比较，结果发现，在所述菌株Ndbn-20基因组中没有发现与已报道的RHOs(Rieske非血红素型氧化酶)、细胞色素P450和厌氧型四氢叶酸依赖型脱甲基酶基因有同源性的基因和氨基酸序列。用好氧型四氢叶酸依赖型的丁香酸脱甲基酶DesA序列和所述菌株Ndbn-20基因组序列进行比对，发现在scaffold50这个片段上有与DesA的同源序列。对包含这段同源序列的的片段(如SEQ ID NO:1所示)进行了ORF分析，结果表明这段序列上包含了一个脱甲基酶系基因簇(如图3所示)，其主要的有效片段如SEQ ID NO:26所示，包含一个脱甲基酶(Vanillate/3-O-methygallate O-demethylase)、一个甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)、一个甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(formyltetrahydrofolate deformylase)和一个次甲基环化酶(methylenetetrahydrofolate cyclohydrolase)。其中脱甲基酶DMT50的氨基酸序列(475个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示，编码相应于所述脱甲基酶DMT50的氨基酸序列的DMT50核苷酸序列(1428个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:3所示；甲基四氢叶酸还原酶MTHFR50位于DMT50下游1111bp处，其氨基酸序列(289个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:4所示，编码相应于所述甲基四氢叶酸还原酶MTHFR50的氨基酸序列的MTHFR50核苷酸序列(870个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:5所示；甲酰四氢叶酸脱甲酰酶DHC50位于DMT50下游167bp处，其氨基酸序列(287个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:6所示，编码相应于所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶DHC50的氨基酸序列的DHC50核苷酸序列(864个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:7所示；次甲基环化酶MTHC50位于DMT50下游4892bp处，其氨基酸序列(298个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:8所示，编码相应于所述次甲基环化酶MTHC50的氨基酸序列的MTHC50核苷酸序列(897个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:9所 示。

第三实施例、脱甲基酶DMT50的体外高效表达及功能鉴定

1、细菌表达载体的构建和重组微生物获得

(1)DMT50基因的PCR扩增

设计一对引物：

引物1：5-CGGGGTACCATGAGGGAGGCTGAAGTGAAGTCC-3(下划线为KpnI酶切位点)，如序列表中SEQ ID NO:10所示；

引物2：5-CCCAAGCTTCTACGCCCGCGCTGCCACGC-3(下划线为HindⅢ酶切位点)，如序列表中SEQ ID NO:11所示；

用下述PCR扩增体系从所述菌株Ndbn-20基因组DNA中扩增DMT50基因：

PCR反应条件为：98℃变性1min；然后进入下列循环：98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共29个循环；最后72℃延伸10min，冷却至室温。

(2)细菌表达载体的构建和重组微生物获得

用限制性内切酶KpnI和HindⅢ分别酶切上述PCR扩增产物和细菌表达载体pET-29a(+)，将切下的DMT50核苷酸序列片段与酶切后的细菌表达载体pET-29a(+)进行酶连，将酶连产物转化到表达宿主菌BL21(DE3)，获得重组微生物BL21(DMT50)。

2、DMT50蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

所述重组微生物BL21(DMT50)在100mL的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中培养至浓度为OD600nm＝0.6-0.8，加入浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度16℃下诱导20小时。离心，收集菌体，用20ml Tris-HCl buffer(100mM，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎(X0-900D ultrasonic processor ultrasonic processor,30％intensity)10min，然后离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱对DMT50蛋白进行纯化，用SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化结果，条带大小和理论预测的条带大小(52.36KDa)一致(如图4所示)。

3、测定DMT50蛋白的酶活力 

酶活反应体系(300μL)：含有0.45mM底物、0.2mg DMT50、1mM四氢叶酸(THF)，缓冲体系为浓度100mM的Tris-HCl(pH 8.0)，温度30℃下 在水浴锅中反应1小时，然后在沸水中放置1min，终止反应。反应液冷冻干燥后加入300μL甲醇溶解冻干物，高效液相色谱(HPLC)检测代谢产物3,6-二氯水杨酸(DCSA)的生成量。一个酶活力单位定义为：在pH 8.0、温度30℃条件下1min内降解麦草畏生成1nmol产物DCSA所需要酶的量，以U表示。

上述实验结果表明：纯化后的DMT50蛋白能在1小时内产生0.18mM的DCSA，DMT50蛋白的比酶活为4.5U/mg。

第四实施例、甲基四氢叶酸还原酶MTHFR50能够提高脱甲基酶DMT50的功能

1、细菌表达载体的构建和重组微生物获得

(1)MTHFR50基因的PCR扩增

引物3：5-CCGGAATTCATGTTGGACGAGAAGAGTTCAGACG-3(下划线为EcoRI酶切位点)，如序列表中SEQ ID NO:12所示；

引物4：5-CCCAAGCTTGCCGTAGGCTGCCCGCGCGC-3(下划线为HindIII酶切位点，如序列表中SEQ ID NO:13所示；

用本发明第三实施例中1(1)所述PCR扩增体系从所述菌株Ndbn-20基因组DNA中扩增MTHFR50基因。

(2)细菌表达载体的构建和重组微生物获得

用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别酶切上述PCR扩增产物和细菌表达载体pET-29a(+)，将切下的MTHFR50核苷酸序列片段与酶切后的细菌表达载体pET-29a(+)进行酶连，将酶连产物转化到表达宿主菌BL21(DE3)，获得重组微生物BL21(MTHFR50)。

2、MTHFR50蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

具体方法参考本发明第三实施例中2所述DMT50蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化的方法。用镍离子亲和层析柱对MTHFR50蛋白进行纯化，用SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化结果，条带大小和理论预测的条带大小(31.79kDa)一致(如图5所示)。

3、鉴定MTHFR50+DMT50和DMT50的酶活力

MTHFR50+DMT50酶活反应体系(300μL)：含有0.45mM底物、0.2mg DMT50(本发明第三实施例中2纯化所得)、0.25mg MTHFR50、1mM四氢叶酸(THF)，缓冲体系为浓度100mM的Tris-HCl(pH 8.0)；DMT50酶活反应体系同本发明第三实施例中3所述体系。同时放入温度30℃下在水浴锅中反应1小时，然后在沸水中放置1min，终止反应。反应液冷冻干燥后加入300μL甲醇溶解冻干物，HPLC检测代谢产物DCSA的生成量。一个酶活力单位定义为：在pH 8.0，温度30℃条件下1min内降解麦草畏生成1nmol产物DCSA所需要酶的量，以U表示。

上述实验结果表明：纯化后只含有DMT50的酶活反应体系在1小时内产 生0.18mM的DCSA，而MTHFR50+DMT50的酶活反应体系在1小时内产生0.72mM的DCSA(如图6所示)；相比于只含有DMT50蛋白的比酶活为4.5U/mg，在甲基四氢叶酸还原酶MTHFR50的存在下，DMT50蛋白的比酶活为18U/mg，充分说明甲基四氢叶酸还原酶MTHFR50能够显著提高脱甲基酶DMT50的功能。

第五实施例、基因序列的优化和合成

1、植物优化序列的获得

保持所述脱甲基酶DMT50的氨基酸序列(475个氨基酸)不改变，对编码相应于所述脱甲基酶DMT50的氨基酸序列的DMT50核苷酸序列(1428个核苷酸)进行密码子优化改造。

密码子优化改造的策略主要包括：依据玉米和大豆的偏好密码子、不稳定序列的改造、G+C含量的提高等。天然基因的G+C含量较低，A+T含量很高，一方面，如果直接将天然基因序列导入植物基因组中可能会被误认为是植物基因调控序列，同时在这些天然基因中会出现A+T富含区域，类似于基因启动子中的TATA盒，这些区域则会导致基因的异常转录；另一方面，在转录的mRNA中聚腺苷酸化信号序列(AAUAAA)、与mRNA剪接相关的小RNA互补序列会导致RNA不稳定。因此，改造后的基因序列除了有较高的G+C含量外，还改变DNA和转录成mRNA中出现的不稳定结构，从而保证蛋白的正常翻译；再一方面，应用玉米和大豆的偏好密码子改造天然基因序列，排除酶切位点和一些序列的修饰。

基于以上优化策略，得到优化DMT50核苷酸序列，优化DMT50核苷酸序列共含有1428个核苷酸，编码475个氨基酸，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。

2、合成优化DMT50核苷酸序列 

优化DMT50核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)的5’端还连接有SpeI酶切位点，所述优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)的3’端还连接有KasI酶切位点。

第六实施例、拟南芥重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有优化DMT50核苷酸序列的拟南芥重组克隆载体

将合成的优化DMT50核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图7所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；mDMT50为优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)；MCS为多克隆位点)。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入200μL新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μL冰冷的溶液III(3M醋酸钾，5M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经SpeI和KasI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述优化DMT50核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，即优化DMT50核苷酸序列正确插入。

2、构建含有优化DMT50核苷酸序列的拟南芥重组表达载体DBN100985

用限制性内切酶SpeI和KasI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的优化DMT50核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的SpeI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100985(定位于叶绿体)，其构建流程如图8所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；AtUbi10：拟南芥Ubiquitin(泛素)10基因启动子(SEQ ID NO:15)；AtCTP2：拟南芥叶绿体转运肽(SEQ ID NO:16)；mDMT50：优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:17)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:18)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:19)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:20)；LB：左边界)。

将重组表达载体DBN100985用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组表达载体 DBN100985)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SpeI和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100985在SpeI和KasI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列，即优化DMT50核苷酸序列。

按照本实施例中2所述的构建含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100985的方法，构建含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100986(定位于胞质)，其载体结构如图9所示(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供)；Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；AtUbi10：拟南芥Ubiquitin(泛素)10基因启动子(SEQ ID NO:15)；mDMT50：优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:17)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:18)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:19)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:20)；LB：左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100986中插入的优化DMT50核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，即优化DMT50核苷酸序列正确插入。

3、构建含有天然DMT50核苷酸序列的拟南芥重组表达载体DBN100986N

按照本实施例中1所述的构建含有优化DMT50核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T的方法，利用天然DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:3)构建含有天然DMT50核苷酸序列的重组克隆载体DBN01R-T。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01R-T中插入的天然DMT50核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即天然DMT50核苷酸序列正确插入。

按照本实施例中2所述的构建含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100985的方法，利用天然DMT50核苷酸序列构建含有天然DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN100986N，其载体结构如图10所示(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供)；Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；AtUbi10：拟南芥Ubiquitin(泛素)10基因启动子(SEQ ID NO:15)；DMT50：天然DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:3)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:17)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:18)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:19)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:20)；LB：左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100986N中插入的天然DMT50核苷酸序列为序列表 中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即天然DMT50核苷酸序列正确插入。

4、拟南芥重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100985、DBN100986和DBN100986N用液氮法转化到农杆菌GV3101中，其转化条件为：100μL农杆菌GV3101、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌GV3101接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切DBN100985、DBN100986和DBN100986N后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100985、DBN100986和DBN100986N结构完全正确。

第七实施例、转基因拟南芥植株的获得

将野生型拟南芥种子悬浮于0.1％琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4℃下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，使土壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖7天。使种子萌发并在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m²秒的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下在温室中培养植物。开始用霍格兰营养液灌溉植物，接着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。

使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的农杆菌菌落接种一份或多份15-30mL含壮观霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培养液的预培养物。以220rpm将培养物在28℃恒速摇动孵育过夜。每个预培养物用于接种两份500ml含卡那霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培养液的培养物并将培养物在28℃持续摇动孵育过夜。室温以约8700×g离心10分钟沉淀细胞，弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于500mL渗透培养基中，所述渗透培养基含有1/2×MS盐/B5维生素、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/L(1mg/mL DMSO中的原液))和300μL/L Silvet L-77。将约1月龄的植物在培养基中浸泡15秒，确保浸没最新的花序。接着将植物侧面放倒并覆盖(透明或不透明)24小时，接着用水洗涤并竖直放置。在22℃以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养植物。浸泡约4周后收获种子。

将新收获的(优化DMT50核苷酸序列和天然DMT50核苷酸序列)T₁种子在室温干燥7天。将种子种在26.5×51cm萌发盘中，每盘接受200mg T₁种子(约10000个种子)，所述种子事先已悬浮于40mL 0.1％琼脂糖溶液并在4℃下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。

用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，利用重力排水。用移液管将预处理后的种子(每个40mL)均匀地种在土壤混合物上，并用保湿罩覆盖4-5天。 在使用出苗后喷洒草铵膦(选择共转化的PAT基因)进行最初转化体选择前1天移去罩。

在7个种植天数后(DAP)并于11DAP再次使用DeVilbiss压缩空气喷嘴以10mL/盘(703L/ha)的喷洒体积用Liberty除草剂(200g ai/L的草铵膦)的0.2％溶液喷洒T₁植物(分别为子叶期和2-4叶期)，以提供每次应用280g ai/ha有效量的草铵膦。在最后喷洒后4-7天鉴定存活株(生长活跃的植物)，并分别移植到用马粪土和蛭石制备的7cm x 7cm的方盆中(每盘3-5棵)。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于22℃培养室中或直接移入温室。接着移去罩并在测试DMT50基因提供麦草畏除草剂耐受性的能力之前至少1天将植物栽种到温室(22±5℃，50±30％RH，14小时光照：10小时黑暗，最小500μE/m²s¹天然+补充光)。

第八实施例、转基因拟南芥植株的除草剂耐受性效果检测

用DMT50基因进行首次拟南芥转化。首先使用草铵膦选择方案从未转化种子背景中选择T₁转化体。转化重组表达载体DBN100985的为定位于叶绿体的转入优化DMT50核苷酸序列的拟南芥植株(At叶绿体mDMT50)，转化重组表达载体DBN100986的为定位于胞质的转入优化DMT50核苷酸序列的拟南芥植株(At胞质mDMT50)，转化重组表达载体DBN100986N的为定位于胞质的转入天然DMT50核苷酸序列的拟南芥植株(At胞质DMT50)。筛选了约20000个At叶绿体mDMT50的T₁种子，并鉴定了156株T₁代阳性转化子(PAT基因)，约0.75％的转化效率；筛选了约20000个At胞质mDMT50的T₁种子，并鉴定了205株T₁代阳性转化子(PAT基因)，约1.0％的转化效率；筛选了约20000个At胞质DMT50的T₁种子，并鉴定了194株T₁代阳性转化子(PAT基因)，约1.0％的转化效率。将At叶绿体mDMT50的T₁植株、At胞质mDMT50的T₁植株、At胞质DMT50的T₁植株和野生型拟南芥植株(播种后18天)对麦草畏进行除草剂耐受性效果检测。

分别将At叶绿体mDMT50的T₁植株、At胞质mDMT50的T₁植株、At胞质DMT50的T₁植株和野生型拟南芥植株用麦草畏(560g ae/ha，1倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷洒。喷施7天和14天后统计植株耐受性情况：7天后生长状况和空白溶剂(水)一致的划为高抗植株，7天后有莲座叶卷曲的划为中抗植株，14天后仍不能抽苔的划为低抗植株，14天后死亡的划为不抗植株。由于每株拟南芥T₁植株是独立的转化事件，可以预计在给定剂量内个体T₁应答的显著差异。结果如表1和图11所示。

对于拟南芥，560g ae/ha麦草畏是将敏感植物与具有平均耐受性水平的植物区分开来的有效剂量。表1和图11的结果表明：优化DMT50基因赋予个体拟南芥植物麦草畏除草剂耐受性(只有部分植株具有耐受性的原因是由于T₁代植物插入位点是随机的，因而耐受性基因的表达水平有差异，表现出耐受性水平 的差异)；相比于At胞质DMT50的T₁植株，At胞质mDMT50的T₁代拟南芥后代部分能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述DMT50基因经植物密码子优化可以增强拟南芥植物对麦草畏除草剂的耐受性；又相比于At胞质mDMT50的T₁植株，At叶绿体mDMT50的T₁代拟南芥后代部分能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述优化DMT50基因定位于叶绿体中表达可以增强拟南芥植物对麦草畏除草剂的耐受性；而野生型拟南芥则不具有麦草畏除草剂耐受性。

表1、转基因拟南芥T₁植株除草剂耐受性实验结果

第九实施例、玉米重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有优化DMT50核苷酸序列的玉米重组表达载体DBN-HT120050

用限制性内切酶SpeI和KasI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-02(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的优化DMT50核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-02的SpeI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN-HT120050(定位于叶绿体)，其构建流程如图12所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)1基因启动子(SEQ ID NO:21)；AtCTP2：拟南芥叶绿体转运肽(SEQ ID NO:16)；mDMT50：优化DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:14)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:17)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:22)；LB：左边界)。

将重组表达载体DBN-HT120050用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组表达载体DBN-HT120050)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提 取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SpeI和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN-HT120050在SpeI和KasI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示核苷酸序列，即优化DMT50核苷酸序列。

2、构建含有天然DMT50核苷酸序列的玉米重组表达载体DBN-HT120050N

按照本实施例中1所述的构建含有优化DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN-HT120050的方法，利用本发明第六实施例中3所述的含有天然DMT50核苷酸序列的重组克隆载体DBN01R-T，构建含有天然DMT50核苷酸序列的重组表达载体DBN-HT120050N，其载体结构如图13所示(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供)；Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)1基因启动子(SEQ ID NO:21)；AtCTP2：拟南芥叶绿体转运肽(SEQ ID NO:16)；DMT50：天然DMT50核苷酸序列(SEQ ID NO:3)；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:17)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:22)；LB：左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN-HT120050N中插入的天然DMT50核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即天然DMT50核苷酸序列正确插入。

3、玉米重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN-HT120050和DBN-HT120050N用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切DBN-HT120050和DBN-HT120050N后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN-HT120050和DBN-HT120050N结构完全正确。

第十实施例、转基因玉米植株的获得及验证

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与本发明第九实施例中3所述的农杆菌共培养，以将本发明第九实施例中1和2构建的重组表达载体DBN-HT120050和DBN-HT120050N中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin1基因的启动子序列、优化DMT50核苷酸序列、天然DMT50核苷酸序列、AtCTP2叶绿体转运肽序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了定位于叶绿体的转入优化DMT50核苷酸序列的玉米植株(Zm叶绿体mDMT50)和定位于叶绿体的转入天然DMT50核苷酸序列的玉米植株(Zm叶绿体DMT50)；同时以野生型玉米植株作为对照。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将DMT50核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD₆₆₀＝0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。

2、用TaqMan验证转基因玉米植株

分别取Zm叶绿体mDMT50和Zm叶绿体DMT50的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PMI基因的拷贝数来确定转基因玉米植株的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测PMI基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取Zm叶绿体mDMT50、Zm叶绿体DMT50和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测PMI基因：

引物5：CCGGGTGAATCAGCGTTT如序列表中SEQ ID NO:23所示；

引物6：GCCGTGGCCTTTGACAGT如序列表中SEQ ID NO:24所示；

探针1：TGCCGCCAACGAATCACCGG如序列表中SEQ ID NO:24所示；

PCR反应体系为： 

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和860μL 1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为： 

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，优化DMT50核苷酸序列和天然DMT50核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且Zm叶绿体mDMT50和Zm叶绿体DMT50均获得了含有单拷贝DMT50基因的转基因玉米植株。

第十一实施例、转基因玉米植株的除草剂抗性效果检测

将Zm叶绿体mDMT50、Zm叶绿体DMT50和野生型玉米植株(V3-V4时期)分别对麦草畏进行除草剂抗性效果检测。

分别取Zm叶绿体mDMT50、Zm叶绿体DMT50和野生型玉米植株的T₁代杂合植株(v5-v6期)，并用麦草畏除草剂(4480g ae/ha，8倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷洒。喷施21天后统计支撑根发育情况。Zm叶绿体mDMT50 共3个株系(S1、S2和S3)，Zm叶绿体DMT50共2个株系(S4和S5)，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选10-15株进行测试。结果如表2所示。

表2、转基因玉米T₁植株除草剂抗性实验结果

表2的结果表明：优化DMT50基因赋予转基因玉米植物麦草畏除草剂的高水平耐受性(由于单子叶植物本身对麦草畏除草剂具有一定抗性，因而表现出高水平抗性)；相比于Zm叶绿体DMT50，Zm叶绿体mDMT50能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述DMT50基因经植物密码子优化可以增强玉米植物对麦草畏除草剂的耐受性；Zm叶绿体DMT50具有中等程度的麦草畏除草剂耐受性；而野生型玉米植株则不具有麦草畏除草剂耐受性。

综上所述，本发明DMT50基因可以降解麦草畏除草剂，优化DMT50基因采用玉米和大豆的偏好密码子，使其特别适合在植物中表达；优化DMT50基因可以赋予转基因植物更好的麦草畏除草剂耐受性，且相比于在胞质中表达，所述优化DMT50基因定位于叶绿体中表达可以增强转基因植物对麦草畏除草剂的耐受性；同时本发明除草剂耐受性蛋白质DMT50为好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶，其不同于已知的麦草畏耐受型基因，因此可以扩大麦草畏耐受型在植物上应用范围。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (24)

1.一种蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种基因，其特征在于，包括：

(a)编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

(c)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

(d)具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

3.一种组合蛋白，其特征在于，包括至少由第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码，所述第一核苷酸序列编码权利要求1所述蛋白质。

4.根据权利要求3所述组合蛋白，其特征在于，所述第二核苷酸序列编码甲基四氢叶酸还原酶、甲酰四氢叶酸脱甲酰酶和/或次甲基环化酶。

5.根据权利要求4所述组合蛋白，其特征在于，所述甲基四氢叶酸还原酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，所述次甲基环化酶具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述组合蛋白，其特征在于，所述第二核苷酸序列具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述组合蛋白，其特征在于，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述组合蛋白，其特征在于，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

9.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述基因或编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述表达盒，其特征在于，所述调控序列为叶绿体转运肽，所述叶绿体转运肽与权利要求2所述基因有效连接。

11.根据权利要求10所述表达盒，其特征在于，所述叶绿体转运肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

12.一种包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒的重组载体。

13.一种增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述蛋白质、权利要求3-8任一项所述组合蛋白或权利要求9-11任一项所述表达盒编码的蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1所述蛋白质、权利要求3-8任一项所述组合蛋白或权利要求9-11任一项编码的蛋白质的第二种蛋白质一起表达。

14.根据权利要求13所述增加除草剂耐受性的方法，其特征在于，所述第二种蛋白质为草甘膦耐受性蛋白质、草铵膦耐受性蛋白质、α酮戊二酸双加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。

15.一种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：用权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂为麦草畏。

16.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植植物的大田施用有效剂量的麦草畏除草剂，所述植物包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体。

17.一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受麦草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。

18.一种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体导入植物。

19.一种控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦耐受性杂草的方法，其特征在于，包括：对种植草甘膦耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘膦耐受性植物包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体。

20.一种产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引入权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒，以产生麦草畏耐受性植物。

21.根据权利要求20所述产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括：通过将亲本植物自交或与第二种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植物包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传了来自所述亲本植物和/或第二种植物的所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒。

22.一种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的方法，其特征在于，包括：

种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒；

使所述植物种子长成植株；

用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述除草剂耐受性基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。

23.根据权利要求13-22任一项所述方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。

24.一种好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶耐受麦草畏除草剂的用途。