CN106198771A - 同时测定组织中两种马兜铃酸-dna加合物的hplc-fld-dad分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测马兜铃酸肾病(AAN)生物标记物，即马兜铃酸(AA)-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析法。该法利用AA-DNA加合物的荧光特性，HPLC-FLD检测AA-DNA加合物、HPLC-DAD检测脱氧核苷，从而测定加合物含量；可同时测定脱氧腺苷-马兜铃酸I加合物(dA-AA-I)、脱氧腺苷-马兜铃酸II加合物(dA-AA-II)，AAN最主要的两种加合物。主要步骤有DNA的提取、DNA的消化及加合物的富集、HPLC-FLD测定AA-DNA加合物、HPLC-DAD测定脱氧腺苷、AA-DNA加合物含量的计算。应用该法，在给予关木通等含有AAs的药物或食物的动物组织(例如大鼠肝、肾组织等)可检测AA-DNA加合物含量。

Description

同时测定组织中两种马兜铃酸-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析方法

[技术领域]

本发明属于生物技术分析领域，具体为涉及一种检测马兜铃酸肾病生物标记物(即马兜铃酸-DNA加合物)的HPLC-FLD-DAD法，可用于马兜铃酸肾病相关研究工作。

[背景技术]

马兜铃酸肾病(AAN)是摄入含有马兜铃酸(AAs)类成分中草药(例如关木通、广防己、青木香等)导致的肾小管间质疾病。目前文献报道约50％的AAN患者同时患有上尿路上皮细胞癌(UTUC)^[1]，70％UTUC患者体内有AA-DNA加合物^[2]。AA-DNA加合物通过引起基因位点AT→TA的突变，阻止转录或DNA复制，促进细胞周期受阻或导致细胞凋亡^[3]，引起肿瘤。AA-DNA加合物作为AA暴露的生物标志物^[2，4]，其检测具有重要意义^[5]。

目前文献报道在动物及患者体内可检测到的AA-DNA加合物有脱氧腺苷-马兜铃酸I加合物(dA-AA-I)、脱氧腺苷-马兜铃酸II加合物(dA-AA-II)、脱氧鸟苷-马兜铃酸I加合物(dG-AA-I)、脱氧鸟苷-马兜铃酸II加合物(dG-AA-II)、脱氧胞苷-马兜铃酸I加合物(dC-AA-I)、脱氧胞苷-马兜铃酸II加合物(dC-AA-II)，其中dA形成的加合物基因诱导作用最强^[1]，即dA-AA-I、dA-AA-II为AAN主要的加合物，这其中又以dA-AA-I在AAN患者中最为常见^[6]。AA-DNA加合物的检测步骤包括DNA提取、酶消化、加合物的富集及检测分析，主要的检测方法包括³²P-后标记法^[7-10]、高效液相(HPLC)-质谱(MS)联用法^[11-14]等，但³²P-后标记法有放射性操作有一定风险，而HPLC-MS联用法花费昂贵。针对此现状，本课题组根据AA-DNA加合物由于具有马兜铃内酰胺环状结构，受激发时会产生荧光信号，认为荧光法(FLD)是检测AA-DNA加合物一种很好的可选择的方法。本课题组^[15，16]前期用AA-I刺激肾小管上皮细胞，证明了细胞核的荧光物质为AA-DNA加合物，并用激光共聚焦测定了其荧光强度，该法可原位观察。Chan^[17]等曾单次给予大鼠AA-I、AA-II(1∶1)混合品并用HPLC-FLD方法进行分析，但仅检测了肾脏，且在肾脏中只检测到dA-AA-II这一种加合物。

因此本发明致力于建立一种HPLC-FLD-DAD法用于检测dA-AA-I、dA-AA-II这两种最主要的AA-DNA加合物。

[发明内容]

本发明的目的是针对上述不是提供一种采用HPLC-FLD-DAD法同时测定两种最主要的AA-DNA加合物(dA-AA-I、dA-AA-II)的分析方法，并应用该法测定给予关木通等含有AAs的药物或食物后的动物的组织(如大鼠肝、肾组织等)中AA-DNA加合物含量。本发明主要通过以下步骤实现：

(1)组织中DNA的提取；

(2)DNA的消化及加合物的富集；

(3)HPLC-FLD测定AA-DNA加合物；

(4)HPLC-DAD测定脱氧腺苷；

(5)AA-DNA加合物含量的计算。

具体操作步骤如下所示：

(1)DNA的提取：苯酚氯仿法提取组织中DNA。

(2)DNA的消化及加合物的富集：取200μg DNA，加入DNase I 30μL(20mg·mL^-1)，70μL 0.01M MgCl₂-0.01M Tris缓冲液(pH 7.0)，用0.01M Tris-5mM NaCl缓冲液(pH 7.5)补体积至400μL，37℃孵育2h。再向其中加入392μL 0.2M Tris缓冲液(pH 8.0～9.0)和4μL磷酸二酯酶I(100mU·μL^-1)，孵育24h后加入4μL碱性磷酸酶(1.25U·μL^-1)。

继续孵育24h后混匀，取10μL加入90μLH₂O，HPLC-DAD检测脱氧腺苷含量。剩余溶液用等体积乙酸乙酯萃取3次合并，氮气吹干，加入50μL甲醇溶解，HPLC-FLD检测AA-DNA加合物。

(3)HPLC-FLD测定AA-DNA加合物：流动相为0.2％乙酸-水(A)、乙腈(B)，B相0～20min在25％～40％范围内梯度变化，20～45min在40％～80％范围内梯度变化。进样量20μL，流速0.8mL·min^-1，柱温25℃。FLD激发波长在280～430nm，发射波长在450～600nm。

(4)HPLC-DAD测定脱氧腺苷：流动相为水(A)、乙腈(B)，B相0～35min在5％～80％范围内梯度变化。进样量20μL，流速1mL·min^-1，柱温25℃。DAD检测波长在250～260nm。

(5)AA-DNA加合物含量的计算：AA-DNA加合物浓度以每10⁵正常脱氧核苷中的加合物数量表示，即[AA-DNA]＝N_dA-AA/N_dA·10^-5。

其中，步骤(3)中FLD激发波长为304nm，发射波长为480nm。流动相为0.2％乙酸-水(A)、乙腈(B)，B相0～10min在25～30％范围内梯度变化，10～20min在30～40％范围内梯度变化，20～35min在40～80％范围内梯度变化，35～45min为80％。

其中，步骤(4)中DAD检测波长为254nm。流动相为水(A)、乙腈(B)，B相梯度变化，0～10min为5％，10～30min为5～80％，30～35min为80％。

本发明的有益效果在于：①优化分离加合物的条件，使其可以同时定量dA-AA-I、dA-AA-II，引起AAN的两种最主要加合物；②利用HPLC-FLD检测AA-DNA加合物、HPLC-DAD检测脱氧核苷，从而测定加合物含量；③所建方法AA-DNA加合物及脱氧腺苷均与内源性成分分离良好，线性良好(r²＞0.999)；加合物的检测限为0.5ng/ml(0.30pmol)、定量限为1ng/ml(0.59pmol)，显示了较高的灵敏度；④所建方法与³²P后标记法相比无放射性，与质谱法相比价廉；⑤应用该方法可用于检测组织中(例如大鼠肝、肾)中的AA-DNA加合物。

[附图说明]

图1马兜铃酸-DNA加合物(dA-AA-I、dA-AA-II)的化学结构

图2HPLC-FLD检测AA-DNA加合物的专属性考察：(A)空白基质(CT-DNA消化液)色谱图；(B)空白基质加dA-AA-I对照品色谱图；(C)关木通给药5天大鼠肾色谱图；(D)关木通给药5天大鼠肝色谱图。

图3HPLC-DAD检测脱氧核苷的专属性考察：(A)空白基质(不含DNA的消化液)色谱图；(B)空白基质加dA对照品色谱图；(C)关木通给药5天大鼠肾色谱图；(D)关木通给药5天大鼠肝色谱图。

[具体实施方式]

下面结合实施例、验证例及附图对本发明作进一步的描述。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。

实施例1 关木通给药大鼠的肾组织中AA-DNA加合物的检测

1.材料

1.1 试剂和仪器

2-脱氧腺苷(dA)、小牛胸腺DNA(CT-DNA)均购自Sigma公司。脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、磷酸二酯酶I均购自Worthington公司。碱性磷酸酶购自上海生工生物有限公司。乙腈、甲醇均为HPLC级，Thermo Fisher公司。乙酸、乙酸乙酯、锌粉、氯化钠、氯化镁均为分析纯，北京化工厂。三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自北京东胜泰博科技有限公司。AA-DNA加合物(dA-AA-I、dA-AA-II)，本课题组前期合成经质谱确证结构。

Agilent 1200液相色谱仪(DAD检测器、FLD检测器、柱温箱、二元泵、自动进样器、脱气机)。Phenomenex Luna C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。

1.2 药材和水煎液

关木通干燥茎，采自辽宁，经鉴定为马兜铃科植物东北马兜铃Aristolochia manshuriensisKom.的藤茎。称取关木通饮片适量，加水浸泡45min，大火煮沸后，文火煮沸30min，过滤，留待浓缩；残渣再加水，大火煮沸后，文火煮沸45min，过滤，留待浓缩。合并两次煎液，旋转蒸发浓缩得到浓缩液，AA-I浓度为2.54mg·mL^-1。

1.3 实验动物

雄性Wistar大鼠，体重150～180g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，均为II级清洁级动物，动物合格证号为SCXK(京)2011-0012。实验前进行适应性喂养4天，自由饮食。

2.方法

2.1 动物实验

雄性Wistar大鼠(n＝5)，灌胃给予关木通水煎液，剂量按AA-I计20mg/kg/d，连续给药5天，在最后一次给药后2h，经腹腔注射10％水合氯醛麻醉，行全身生理盐水灌流，取肾组织，立即放入液氮中，样品检测前保存于-80℃。

2.2 HPLC-FLD-DAD检测组织中AA-DNA加合物

(1)DNA的提取：苯酚氯仿法提取大鼠肾组织中DNA。

(2)DNA的消化及加合物的富集：取200μg DNA，加入DNase I 30μL(20mg·mL^-1)，70μL 0.01M MgCl₂-0.01M Tris缓冲液(pH 7.0)，用0.01M Tris-5mM NaCl缓冲液(pH 7.5)补体积至400μL，37℃孵育2h。再向其中加入392μL 0.2M Tris缓冲液(pH 8.0～9.0)和4μL磷酸二酯酶I(100mU·μL^-1)，孵育24h后加入4μL碱性磷酸酶(1.25U·μL^-1)。

继续孵育24h后混匀，取10μL加入90μLH₂O，HPLC-DAD检测脱氧腺苷含量。剩余溶液用等体积乙酸乙酯萃取3次合并，氮气吹干，加入50μL甲醇溶解，HPLC-FLD检测AA-DNA加合物。

(3)HPLC-FLD测定AA-DNA加合物：流动相为0.2％乙酸-水(A)、乙腈(B)，B相0～10min在25～30％范围内梯度变化，10～20min在30～40％范围内梯度变化，20～35min在40～80％范围内梯度变化，35～45min为80％。进样量20μL，流速0.8mL·min^-1，柱温25℃。FLD激发波长304nm，发射波长480nm。

(4)HPLC-DAD测定脱氧腺苷：流动相为水(A)、乙腈(B)，B相梯度变化，0～10min为5％，10～30min为5～80％，30～35min为80％。进样量20μL，流速1mL·min^-1，柱温25℃。DAD检测波长254nm。

(5)AA-DNA加合物含量的计算：AA-DNA加合物浓度以每10⁵正常脱氧核苷中的加合物数量表示，即[AA-DNA]＝N_dA-AA/N_dA·10^-5。

3.结果

在给药5天大鼠肾脏中能检测到dA-AA-I、dA-AA-II，如图2C，其含量分别为16.90±4.31×10^-5、1.21±0.61×10^-5。

实施例2 关木通给药大鼠的肝组织中AA-DNA加合物的检测

1.材料

1.1 试剂和仪器

同实施例1。

1.2 药材和水煎液

同实施例1。

1.3 实验动物

同实施例1。

2.方法

2.1 动物实验

操作同实施例1，所取组织为大鼠肝组织。

2.2 HPLC-FLD-DAD检测组织中AA-DNA加合物

操作同实施例1

3.结果

在给药5天大鼠肝脏中能检测到dA-AA-I，未检测到dA-AA-II，如图2D，其含量为7.24±2.24×10^-5。

验证例 HPLC-FLD-DAD检测AA-DNA加合物及脱氧腺苷的方法学验证

1.HPLC-FLD测定AA-DNA加合物的方法学验证

分别制备空白基质(CT-DNA的消化液)、空白基质加dA-AA-I对照品及关术通给药大鼠肝、肾组织样品，同法处理测定并进行色谱图比较，考察专属性。将不同浓度的dA-AA-I对照品加入空白基质中，按样品同法处理测定，选取6个浓度点建立标准曲线，即1、2.5、5、10、25、50ng·mL^-1。标准曲线最低浓度点为LOQ，且S/N＞10，继续稀释至S/N＞3的最低浓度为LOD。分别在日内、日间(1～3天)选取高浓度(40ng·mL^-1)、中浓度(10ng·mL^-1)、低浓度(2.5ng·mL^-1)样品，每个浓度平行制备5份，进行日内、日间精密度准确度考察。对比空白基质同法处理后，加入相当于高浓度(40ng·mL^-1)、中浓度(10ng·mL^-1)、低浓度(2.5ng·mL^-1)样品的等量dA-AA-I甲醇溶液，考察dA-AA-I的提取回收率。高浓度(40ng·mL^-1)、低浓度(2.5ng·mL^-1)样品室温放置24h，同法处理测定，并与0h测得的结果进

行比较，考察样品稳定性。

2.HPLC-DAD测定脱氧腺苷的方法学验证

分别制备空白基质(不含DNA的消化液)、空白基质加dA对照品及关木通给药大鼠肝、肾组织DNA的消化液，同法处理测定并进行色谱图比较，考察专属性。将不同浓度的dA对照品加入空白基质中，按样品同法处理测定，选取7个浓度点建立标准曲线，即0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0、10μg·mL^-1。标准曲线最低浓度点为LOQ，且S/N＞10，继续稀释至S/N＞3的最低浓度为LOD。分别在日内、日间(1-3天)选取高浓度(5.0μg·mL^-1)、中浓度(1.0μg·mL^-1)、低浓度(0.25μg·mL^-1)样品，每个浓度平行制备5份，进行日内、日间精密度准确度考察。高浓度(5.0μg·mL^-1)、低浓度(0.25μg·mL^-1)样品室温放置24h，同法处理测定，并与0h测得的结果进行比较，考察样品稳定性。

3.方法学验证结果

3.1 专属性

如图2、3，dA-AA-I和dA均与内源性成分分离良好，分离度＞1.5。

3.2 标准曲线、线性范围

dA-AA-I的标准曲线为y＝0.8377x-0.3753(r²＝0.9998)、线性范围为1～50ng·mL^-1，dA的标准曲线为y＝57.13x-1.5175(r²＝0.9999)、线性范围为0.10～10μg·mL^-1。

3.3 检测限、定量限

dA-AA-I的检测限为0.5ng·mL^-1(0.30pmol)，定量限为1ng·mL^-1(0.59pmol)，显示了较高的灵敏度。dA的检测限为0.05μg·mL^-1，定量限为0.10μg·mL^-1。

3.4 日内日间精密度、准确度

表1所示，dA-AA-I及dA在高中低三个浓度的日内、日间精密度均小于15％，准确度在85％～115％。

3.5 提取回收率、稳定性

表1所示，dA-AA-I的提取回收率为82.6％～84.5％。dA-AA-I及dA在室温放置24h，稳定性在85％～115％。符合生物样品方法学考察要求。

表1 dA-AA-I、dA的日内日间精密度、准确度、回收率

注：C_a为加入浓度(added concentration)，Cc为计算浓度(calculated concentration)，A_基质/A_溶剂以dA-AA-I加入基质同法处理测定的峰面积(A_基质)与dA-AA-I甲醇溶液峰面积(A_溶剂)的比值

本发明建立的HPLC-FLD-DAD法利用AA-DNA加合物的荧光特性，具有专属性强，背景干扰少的特点；有着较高的灵敏度，检测限为0.5ng/mL(0.30pmol)，定量限为1ng/mL(0.59pmol)。两种AA-DNA加合物由于结构相似，液相分离困难，本发明优化了HPLC-FLD检测加合物的液相条件，并成功在大鼠肾脏中检测到了dA-AA-I、dA-AA-II，AA引起癌症的两种最主要加合物。本发明是一种很好的检测AAN生物标记物的方法，可用于AAN相关研究。

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Claims (7)

1.一种检测马兜铃酸肾病(AAN)生物标记物，即马兜铃酸(AA)-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD法，其特征在于，该法可同时测定动物组织中脱氧腺苷-马兜铃酸I加合物(dA-AA-I)、脱氧腺苷-马兜铃酸II加合物(dA-AA-II)，这两种AAN最主要的加合物；该法利用AA-DNA加合物的荧光特性，用HPLC-FLD检测AA-DNA加合物、用HPLC-DAD检测脱氧核苷，从而测定加合物含量，该方法含有如下步骤：

(1)DNA的提取：采用苯酚氯仿法提取动物组织中DNA；

(2)DNA的消化及加合物的富集：取200μgDNA在Tris缓冲液弱碱性环境中，分别按顺序加入三种酶在37℃孵育反应，即30μL DNase I、4μL磷酸二酯酶I、4μL碱性磷酸酶，消化完后用乙酸乙酯萃取，富集加合物；

(3)HPLC-FLD测定AA-DNA加合物：FLD激发波长在280～430nm，发射波长在450～600nm，流动相为0.2％乙酸-水(A)、乙腈(B)，B相0～20min在25％～40％范围内梯度变化，20～45min在40％～80％范围内梯度变化；

(4)HPLC-DAD测定脱氧腺苷：DAD检测波长在250～260nm，流动相为水(A)、乙腈(B)，B相0～35min在5％～80％范围内梯度变化；

(5)AA-DNA加合物含量的计算：AA-DNA加合物浓度以每10⁵正常脱氧核苷中的加合物数量表示。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(3)中，FLD激发波长在280～350nm，发射波长在450～520nm。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(3)中，FLD激发波长为304nm，发射波长为480nm。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(3)中，流动相为0.2％乙酸-水(A)、乙腈(B)，B相0～10min在25～30％范围内梯度变化，10～20min在30～40％范围内梯度变化，20～35min在40～80％范围内梯度变化，35～45min为80％。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(4)中，DAD检测波长为254nm。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(4)中，流动相为水(A)、乙腈(B)，B相梯度变化，0～10min为5％，10～30min为5～80％，30～35min为80％。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，给予关木通等含有AAs的药物或食物后的动物组织(例如大鼠肝、肾组织等)可以检测AA-DNA加合物(dA-AA-I)的含量。