CN105572233A - 植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，是取叶片，液氮研磨后用过量碱溶液进行超声提取，冰浴浸泡后离心、过滤，加入盐酸羟胺水溶液，水浴后离心、过滤；于滤液中加入浓盐酸，用色谱纯级乙酸乙酯萃取，得到的有机相旋转蒸发，入氮气吹干仪吹近干后加入硅烷化试剂，水浴后再次入氮气吹干仪吹干，加入色谱纯级乙酸乙酯溶解样品瓶中固体，进行GC-MS分析，并与该分析条件下琥珀酰丙酮标准品的出峰时间和特征峰进行比较。本检测方法杂质少、灵敏度高，步骤较少、方便快捷；有效地实现了对植物中琥珀酰丙酮的检测，填补了现有技术中尚没有可检测植物中琥珀酰丙酮的技术的空白，为研究植物乃至生物体内酪氨酸代谢紊乱提供了有力的工具。

Description

植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术，具体涉及一种检测植物叶片中是否有琥珀酰丙酮积累的方法。

背景技术

酪氨酸降解途径在动物中是必不可少的，在动物新陈代谢中占有十分重要的地位，若酪氨酸途径被中断或堵塞将会导致严重的代谢紊乱。Lindblad等人发现在遗传性酪氨酸血症患者体内红细胞内的胆色素原合酶的活性不到正常活性的5％，而胆色素原合酶在肝细胞内的活性只有正常活性的1％。酪氨酸代谢的紊乱导致中间代谢产物的累积，从而致使人体内的肝和肾受到严重损伤。Ruppert等人发现延胡索酰乙酰乙酸酶基因发生突变的纯合突变体小鼠在出生后不久便死亡，死亡的原因是不能激活肾和肝细胞内具有激素依赖性糖原异生所需要的相关的酶，同样，它的直接原因也是酪氨酸降解途径的紊乱。

人类中若酪氨酸降解途径中断会引发I型遗传性酪氨酸血症病(HereditaryTyrosinaemiatypeI，HT1)。HT1的病因是酪氨酸降解途径中的最后一个酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetatehydrolase，FAH)发生突变造成的，它是一种先天性遗传病，主要影响的器官是肝脏，影响的范围是从肝硬化到肝癌。除此之外，还造成肾小管损伤和急性神经系统损坏。对于这个病的诊断主要是依靠检测患者体内琥珀酰丙酮(succinylacetone，SA)的含量。

琥珀酰丙酮是生物体内二十种基本氨基酸之一的酪氨酸非正常代谢的产物。酪氨酸正常代谢生成二氧化碳和水，当代谢过程中一种重要的酶，延胡索酰乙酰乙酸酶缺乏时，酪氨酸代谢受阻，其中间产物马来酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸会在生物体内大量积累并转化成琥珀酰丙酮，最终产生毒害作用，因此，生物体内琥珀酰丙酮含量的检测是判断生物是否发生酪氨酸代谢紊乱的重要依据。

酪氨酸代谢紊乱多见于人和动物，并且已有了较为成熟的人和动物体液中琥珀酰丙酮的分析方法。植物体内发生酪氨酸代谢紊乱的现象虽也有报导，但由于缺乏植物中琥珀酰丙酮的分析技术，尚无法确认，相关研究也因此而滞后。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中尚没有关于检测植物体内是否含有琥珀酰丙酮的方法的不足，提供一种植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，以判断植物是否有琥珀酰丙酮的积累。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，该方法步骤如下：

a、浸取：取叶片，液氮研磨后置于过量的pH值为11-13、摩尔浓度为10mol/L的NaOH溶液或KOH溶液中，超声提取10-15min，超声频率为35-45MHZ，再于冰浴下浸泡1-2小时，浸泡液在5-7℃下离心，采用0.22μm滤膜过滤；其中，离心转速为9500-10500r/min，时间为18-22min。

b、异恶唑化：于上述滤液中，按每20ml滤液加2.8-3.2ml质量体积浓度为10g/L的盐酸羟胺水溶液的比例，加入盐酸羟胺水溶液，在55-65℃下水浴40-80min，常温下离心，采用0.22μm滤膜过滤；其中，离心转速为3500-4500r/min，时间为3-7min。

c、转移溶剂：按每20ml滤液加2.4ml摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸的比例，于b步骤所得滤液中加入浓盐酸(目的是让水相变为酸性，方便接下来将琥珀酰丙酮萃取到有机相中)，再按每20ml滤液加10mL、8mL、5mL色谱纯级的乙酸乙酯的比例，依次加入乙酸乙酯萃取，合并有机相；

d、硅烷化：将上述有机相旋转蒸发，蒸发后的溶液体积是每4g叶片原料得1-3ml，入氮气吹干仪吹近干，即保证不被完全吹干，接近干燥即可(使用氮气吹，一方面是降低液面溶剂蒸汽压，使溶剂加快蒸发；另一方面是氮气不活泼，隔绝氧气，能保护目标物)，按每4g叶片原料加175-225ul硅烷化试剂的比例加入硅烷化试剂(BSTFA:TMCS＝99:1)，于60-70℃下水浴85-95min，；再入氮气吹干仪吹干后，按每4g叶片原料加40-120ul色谱纯级乙酸乙酯的比例加入色谱纯级乙酸乙酯溶解样品瓶中固体，进行GC-MS分析，并与琥珀酰丙酮标准品配制成的溶液在该GC-MS分析条件下得到的琥珀酰丙酮标准品的出峰时间和特征峰进行比较。

上述GC-MS分析条件为：进样量2μL，不分流；进样口温度250℃；氦气总流速69.2mL/min；升温程序：70℃保持2min，以10℃/min升温至180℃，然后再以16℃/min升温至270℃，保持2min；辅助加热器温度280℃；离子化方式：EI；选择离子监测模式。

琥珀酰丙酮在生物体内含量极低，需要对样品进行富集再搭配高灵敏度的分析仪器才能检测到。因此，本方法首先采用液氮研磨再进行超声提取，将琥珀酰丙酮从植物叶片含有的大量有机酸、有机碱、脂类、盐类以及大分子的蛋白质、糖类等复杂的体系中提取出来，以保持其分子结构不被破坏，并尽量降低杂质的干扰。由于琥珀酰丙酮沸点较高，且热不稳定，而不能直接进行气相色谱-质谱分析，本方法在分析检测前利用盐酸羟胺将琥珀酰丙酮衍生化，防止琥珀酰丙酮被氧化，使其转化成低沸点并且稳定的化合物。

本检测方法杂质少、灵敏度高，步骤较少、方便快捷；属于植物中检测琥珀酰丙酮的首创技术。本发明有效地实现了对植物中琥珀酰丙酮的检测，填补了现有技术中尚没有可检测植物中琥珀酰丙酮的技术的空白，为研究植物乃至生物体内酪氨酸代谢紊乱提供了有力的工具。

附图说明

图1是琥珀酰丙酮标准品的色谱图；

图2是琥珀酰丙酮标准品的质谱图；

图3是4个样品的色谱图；

其中，A表示样品1，B表示样品2，C表示样品3，D表示样品4。

图4是3个样品在保留时间11.90min附近的质谱图。

其中，B表示样品2，C表示样品3，D表示样品4。

具体实施方式

本实施例中，采用4个样品，样品1和样品3是野生型拟南芥叶片，样品2和样品4是拟南芥突变体sscd1的叶片，分别按下列步骤依次进行操作分析。

1.浸取

取叶片4g，液氮研磨后置于17mL摩尔浓度为10mol/L的NaOH水溶液(pH值为12)中，超声(超声频率为40MHZ)提取12min，再于冰浴下浸泡1.5小时，浸泡液于6℃以10000r/min的转速离心20min，然后用0.22μm滤膜过滤。

2.异恶唑化

于上述滤液中加入3mL质量体积浓度为10g/L的盐酸羟胺水溶液，60℃下水浴1h，常温下以4000r/min的转速离心5min，再用0.22μm滤膜过滤。3.转移溶剂

在上述滤液中加入2.4mL摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸，依次用10mL、8mL、5mL色谱纯级乙酸乙酯萃取，合并三次的有机相，得到23mL有机相。

4.硅烷化

将得到的有机相旋转蒸发至2mL，转移到4mL样品瓶中氮气吹至近干。加入200μL硅烷化试剂(BSTFA:TMCS＝99:1)，65℃下水浴90min，氮气吹干仪吹干后加入100μL色谱纯级乙酸乙酯溶解样品瓶中固体，进行GC-MS分析。5.GC-MS条件设置

进样量2μL，不分流；进样口温度250℃；氦气总流速69.2mL/min；升温程序：70℃保持2min，以10℃/min升温至180℃，然后再以16℃/min升温至270℃，保持2min；辅助加热器温度280℃；离子化方式：EI；选择离子监测模式，目标离子质量数分别为212、138和227。

6.样品分析结果

依上述GC-MS分析条件分析琥珀酰丙酮标准品的色谱图和质谱图。由图1可知，琥珀酰丙酮标准品的出峰时间在11.90min左右。从图2可知，琥珀酰丙酮标准品的EI质谱图中特征峰包括109、138、182、212和227等。

如图3所示，样品2、样品3和样品4都在琥珀酰丙酮的保留时间11.90min附近有明确的色谱信号，其中样品2信号最高，样3信号最低，样品1中则无琥珀酰丙酮。

如图4所示，样品2和样品4的质谱图中包含琥珀酰丙酮的特征离子，109、138、182、212和227等，但样品3的质谱图中没有包含这些特征离子，由此可知样品2和样品4中含有琥珀酰丙酮，样品3中含有另一种保留时间也在11.90min附近的物质。

从上述分析结果可知，野生型拟南芥中不含有琥珀酰丙酮，而拟南芥突变体sscd1中含有琥珀酰丙酮。

Claims (5)

1.一种植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，该方法步骤如下：

a、浸取：取叶片，液氮研磨后置于过量的pH值为11-13、摩尔浓度为10mol/L的NaOH溶液或KOH溶液中，超声提取10-15min，超声频率为35-45MHZ，再于冰浴下浸泡1-2小时，浸泡液在5-7℃下离心，过滤；

b、异恶唑化：于上述滤液中，按每20ml滤液加2.8-3.2ml质量体积浓度为10g/L的盐酸羟胺水溶液的比例，加入盐酸羟胺水溶液，在55-65℃下水浴40-80min，常温下离心，过滤；

c、转移溶剂：按每20ml滤液加2.4ml摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸的比例，于b步骤所得滤液中加入浓盐酸，再按每20ml滤液加10mL、8mL、5mL色谱纯级的乙酸乙酯的比例，依次加入乙酸乙酯萃取，合并有机相；

d、硅烷化：将上述有机相旋转蒸发，蒸发后的溶液体积是每4g叶片原料得1-3ml，入氮气吹干仪吹近干即保证不被完全吹干，按每4g叶片原料加175-225ul硅烷化试剂的比例加入硅烷化试剂，于60-70℃下水浴85-95min，；再入氮气吹干仪吹干后，按每4g叶片原料加40-120ul色谱纯级乙酸乙酯的比例加入色谱纯级乙酸乙酯溶解样品瓶中固体，进行GC-MS分析，并与琥珀酰丙酮标准品配制成的溶液在该GC-MS分析条件下得到的琥珀酰丙酮标准品的出峰时间和特征峰进行比较。

2.如权利要求1所述的植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述步骤d中的GC-MS分析条件为：进样量2μL，不分流；进样口温度250℃；氦气总流速69.2mL/min；升温程序：70℃保持2min，以10℃/min升温至180℃，然后再以16℃/min升温至270℃，保持2min；辅助加热器温度280℃；离子化方式：EI；选择离子监测模式。

3.如权利要求1所述的植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述步骤a中的离心转速为9500-10500r/min，时间为18-22min。

4.如权利要求1所述的植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述步骤a和b中的过滤是采用0.22μm滤膜过滤。

5.如权利要求1所述的植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述步骤b中的离心转速为3500-4500r/min，时间为3-7min。