CN108467417A - 西青果提取物、西青果提取物单体化合物及其在抑制单胺氧化酶b活性中的应用 - Google Patents

西青果提取物、西青果提取物单体化合物及其在抑制单胺氧化酶b活性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了西青果提取物、西青果提取物单体化合物及其在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG‑EA‑7是西青果甲醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯部分再经正相柱二氯甲烷‑丙酮‑甲酸体系梯度洗脱分离，所得组分中抑制单胺氧化酶B活性最强的部分。西青果提取物的5种单体化合物是该西青果提取物经反相柱分离得到；分离体系是中压玻璃层析柱，以水‑甲醇体系，梯度洗脱得到。本发明提供上述西青果提取物、西青果提取物5种单体化合物在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。本发明还提供单体化合物XQG‑EA‑7‑6的HPLC鉴定方法。

Description

西青果提取物、西青果提取物单体化合物及其在抑制单胺氧 化酶B活性中的应用
技术领域
本发明涉及西青果提取物、西青果提取物单体化合物，以及两者在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。属于天然产物化学领域。
背景技术
单胺氧化酶(MAO)是位于神经元和非神经元细胞线粒体外膜的氧化还原酶，能催化内源性单胺神经递质与胺异生素的氧化脱氨。人体内含有两种单胺氧化酶，分别是单胺氧化酶A(MAO-A)、单胺氧化酶B(MAO-B)。MAO活性的变化与某些中枢神经系统疾病和外周神经系统疾病有关。异常MAO-A活动与抑郁、焦虑和精神紊乱有关，而患有阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病的病人脑内的MAO-B活性异常升高。
单胺氧化酶B存在于动物的多种组织中，如肝、肾、脑、甲状腺等。在脑5-羟色胺能神经元、组胺能神经元和神经胶质细胞中，能够催化多巴胺、血清素等单胺类神经递质氧化脱氨基生成相应的醛和过氧化氢；在肝脏中，主要催化苄胺、苯乙基胺、酪胺等外源胺生成二氧化碳及氨；它还可氧化环境毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)生成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，MPP+是一种能够抑制线粒体功能并导致多巴胺能神经元退化的神经毒素。MAO-B抑制剂通过抑制单胺氧化酶B的活性，减少多巴胺分解代谢，提高突触间隙多巴胺浓度，从而改善帕金森病的症状。临床上，MAO-B抑制剂如司来吉兰、雷沙吉兰已被用于治疗帕金森病。然而，司来吉兰有选择性差、不良反应大的缺点，能增加高血压和心脏病发生率，其在体内会代谢为安非他命类的衍生物，有中枢兴奋的毒副作用；雷沙吉兰对两种MAO选择性不够强，同时其对酶活性抑制的不可逆性仍然不是理想的药物。因此，从天然资源中寻找更好的MAO-B抑制剂对于药物发现具有重要意义。
西青果是我国传统药材，主要分布于巴基斯坦与印度，在我国主要分布于广东、云南等地区。传统医药对西青果药用功效的使用主要集中在清热生津、解毒涩肠，现代医药对西青果的化学成分及相应生物活性研究较少，对于西青果的生物活性潜质挖掘不足。尚无文献报道西青果对单胺氧化酶B的抑制活性。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供西青果提取物、西青果提取物5种单体化合物在抑制单胺氧化酶B活性中的应用，以及一种西青果提取物单体化合物。
为实现上述目的，本发明首先提供西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7，技术方案如下：
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7，其特征在于：是西青果甲醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯部分再经正相柱二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱分离，所得组分中抑制单胺氧化酶B活性最强的部分。
上述西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7具体制备方法是：
步骤S1、西青果原料粉碎，料液比1:5，80％甲醇回流提取，滤液减压浓缩至无甲醇味，得西青果甲醇提取物；
步骤S2、西青果甲醇提取物经石油醚萃取，分离，水相经乙酸乙酯萃取，分离，有机相浓缩得乙酸乙酯部分；
步骤S3、乙酸乙酯部分经甲醇溶解，HPLC正相柱二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱分离，分离所得组分中，抑制单胺氧化酶B活性最强的部分即为西青果提取物XQG-EA-7；所述二氯甲烷-丙酮-甲酸体系浓度为15:1:0.1～0:1:0.1。
上述西青果提取物XQG-EA-7，是西青果甲醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯部分再经HPLC二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱分离，所得分离组分中抑制单胺氧化酶B活性最强的部分。该西青果提取物XQG-EA-7经试验证明，能够抑制单胺氧化酶B活性。因而，本发明同时提供如下技术方案：
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。
本发明同时提供西青果提取物的5种单体化合物，其技术方案如下：
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7，其特征在于：是上述的西青果提取物XQG-EA-7经反相柱分离得到；所述分离体系是中压玻璃层析柱，以水-甲醇体系，水-甲醇＝3:1～0:1，梯度洗脱。
上述单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7的获得，是：首先，制备西青果提取物XQG-EA-7；其次，将西青果提取物XQG-EA-7用尽量少的25％甲醇溶解，湿法上样，中压玻璃层析柱，柱温：室温，流速：2ml/min，压力：1.5MPa，以水-甲醇体系梯度洗脱，具体洗脱条件：水-甲醇＝2:1、3.3h，水-甲醇＝3:2、3.3h，水-甲醇＝1:1、3.3h，水-甲醇＝2:3、3.3h，水-甲醇＝3:7、3.3h，水-甲醇＝1:4、3.3h，水-甲醇＝1:9、3.3h，水-甲醇＝0:1、3.3h。
上述5种西青果提取物的单体化合物经试验证明，能够抑制单胺氧化酶B活性。因而，本发明同时提供如下技术方案：
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物任一单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。
本发明同时提供西青果提取物的单体化合物XQG-EA-7-6，该单体化合物经试验证明，能够抑制单胺氧化酶B活性。其具体技术方案是：
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物单体化合物XQG-EA-7-6，其特征在于：是白色粉末，溶于甲醇，是权利要求1或2或3所述的西青果提取物XQG-EA-7经反相柱分离得到；所述分离体系是中压玻璃层析柱，以水-甲醇体系，水-甲醇＝3:1～0:1，梯度洗脱。
本发明同时提供西青果提取物单体化合物XQG-EA-7-6的HPLC鉴定方法，其技术方案如下：
西青果提取物单体化合物XQG-EA-7-6的HPLC鉴定方法，其特征在于：
样品处理：取西青果提取物XQG-EA-7-6溶解于50％甲醇中；
HPLC检测体系：C18柱、柱温35℃、流速0.8m L/min、表1所示洗脱条件：
表1HPLC洗脱条件
时间/min 流速/mL·min-1 流动相A：0.1％磷酸/％ 流动相B：甲醇/％
0.01 0.8 85 15
20 0.8 45 55
25 0.8 0 100
28 0.8 0 100
30 0.8 85 15
紫外检测波长254nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)提供了西青果提取物XQG-EA-7及其中的5种单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7。(2)提供了西青果提取物XQG-EA-7及其中的5种单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。(3)提供了一种单体化合物XQG-EA-7-6，该物质从西青果中提取分离得到，具有抑制单胺氧化酶B活性的功效。
附图说明
图1是西青果提取物XQG-EA-7硅胶薄层板点板分析结果图。
图2是西青果提取物XQG-EA-7、西青果提取物单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7的HPLC色谱图。
图3是XQG-EA-7-2的MS图谱。
图4是XQG-EA-7-3的MS图谱。
图5是XQG-EA-7-5的MS图谱。
图6是XQG-EA-7-6的MS图谱。
图7是XQG-EA-7-7的MS图谱。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
实施例一
西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7制备。
1、西青果甲醇提取
西青果原料250g，清洗、粉碎；80％甲醇提取，料液比(重量比)1:5，甲醇回流提取三次，其提取时间分别为2h、1.5h、1h，合并三次滤液，滤液减压浓缩至无甲醇味。取1ml浓缩液蒸干计算其质量，计算出总提取物的质量为97.9g，算出西青果的提取率为39.16％。
2、萃取
总提取物取1g留样，剩下96.9g依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分别浓缩各部分萃取溶液得到石油醚(PET)部分0.54g、乙酸乙酯(EA)部分42.18g、正丁醇(NBA)部分34.00g、水(H2O)部分19.38g。
3、乙酸乙酯部分的正相柱分离
西青果甲醇提取物经石油醚萃取，分离，水相经乙酸乙酯萃取，分离，有机相浓缩得乙酸乙酯部分；
取35g乙酸乙酯部分经甲醇溶解，与70g硅胶(300～400目)拌样，并置于通风橱中挥干。取1kg硅胶干法装柱，将填料敲紧填实，然后将上层已经挥干的硅胶缓慢倒入柱中。过柱分析条件为展开剂为二氯甲烷：丙酮：甲酸＝5:1:1。显色剂：典显。正相柱分离体系：常压玻璃层析柱：高75cm、内径8cm、外径8.7cm，柱温：室温，流速：15ml/min，压力：常压，二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱(15:1:0.1～0:1:0.1)，具体条件：二氯甲烷-丙酮-甲酸(15:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(12:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(10:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(8:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(6:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(4:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(2:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(1:1:0.1)6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸(0:1:0.1)6.6h。
洗脱得7个组分，分别命名为XQG-EA-1、XQG-EA-2、XQG-EA-3、XQG-EA-4、XQG-EA-5、XQG-EA-6、XQG-EA-7。
采用犬尿胺试验(试验操作同试验例一)分别检测7个组分抑制MAO-B活性的能力，结果显示XQG-EA-7抑制性最为强。
实施例二
单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7制备及鉴定。
1、XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7反相柱分离制备
取60g C18反相硅胶溶于甲醇，浸泡过夜后装柱。装完以后，用400mL甲醇冲洗色谱柱，然后用起始流动相(水：甲醇＝3:1)400mL平衡色谱柱。取实施例一所得西青果提取物XQG-EA-7 2g样品，用尽量少的25％甲醇溶解，湿法上样。中压玻璃层析柱：高75cm、内径2.5cm、外径3cm，柱温：室温，流速：2ml/min，压力：1.5MPa，以水-甲醇体系梯度洗脱(3:1～0:1)，具体洗脱条件：水-甲醇(2:1)3.3h，水-甲醇(3:2)3.3h，水-甲醇(1:1)3.3h，水-甲醇(2:3)3.3h，水-甲醇(3:7)3.3h，水-甲醇(1:4)3.3h，水-甲醇(1:9)3.3h，水-甲醇(0:1)3.3h。
洗脱样品用硅胶薄层板点板分析，展开剂为水：甲醇＝3:2，显色剂：典显，总共得到7个部分，分别命名为XQG-EA-7-1'、XQG-EA-7-2'、XQG-EA-7-3'、XQG-EA-7-4'、XQG-EA-7-5'、XQG-EA-7-6'、XQG-EA-7-7'，结果如图1所示，从左到右依次为XQG-EA-7、XQG-EA-7-1'、XQG-EA-7-2'、XQG-EA-7-3'、XQG-EA-7-4'、XQG-EA-7-5'、XQG-EA-7-6'、XQG-EA-7-7'。其中，XQG-EA-7-2'、XQG-EA-7-3'、XQG-EA-7-5'、XQG-EA-7-6'、XQG-EA-7-7'分别各析出一个单体化合物，分别命名为XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7。
2、XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7的HPLC分析及结构鉴定
2.1HPLC分析
样品处理：取上述所得XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7各2g溶解于50％甲醇中。
色谱柱为Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇(流动相B)与0.1％磷酸(流动相A)，流速0.8m L/min，紫外检测波长254nm，柱温35℃，洗脱条件见表1。HPLC色谱图如图2所示。
表1 5个单体化合物HPLC洗脱条件
时间/min 流速/mL·min-1 流动相A：0.1％磷酸/％ 流动相B：甲醇/％
0.01 0.8 85 15
20 0.8 45 55
25 0.8 0 100
28 0.8 0 100
30 0.8 85 15
2.2质谱结构鉴定
质谱检测操作条件：溶剂：50％甲醇、鞘气：5arbs、进样速度：5μl/min、离子源：电喷雾离子源、负离子模式：2500v、质量分析器：三通四级杆。
XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-7分子离子峰分别为633.21、651.32、953.23、301.20，通过与文献对比鉴定他们所对应的化合物分别是柯里拉京、诃子宁、诃黎勒酸、鞣花酸，XQG-EA-7-6是未知成分(MS图谱如图3～图7所示)。5个单体化合物的性质如表2。
表2五个单体化合物的性质
试验例一
XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7抑制单胺氧化酶B活性试验。
1、主要试剂
样品溶液：分别取实施例二制得XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7样品各2mg，分别将样品用2ml含10％二甲基亚砜的12.5mM磷酸缓冲溶液溶解，得1mg/ml原溶液，再用含10％二甲基亚砜的12.5mM磷酸缓冲溶液将其稀释至0.1mg/ml。
酶溶液：从猪肝中提取总MAOs(酶的活性为100U/ml，蛋白浓度为3.55mg/mL。，提取方法参考文献M.Matsukawa,A Screening System of Prodrugs Selective for MAO-A orMAO-B,NeuroToxicology,25(2004)293-302.)，用氯吉兰(MAO-A不可逆抑制剂)抑制总MAOs中MAO-A(抑制方法参考文献Youdim M B,Gross A,Finberg J P.Rasagiline[N-propargyl-1R(+)-aminoindan],a selective and potent inhibitor of mitochondrialmonoamine oxidase B.[J].British Journal of Pharmacology,2010,132(2):500-506.)，得到MAO-B(酶活性为100U/ml)，-80℃保存。临用前用PBS缓冲溶液将其稀释到工作液浓度10U/mL。
犬尿胺(底物)溶液：将犬尿胺溶于12.5mM磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中，浓度为0.2mM。
终止剂(2mol/L氢氧化钠溶液)溶液：称取8g氢氧化钠，溶解后用玻璃棒引流进100mL容量瓶中，定容。
PBS缓冲溶液：12.5mM磷酸缓冲溶液(pH 7.4)。
抑制剂溶液：氯吉兰，配制为0.1mg/mL。
阳性对照液：沙芬酰胺配制为0.1mg/mL的溶液。
2、试验操作
实验方法：MAO-B活性采用荧光法测定，以犬尿胺为底物。实验分为空白组、对照组、样品空白组、样品组，各反应物按表3中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表3依次加入PBS缓冲溶液、抑制剂溶液、酶溶液，于37℃下振摇10min。反应结束后，取出，加入0.2mM犬尿胺(底物)溶液，于37℃下振摇反应30min，结束后加入80μL终止剂终止反应。
表3各反应物添加计量和顺序(单位：μL)
由于单胺氧化酶B可以催化犬脲胺发生反应，生成荧光物质4-羟基喹啉，该化合物在激发波长310nm处，最大荧光发射波长为400nm。所以终止反应后在400nm处其测定其荧光强度，根据式1便可计算出各样品对MAO-B的抑制率。
抑制率(I)％＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％ 式1
(式中，A—没有抑制剂存在时的荧光强度值；B—仅有底物时的荧光强度值；C—酶与底物在抑制剂存在下的荧光强度值；D—没有酶存在时的荧光强度值)
3、试验结果
表4、主要试验数据
根据试验数据计算出，当XQG-EA-7-2(柯里拉京)、XQG-EA-7-3(诃子宁)、XQG-EA-7-5(诃黎勒酸)、XQG-EA-7-6和XQG-EA-7-7(鞣花酸)的浓度为0.05mg/mL时，他们对MAO-B的抑制率分别为78.86％、58.55％、59.35％、49.28％、74.10％。

Claims (10)

1.西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7，其特征在于：是西青果甲醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯部分再经正相柱二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱分离，所得组分中抑制单胺氧化酶B活性最强的部分。
2.根据权利要求1所述的西青果提取物XQG-EA-7，其特征在于：依如下方法制备：
步骤S1、西青果原料粉碎，料液比1:5，80％甲醇回流提取，滤液减压浓缩至无甲醇味，得西青果甲醇提取物；
步骤S2、西青果甲醇提取物经石油醚萃取，分离，水相经乙酸乙酯萃取，分离，有机相浓缩得乙酸乙酯部分；
步骤S3、乙酸乙酯部分经甲醇溶解，正相柱流动相二氯甲烷-丙酮-甲酸体系梯度洗脱分离，分离所得组分中，抑制单胺氧化酶B活性最强的部分即为西青果提取物XQG-EA-7；所述二氯甲烷-丙酮-甲酸体系浓度为15:1:0.1～0:1:0.1。
3.根据权利要求2所述的所述西青果提取物XQG-EA-7，其特征在于：所述步骤S3中，分离体系：常压玻璃层析柱：高75cm、内径8cm、外径8.7cm，柱温：室温，流速：15ml/min，压力：常压，梯度洗脱：二氯甲烷-丙酮-甲酸＝15:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝12:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝10:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝8:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝6:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝4:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝2:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝1:1:0.1、6.6h，二氯甲烷-丙酮-甲酸＝0:1:0.1、6.6h。
4.权利要求1或2或3所述的西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物XQG-EA-7在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。
5.西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7，其特征在于：是权利要求1或2或3所述的西青果提取物XQG-EA-7经反相柱分离得到；所述分离体系是中压玻璃层析柱，以流动相水-甲醇体系，水-甲醇＝3:1～0:1，梯度洗脱。
6.根据权利要求5所述的西青果提取物单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7，其特征在于：依如下方法制备：
首先，制备西青果提取物XQG-EA-7；
其次，将西青果提取物XQG-EA-7用尽量少的25％甲醇溶解，湿法上样，中压玻璃层析柱，柱温：室温，流速：2ml/min，压力：1.5MPa，以水-甲醇体系梯度洗脱，具体洗脱条件：水-甲醇＝2:1、3.3h，水-甲醇＝3:2、3.3h，水-甲醇＝1:1、3.3h，水-甲醇＝2:3、3.3h，水-甲醇＝3:7、3.3h，水-甲醇＝1:4、3.3h，水-甲醇＝1:9、3.3h，水-甲醇＝0:1、3.3h。
7.根据权利要求5或6所述的西青果提取物单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7，其特征在于：所述单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-7分别是柯里拉京、诃子宁、诃黎勒酸、鞣花酸。
8.权利要求5或6所述的西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物任一单体化合物XQG-EA-7-2、XQG-EA-7-3、XQG-EA-7-5、XQG-EA-7-6、XQG-EA-7-7在抑制单胺氧化酶B活性中的应用。
9.西青果(Terminalia chebula Retz.)提取物单体化合物XQG-EA-7-6，其特征在于：是白色粉末，溶于甲醇，是权利要求1或2或3所述的西青果提取物XQG-EA-7经反相柱分离得到；所述分离体系是中压玻璃层析柱，以水-甲醇体系，水-甲醇＝3:1～0:1，梯度洗脱。
10.根据权利要求9所述的单体化合物XQG-EA-7-6的HPLC鉴定方法，其特征在于：
样品处理：取西青果提取物XQG-EA-7-6溶解于50％甲醇中；
HPLC检测体系：C18柱、柱温35℃、流速0.8m L/min、表1所示洗脱条件：
表1 HPLC洗脱条件
时间/min 流速/mL·min-1 流动相A：0.1％磷酸/％ 流动相B：甲醇/％ 0.01 0.8 85 15 20 0.8 45 55 25 0.8 0 100 28 0.8 0 100 30 0.8 85 15
紫外检测波长254nm。
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