CN105092753A - 组合型胺类代谢标志物的应用及试剂盒与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了血清中胺类代谢物：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸，作为组合标志物在制备用于诊断受试者中的早期肝性脑病患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的早期肝性脑病患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清中上述胺类组合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量Prob以及判断截点值(cutoff)，判断所述受试者是否是早期肝性脑病患者。所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明可应用于辅助早期肝性脑病的临床诊断，有诊断特异性高和灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志物血氨相互补充的特点，具有较高的开发应用的价值。

Description

组合型胺类代谢标志物的应用及试剂盒与检测方法

技术领域

本发明涉及一种新的胺类组合标志物在诊断早期肝性脑病中的应用。属于分析化学及临床医学及医学领域。

背景技术

肝性脑病(Hepaticencephalopathy，HE)是由急、慢性肝功能衰竭或各种门-体分流引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合征。该综合症常见于终末期肝硬化，根据意识障碍程度、神经系统表现和脑电图改变，将HE自轻微的精神改变到深昏迷分为0-4期(westHaven分期)。早期肝性脑病(如0期，即轻微型肝性脑病MHE)是肝性脑病发展过程中的特殊阶段，具有发病率高，隐蔽性强的特点，在我国发病率为24.7％-85％，在肝硬化患者中发病率为51.3％,因其难以被发现和治疗，导致病情恶化，一旦进展为临床型肝性脑病致死率可高达50％，因此，肝性脑病早期诊断尤为重要。目前，诊断方法有智能测试，神经电生理和神经电心理测试诊断和核磁共振波谱成像(MRS)三类，前两者测试虽简单，但易受年龄、文化程度影响；而基于MRS的诊断虽然更精密、客观、敏感，但其检测成本较高。目前，肝性脑病发病机制仍不清楚，同时缺乏早期诊断的金标准，因此，开发新的高灵敏度和特异性的诊断方法势在必行。

已有研究表明肝性脑病涉及到许多胺类(特别是氨基酸类)的代谢，如细胞增殖方面：多胺类物质在细胞生长和增殖以及蛋白质和核酸的合成中有着重要的作用[参考文献1：J.Janne，L.Alhonen，T.A.Keinanen，M.Pietila,A.Uimari,E.Pirinen,M.T.Hyvonen,A.Jarvinen,J.Cell.Mol.Med.9(2005)865–882.]；稳态调节方面：支链氨基酸在加速氨的解毒，调整氨基酸平衡，减少脑中芳香族氨基酸的流入，促进蛋白质合成，谷氨酰胺的的生成，抑制蛋白质水解中有着重要的作用[参考文献2：HolecekM(2010).Nutrition26:482–490]；能量动态平衡方面：血浆中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的上升可能引起颅内压的升高和脑氧消耗量的降低[参考文献3：RaphaelN,Vuille-Dit-Bille,RiemHa-Huy.AminoAcids(2012)43:1287–1296]；信号传导方面：苯丙氨酸和酪氨酸是合成去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴的胺兴奋神经传导物质的前驱物[参考文献4：FernstromJD,FernstromMH.JNutr137((6Suppl1)):1539S–1547S]；同时，苯丙氨酸和酪氨酸经脱羧作用生成苯乙胺和酪胺，当肝功衰竭时不经肝内分解进入而脑组织，则可经经非特异性的β羟化酶作用分别形成苯乙醇胺和β羟酪胺，它们的化学结构与儿茶酚胺相似，是假神经递质。假神经递质增多，可取代正常递质儿茶酚胺，但它们不能传递神经冲动，可使大脑发生异常抑制，这可能与肝昏迷的症状有关；鉴于此，检测血清中胺类代谢物的变化有助于我们了解肝性脑病的代谢谱，以便开发和建立更有效的早期肝性脑病诊断方法。

目前，检测胺类物质的方法有：高效离子交换色谱法、毛细管电泳技术、气相色谱法和液相色谱法及其联用的紫外吸收、质谱等。高效离子交换色谱法对氨基酸检测专一性强,但分析成本高，工作效率低[参考文献5：MooreS，SpackmandH，SteinWH.Anal.Chem.,1958,30(7):1185-1190)]；毛细管电泳技术具有高效快速灵敏进样少成本低等优点，但是其重现性较差[参考文献6：PoinsotV,CarpeneMA,BouajilaJ.Electrophoresis,2012,33(1):14-35.]；气相色谱法柱效高、快速易与质谱仪联用等优点，但该方法衍生条件苛刻，不同胺类物质衍生反应速度不同或者衍生化试剂也不同，操作过程繁琐且易带来污染[参考文献7：KhuhawarMY,MajidanoSA.Chromatographia,2011,73(7/8):701-708.]；高效液相色谱法，具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点,特别是与质谱联用后，其分析检测的灵敏度和分辨率显著提高，广泛应用于多种生物样品内胺类物质的检测[参考文献8：RanLiu,QingLi,RanMa,XiaohuiLin,HuarongXu,KaishunBi.AnalyticaChimicaActa791(2013)36–45]，但在常规液质联用方法中由于胺类物质极性强，出峰时间快，离子抑制现象严重难以被检测。基于此，本试剂盒采用基于丹磺酰氯衍生血清中胺类物质的液质联用的方法，大大减弱了胺类物质的离子抑制现象，改善了分离度，明显地增强了检测的灵敏度。并且本应用涉及的试剂盒可以检测到至少95种胺类物质，可以系统、全面地监测早期肝性脑病血清胺类物质代谢谱的变化，为早期HE的机理解释和诊断提供新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对早期肝性脑病隐蔽性强而诊断困难的问题，发现了一种新的组合的能够应用于早期肝性脑病诊断，上述组合胺类标志物的特征和检测方法如下：

本发明确定的5种胺类代谢物：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸都是人体中重要的代谢物，目前有研究表明，它们都涉及到肝性脑病的发生和发展：鸟氨酸几乎涉及尿素循环的活化和氨的解毒的全过程，在此过程中形成精氨酸，继而分裂出尿素形成鸟氨酸，鸟氨酸异常是由于尿素循环受阻引起；天冬氨酸参与肝细胞内核酸的合成，间接参与三羧酸循环，促进肝细胞能量的合成，加速肝细胞恢复和再生，提高肝细胞摄取、转化、排泄TBIL的能力及提高对血氨的解毒能力[参考文献9：唐先明，王谷丰.张永红等.临床消化病杂志，2004，16(3)：122—123.]；在黄嘌呤氧化酶(主要来自于肝细胞)氧化作用下，次黄嘌呤可转化为黄嘌呤，当肝细胞膜受损时会导致血清中次黄嘌呤代谢异常；苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸则涉及到苯丙氨酸和谷氨酰胺的代谢：苯丙氨酸是一种芳香族氨基酸，是形成假神经递质β苯乙醇胺的前体物质，同时有研究表明，血浆中苯丙氨酸的升高对降低颅内压和增加脑氧消耗量有影响[参考文献10：肝性脑病诊断治疗专家委员会.中国肝脏病杂志.2009,1(2)：46-55.]；谷氨酰胺是氨解毒代谢--谷氨酰胺合成的产物，其代谢可直接反映血氨的解毒情况。本发明首次将以上五种胺类代谢物组合并应用在早期肝性脑病的诊断，所述胺类代谢组合标志物由基于丹黄酰氯衍生技术的液相色谱质谱联用方法检测，方法用如下：

分离系统为Waters超高效液相色谱，色谱柱为C18，流动相流速为0.35ml/min，柱温为60摄氏度，进样量为10ul(也可使用C8色谱柱，柱温为25-60摄氏度，流速为0.2-1.0ml/min但因这些条件分离速度慢且各胺类物质分离度较差而未被采用)；洗脱液为A相0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液(也可以选择0.1％(v/v)甲酸的水溶液和乙腈(甲醇)溶液洗脱液，但灵敏度相对要低些)；内标通常选择为胺类同位素也可采用其他质谱检测常用内标如亮氨酸脑菲肽等。检测器采用的质谱为高分辨的线性离子阱-轨道阱质谱(LTQOrbitrapMS)，正离子模式检测。

血清样本预处理方法：

血样在4℃下解冻，取100μL血清样本，加入400μL含有多个内标的乙腈提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000rpm转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥；干燥后的粉末样品进行丹黄酰氯衍生，步骤如下：加5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0.15M的碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液50uL，涡旋30-60s，封膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去膜，再加入0.5M丁胺水溶液30uL，60摄氏度水浴震荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离心，取上清进样。通过总离子流图计算内标峰、五种胺类代谢物的峰面积，以确定五种胺类代谢物的相对含量。提取剂中内标及其浓度见附表1。

所获得数据通过SPSS软件进行二元逻辑回归分析：在三类样本中，每类随机挑出2/3的样本作为训练集用于建模，剩余的1/3样本作为测试集用于验证。所建模型获得的回归方程如下：

X＝56.712*A-3.559*B-69.638*C-280.485*D+14.578*E-4.209

Prob(早期肝性脑病)＝1/(1+e^-X)

其中A、B、C、D、E分别为谷氨酰苯丙氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、D为次黄嘌呤、E为天冬氨酸的相对浓度，Prob(早期肝性脑病)为肝性脑病的概率，Cutoff＝0.36，即当Prob(早期肝性脑病)值大于0.36时，诊断为早期的肝性脑病。

所建模型对非早期肝性脑病和早期肝性脑病具有良好的判别能力(见图2、3)，组合标志物的AUC＝0.954、灵敏度为86.7％、特异性为87.5％(见表2)；同时，在训练集中干扰组和早期肝性脑病的正确诊断率分别为87.5％和86.7％，测试集中均为87.5％。此外，组合标志物在血氨假阴性(<60umol/l)的早期肝性脑病患者中的诊断准确率为85％(见图4)；优异的ROC曲线结果和训练集、测试集中良好的正确诊断率以及和传统肝性脑病标志物良好的互补性表明五种胺类组合标志物具有为早期肝性脑病诊断的潜力。

本发明具有的效果是：血清样品中胺类代谢物天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸可以联合用于早期肝性脑病病人的识别。通过本发明涉及的组合标志物，能够对早期肝性脑病的诊断具有高灵敏、高特异性特征。同时，该组合标志物可以与传统的标志物血氨互补，联合使用能够用于早期肝性脑病的辅助诊断。

附图说明

图1为天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸在正常对照组、肝硬化组和肝性脑病早期组血清样本中的含量变化(均值±标准偏差表示)；

图2为联合标志物及其单个标志物在判别早期肝性脑病组和干扰组—正常对照组及肝硬化组的ROC曲线；

图3为联合标志物在判别早期肝性脑病组和干扰组-肝硬化组的诊断结果图；

图4为联合标志物和血氨在判别早期肝性脑病组和干扰组-肝硬化组的诊断正确率比较图。

具体实施方式

实施例1

1.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

肝硬化组纳入标准：参照2010年修订慢性乙型肝炎防治指南[11]。

早期肝性脑病纳入标准：选择了至少接受过5年教育的肝硬化患者作为研究对象，其中数字连接试验-A、数码-符号试验或脑电图三者诊断中至少一项异常，则诊断为早期肝性脑病。

健康对照组纳入标准：正常体检人群(40－70岁之间)，体检身体健康者。

相同条件下采用血清样本：33例正常人、15例肝硬化和23早期肝性脑病(0期11例、I期12例)患者的血清样本；入院后24小时内留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小时之内分离血清，置于-80℃冰箱保存，备检。

2.分析方法

2.1血清样本预处理

血样在4℃下解冻，取100μL血清样本，加入400μL含有多个内标的乙腈提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000rpm转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥；干燥后的粉末样品进行丹黄酰氯衍生，步骤如下：加5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0.15mol/L的碳酸钠和0.15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶液50uL，涡旋30-60s，封上封口膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去上封口膜，再加入0.5mol/L丁胺水溶液30uL，60摄氏度水浴震荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离心，取上清，以待进样。提取液中加入的同位素内标及相应的浓度见表1。

表1内标及其在乙腈提取液中的浓度

2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：色谱仪为WatersAcQuity超高效液相色谱(Waters,Ireland)；色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18(1.7um，2.1mmX100mm)(Waters,Ireland)；流动相A为流动相：A相为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-1min为2％B相，1min-20min线性变化到80％B相，20min-25min线性变化到100％B相，保持4min，0.1min内线性降至2％B相并保持1mins；柱温为60℃；流动相流速为0.35mL/min；进样量为10μL。

(2)质谱条件：质谱仪为线性离子阱-轨道阱质谱(LTQOrbitrapMS)(Thermo,USA)；采用正离子模式检测；扫描范围：m/z80-1000；毛细管温度为300℃，喷雾电压为4.5kV，鞘流气为35arbitraryunits，辅助气流为5arbitraryunits；分辨率为60000。

2.3血清测试结果及辅助诊断方法

对于正常对照组和肝硬化组，鸟氨酸和谷氨酰苯丙氨酸在早期肝性脑病组中显著性升高，天冬氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸则显著性下降(见图1)。同时，将各标志物的含量带入回归方程式中，计算出概率，采用的cutoff值为0.36，即组合标志物的概率大于0.36则认为是早期肝性脑病(图2)，组合标志物的AUC＝0.954，灵敏度和特异性也比较高，分别为86.7％和87.5％(见表2)。而常用的肝性脑病床标志物血氨在早期肝性脑病组也有低于诊断cutoff值(60mol/L)的假阴性样本(23例肝癌样本中有20例血氨值小于60mol/L)。进一步分析此结果，早期肝性脑病中，23例肝癌患者中有20例呈阴性反应(血氨<60mol/L),而采用组合标志物法来对这20例病人进行诊断时，发现其中17例呈阳性反应(概率>0.36)。这说明组合标志物与血氨具有较好的互补性(见图4)，两者进行联合诊断更有助于提高检测早期肝性脑病的能力。

表2各标志物及其组合在非肝性脑病组和早期肝性脑病组中的灵敏度和特异性

本发明所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明可应用于辅助早期肝性脑病的临床诊断，有诊断特异性高和灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志物血氨相互补充的特点，具有较高的开发应用的价值。

Claims (5)

1.组合型胺类代谢标志物的应用，即组合型胺类代谢标志物在制备用于诊断受试者中的早期肝性脑病患者的试剂盒的用途，所述组合标志物由天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同构成。

2.一种检测受试者中的早期肝性脑病的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)标准品：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸，所述标准品分别用于对应的血清中胺类代谢物天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的定性；

(2)含内标的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，为包含至少一种内标物的乙腈溶液，含内标的提取液为：1-5ug/ml稳定同位素标记的色氨酸、1-5ug/ml稳定同位素标记的丙氨酸、1-5ug/ml稳定同位素标记的亮氨酸和1-5ug/ml稳定同位素标记的胸腺嘧啶中一种或二种以上的乙腈溶液；

(3)衍生化试剂：5mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液、0.5mol/L丁胺水溶液和0.15mol/L的碳酸钠和0.15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶液；

(4)洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液和0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其中受试者包括早期肝性脑病患者，及对照的肝硬化患者和/或正常人。

4.一种计算受试者的血清样品中的组合标志物变量的方法，所述组合标志物由天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同构成，所述方法包括以下步骤：

1)以含有内标物的提取液处理来自受试者的血清样本，沉淀血清蛋白后，提取上清、冻干；随后对冻干的粉末进行2步丹磺酰氯衍生法衍生，步骤如下：加5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0.15mol/L的碳酸钠和0.15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶液50uL，涡旋30-60s，封上封口膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去上封口膜，再加入0.5mol/L丁胺水溶液30uL，60摄氏度水浴震荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离心，取上清，采用质谱正离子模式检测分析；

2)在液相色谱-质谱分析获得的总离子流图上，提取天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸衍生后所对应离子的色谱峰；天冬氨酸衍生后离子的提取参数为:质核比为367.0962±0.005的离子，鸟氨酸衍生后离子的提取参数为:599.1995±0.005的离子，次黄嘌呤衍生后离子的提取参数为:370.0972±0.005的离子，苯丙氨酰苯丙氨酸衍生后离子的提取参数为:546.2061±0.005的离子，谷氨酰苯丙氨酸衍生后离子的提取参数为:759.2449±0.005的离子；

3)以试剂盒中五种胺类物质天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的标准品对检测到的离子进行定性；将浓度为4-50ug/ml的五种胺类物质标准品水溶液在步骤1)相同条件下衍生后，进行液相色谱-质谱分析，确定五种标准品衍生后对应离子的保留时间以及实测质核比，与在受试者样本中实测的五种物质相比较；

4)对每一受试者样本中经定性后的五种物质的色谱面积分别与提取液中的内标物比较，获得天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的相对浓度；

5)以上述五种胺类代谢物的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算组合标志物变量P。

5.根据权利要求4所述计算受试者的血清样品中的组合标志物变量的方法，其中受试者包括早期肝性脑病患者，及对照的肝硬化患者和/或正常人。