CN1090328A

CN1090328A - 改进的脂解酶和其用途

Info

Publication number: CN1090328A
Application number: CN93119915A
Authority: CN
Inventors: M·R·艾格蒙德; H·T·W·M·范德希登; W·穆斯特斯; H·彼得斯; C·T·韦里斯; J·迪弗力格
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-18
Publication date: 1994-08-03
Also published as: JPH08504588A; ZA939415B; CZ157895A3; AU5699994A; WO1994014963A1; EP0679188A1; HUT71325A; BR9307678A; PL309388A1; SK79595A3; HU9501771D0; CA2150837A1

Abstract

提供具有改善的脂解活性的真核角质酶变异体，其中修饰氨基酸序列以便提高酶表面的疏水性。特别是提供茄病镰孢的变异体。

Description

本发明主要涉及脂解酶领域。特别是，本发明涉及用重组DNA技术改进过的脂解酶，涉及有关生产它们的方法以及其用途，特别是用于酶洗涤剂组合物中。

脂解酶是能够将甘油三酯水解成游离脂肪酸和甘油二酯，单酸甘油酯并最终水解成甘油的酶。它们也可裂解更复杂的酯如植物中的角质层或皮肤的皮脂。脂解酶用于工业上的各种酶加工，如甘油三酯的酯交换和酯基转移以及酯的合成。也可将它们用于洗涤剂组合物以达到改善洗涤剂产品去除脂肪特性的目的。

应用最广泛的脂解酶是脂酶（EC3.1.1.3）。例如，EP-A-258068和EP-A-305216（均属Novo Nordisk）都描述了用rDNA技术经异源宿主微生物生产真菌酯酶，特别是来自Thermomyces Lanuginosus/Humicola Lanuginosa的酯酶。EP-A-331376（Amano）描述了酯酶和用rDNA技术生产它们的方法及它们的用途，包括来自葱头假单孢菌的氨基酸序列。在WO-A-89/09263和EP-A-218272（均属Gist-Brocades）中进一步给出了用rDNA技术生产的其它酯酶的实例。尽管有大量关于酯酶和其修饰物的公开文献，但迄今为止，仅发现来自Humicola Lanuginosa的酯酶具有广泛的商业应用，可作为商标名为Lipolase（TM）的洗涤产品的附加成分。

酯酶的一个特征是它们表现出界面活性，这意味着对已形成界面或胶束的底物的酶活性比完全溶解的底物高出很多。若底物浓度高于底物的临界胶束浓度（CMC），则由酯解活性的突然增加反映出界面活性，并形成界面。在酶活性对底物浓度的曲线图中，可通过实验观察到这种现象表现为不连续性。

已经从酯酶分子蛋白质结构构象的改变，解释了酯酶界面活性的机制。在游离的，未结合状态，螺旋形盖盖住了催化结合位点。结合到脂底物上后，代替了与盖的结合，催化位点暴露出来。也认为螺旋盖与脂界面相互作用，因此，使酶保持与界面的结合。

WO-A-92/05249（Novo Nordisk）公开了遗传工程方法修饰的酯酶（特别是来自Humicola Lanuginosa的酯酶），在脂接触区对其进行了修饰。在该申请中，将脂接触区定义为在活性结构中由螺旋形盖覆盖的表面。修饰涉及酯接触区中一个或多个氨基酸残基的缺失或取代，以便增加脂接触区的静电荷和/或降低脂接触区的疏水性，或者以便改变脂接触区的表面构型。通过缺失脂接触区中的一个或多个带负电荷的氨基酸残基，或者用中性或更多的带正电荷的氨基酸取代这些残基，和/或用带正电荷的氨基酸取代脂接触区中的一个或多个中性氨基酸残基，和/或缺失脂接触区中的一个或多个亲水的氨基酸残基，或用疏水氨基酸取代这些残基来达到上述目的。

角质酶是酶的一个亚类（EC3.1.1.50），蜡酯水解酶。这些酶能够降解角质（一种植物中产生的作为叶子和茎上保护性包被的酯化长链脂肪酸和脂肪醇网）。另外，它们具有一些脂解活性，即，它们能够水解甘油三酯。因此，认为它们是一种特殊的酯酶。但与酯酶相反，角质酶不表现出任何基本的界面活性。

可以从许多来源，如植物（花粉），细菌和真菌得到角质酶。由于它们的脂肪降解特性，已提出将角质酶作为酶洗涤剂组合物的成分。例如，WO-A-88/09367（Genencor）提出将一种表面活性剂和一种基本上纯的细菌角质酶组合起来以配制有效的清洗组合物。公开的是含有从克兰氏阴性菌恶臭假单孢菌ATCC53552得到的角质酶的洗涤剂组合物。然而，在最近的欧洲专利申请EP-A-476915（Clorox）中，它公开了相同的酶-将其称为脂酶-若按常规方法使用在从织物上除去油渍方面不比其它脂酶更有效。

最近，已确定了来自茄病镰孢的角质酶的三维结构（Martinez）等人，（1992）Nature 356，615-618）。发现该酶不具有覆盖催化结合位点的螺旋形盖。而活性位点丝氨基残基似乎能为溶剂接近。这些发现看起来可证实目前关于酯酶中介面活性机制的理论。

已将来自茄病镰孢的角质酶克隆并定序（Ettinger等人，（1987）Biochemistry 26，7883-7892）。WO-A-90/09446（Plant Genetics Systems）描述了该基因在大肠杆菌中的克隆和生产。在没有和存在角质酶与底物间界面的两种情况下，角质酶可有效催化含水或非水介质中酯的水解与合成。以其正常稳定性为基础上可用这种角质酶生产清洗剂如洗衣用洗涤剂和其它专门溶解脂肪的制品，如化妆品组合物和香波。既未公开以经济可行的途径生产该酶的方法，也没公开含角质酶的特定酶洗涤剂组合物。

由于该特性（即没有界面活性），对于本专利申请来说，我们将角质酶定义为基本上不表现界面活性的脂解酶。因此，角质酶与经典的脂酶不同，即它们没有覆盖催化结合位点的螺旋状盖。

如上文提到的，迄今为止，仅发现得自Humicola Lanuginosa的脂酶有广泛的商业应用，可作为商标名为Lipolase（TM）的洗涤产品的附加成分。在Chemistry和Industry（1990，page 183-186），Henrik Malmos在他的文章中提到已经知道，一般在洗涤过程中，脂酶的活性低，而且Lipolase（TM）也不例外。在干燥过程中，若织物的水含量减少，则酶会重新得到其活性并水解脂肪油渍。在接下去的洗涤过程中，除去水解的物质。这可以解释为什么在第一次洗涤过程中脂酶的作用低而在接下去的过程中作用明显。因此，仍需要在洗涤过程中表面出任何显著活性的脂解酶。

我们已发现角质酶（特别是来自茄病镰孢的角质酶）表现出明显的洗涤效果。然而，还需要具有改善的洗涤用脂解酶活性的角质酶和生产所述酶的方法。

本发明的目的是提供经过修饰以提高其性能，特别是它们的洗涤用脂解活性的角质酶。

我们现已惊奇地发现，通过修饰氨基酸序列，这样提高酶表面的疏水性，可以改善真核角质酶的特别是来自茄病镰孢，Colletotrichum Capsici，盘长孢状毛盘孢和Magnaporthe grisea的角质酶的脂解活性。

母体角质酶的角质酶变异体，其中已修饰过氨基酸序列，这样就提高了酶表面的疏水性。最好是，提高酶表面的疏水性以便形成扩大的脂接触区。

本发明涉及角质酶的变异体。按上文所讨论的，可从许多来源，如植物（如花粉），细菌和真菌获得角质酶。为了用重组DNA技术进行修饰，在本发明中用作母体角质酶或起始物质的角质酶选自真核的角质酶。真核角质酶可从各种来源获得，例如植物（如花粉），或真菌。

（真核的）真菌角质酶似乎含有具有不同特异性（叶-特异性和茎-特异性）的两个家族。具有叶-特异性的角质酶往往会有酸或中性最佳PH，而具有茎-特异性的角质酶往往会有碱性最佳PH。具有碱性最佳PH的角质酶更适用于碱合成的洗涤剂组合物如重垢织物洗涤粉和液体。具有酸性至中性最佳PH的角质酶更适用于轻垢织物或漂洗调理剂，而且适用于工业用清洗产品。

在下列表Ⅰ中，列出了具有茎-特异性的四种不同角质酶，以及它们的最佳PH。

表Ⅰ

具有茎-特异性的角质酶的实例最佳PH

茄病镰孢 9

玫瑰色镰孢 10

茄属丝核菌 8.5

甘蓝链格孢(PNBase I) 9

在本发明中特别优选的是从野生型茄病镰孢（Ettinger等人，1987）得到的角质酶。若用于特定的洗涤剂组合物，则这种角质酶表现出明显的“洗涤用”效果。

为了用重组DNA技术进行修饰，在本发明中适宜作母体角质酶或起始物质的是与来自茄病镰孢的角质酶有高度氨基酸序列同源性的角质酶。实例是来自Colletotrichum capsici，盘长孢状毛盘孢和Magnaporthe grisea。在图12中列出了这些角质酶的部分氨基酸并且可以看出有高度的同源性。

除通过修饰其基因改进茄病镰孢外，用从茄病镰孢得到的5′-和3′-DNA探针，编码（前）角质酶的Colletotrichum capsici，盘长孢状毛盘孢和Magnaporthe grisea cDNA和识别其它脂解酶中保守序列的探针可分离编码来自其它真核生物的角质酶的遗传信息，并且如果需要，通过聚合酶链反应或PCR技术（参见，例如WO-A-92/05249），用这些探针扩增从生产角质酶的真核细胞的信使RNA′s（mRNA′s）得到的cDNA′s。按标准方法，在大肠杆菌中克隆并表达角质酶编码基因后，在适当条件下，检测角质酶在（脂肪）污点除去方面的性能。用这样的方法，可以得到许多具有改善的洗涤用性能的，上述角质酶的天然变异体。此外，这些天然产生的角质酶的序列为进一步进行茄病镰孢角质酶的蛋白质工程提供了极好的基础。

在有关决定“洗涤用”脂解酶活性的因素的新观点及仔细观察茄病镰孢角质酶三维结构的基础上，我们已发现许多如何提高这种角质酶性能的可能性和一般用重组DNA技术得到的角质酶。

由于角质酶基本上不同于象Lipolase（TM）那样的脂酶，因此，角质酶底物（脂界面）间的相互作用所基于的原理也不同于可结合底物的疏水区，其盖打开和暴露的原理（Brzozowski等人，（1991）Nature 351，491-494）。

本发明指出，可以修饰角质酶，这样可以改善与底物的相互作用而不会在修饰的角质酶的表面上形成上述大的疏水区，使得角质酶分子开始聚集。可以通过导入疏水氨基酸象丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及甲硫氨酸并降低谷氨酸、谷氨酸胺和组氨酸的水平，如果这些氨基酸的疏水侧链不会被埋在角质酶的疏水核心中，则从而可增加疏水表面。一般不认为甲硫氨酸是疏水氨基酸。然而，若加到特定的位置上，在角质酶分子表面，甲硫氨酸可有效地起到提高疏水性的作用。

在某些情况下，发现除导入疏水氨基酸外，导入带电荷的氨基酸也有益于避免酶的聚集。令人惊奇地是，我们发现，若加到角质酶分子的特定位置，带正电荷的氨基酸象赖氨酸和精氨酸也能增加疏水表面面积。这限于赖氨酸和精氨酸中的亚甲基未埋在分子中的角质酶分子中的那些位置。用赖氨酸或精氨酸的优点是氨基-或亚氨基增加了暴露亚甲基并因此能够与脂相相互作用的可能性。

通常不认为赖氨酸和精氨酸是疏水氨基酸。然而，形成这些残基侧链的原子含有许多可以与脂相相互作用的原子（在亚甲基部分）。事实上，赖氨酸残基疏水部分的大小可以与缬氨酸残基的相比。

如果导入正电荷会对角质酶的其它内在特性产生副作用，那么通过在或靠近与脂相相互作用的角质酶分子部分的表面，导入平衡的负电荷或消除静电荷来抵消这种副作用。

观察活性位点周围，茄病镰孢角质酶表面的疏水性，发现这样的疏水性不是最佳的。为了使其得到提高，可以用更松散的疏水残基取代该区域中的特定氨基酸。

为了更好地理解脂解酶中结构和功能间的相互关系，我们仔细研究了许多所述酶的三维（3D）结构。在这些结构还未发表时，我们用分子模拟技术的方法推导出了其结构。

用X射线晶体学方法已经确定了Rhizomucor miehei脂酶的3D结构（Brady等人（1990）Nature 343，767-770，Brzozowski等人（1991）Nature 351，491-494，Derewenda等人（1992）Biochemistry 31，1532-1541）。活性位点Ser 144（属于Ser-His-Asp蛋白酶那样的催化三元素组）被埋在短的螺旋状盖下（残基85-91）。其活性位点Ser被埋的结构在下文将被称为酶的“关闭的”酶象。认为在油-水界面的吸附作用与螺旋状盖的运动有关。作为这种运动的结果，活性位点丝氨酸变成暴露的并增加了活性位点周围的疏水区。认为“开的”构象相当于在油-水界面吸附的活性酶。

已经将真菌Rhizomucor miehei“关闭”形式的Ca-等同物寄存在Brookhaven的Protein Data Bank。用完善的计算方法生产Rhizomucor miehei脂酶的全部蛋白质等同物（骨架和侧链）。用S.Wodak等人（1989），Protein Engineering 2，335-345）描述的计算方法，生产Rhizomucor miehei脂酶的粗起始模型。在SYBYL分子模型化软件包（TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri）提供了该方法。随后，通过使用在BIOSYM分子模型化软件包（BIOSYM，San Diego，California）中提供的能量最小化（EM）和分子动力学（MD）技术改进模型。在模型的EM和MD完善过程中，使用已知方法。同时按潜在能量功能和已知结构标准对模型作详细的能量最优化处理。通过如氢键的数量和质量，氢在二级结构单体中的结合模式，肽单位的方向，主链二面角的值，芳香基团的相反作用角及空腔的大小等标准评估模型的质量。此外，检查该模型不适当包埋的电荷，特别是暴露的疏水残基和能量方面二硫键不适当的位置。从Ponder & Richards旋转异构体库（Ponder等人，（1987）J.Mol.Biol 193，775-791）选择相关的侧链旋转异构体。来自该库的特定侧链旋转异构体的最终选择是以上述提到的结构标准评价为基础的。用MD将侧链原子退火到位。有关该模型结构与已知结构特性一致性的详细检测及优化结构特征的EM和MD计算使得可得到Rhizomucor miehei脂酶的可靠的全原子模型。用MD计算机模拟分析得到Rhzomucor miehei脂酶的“开”构象，其中将C₁₀-甘油三酯对接在脂酶的活性位点。与发表的开结构构象特征（Derewenda等人，Biochemistry（1992）31，1532-1541）作详细的比较发现，用这种方法得到的“开”构象的计算机模型是基本相同的。

从真菌Rhizomucor miehei脂酶的已知3D结构开始，通过使用SYBYL分子模拟软件包（TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri）的COMPOSER软件提供的法则为基础的可对比模拟技术得到Humicola Langinosa脂酶“开”和“关闭”的3D-结构。用与上述相同的计算方法改进得到的Humicola Lanuginosa脂酶模型。

通过比较真菌Rhizomucor miehei脂酶和Humicola Lanuginosa脂酶的三维（3D）结构，鉴定与底物吸附到酶上有关的脂酶分子部分。

从茄病镰孢角质酶的已知3D结构开始，通过使用SYBYL分子模拟软件包（TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri）的COMPOSER软件中提供的法则为基础的可对比模拟技术，得到盘长孢状毛盘孢角质酶的3D-结构。用与上述相同的计算方法，改进得到的盘长孢状毛盘孢角质酶模型。

从下列表Ⅱ中列出的脂解酶的三维结构，出乎意料地观察到人们可以定义一个特定的载体，该载体最小面积地覆盖茄病镰孢角质酶116到120残基的全部Ca-原子。该载体基本上垂直于与底物发生相互作用的表面。

从下列表Ⅱ，接着比较大量不同来源脂解酶的一级序列，来自茄病镰孢的角质酶的氨基酸残基116到120似乎位于具有很大程度功能同源性的区域。用脂解酶的一致序列Gly-（His/Tyr）-Ser-X-Gly可以指导排列。

表Ⅱ

Humicola Lanuginosa 脂酶 YRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGY

米赫毛霉脂酶 YDVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREE

人胰脂酶 SNVHVIGHSLGAHAAGEAGRRTVGTIG

镰刀菌属种的角质酶 ATLEAGGYSQGAALAAASIEDLDSAIR

盘长孢状毛盘孢角质酶 AAIVSGGYSQGTAVMAGSISGLSTTIK

因此，我们使用覆盖茄病镰孢角质酶中氨基酸残基116到120的载体以确定部分角质酶分子，其中应进行氨基酸修饰以使得到其有改善的洗涤用活性的角质酶。下列表Ⅲ给出了表Ⅱ中所示脂解酶所邻接的氨基酸的结构。

表Ⅲ

链链螺旋活性

位点

H.lanuginosa脂酶 138-141 142 ser*146 147-159 his258

米赫毛霉脂酶 136-139 (fit:140-ser*144) 145-157 his257

人胰脂酶 144-147 (fit:148-ser*152) 153-165 his263

镰刀菌角质酶 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188

盘长孢状毛盘 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188

孢角质酶

Ser^*=活性位点的丝氨酸

本发明一方面是提供一种具有改善的洗涤用脂解活性的修饰过的角质酶，其中修饰氨基酸的序列以提高该酶表面的疏水性。最好是提高邻近脂接触区的酶表面的疏水性以形成增大的脂接触区。

通过用选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和组氨酸的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，可达到提高角质酶表面疏水性的目的。优选的是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。

发现除以这样的方式修饰氨基酸序列有助于提高表面疏水性外，还可通过导入一个或多个赖氨酸或精氨酸残基来导入一个或多个正电荷。

最好是，修饰的残基位于由载体确定的分子部分，该载体最小面积覆盖茄病镰孢角质酶残基116到120的全部Ca-原子，或不同角质酶相应的Ca-原子，并水平垂直于所述载体，同时含残基117的Ca-原子，或不同角质酶相应的Ca-原子。

如上所述，已公开了茄病镰孢角质酶的三维结构。在那种情况下，应清楚修饰将会产生在本发明范围内的修饰物。假如还不知道特定角质酶的三维结构，然而，通过排列已知序列（见图12）的氨基酸序列，根据脂解酶的一致序列Gly-（His/Tyr）-Ser-X-Gly，可以得到在本发明范围内的修饰物。最好是，在该方法中也使用分子模拟技术。

按本发明生产的角质酶变异体，若用作洗涤剂或清洗组合物的成分，可在酶活性方面带来优越性。特别是，在洗涤过程的主要环节中，发现它们有改善的洗涤用性能。洗涤过程主要环节中的洗涤用性能，是指用正常的洗涤条件（就所关心的浓度、水的硬度、温度而言），在欧洲型自动洗衣机的单一洗涤过程中，含酶的洗涤剂组合物能够从弄脏的织物上除去显著量的油污。应注意到，在相同条件下，传统商业上可得到的脂解酶Lipolase（TM）（来自Novo Nordisk）对油污看起来没有任何显著的洗涤用效果。

用下列检测评估酶对油污的洗涤用效果。将棉含量低于10%的新聚酯试验品用无酶的洗涤剂产品（如下列给出的一种）预洗涤，随后彻底地漂洗。然后用橄榄油或另一种适宜的，可水解油污弄脏上述未脏的布。在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗涤液中温育每块试验品布（重约1g）。该洗涤液含有下列以每升1g的剂量给出的洗涤剂产品。在充满水的iele TMT洗衣机中，并使用正常的30℃主要洗涤步骤将瓶子搅拌30分钟，以3LU/ml将角质酶加到洗涤液中。对照组不含任何酶。洗衣粉有下列组分（以%重量计）：

乙氧化醇非离子表面活性剂 9.5

硫酸钠 38.6

碳酸钠 40.4

硅酸钠（Na₂O∶Si₂O＝2.4） 7.3

水 4.2

我们用C₁₂-C₁₅的乙氧化醇10.5-13EO作为非离子表面活性剂，但乙氧化醇非离子的天然物可在很宽的范围内变化。

洗涤后，用冷水彻底地漂洗布并在带冷空气的滚动干燥器中干燥，并估算残留的脂肪量。这可以由几种方法完成。普通方法是在Soxhlet提取装置中用石油醚提取布，蒸发掉溶剂并通过称重确定残余的脂肪物质占布上起初量脂肪部分的百分比。

按第二种，更灵敏的方法，用溴化了的橄榄油弄脏试验布（Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.（1868），Textile Research Journal 38，105-107）。然后将每一件试验布在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗涤液中温育。在充满中的洗衣机中并用常规的30℃主要洗涤步骤搅拌一系列瓶子。主要洗涤后，在5秒钟内，用冷水仔细漂洗试验品布。漂洗后即刻将试验布放在带冷空气的干燥机中干燥。干燥后，用X射线荧光光谱测定法，通过测量布的溴含量来确定残余的脂肪量。可将脂肪清除量确定为在布上开始存在的量的百分比，如下：

%污迹去除量＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ＊100%

其中：溴bw是指洗涤前布上的百分比溴，溴aw是洗涤后布上的百分比溴。

评估酶活性的另一种方法是按标准技术测量在460nm的反射度。

在本发明上下文中，修饰的、突变的或突变体酶或酶变异体是指经表达突变基因的突变生物生产的酶。突变基因（而不是仅含无症状突变的突变基因）是指编码一种酶的基因，该酶具有直接或间接得自相应母体酶序列，与相应的母体酶序列有一个或多个位置不同的氨基酸序列。母体酶指相应的未改变基因的基因产物。基因中的无症状突变是指（归因于密码子-氨基酸关系中多余度的）不会改变由该基因编码的酶的氨基酸序列的基因多核苷酸序列中产生的改变或差异。

突变体或突变的微生物是指一种母体微生物经受涉及其酶基因突变的微生物或者由经受涉及其酶基因突变的母体微生物转变而来的微生物。可通过（a）突变已存在于母体微生物中的相应基因（母本基因），或（b）转移（导入）直接或间接从其它来源得到的相应基因，并然后导入（包括基因的突变）到该微生物中使其变成突变微生物。宿主微生物是一种突变基因或其它来源的转移基因构成其一部分的微生物。一般，它可以是与母本微生物相同或不同菌株或种源或血缘的。

特别是，本发明提供WO-A-90/09446（Plant Genetics Systems）中公开的茄病镰孢角质酶，Colletotrichumcapsici，盘长孢状毛盘孢和Magnaporthe grisea角质酶的突变形式。通过rDNA修饰的含经rDNA技术得到或加工的基因的微生物，可以生产这些角质酶变异体。

一旦鉴定了位于由载体确定的分子部分的氨基酸残基，所述载体最小面积覆盖Fusarium solanipisi角质酶残基116到120的全部Ca-原子，或不同角质酶相应的Ca-原子，并水平垂直于所述载体且含有残基117的Cα-原子，或不同角质酶相应的Cα-原子，人们就可以通过在一个或多个鉴定的位置导入适宜的氨基酸从而修饰氨基酸序列，例如突变N712K涉及茄病镰孢角质酶或其同源物的序列。

上述修饰将会影响角质酶的结构，这对于专业人员是显而易见的。显然，优选的修饰是对活性位点周围的静电荷不会影响太多。本发明人已经研究了了解酶构象的必然扭曲与提高酶活性益处间平衡的必需水平，这样可以预测并生产具有高成功率的成功的角质酶。

在下列表Ⅳ和本说明书的其它部分，用下列一个字母和三个字母的缩写表示肽中的氨基酸和氨基酸残基：

表Ⅳ

A=Ala=丙氨酸 V=Val=缬氨酸

L=Leu=亮氨酸 I=ILe=异亮氨酸

P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸

W=Trp=色氨酸 M=Met=甲硫氨酸

G=Gly=甘氨酸 S=Ser=丝氨酸

T=Thr=苏氨酸 C=Cys=半胱氨酸

Y=Tyr=酪氨酸 N=Asn=天冬酰胺

Q=Gln=谷氨酰胺 D=Asp=天冬氨酸

E=Glu=谷氨酸 K=Lys=赖氨酸

R=Arg=精氨酸 H=His=组氨酸

在本说明书中，突变存在于蛋白质的氨基酸序列，因此，可以以下列简化的方式通过突变位置和突变性质描述突变体蛋白质本身：通过鉴定由突变影响的原氨基酸残基;突变位点（序列号）;通过鉴定代替原氨基酸残基的取代氨基酸残基。如果将一个额外的氨基酸插入到序列中，则用一个或多个脚注字母标明其位置，所述脚注字母附于标准序列或参考序列最后一个在前成员的序号上。

例如，将其特征在于172位由赖氨酸取代天冬酰胺的突变体表示为：Asn172Lys或N172K。将在天冬酰胺后（假设）插入的一个附加的氨基酸残基如脯氨酸表示为Asn172Asn Pro或N172NP，另一种表示为为＊172aP，插入的残基表示为位置号172a。将在相同位置天冬酰胺的（假设）缺失表示为Asn172＊功N172＊。星号表示在所标明位置缺失或丢失的氨基酸残基，或者将其看成由实际缺失或仅与在该位置有一个残基的另一个或参考序列比较引起的丢失或与之同源。

由加号将多突变分开，如，N172K+S541+A128F表示一种带有3个取代突变的突变体蛋白质，标明在氨基酸序列分别在这三个所提及的位置上的取代。如果需要，可将下列表中所给的突变结合起来。

下面所给的表Ⅴ表示根据本发明特定有用的角质酶变异体的实例，是以茄病镰孢角质酶的序列为基础的。

表Ⅴ

茄病镰孢角质酶的变异体

T19V、G41A、T45K、T45P、*149a、S54l、

N58R、G75R、A76P、G82A、D83S、A85F、

A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、

A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、

I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、

D194R、G197V、E201K。

按照本发明，优选的变异体是茄病镰孢

角质酶的A85F，N172K和E201K，以及其它角质酶相应的变异体。上述相应角质酶变异体的实例是来自盘长孢状毛盘孢角质酶的变异体Asp172Lys或D172K。

根据本发明的另一方面，提供生产本发明角质酶变异体的方法。产生天然角质酶的微生物一般是植物病原体，并且这些微生物不太适合作为修饰角质酶基因的宿主细胞。因此，将编码修饰的（前）角质酶的基因整合到rDNA载体中。可将该载体转移到对于rDNA技术优选的宿主微生物中。为了达到这一目的，可以使用与WO-A-90/09446中描述的rDNA载体基本相似的rDNA载体。

产生天然角质酶的微生物不太适合发酵方法。为了提高发酵过程的产率，应将编码改进的角质酶的基因转移到可在廉价的培养基上快速生长并能合成和分泌大量角质酶的微生物中。根据本发明，上述适宜的rDNA修饰的宿主微生物是细胞，连同其它一道的，芽孢菌、棒状杆菌、葡萄球菌和链霉菌，或低等真核生物，如啤酒酵母及有关的种，马克斯克鲁维氏酵母和相关的种，多形汉逊氏酵母和有关的种，以及曲霉菌属的种。优选的宿主微生物是低等真核生物，由于这些微生物在发酵过程中能够很好地生产并分泌酶并能够使角质酶分子糖基化。糖基化作用可以影响角质酶在洗涤剂系统中的稳定性。

本发明也提供通过将修饰的真核角质酶基因（如来自茄病镰孢的基因）导入克隆的rDNA载体而得到的遗传工程物质，以及它们转化新宿主细胞并在新宿主细胞中表达角质酶变异体基因的用途。

本发明也提供用rDNA技术生产或修饰的多核苷酸（它编码上述的角质酶变异体），含所述多核苷酸的rDNA载体，以及含所述多核苷酸和/或所述rDNA载体的rDNA修饰的微生物。本发明也提供编码修饰的真核角质酶的相应多核苷酸，例如，一种具有编码成熟角质酶变异体的碱基序列的多核苷酸，在多核苷酸中，在最后的转译密码子后接着终止密码子，并且可选择地直接在编码成熟角质酶变异体的核苷酸序列上游，有编码该角质酶变异体前原-或前-序列的核苷酸序列。

在上述多核苷酸中，可以修饰得自原生物的编码角质酶的核苷酸序列，以便将至少一个密码子，且最好是尽可能多的密码子加工成“无症状”突变的主体以形成编码相同氨基酸残基的密码子，并作为新宿主优选的密码子，由此提供在上述宿主细胞中使用的，用于改善稳定性的导入基因的信使-RNA。

在编码前-或成熟角质酶的核苷酸序列的上游，可安放一种编码适用于所选宿主的信号或分泌序列的核苷酸序列。因此，本发明的一个实施方案涉及将编码角质酶变异体或其前体的核苷酸序列插入于其中的rDNA载体。

核苷酸序列可以得自例如：

（a）一种天然产生的核苷酸序列（如，编码由茄病镰孢产生的前原-或前-角质酶的原氨基酸序列）;

（b）化学合成的核苷酸序列（由对于新宿主优选的密码子组子），和导致新宿主中稳定的信使RNA的核苷酸序列，还编码原氨基酸序列;

（c）得自前面段落a或b中提到的，编码茄病镰孢角质酶的核苷酸序列之一的遗传工程方法加工的核苷酸序列，它具有不同的氨基酸序列但在洗涤剂系统中有更好的稳定性和/或活性。

总之，在优选的宿主之一中，能直接表达编码上述角质酶基因的核苷酸序列的rDNA载体最好含有下列组分：

（a）编码成熟角质酶或前角质酶或相应的前角质酶的双链（ds）DNA，其中至少已将部分前序列直接从分泌信号（对于所选的宿主细胞是优选的）的下游除去。如果应被转译的基因部分未从密码子ATG开始，则应把ATG密码子放在前面。转译部分的基因应总是由适当的终止密码子来结束;

（b）一个表达调节子（适用于所选的宿主物），位于编码角质酶（组分（a））的dsDNA正链上游;

（c）一个终止序列（适用于所选的宿主生物），位于编码角质码（组分（a））的dsDNA的正链上游;

（d1）有利于整合到所选宿主基因组中的dsDNA的核苷酸序列或，

（d2）适用于所选宿主的复制原点;

（e1）选择性地（营养缺陷型）选择标记。营养缺陷型标记可以由营养缺陷型标记的编码区和缺损启动子组成;

（e2）可选择地，编码蛋白质的dsDNA序列，所述蛋白质涉及在所选的宿主中，角质酶前体形式之一的成熟和/或分泌。

上述rDNA载体还可携带（如前定义的多核苷酸的上游和/或下游）其它可促进角质酶功能表达的序列。营养缺陷型标记可以由营养缺陷型标记的编码区和缺损启动子区组成。

本发明的另一实施方案是发酵生产上述各种角质酶变异体中的一种。所述发酵可以是一般的间接发酵，分批加料发酵或连续发酵。所用的方法的选择取决于宿主菌株和优选的下游加工方法（已知的本身）。因此，本发明也提供用于生产本文所说明的角质酶变异体的方法，包括发酵培养一种rDNA修饰的微生物的步骤，该微生物含rDNA技术加工的基因，该基因携带至少一个影响角质酶氨基酸序列的突变，由于使该角质酶具有与相应母体酶相比改善的活性，通过从发酵液中分离由微生物生产的角质酶，或从发酵液中分离微生物细胞来制备角质酶变异体，破碎分离的细胞，用物理或化学浓缩或纯化方法从所述发酵液或所述细胞中浓缩或纯化角质酶变异体。选择优选的条件以便由微生物将角质酶变异体分泌到发酵液中，用过滤或离心除去细胞后，从发酵液中回收酶。可选择地，然后可将角质酶变异体浓缩并纯化至所需的程度。除微生物的特殊性质外，这些发酵方法本身可以是以已知的发酵技术和常规使用的发酵和下游加工设备为基础的。

本发明也提供用rDNA技术生产改变过的微生物的方法，该微生物能够生产角质酶变异体，其特征在于将导入微生物的编码角质酶变异体的基因连接在其5′-末端以得到一个编码（修饰的）前序列功能的基因片段作为宿主生物的信号-或-分泌序列。

根据本发明的另一方面，提供rDNA修饰的含角质酶变异体基因并能生产由所述基因编码角质酶变异体的微生物，在rDNA修饰的微生物中，最好除去（如，由另一个结构基因代替）编码天然角质酶的基因（如果原来存在）。

根据本发明的另一方面，提供含有本发明角质酶变异体的酶洗涤剂组合物。上述组合物由角质酶变异体和在洗涤剂系统中常用的其它组分（包括用于洗涤剂组合物和全配方洗涤剂和清洗组合物的附加成分，如已知本身种类和如在EP-A-258，068中描述的）。特别是，它们可含有5-60，最好是20-50%重的脱垢助洗剂和0.1-50%重的活性系统，依次含有0-95%重的一种或多各阴离子表面活性剂和5-100%重的一种或多种非离子表面活性剂。

上述洗涤剂组合物的其它组分可以是任何已知种类的，如GB-A-1，372，034（Unilever）;US-A-3，950，277;US-A-4，011，169;EP-A-179，533（Procter & Gamble）;EP-A-205，208和EP-A-206，390（Unilever）;JP-A-63-078000（1988）和1988.6月的Research Diclosure 29056，中所描述的，及本文提及的几个说明书中的每一种（所有文献均引入本文作为参考）。

可以以任何稳定的形式，即颗粒组合物酶溶液或淤浆，或与载体物质（如EP-A-258，068和Novo Nordisk Savinase（TM）和Lipolase（TM）产品中的）形式，将本发明的角质酶变异体可有效地加到洗涤剂组合物中。

可以在很宽的范围内选择角质酶变异体的加入量，如每克10-20，000LU，且最好是每克洗涤剂组合物50-2，000LU。

在本说明书中，LU或脂酶单位按它们在EP-A-258，068（Novo Nordisk）中所定义的。

在其它酶也可以是现存的情况下，在细节上已作必要修正时，相似考虑可以应用。同样参见欧洲专利申请EP-A-407，225。

在蛋白酶与角质酶一起存在的上述洗涤剂组合物中，可得到更多的益处，从pl低于10的蛋白酶中选择上述蛋白酶。EP-A-271，154（Unilever）描述了大量这样的蛋白酶。在特定环境下，与角质酶一起使用的蛋白酶可包括文献中所公开的如BPN′型或许多类型的枯草杆菌蛋白酶，其中一部分已用于洗涤剂用途，如EP-A-130，756或EP-A-251，446（两者均属Genetech）;US-A-4，760，025（Genencor）;EP-A-214，435（Henkel）;WO-A-87/04661（Amgen）;WO-A-87/05050（Genex）;Thomas等人（1986/5）Nature 316，375-376和（1987）J.Mol.Biol.193，803-813;Russel等人（1987）Nature 328，496-500中描述的突变体蛋白酶。

现在用下列实施例进一步说明本发明，除另外说明外，基本上按Sambrook等人（1989）的描述完成用于操作和分析核酸物质的所有技术。

附图：

图1A：合成的茄病镰孢角质酶基因盒1与构成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中标明了寡核苷酸碱基转换。小写字母表示开放阅读框架外的核苷酸位置。

图1B：合成的茄病镰孢角质酶基因盒2和构成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中标明了寡核苷酸的碱基转换。

图1C：合成的茄病镰孢角质酶基因盒3和构成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中标明了寡核苷酸的碱基转换

图1D：编码茄病镰孢前-原-角质酶的合成的角质酶基因的核苷酸序列。标明了角质酶的前-序列，原-序列和成熟序列。也标明了用于克隆和寡核苷酸碱基转换的位点，小写字母指开放阅读框架外的核苷酸位置。

图2：合成的DNA片段的核苷酸序列，用于连接茄病镰孢原-角质酶编码序列与编码大肠杆菌phoA前-序列衍生物的序列。标明了核糖体结合位点（RBS）和用克隆的限制酶位点。用一个字母密码也标明可被编码的phoA信号序列的氨基酸序列和部分角质酶基因。

图3：盒8的核苷酸序列，SacⅠ-BclⅠ片段编码有关蔗糖酶前-序列编码序列和成熟茄病镰孢角质酶的融合点。

图4：通过从pUR2740缺失一个0.2kb SalⅠ-NruⅠ得到的质粒pUR2741是一个大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，含有部分pBR322，从2μm质粒得到的酵母细胞中的复制原点，一个酵母leu 2D基因及在酵母ga17启动子控制下的酵母蔗糖酶信号序列编码区与植物α-半乳糖苷酶基因的融合。

图5：质粒pUR7219是大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，含有部分pBR322，从2μm质粒中得到的酵母细胞中的复制原点，一个酵母Leu2D基因及在酵母ga17启动子控制下的酵母蔗糖酶信号序列编码区与编码成熟茄病镰孢角质酶的区域的融合。

图6：质粒pUR2740是一种大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，含有部分pBR322，从2μm质粒得到的酵母细胞中的复制原点，一个酵母Leu2D基因及在酵母ga17启动子控制下的酵母蔗糖酶信号序列编码区与植物α-半乳糖苷酶基因的融合。

图7：盒5，6和7核苷酸序列，含有ex1A前一序列和成熟茄病镰孢角质酶编码序列的不同类型的接头。

图8：通过在pUC19的SalⅠ位点插入黑色曲霉awamori变种基因组DNA的5.3kbSalⅠ片段得到的质粒pAW14B。

图9：通过用BspHⅠ-AflⅡ片段代替含有ex1A开放阅读框架的BspHⅠ-AflⅡ片段得到的质粒pUR7280，含有茄病镰孢前-原-角质酶编码序列。因此，质粒pUR7280含有在黑色曲霉awamori变种启动子和终止子控制下的茄病镰孢前-原-角质酶基因。

图10：通过将黑色曲霉amds和黑色曲霉awamori变种pyrG选择标记导入pUR7280而得到的质粒pUR7281。

图11：Fusarium solani pisi角质酶分子的示意图

图12：Fusarium solani pisi Colletotrichum capsici盘长孢状毛盘孢和Magnaporthe grisea角质酶的部分氨基酸序列，表明了在3-D结构中，残基的位置。

图13：茄病镰孢角质酶和角质酶变异体N172K的洗涤用效果。

图14：茄病镰孢角质酶和角质酶变异体E201K的洗涤用效果。

图15：茄病镰孢角质酶和角质酶咳A85F的洗涤用效果。

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实施例1;

构建编码茄病镰孢前-原-角质酶的合成基因。

基本上按EP-A-407225（Unilever）中的描述构建编码茄病镰孢前-原-角质酶的合成基因。以公开的茄病镰孢基的核苷酸序列（Soliday等人，（1984）和WO-A90/09446，Plant Genetic Systems）为基础，设计一个完全的合成DNA片段，它含有编码茄病镰孢前-原-角质酶多肽的区域。与原始的茄病镰孢基因序列相比，通过该基因内适当的位置导入限制酶识别位点而不影响被编码的氨基酸序列，该合成的角质酶基因含有几个核苷酸的变化。在图1D中展现了完整合成角质酶基因的核苷酸序列。

从合成的DNA寡核苷酸开始，通过组合三个单独的盒，完成合成角质酶基因的构建。将每个合成DNA盒在起始端加上一个EcoRⅠ位点，在末端加一个HindⅢ位点。用Applied Biosystems 380A DNA合成仪合成寡核苷酸并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。为了构建每个盒，接着用下列概述的方法。将构成一个所给定盒的等摩尔量（50pmol）寡核苷酸混合，在其5′-末端磷酸化，退火并按标准技术连接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割所得的双链DNA混合物，用琼脂糖凝胶电泳按大小分级分离，并用电洗脱从凝胶中回收。将所得的合成DNA盒与PUC9的2.7kbEcoRⅠ-HindⅢ片段连接并转化大肠杆菌。用适宜的寡核苷酸引物以两个方向对大量克隆的EcoRⅠ-HindⅢ插入物作完全定序以确定合成盒的序列。用这种方法，构建pUR7207（合盒1，图1A），pUR7208（合盒2，图1B）和pUR7209（含盒3，图1C）。最后，通过将pUR7207的2.9kbEcoRⅠ-ApaⅠ片段与pUR7208的0.2kbApaⅠ-NheⅠ片段和pUR7209的0.3kbNheⅠ-HindⅢ片段结合在一起产生pUR7210，组成合成角质酶基因。该质粒含有一个编码完整茄病镰孢前-原-角质酶的开放阅读框架（图1D）。

实施例2

在大肠杆菌中表达茄病镰孢（原）角质酶

用合成的角质酶基因构建大肠杆菌表达载体，其与WO-A-90/09446（Plant Genetic Systems）中描述的一种功能上相似。设计一个构建体，其中适当的大肠杆菌表达信号在编码茄病镰孢原-角质酶的合成基因部分之前，这些信号即，（ⅰ）一个可诱导的启动子，（ⅱ）一个核糖体结合位点和（ⅲ）一个信号序列，该序列提供转译起始信密码子并提供将原-角质酶运出胞质膜所需的信息。

设计一个合成连接子（见图2）以便将大肠杆菌phoA信号序列（Michaelis等人，1983）的衍生物与合成角质酶基因的原序列融合。为了使信号肽的断裂及原-角质酶的分泌达到最佳水平，所述接头的核苷酸序列便于将该连接子核苷酸序列phoA信号序列的3个C-末端氨基酸残基（Thr-Lys-Ala）变成Ala-Asn-Ala并将角质酶原序列的N-末端氨基酸残基（Leu1，见图1D）变成Ala。该构建确保将角质酶分泌到外周胞质空间（参见WO-A90/09446，Plant Genetic Systems）。

为了得到上述构建体，从pUR7210中除去含角质酶前-序列和部分原-序列的69bpEcoRⅠ-SpeⅠ片段并用合成的DNA连接子序列（EcoRⅠ-SpeⅠ片段）代替，该连接子序列提供大肠杆菌phoA前序列的衍生物以及角质酶原-序列的改变的N-末端氨基酸残基（图2）。将所得的质粒命名为pUR7250并将其用于0.7kbBamHⅠ-HindⅢ片段的分离，该片段含一个核糖体结合位点和与phoA信号序列编码区融合的原-角质酶编码区。将该片段与pMMB67EH（Fürste等人，1986）的8.9kb BamHⅠ-HindⅢ片段连接以得到pUR7220。在该质粒中将编码原-角质酶的合成基因与

phoA信号序列的改变的变体融合，并置于可诱导的tac-启动子的控制下。

在2升含0.5升ⅨTB培养基（Tartof和Hobbs，1988）的摇瓶中生长含pUR7220的大肠杆菌菌株WK6，ⅨTB培养基由下列组成：

0.017MKH₂PO₄

0.017MK₂HPO₄

12g/1Bacto-胰蛋白胨

24g/1Bacto-酵母提取物

0.4%甘油（V/V）

在剧烈的振荡（150rpm）下，在存在100μg/ml氨苄青霉素的情况下，使培养物于25℃-30℃生长过夜至610nm处OD值为10-12。然后，将IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷）加到10μm的终浓度，并继续温育另一个12-16小时。当可观察到生产的脂解活性量没有进一步显著增加（通过分析从培养物取出的样品来判断）时，通过离心收集细胞，并于0℃将其再悬于原培养体积的含20%蔗糖的缓冲液中。通过离心收集细胞，并将其再悬于原培养体积的冰冷水中，通过渗透休克溶解细胞。通过离心除去细胞碎片，用乙酸将无细胞提取物酸化至PH4.8，于4℃过夜，除去所得的沉淀。通过超滤及冷冻干燥无细胞提取物，在该步可得到基本上没有外源脂酶，纯度大于75%的角质酶制品。另外，通过将酸化的细胞游离提取物负载到SP-sephadex，用PH8.0的缓冲液洗脱酶，浓缩碱溶液通过一个适宜的DEAE-纤维素（Whatman DE-52）柱并直接使DEAE流到Q-sepharose HP（Pharmacia）柱，可将角质酶纯化到匀质（即，纯度大于95%）。用盐梯度洗脱得到一般总产率大于75%的匀质角质酶制品。

实施例3

构建编码茄病镰孢角质酶变异体的基因

用实施例1中描述的茄病镰孢前-原-角质酶的合成基因，构建被编码的氨基酸序列中有改变的变异体基因。为了完成该构建，使用与实施例1中描述的基本相同的方法构建组成完全合成角质酶基因的三个盒。例如，用与实施例1中描述的相同的寡核苷酸（除覆盖被诱变位置（即，Asn 172）的编码三联体的两个寡核苷酸不同外），通过装配一种新型的盒3来构建编码茄病镰孢角质酶变异体N172K的基因。而使用两个含突变序列的新的合成寡核苷酸，但在其它方面与它们取代的原寡核苷酸相同。特别是，通过掺入CUT13DMH变异体（含AAG代替AAT）和CUT13KMH变异体（含CTT代替ATT）代替CUT13DMH和CUT13KMH（见图1C），装配含突变N172K的新盒3。基本上按实施1所述克隆并定序新盒3，并将含突变的0.3kb NheⅠ-HindⅢ DNA片段换成pUR7210中的相应片段，得到pUR7257（N172K）。用来自该质粒的0.6KSpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR7220中相应片段，得到大肠杆菌表达质粒pUR7224（N172K）。用该大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌菌株WK6。按实施例2中的描述使转化体生长，并基本按实施例2中的描述回收并纯化变异体原-角质酶。

以类似的方法，通过掺入CUT13FMH变异体（含AAG代替GAG）和CUT13MMH变异体（含CTT代替CTC）代替CUT13FMH和CUT13MMH（见图1C）组建一种新的盒3，从而构建编码茄病镰孢角质酶变异体E201K的基因。

以类似的方法，通过掺入CUT12CMH变异体（含TTC代替GCT）和CUT121MH变异体（含GAA代替AGC）代替CUT12CMH和CUT121MH（见图1B）组建新的盒2，从而构建编码茄病镰孢，角质酶变异体A85F的基因。

实施例4

在啤酒酵母中表达茄病镰孢角质酶

为了在啤酒酵母中表达合成的茄病镰孢角质酶基因，构建一个表达载体，其中啤酒酵母蔗糖酶（Taussig和Carlsson，1983）的前序列和强的，可诱导ga17启动子（Nogi和Fukasawa，1983）在编码成熟角质酶的合成基因之前。为了制备有关上述融合的合成角质酶基因，合成一个衔接头片段，其中将有关蔗糖酶前序列的编码区与编码成熟角质酶N-末端的序列融合。基本上按实施例1中的描述（盒8，见图3），将该片段在pUC9中组合成EcoRⅠ-HindⅢ盒，得到pUR7217。将质粒pUR7210和pUR7217转化到大肠杆菌JM110（一种没有母本甲基酶活性的菌株）中，并将pUR7217的2.8kbBclⅠ-HindⅢ片段与pUR7210的0.6kbBclⅠ-HindⅢ片段连接，产生pUR7218，其中将编码成熟酶肽的核苷酸序列与部分啤酒酵母蔗糖酶前序列编码区融合。

通过分离pUR2740的8.9kb NruⅠ-SalⅠ片段，用klenow聚合酶填平SalⅠ延伸的末端，并使片段再环化，从而从pUR2740（Verbakel，1991，见图6）制得表达载体pUR2741（见图4）。将pUR2741的7.3kbSacⅠ-HindⅢ片段与pUR7218的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段连接，得到pUR7219（见图5）。可选择地，将啤酒酵母polⅡ终止子放在角质酶基因后，HindⅢ位点中，证明它对于角质酶基因的有效表达不是必需的。大肠杆菌-啤酒酵母穿梭质粒PUR7219含有于携带2μ质粒的啤酒酵母菌株（Cir⁺菌株）中起作用的复制原点，使得可选择啤酒酵母leu2^-菌株中高拷贝量转化体的启动子-缺陷性的啤酒酵母leu2基因，在强的，可诱导啤酒酵母ga17启动子调控下的与啤酒酵母蔗糖酶前-序列相连的编码成熟部分茄病镰孢角质酶的合成基因。

用有关酵母细胞电穿孔的标准方法，用2μ啤酒酵母质粒和pUR7219的等摩尔混合物共转化与菌株YT6-2-1L（Erhart和Hollenberg，1981）相同的啤酒酵母菌株SU50（a，cir，Leu2，his4，can1）。筛选亮氨酸原养型转化体，并从许多转化体中分离总DNA。所有转化体似乎均含2μ质粒和pUR7219，例证为，由于同时存在2μ酵母质粒，所以若存在高拷贝数时，pUR7219所含的启动子-缺陷型Leu2基因可仅能从功能补充Leu2缺陷型菌株。通过在完全培养基上培养40代，接着在选择和完全固体培养基上影印培养，得到啤酒酵母菌株SU51（a，Cir⁺，leu2，his4，can1）。而一个转化体稳定地含有pUR7219质粒。

使含pUR7219的啤酒酵母菌株SU51在含0.2升MM培养基的1升摇瓶中生长，MM培养基由下列组成：

-没有氨基酸的酵母氮成分（YNB） 6.7g/l

-组氨酸 20mg/l

-葡萄糖 20g/l

使培养物在剧烈振荡（150rpm）下。于30℃生长过夜到610nm的OD值为2-4。离心收集细胞并将其再悬于2升摇瓶中的1升YPGAL培养基，YPGAL培养基有下列组成：

-酵母提取物 10g/l

-细菌用蛋白胨 20g/l

-半乳糖 50g/l

并继续再培养12-16小时。以有规律时间间隔从培养中取出样品并离心以除去生物质。用橄榄油作为底物，通过效价滴定检测，分析上清液的角质酶活性。对于每个样品，将100到200μl间的滤液加到5.0ml脂酶底物（Sigma，含作为脂酶底物的橄榄油）和25.0ml缓冲液（5mM Tris-HCl pH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl₂）的搅拌混合物中。在30℃完成检测，并使用Mettler DL25滴定仪，通过用0.05M NaOH自动滴定到pH9.0，来测量脂肪酸的释放。得到对时间的滴定剂量曲线。从曲线的最大斜率计算样品中所含的脂酶量。将1个单位的酶活性定义为在上述定义的条件下，1分钟内从橄榄油释放1μmol脂肪酸的酶量。上述测定法是本领域专业人员熟知的。

当角质酶活性不再提高时，通过离心除去细胞，用乙酸将无细胞提取物酸化至pH4.8，并按实施例1描述回收角质酶。

实施例5

在啤酒酵母中表达茄病镰孢角质酶变异体

以下列方式，在啤酒酵母中表达茄病镰孢角质酶的变异体N176k。用pUR7257（N172K）的0.5kb ApaⅠ-HindⅢ片段代替pUR7218的类似片段，得到pUR7228（N172K），其中将含突变的该基因与编码啤酒酵母信号序列的序列进行可操作的融合，将pUR2741的7.0kbSacⅠ-HindⅢ片段与pUR7228（N172K）的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段连接，得到pUR7234（N172K）。用该质粒转化啤酒酵母菌株SU51。按实施例4中的描述培养所得的转化体，并按实施例4和1中的描述，从培养液中回收生产的变异体酶。

按实施例3中的描述，用编码角质酶变异体E201K的茄病镰孢基因变异体以相同的方式在啤酒酵母中生产茄病镰孢角质酶变异体E201K。

按实施例3中的描述，用编码角质酶变异体A85F的茄病镰孢角质酶基因变异体以相同的方式，在啤酒酵母中生产茄病镰孢pisi角质酶变异体A85F。

实施例6

在曲霉菌中表达茄病镰孢角质酶

为了在黑色曲霉awamori变种中表达合成的茄病镰孢角质酶基因，构建一个表达形体，其中将编码茄病镰孢前-原-角质酶的合成基因置于黑色曲霉awamori变种强的，可诱导exlA启动子（Maat等人，1992，de Graaff等人，1992）的控制下。

从质粒pAW14B开始构建前-原-角质酶表达质粒（pUR7280），pAW14B于1990.5.31保藏在大肠杆菌菌株JM109中，寄存于Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherland，保藏号为No CBS237.90，该质粒含有在其上定位了一个0.7kb内切木聚糖酶Ⅱ（exlA）基因的约5.3kbSaLⅠ片段，及2.5kb的5′-侧序列和2.3kb的3′-侧序列（图8）。在pAW14B中，用前-原角质酶编码区代替exlA编码区。含有ex1A基因第一密码子（ATG）的BspHⅠ位点（5′-TCATGA-3′）和含有ex1A基因终止密码子（TAA）的AflⅡ位点（5′-CTTAAG-3′）有利于pUR7280的构建。

按如下完成构建：用BspHⅠ部分切割pAW14B（7.9kb）并从琼脂糖凝胶中分离线性化的质粒（7.9kb）。随后，用BsmⅠ切割分离的7.9kb片段，切割所需BspHⅠ位点下游的少数核苷酸，以除去在其它BspHⅠ位点线性化的质粒，在琼脂糖凝胶上分离开片段，并分离7.9kbBspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割该片段，并分离得到的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段。

将含有编码茄病镰孢前-原-角质酶的完整开放阅读框架的pUR7310的0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段与pAW14B的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段连接，得到pUR7280。随后，可将构建的载体（pUR7280）用常规的共转化技术转移到霉菌（如黑色曲霉，黑色曲霉awamori变种，等）中，并然后经内切木聚糖酶启动子的诱导而表达前-原-角质酶基因。也可以经构建的rDNA载体提供常规的选择标记（如amds或pyrG，潮霉素，等）并用所得的rDNA载体转化霉菌以生产所需的蛋白质。作为一个实施例，将amds和pyrG选择标记导入表达载体，得到pUR7281（图10）。为了达到该目的，用合成的寡核苷酸（5′-AATTGCGGCCGC-3′）通过将EcoRⅠ位点（存在于前-原-角质酶基因ATG密码子上游的1.2kb）变成NotⅠ位点，产生NotⅠ位点，得到pUR7282。给含有完整构巢曲霉amds基因和黑色曲霉awamori变种pyrG基因以及它们各自的启动子和终止子的适当DNA片段提供位于侧面的NotⅠ位点，并将其导入pUR7282的NotⅠ位点，得到pUR7281（图10）。

作为在黑色曲霉awamori变种中表达合成的茄病镰孢角质酶基因的另一种方法，构建表达载体，其中不是成熟角质酶自己的前-原-序列而是黑色曲霉awamori变种exlA的前-序列，在编码成熟角质酶的合成基因之前。

为了制备上述融合体的合成角质酶基因，合成几个衔接子片段，其中，以不同的方式，将exlA前-序列的编码序列与编码成熟角质酶N-末端的序列相连。在盒5中，这种连接是通过将exlA前-序列与角质酶的前-序列融合而完成的。在盒6中，将exlA前-序列与成熟角质酶的N-末端残基融合。盒7与盒6相同，但为了更好地满足裂解信号肽的需要，将被编码的成熟角质酶多肽的N-末端残基从原来的甘氨酸变成丝氨酸。基本按实施例1中的描述从合成的寡核苷酸组合盒5、6和7（见图7）。用盒5代替pUR7210的0.1kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，得到pUR7287。分别用盒6和7代替pUR7210的0.1kbEcoRⅠ-BclⅠ片段，得到pUR7288和pUR7289，分别将0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段与pAW14B的7.2kb BspHⅠ-AflⅡ片段连接，得到pUR7290，pUR7291，pUR7292。

随后，用常规的共转化技术，将构建的rDNA载体转移到霉菌（黑色曲霉，黑色曲霉awamori变种）中并通过诱导内切木聚糖酶Ⅱ启动子表达前-（原）-角质酶基因。也可给构建的rDNA载体提供常规的选择标记（如amds或pyrG，潮霉素）并可用所得的rDNA载体转化霉菌以生产所需的蛋白质，如在有关pUR7280（见上文）的实施例中说明的那样。

使用表达载体pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7292的任一个（含有在黑色曲霉awamori变种exlA启动子和终止子控制下的带有或不带相应的原-序列的茄病镰孢成熟角质酶编码区及或者角质酶信号序列或者exlA信号序列）转化的曲霉菌株在下列条件下生长：用孢子（终浓度：10E6/ml）接种多个含400ml合成培养基（pH6.5）的1升摇瓶。该培养有下列组合物（AW培养基）：

蔗糖 10g/l

NaNO₃6.0g/l

KCl 0.52g/l

KH₂PO₄1.52g/l

MgSO₄·7H₂O 0.49g/l

酵母提取物 1.0g/l

ZnSO₄·7H₂O 22mg/l

H₃BO₃11mg/l

MnCl₂·4H₂O 5mg/l

FeSO₄·4H₂O 5mg/l

CaCl₂·6H₂O 1.7mg/l

CuSO₄·5H₂O 1.6mg/l

NaH₂MoO₄·2H₂O 1.5mg/l

Na₂EDTA 50mg/l

在MK X恒温箱振荡器中，于30℃，以200rpm温育24小时。生长后，过滤（0.45μm滤器）收集细胞，用没有蔗糖和酵母提取物的AW培养基（盐溶液）洗涤两次，再悬于50ml盐溶液并转移至含50ml盐溶液的300ml摇瓶中，向该盐溶液中加入木糖至10g/l的终浓度（诱导培养基）。按与上述相同的条件继续培养过夜。通过miracloth过滤所得的培养物以除去生物质并基本按实施例2中的描述回收角质酶。

实施例7

在曲霉菌中表达茄病镰孢角质酶变异体。

基本上按照实施例6中描述的途径，但现在用pUR7257（N172K）代替pUR7210构建真菌表达载体，在黑色曲霉awamori变种中生产含有突变N172K的茄病镰孢角质酶变异体。

实施例8

鉴别并分离与茄病镰孢角质酶基因有关的基因

从不同的真菌中分离编码角质酶的基因，所述角质酶与茄病镰孢角质酶有不同程度的同源性。使真菌培养物在500ml摇瓶中生长，该摇瓶含Hankin和Kolattukudy（1968）描述的，用0.25%葡萄糖补充的培养基，并在MKX恒温器振荡器（100rpm）中于28℃培养4天。此时，葡萄糖已被消耗掉，并基本按Ettinger等人的描述（1987），通过加入角质素水解产物诱导角质酶生产。从培养物中以有规律的间隔取出样品，并按标准技术分析脂解活性的存在（见实施例4）。正常地，诱导后约两天后，可以证明脂解活性，此时，用标准技术过滤收集细胞。洗涤菌丝体，将其冷冻在液氮中，并按标准技术冻干。基本按Sambrook等人的描述（1989）用硫氰酸胍法分离总细胞RNA制品，并用氯化铯密度梯度离心纯化。用PolyAT束mRNA分离盒（Promga）分离polyA（+）mRNA部分。按标准技术，用茄病镰孢角质酶基因的cDNA片段作探针，将polyA（+）mRNA部分用于Northern杂交分析以确定角质酶-有关的基因的表达。按供应商的说明用ZAP cDNA合成盒（Stratagene，La Jolla）对含有能与探针杂交的物质的mRNA制品作cDNA分析，产生的cDNA片段带有位于poly-A区侧面的XhoⅠ粘性末端并在另一末端有一个EcoRⅠ接头。通过在λZAPⅡ载体（Stratagene，La Jolla）中以意义方法直接克隆，用获得的cDNA片段构建表达文库，使得表达β-半乳糖苷酶融合蛋白（Huse等人，1988）。用抗茄病镰孢角质酶抗血清筛选这些文库。

另外，用角质酶特异的引物（见表2），使合成的cDNA部分经PCR-筛选。这些引物得自数种真菌角质酶基因（Ettinger等人，1987）的氨基酸序列的比较。选择对每套引物最佳的PCR反应条件，用茄病镰孢角质酶作对照。在相同的条件下，可以用与由茄病镰孢角质酶的cDNA产生的PCR片段长度相似的（或远大于之）的长度，生产具有特异PCR片段的cDNA的这些制品，用凝胶电泳纯化PCR片段并从凝胶上分离。

作为另一种方法，也可将使用角质酶特异性引物的PCR筛选技术直接用于一些真菌菌株的基因组DNA，用茄病镰孢的基因组DNA作正对照。在相同条件下，可以用与由茄病镰孢角质酶的cDNA产生的PCR长度相似的（或远大于之的）长度，生产具有特异PCR片段的cDNA的这些制品，用凝胶电泳法纯化PCR片段并从凝胶上分离。

对于在表达文库法或PCR筛选法（用cDNA或基因组DNA）中标为阳性的菌株以及大量其它菌株，分离高分子量的基因组DNA。基本按Ettinger等人的描述（1987）使菌株生长，并按Graaff等人的描述（1988）分离基因组DNA。用各种限制酶消化基因组DNA，用类似的cDNA插入片段（表达文库法）或PCR片段（PCR筛选法）或茄病镰孢角质酶基因（其它菌株）作探针，用Southern杂交分析，并构建角质酶基因的物理图谱。经凝胶电泳将适当消化的基因组DNA按大小分级分离，并从凝胶上分离适当大小的片段，并亚克隆在pUC19中。用相应的cDNA插入片段（表达文库）或PCR片段（PCR筛选法）筛选这些基因组文库，得到含有角质酶基因的基因组拷贝的克隆。将这些基因以两个方向定序。通过测定相应的cDNA序列或与其它角质酶序列（Ettinger等人，1987）比较，鉴别内含子。也可从上述比较推测成熟角质酶多肽的N-末端。用标准PCR技术，除去内含子，立即用遗传工程方法将HindⅢ位点加到开放阅读框架的下游，并将啤酒酵母蔗糖酶基因（SacⅠ位点在其之前，比较盒8，图3）前序列的编码序列与编码成熟角质酶N-末端的序列融合。将得到的含有（与编码啤酒酵母蔗糖酶前-序列的序列可操作相连的）角质酶基因的SacⅠ-HindⅢ片段与pUR7241的7.3kb SacⅠ-HindⅢ片段（见图4）相连并转化啤酒酵母菌株SU51。基本按实施例4中的描述，表达真菌角质酶并从将其从培养液中回收。

实施例9

茄病镰孢角质酶变异体N172K的洗涤用活性

将角质酶变异体N172K的除脂肪效果与野生型茄病镰孢角质酶的作比较。在检测中，用经溴化了的橄榄油弄脏的聚酯检测布作为检验物。用X射线荧光光谱测定法，通过测量检测布上的溴量，确定检测布上的脂肪量。

在以下几种实验条件下，以3LU/ml的剂量确定野生型茄病镰孢角质酶（WT）和N172K变异体的酶促去除污垢量：

去污（％）WT	去污（％）N172K	温度（℃）	洗涤剂产品	水硬度（FH）
					4.9	10.1	40	A(lg/l)	6
1.6	6.7	40	B(2g/l)	6
					20.2	24.6	40	C(2g/l)	27
13.2	13.4	40	B(lg/l)	27
					30.8	40.6	30	C(2g/l)	27
17.4	22.4	30	B(2g/l)	27

洗涤剂产品A-C的组分（以%重量计）如下

产品A

化合物	重量％
		非离子表面活性剂C₁₂－C₁₅醇的10.5-13EO	9.5
硫酸钠	38.6
		碳酸钠	40.4
硅酸钠（Na₂O:si₂O=2.4）	7.3
		水	4.2

产品B

化合物	重量%
		DOBS	6.4
皂	1.7
		Synperonic A7	3.0
沸石	43
		SokolanCP7	9.9
水玻璃	1.2
		CMC钠	0.77
碳酸钠	10.16
		NaOH	2.6
水	到100%

产品C

化合物	重量%
		可可伯烷基硫酸盐	5.2
非离子表面活性剂C₁₂-C₁₅醇的7EO	5.2
		非离子表面活性剂C₁₂-C₁₅醇的3EO	6.6
硫酸钠	0.45
		沸石 4A	32.00
碳酸钠	11.52
		硬脂皂	2.00

在各种洗涤条件下，有关野生型茄病镰孢角质酶洗涤用性能（清除油污）的增强是明显的。图13表示用2g/l洗涤剂产品C在30℃，27°FH，洗涤30分钟后，各种酶浓度的洗涤用性能。

为了比较，也用Lipolase（TM）完成相同的实验。在所有情况下，角质酶变异体N172K是最好的。

实施例12

茄病镰孢变异体E201K的洗涤用活性。

用2g/l洗涤剂产品C（见实施例11）在30℃，27°FH，洗涤30分钟后，将各种酶浓度角质酶变异体E201K的脂肪清除效果与野生型茄病镰孢角质酶的效果作比较。在检测中，用由溴化了的橄榄油弄脏的聚酯检测布作检验物。用X射线荧光光谱测定法通过测量检测布上的溴量，确定检测布上的脂肪量（见上文描述）。

所得的结果列于图14。有关野生型茄病镰孢角质酶洗涤用性能（油污清除）的增强是明显的。为了比较，用Lipolase（TM）完成相同的实验。发现E201K角质酶变异体的性能明显地好。

实施例13

茄病镰孢变异体A85F的洗涤用活性。

用2g/l洗涤剂产品C（见实施例11），在30℃，27°FH洗涤30分钟后，将各种酶浓度角质酶变异体A85F的脂肪清除效果与野生型茄病镰孢角质酶的比较。在检测中，用由溴化了的橄榄油弄脏的聚酯检测衣服作检测物。用X射线荧光光谱测定法，通过测量检测布上的溴量，确定检测布上的脂肪量（如上文所述）。

结果列于图15。有关野生型茄病镰孢角质酶洗涤用性能（油污清除）的增强是明显的。为了比较，同样用Lipolase（TM）完成相同的实验。发现A85F角质酶变异体的性能明显好。

Claims

1、一种母本角质酶的角质酶变异体，其中氨基酸序列已经以提高酶表面的疏水性方法进行修饰。

2、根据权利要求1的角质酶变异体，其中已提高了与脂接触区相邻的酶表面的疏水性以便形成扩大的脂接触区。

3、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，通过用选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，提高了疏水性。

4、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，氨基酸序列已经以除提高表面的疏水性外，还导入了一个或多个正电荷的方式进行修饰。

5、根据权利要求4的角质酶变异体，其中通过导入一个或多个赖氨酸或精氨酸残基导入正电荷。

6、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，被取代的氨基酸残基有短侧链，且最好选自丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。

7、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，母本角质酶是真核的角质酶。

8、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，母本酶是与抗茄病镰孢角质酶产生的抗体发生免疫交叉反应的角质酶。

9、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，母本酶是来自茄病镰孢的角质酶。

10、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，由此，修饰的残基位于由载体限定的分子部分，（所述载体至少包含茄病镰孢角质酶残基116到120的全部Ca-原子，或者不同角质酶的相应Ca-原子）以及定位于与所述载体垂直平面并含有残基117的Ca-原子，或者不同角质酶相应的Ca-原子。

11、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，被修饰的残基位于与载体垂直的第一平面（所述载体至少包括离残基117 Ca-原子15

距离的茄病镰孢角质酶残基116到120Ca-原子）和与所述第一平面平行的第二平面之间的分子部分且含有残基117的Ca-原子。

12、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，被修饰的残基位于茄病镰孢角质酶氨基酸序列的一个或多个下列位置，或不同角质酶的相应位置：

17、18、19、40、42-46、50、53、54、58、74、75、76、78、80-88、91、92、93、95、96、97、99、100、119、150-156、158、160、168、169、170、172、173、174、176、179、180-190、192、193、194、196、197、198、201。

13、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，被修饰的残基位于茄病镰孢角质酶氨基酸序列的一个或多个下列位置，或不同角质酶中的相应位置：

19、41、45、49、54、58、75、76、82、85、92、93、99、100、127、128、172、173、179、183、184、185、189、190、194、197、201。

14、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，在茄病镰孢角质酶的氨基酸序列中，或不同角质酶中的相应位置产生一个或多个下列修饰：T19V、G41A、T45K、T45P、＊l49a、S54l、N58R、G75R、A76P、G82AD83S、A85F、A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、D194R、G197V、E201K。

15、根据前面任一权利要求的角质酶变异体，其中，在茄病镰孢角质酶的氨基酸序列中，或不同角质酶中的相应位置产生一个或多个下列修饰：A85F，N172K，E201K。

16、一种生产根据前面任一权利要求的角质酶变异体的方法，包括发酵培养rDNA改进的微生物，该微生物含用rDNA技术加工的编码角质酶基因的变异体，通过从发酵液分离由所述微生物生产的角质酶变异体，或通过从发酵液中分离所述微生物的细胞，破碎分离的细胞，用物理或化学浓缩或纯化方法，浓缩或部分纯化来自所述发酵液或所述细胞的角质酶，从而完成角质酶变异体的制备。

17、一种用rDNA载体转化的并由此能表达所述角质酶变异体的rDNA改进的微生物，所述载体携带编码根据权利要求1到15的任一角质酶变异体的基因。

18、根据权利要求17一种携带编码角质酶变异体的基因的rDNA改进的微生物，通过在所述基因的5′-末端与编码具有作为宿主生物信号或分泌序列功能的（改进的）前序列的基因片段融合，而将所述基因导入该微生物。

19、根据权利要求17或18的任一rDNA改进的微生物，其中，宿主生物是真核生物，如酵母属或克鲁维氏酵母属或汉逊氏酵母属，或曲霉属的真菌。

20、根据权利要求17到19的任一rDNA改进的微生物，携带编码权利要求1到15的角质酶变异体的重组DNA载体，在所述微生物的一个前代细胞中，已通过编码营养缺陷型标记的基因进行基因取代而将该微生物加工成营养缺陷型突变体。

21、一种具有编码根据权利要求1-15任一成熟角质酶变异体的碱基序列的多核苷酸或其功能等同物或突变体，其中，多核苷酸最好的被转译密码子后接着终止密码子，且可选择地含有直接位于编码该成熟酶的核苷酸序列上游的，编码该角质酶前-序列的核苷酸序列。

22、一种具有编码根据权利要求1-15任一角质酶变异体的碱基序列的多核苷酸，其中，多核苷酸最后的被转译密码子后接着终止密码子，且可选择地含有直接位于编码该成熟酶的核苷酸序列上游的，编码至少部分相应前序列的核苷酸序列，和/或适用于所选择的宿主生物的信号-或分泌-序列。

23、一种具有编码根据权利要求1-15任一成熟角质酶变异体的碱基序列的多核苷酸，或其功能等同物或突变体，其中，已经修饰了得自源生物的角质酶-变异体编码核苷酸序列，以便至少一个密码子，且最好是尽可能多的密码子被加工成“无症状”突变的主体，从而形成编码等同氨基酸残基的密码子并且是权利要求17到20中特定的新宿主优选的密码子，由此，在使用时在上述宿主细胞内提供用于改进稳定性的导入基因的信使RNA。

24、权利要求21到23任一多核苷酸，其中，在编码原-或成熟角质酶变异体的核苷酸序列上游，有一个编码适用于权利要求17到20中限定的任一宿主的信号或分泌序列的核苷酸序。

25、一种能直接表达编码角质酶变异体基因的核苷酸序列的重组DNA载体，含有下有成分：

（a）编码成熟角质酶变异体或前角质酶或相应的前角质酶的双链（ds）DNA，其中已将至少部分前序列直接从分泌信号（对于所选的宿主细胞是优选的）的下游除去，提供应被转译的部分基因不从密码子ATG开始，一个ATG应被放在前面，且被转译的部分基因用一个适当的终止密码子终止或加入上述密码子;

（b）位于编码角质酶变异体的dsDNA（成分a）的正链上游的表达调节子（适用于所选的宿主生物），

（c）位于编码角质酶变异体的dsDNA（组分a）正链下游的终止子序列（适用于所选的宿主生物）;

（d1）适用于所选宿主的复制原点;

（e1）选择性地含有一个（营养缺陷型）选择标记;

（e2）选择性含有一个编码蛋白质的dsDNA序列。

所述蛋白质涉及所选宿主中角质酶前体形式之一的成熟和/或分泌。

26、根据权利要求25的重组DNA载体，也携带在较早限定的核苷酸的上游和/或下游，促进角质酶功能表达的其它序列。

27、根据权利要求25-26的任一重组DNA载体，携带由营养缺陷型标记的编码区和缺陷启动子区组成的营养缺陷型标记。

28、一种酶洗涤剂组合物含有权利要求1-15的任一角质酶变异体。