CN1090329A

CN1090329A - 改进的脂解酶及其用途

Info

Publication number: CN1090329A
Application number: CN93121760A
Authority: CN
Inventors: M·R·艾格蒙德; H·T·W·M·范德希登; W·穆斯特斯; H·彼得斯; C·T·韦里斯; J·迪弗力格
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1992-12-23
Filing date: 1993-12-23
Publication date: 1994-08-03
Also published as: ZA939416B; CA2151038A1; EP0802981A1; PL309403A1; AU5700094A; BR9307722A; JPH08504589A; SK80295A3; CZ163995A3; HUT71315A; WO1994014964A1; HU9501874D0

Abstract

本发明提供了一种亲本角质酶的角质酶变异体，该变异体的氨基酸序列已以提高其与阴离子表面活性剂的方式进行改变。具体讲，通过减少阴离子表面活性剂与酶的结合而提高与阴离子表面活性剂的相容性。

Description

总的来说，本发明涉及脂解酶领域。更具体地说，本发明涉及采用重组DNA技术改进的脂解酶，涉及该酶的制备方法及该酶的用途，尤其是应用酶促洗涤组合物。

脂解酶是指将甘油三酯水解为游离脂肪酸以及甘油二酯，甘油单酯以及最后水解为甘油的酶。它们还能分解更复杂的酯如植物的角质层或皮肤的皮脂。工业上的各种酶促过程如甘油三酯的酯交换以及酯基转移作用以及酯合成过程中都应用脂解酶。为了有助于提高洗涤剂产品的去除油脂的特性，将脂解酶用于洗涤剂组合物中。

最普遍使用的脂解酶是脂酶（EC 3.1.1.3）。例如，EP-A-258 068和EP-A305 216（两个Novo Nordisk）两者描述了采用重组DNA技术由异源宿主微生物制备的真菌脂酶，尤其是从Thermomyces Lanuginosus/Humicola lanuginosa制备的脂酶。EP-A-331 376（Amano）描述了含有葱头假单胞脂酶的氨基酸序列的脂酶以及该酶的重组DNA制备技术，及其用途。在WO 89/09263以及EP-A-218272（两个Gist-Brocades）进一步提供了重组DNA技术制备的脂酶的例子。尽管公开了大量的脂酶及其修饰物，但到目前为止，仅发现来源于Humicola lanuginosa的脂酶由于其可用作为商品名为Lipolase（TM）的洗涤产品的附加成分而具有广泛的商业应用性。

脂酶的一个鉴别特征是它们具有界面活化作用。这意味着该酶对已形成界面或胶态分子团的底物的作用比对完全溶解的底物的作用活性更高。当将底物浓度提高至底物的临界胶团浓度（CMC），并形成界面时突然提高脂解活性可出现界面活化作用。将试验结果绘制酶活性相对底物浓度图谱，上述现象在该图上表现为不连续的点。

根据脂酶分子蛋白质结构中构象变化可解释脂酶的界面活性化作用机制。在游离的未结合状态，由一个螺旋形的盖覆盖了催化结合位点。在结合至脂类底物上后，该盖被取代并将催化位点暴露出来。也可以认为螺形盖与脂类界面相互作用，因而使酶仍结合至该界面上。

WO-A-92/05249（Novo Nordisk）公开了通过遗传手段改进的脂酶，尤其是来自于Humicola lanuginosa的脂酶，在该酶的脂类接触区已进行了改变。该申请中将脂类接触区定义为由螺旋形复盖的活性形式的表面。其中的改进包括缺失或取代该脂类接触区中的一个或多个氨基酸残基，经增加脂类接触区的静电荷和/或降低其疏水性，或便于改变脂类接触区的表面构型。这种改进可以采用使脂类接触区内的一个或多个带负荷氨基酸残基缺失，或用中性或多个带正电荷氨基酸取代这些氨基酸，和/或用带正电荷氨基酸替代该脂类接触区内的一个或多个中性氨基酸残基，和/或缺失该脂类接触区内的一个或多个亲水性氨基酸残基，或由疏水性氨基酸取代这些残基来实现。

角质酶（Cutinase）是蜡酯水解酶的一个亚类（EC3.1.1.50）。这些酶能降解角质层：即存在于植物上的脂化的长链脂肪酸和脂肪醇的网状组织，作为叶和茎的保护性覆盖层。另外，角质酶具有某些脂解活性。即能够水解甘油三酯。因此将这些酶作为脂酶的一个特殊种类。但是，与脂酶相反，角质酶没有显示任何本质上的界面活化作用。

角质酶可从如植物（例如花粉），细菌以及真菌的多种来源得到。由于其降解脂肪的特性，已有人建议将角质酶作为酶促洗涤剂组合物的成分。例如，WO-A-88/09367（Genencor）建议将一种表面活性剂和一种基本上活化的细菌角质酶结合可以配制有效的洗涤剂组合物。它公开的洗涤剂组合物包括从革兰氏阳性细菌葱头假单胞菌ATCC 53552获得的角质酶。但是，在更新的欧洲专利申请EP-A-476 915（Clorox）中，公开了当以常规方法使用时，同样的该酶（该文中称为脂酶）在从纤维织物上去除油污渍时并不比其他脂酶更有效。

最近，已测定了从茄病镰孢得到的角质酶的三维结构（Martinezet al.（1992）Nature 356，615-618）。已发现这些角质酶并不具有覆盖催化结合位点的螺旋形盖子。代替之，似乎溶剂可接近该活性位点丝氨酸残基。这些结果似乎已证实本发明的关于脂酶的界面活化作用机制的理论。

已将茄病镰孢的角质酶基因进行克隆并已测序（Ettinger et al.，（1987）Biochemistry 26，7883-7892）。WO-A-90/09446（植物遗传系统）描述了该基因在大肠杆菌中的克隆和制备。在角质酶和底物之间有或无界面对，该角质酶能有效地催化水相和非相介质中的酯的水解和合成。基于它的总体稳定性，暗示该角质酶能用于制备如洗衣用洗涤剂的洗涤剂以及其他特殊的脂溶性制剂如化妆用组合物和香波。尚没有公开经济可行的制备该酶的方法，也没有公开含有角质酶的具体的酶促洗涤剂组合物。

由于上面所述鉴别特征，即没有界面活化作用。为了达到公开本专利申请的目的，我们将角质酶定义为基本上没有界面活化作用的脂解酶。因此角质酶与经典的脂酶不同，它不具有覆盖催化结合位点的螺旋形盖。

如上所述，至今为止只有来源于Humicola lanuginosa的脂酶由于其可作为商品名为Lipolase（TM）的洗涤剂产品的添加剂而具有广泛的商业应用性。在CHemistry and Industry 1990，第183-186上登载的Henrik Malmos的文章中，指出已知在洗涤过程中脂酶活性通常是低的，并且Lipolase（TM）也不例外。在干燥过程中，当纤维织物中水含量降低时，酶恢复其活性并且水解脂肪污染垢物，在随后的洗涤周期期间，除去经水解的物质。这一观点也解释了为什么在第一个洗涤周期后脂酶作用较低，但在接着的周期有显著作用。因此，仍然需要在洗涤过程中具有显著活性的脂解酶。

我们已经发现角质酶，尤其是茄病镰孢的角质酶具有明显的，洗涤用的效果。但是，仍然需要能在富含阴离子的洗涤剂的组合物中具有改善了的洗涤用的脂解活性的角质酶变异体，以及需要制备此类酶的方法。

根据本发明，提供了其中的氨基酸序列已以一定方式进行了改变的角质酶变体，该方式是指提高其与阴离子表面活性剂的相容性。更具体地讲，已发现通过降低阴离子表面活性剂与该酶的结合力可以提高富含阴离子的洗涤剂组合物中真核角质酶，尤其是来源于茄病镰孢，Colletotrichum capsici，盘长孢状毛盘孢以及Magnaporthe grisea的角质酶的脂解活性。

一种亲本角质酶的角质酶变异体，是指以一定的方式改变了其中的氨基酸序列，该方式指特别是通过降低阴离子表面活性剂与该酶结合而提高与阴离子表面活性剂的相容性。

本发明涉及角质酶的变异体。如上所讨论，角质酶可从例如植物（如花粉），细菌和真菌多种来源获得。在本发明中，作为亲本角质酶或起始材料，采用重组DNA进行修饰的角质酶选自于真核角质酶。真核角质酶可以从例如植物（如花粉），或真菌的各种来源获得。

（真核）真菌角质组可能含有具有不同特异性，即叶特异性和茎特异性的两个家族。具有叶特异性的角质酶倾于具有酸性或中性最适PH值，而具有茎特异性的角质酶倾于具有碱性最适PH值。具有碱性最适PH值的角质酶更适用于碱组成的洗涤剂组合物如重垢的织物洗涤粉和洗涤液。具有酸性至中性最适PH的角质酶更适用于轻垢的产品或漂洗调理剂，但也适用于工业洗涤产品。

在下列表Ⅰ中，列出了四种的茎-特异性角质酶，以及它们的最适PH。

表1

具有茎特异性的角质酶的例子最适PH

茄病镰孢 9

玫瑰包镰孢 10

茄属丝核菌 8.5

甘蓝链格孢(PNB ase I) 9

本发明中特别优选的角质酶来源于野生型茄病镰孢（Ettinger et al.1987）。当用于特定洗涤剂组合物时，该角质酶具有明显的“洗涤用”的效果。

与来自于茄病镰孢的角质酶具有高度氨基酸序列同源性的角质酶也适合作为本发明中采用重组DNA技术进行修饰的亲本角质酶或起始材料。这样的例子有来自Colletotrichum capsici，盘长孢状盘孢以及Magnaporthe grisea的角质酶。在图11中列出了这些角质酶的部分氨基酸序列，并从中可看出有高度同源性。

可供选择来用于通过改变其基因而改进茄病镰孢角质酶的方案是，使用源于茄病镰孢，Colletotrichum capsici，盘长孢状毛盘孢以及Magnaporthe grisea的编码（原）角质酶的cDNA的5′和3′-DNA探针以及能识别其他角质酶中的保守序列的探针来分离编码其他真核有机体角质酶的遗传信息，并且如果必要，通过聚合酶链反应或PCR技术，使用这此探针以扩增源于产生角质酶的真核细胞的信使RNA（mRNA）的cDNA（参见，例如WO-A-92/05249）。根据标准方法，将得到的角质酶编码基因克隆于大肠杆菌并在其中表达以后，在合适条件下检测角质酶在去除（脂肪）污物方面的效果。在该方法中可以获得大量的具有改善的洗涤效果的上面所述角质酶天然存在的变异体。而且，这些天然存在的角质酶序列为茄病镰孢角质酶进一步的蛋白质工程提供了极好的依据。

基于关于决定脂解酶的“洗涤用”活性的因子以及仔细检查茄病镰孢角质酶的3D结构（Martinez et al.（1992）Naturc 356，615-618）的新观点并且检查了茄病镰孢角质酶的3D结构，我们发现通过重组DNA技术有多种可能性可以提高该角质酶以及一般所说角质酶与阳离子表面活性剂的相容性。

从已知的茄病镰孢角质酶的3D结构开始，应用在SYBYL分子成型软件包装的COMPOSER组件（TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri）中提供的基于规则的可相比的成型技术获得盘长孢角质酶的3D结构。应用BIOSYM分子面型软件包装（BIOSYM，SanDiego，California）中提供的能量最小化方法（EM）以及分子动态学（MD）技术精制所获得的盘长孢状毛盘孢角质酶模型。在该模型的EM和MD精制过程中，使用基于公知技术的方法，基于潜在的能量作用以及已知的结构标准，同时可使模型的能量分派达到最佳化。按照如二级结构成分中氢键的数目和特性，氢键合类型，肽单位的定向主链二面角的值，芳香族基因的干扰角以及腔的大小的标准估测模型性质。而且，检测模型中非适当掩蔽的电荷，极度显露的疏水基以及处于能量不稳定的位置的二硫键。从Ponder & Richards旋转异构体文库（Ponder et al.（1987）J.Mol.Biol.193，775-791）选择相关的侧链旋转异构体。根据上面介绍的结构评估标准，从该文库中最后选择出特定的侧链旋转异构体。用MD法将侧链原子退火至其位置上。应用同样的方法可获得Magnaporthe grisea角质酶的3D-结构。

本发明显示以一定方式可以改进角质酶，该方式是降低与阴离子表面活性剂的相互作用而不改变改进后的角质酶的洗涤用效果。可用多种方法达到上述结果。首先，通过降低阴离子表面活性剂和酶之间的静电荷作用而减少阴离子表面活性剂与该酶的结合。例如，通过用赖氨酸残基替代一个或多个带正电荷的精氨酸残基，这此残基的定位接近于能与阴离子表面活性剂的非极性尾相结合的疏水拼接物。通过在离精氨酸约6

的距离内导入一个负电荷，例如一个谷氨酸残基而应盖着该精氨酸残基的正电荷从而也可以降低阴离子表面活性剂与该酶之间的静电荷作用。可选择另一种方法，通过用未带电荷的氨基酸残基替代一个或多个正电荷精氨酸残基可以降低阴离子表面活性剂与该酶之间的静电荷作用，其中的精氨酸残基的定位接近于能与阴离子表面活性剂的非极性尾相结合的疏水性拼接物。再者，通过用负电荷氨基酸残基替代一个或多个正电荷精氨酸残基可以降低阴离子表面活性剂与酶之间的静电荷作用，其中所说的精氨酸残基的定位接近于能与阴离子表面活性剂的非极性尾相结合的疏水性拼接物。

降低阴离子表面活性剂与酶之间的结合力的另一种途经是用疏水性较小的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基，这些残基定位于能与阴离子表面活性剂的非极性尾相结合的疏水拼接物。这些较小的疏水性氨基酸残基优选选自于下列组：甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，天冬氨酸以及苏氨酸。

由于这些酶提高了与阴离子的相容性，当用作为富含阴离子洗涤剂或清洁组合物的成分时，本发明制备的角质酶变异体在酶活性方面有优势。在本发明公开的内容中，富含阴离子是指该洗涤剂或清洁组合物含有表面活性剂系统，组成该系统的阴离子表面活性剂含量高于5%，通常高于10%，特别是高于20%。

已发现在洗涤过程的主要周期中本发明的角质酶变异体具有提高了的洗涤用性能。在洗涤过程的主要周期中具有洗涤用性能是指在用欧洲型的自动化洗衣机进行的单一洗涤过程中，使用就浓度，温度而言的正常洗涤条件，含有该酶的洗涤剂组合物能从脏污的织物上除去显著量的油污渍。应牢记在同样条件下，常规使用的从商业途经购买的脂解酶Lipolase（TM）ex Novo Nordisk完全不具有显著的对油性污渍的洗涤用效果。

使用下面的分析方法可以估评一种酶对油性污渍的洗涤用效果。利用不含酶的洗涤剂产品如下文中给出的产品将含有低于10%棉花的新的多酯试验物预洗涤并且随后彻底漂洗干净。然后用橄榄油或其他适于水解的油污物弄脏上述的没有脏污的布。在一个100ml聚乙烯瓶中将各块待测布（重约1克）于30ml洗涤液中保温。该洗涤液含有1克剂量/l的下文中给出的洗涤剂产品。在装了水的Miele TMT洗衣机中，使用正常的30℃主要洗涤程序将瓶振荡30分钟。将3LU/ml浓度的角质酶变异体预加到洗涤液中。对照不含有任何酶。

该洗衣粉具有下列组成（按重量%）

LAS 6.9

皂 2.0

非离子型表面活性剂 10.0

沸石 27.0

碳酸钠 10.2

硫酸钠 13.0

在洗涤之后，用冷水彻底漂洗布片并在干燥机中用冷空气干燥，估测残留脂肪的量。这一过程可用几种方法完成。常用的方法是在Soxhlet萃取中仅用石油醚萃取所检测的布，蒸馏掉溶剂并且通过称重而将布片上残留的脂肪物质作为布片上起始脂肪量的分数，计算出残留脂肪物质的百分数。

根据第二种更灵敏的方法，用溴化的橄榄油弄脏所检测的布（Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.（1968），Textile Research Journal 38，105-107）。然后在100ml的聚乙烯瓶中将每块待测布片在30ml洗涤液中保温。然后在装满水的洗衣机中，使用正常的30℃主洗涤程序和振荡这一系列瓶子。在它程序洗涤后，将待测的布片在冷水中小心地漂洗5秒钟。漂洗后立即将待测的布在干燥器中用冷空气干燥。在干燥之后，借助于X-射线荧光分光光度计通过检测布片的溴含量而决定残留的脂肪量。测出移走的脂肪占待测布片存在的起始量脂肪的百分数，按如下所示：

除去的脏污物%＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ×100%

其中：溴bw表示在洗涤前布片上溴的百分数，

溴aw是在洗涤之后布片上溴的百分数。

估测酶活性的再一种方法是根据经典技术检测460nm处的反射系数。

在本发明的内容中，一种改进的，变异的或被突变的酶或一种酶的变异体是指由表达一种变异基因的变异有机体产生的酶。一种突变基因（除仅含有静止突变的酶以外）是指编码一种酶的基因，该酶具有直接或间接地从其相应的亲本酶的序列衍生的一个氨基酸序列，并且酶的序列中有一个或多个位点与亲本酶的序列不相同。亲本酶是指相应的未改变的基因的基因产物。基因的静止突变是指在该基因的多核苷酸序列中产生和变化或不同（归因于多余的密码子-氨基酸关系）并未导致该基因编码的酶的氨基酸序列的变化。

一种变异的或突变的微生物是指一种微生物，它是一种被用于突变其编码该酶的基因的亲本微生物或是从该亲本微生物遗传下来的一种微生物。（a）通过使已存在于亲本微生物的相应基因（亲本基因）发生突变，或（b）通过转移（导入）直接或间接从另一种来源获得的相应基因，然后将其导入（包括突变的基因）至将成为变异微生物的微生物中而完成该微生物的上述突变过程。一种宿主微生物是指由突变基因，或其他来源的一个转移基因构成其一个成分的微生物。通常它是与亲本微生物相同或不同的菌株或具有相同或不同的种源或遗传特性。

具体讲，本发明提供了在WO-A-90/09446（Plant Genetics Systems）中公开的茄镰孢的角质酶的突变体，以及来源于Colletotrichum capsici，盘长孢状毛孢以及Magnaporthe grisea的角质酶的突变型。采用重组DNA改进的微生物可以制备这些角质酶变异体，该微生物含有通过重组DNA技术获得或制备的一个基因。

已经鉴别了由另外一个氨基酸残基替代几个氨基酸残基，例如相对于茄病镰孢角质酶的序列或其同源序列的突变R17E。

本领域内技术人员将明白，这种改进会影响角质酶的结构。显然，优选的修饰是不会对活性位点周围的静电荷有太多影响。本发明人已经研究出了在酶构象的不可避免的变形与提高活性而得到的利益之间必需要达到何种水平的平衡关系，知道这种平衡何使我们具有高度的成功率，推测并制备成功的角质酶异体。在下面的表Ⅱ或说明书其他段落中，采用如下所示的一字母和三字母缩写表示肽序列中的氨基酸和氨基酸残基：

表Ⅱ

A=Ala=丙氨酸 V=Val=缬氨酸

L=Leu=亮氨酸 I=Ile=异亮氨酸

P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸

W=Trp=色氨酸 M-Met=蛋氨酸

G=Gly=甘氨酸 S=Ser=丝氨酸

T=Thr=苏氨酸 C=Cys=半胱氨酸

Y=Tyr=酪氨酸 N-Asn=天冬酰胺

Q=Gln=谷氨酰胺 D=Asp=天冬氨酸

E=Glu=谷氨酸 K=Lys=赖氨酸

R=Arg=精氨酸 H=His=组氨酸

在本说明书中，采用下列简述方法中的突变位置及特性描述了存在于蛋白质氨基酸序列中的突变以及由该突变引起的蛋白质本身突变：通过识别受突变影响的原始氨基酸残基;该突变的位点（以序列编号表示）;以及通过识别被用来替代原始残基的氨基酸残基。如果有一个额外的氨基酸插入到该序列中，用连接到调节序列或参照序列的最后位在前的成员的编号上的一个或多个写在下角的字母表示。

例如，以在17位由谷氨酰胺替代精氨酸的特征的突变按如下命名：Arg 17 Glu或R17E。假设在精氨酸后面插入一个其他的氨基酸残基如脯氨酸，可以表示为Arg 17 Arg Pro或R17RP，或者表示为＊17aP，其中将插入的残基的位置编号命名为17a。假设在同一位点上缺失精氨酸，可以表示为Arg17＊或R17＊。星号表示在所命名的位置上缺失或错过一个氨基酸残基，对于“错过”可认为是真正缺失或仅与在该位点有一个残基的另一个序列或参照序列相比有差异或同源。

用加号将多个突变分隔开，例如，R17E+S54I+A128F表示一个携带了替代突变的蛋白质，如其中指出的，氨基酸序列中三个所提及的每一个点发生了突变。如果必要，合并下面给出的突变。

下面显示的表Ⅲ表示本发明的角质酶变异体的具体实例，这些变异体基于茄病镰孢和Magnaporthe grisea的角质酶的序列得到的。

表Ⅲ

茄病镰孢角质酶变异体：

R17L,R17K,R17E,L51A,L51S,R78L,

T80D,R88E,R96N,R96Q,R156L,A195S,

R196A,R196K,R196E。

Magnaporthe grisea角质酶变异体：

A80D,A88E,R156L。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备本发明角质变异体的方法。通常植物病原菌是天然存在的产生角质酶的微生物，并且这些微生物非常不适于用作为改进酶基因的宿主细胞。因此，将改进（原）角质酶的编码基因整合到重组DNA载体中，利用重组DNA技术可将该载体转移到优选的宿主微生物中。为了上述目的可以使用基本上相同于WO-A-90/09446中描述的重组DNA载体。

由微生物产生的天然形式的角质酶并不十分适合于发酵方法。为了提高发酵过程的产量。应将编码改进角质酶的基因转移至能在便宜培养上快速生长的微生物中，并且该微生物能合成和分泌大量的角质酶。本发明所述的经改进的合适重组DNA（宿主微生物）是在不同的芽孢杆菌，棒状杆菌，葡萄球菌以及链霉菌中的细菌，或低等真核生物如啤酒酵母以及其相关的种，马克斯克鲁维氏酵母及其相关种，多形以逊氏酵母及其相关种，以及曲霉属内的种。优选宿主微生物是低等真核生物，因为这些微生物在发酵过程中可以很好地产生和分泌酶，并能够糖酵解角质酶分子。糖酵解作用可使角质酶稳定地存在于洗涤剂系统中。

本发明还提供了通过将改进的真核角质酶基因（例如，源于茄病镰孢的基因）导入到克隆重组DNA载体中而产生的遗传物质，以及使用该遗传物质转化新的宿主细胞，并用于在新的宿主细胞中表达角质酶变异体基因。

本发明还提供了由重组DNA技术制备或改进的能编码所述角质酶变异体的多聚核苷酸，提供了含有该多核苷酸的重组DNA载体，以及含有多核苷酸和/或该重组DNA载体的重组DNA修饰的微生物。本发明还提供了相应的编码改进的真核角质酶的多核苷酸，例如，具有编码成熟角质酶变异体的碱基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最后一个转译密码子后跟随一个终止密码子，并且选择性地在编码成熟角质酶变异体的核苷酸序列的相连的上游具有编码该角质酶变异体的前原或原序列的核苷酸序列。

在上述多核苷酸中，可以一定方式改进源于该有机源的编码角质酶的核苷酸序列，该方式是指制备至少一个，最好是尽可能多的遭受“静止”突变的编码子，以形成编码等价氨基酸残基的密码子，并且这些形成的密码子是新宿主优选选用的密码子，从而在所述宿主细胞内提供了具有改进稳定性的所导入基因的一种信使RNA。

在为原-或成熟角质酶编码的核苷酸序列的上游，可以定位一个核苷酸序列，该序列为适合于所选择的宿主的信号或分泌序列编码。因此，本发明的一个实例是指一种重组DNA载体，在该载体中插入了一个为角质酶变异体或其一种前体编码的核苷酸序列。

例如从下列来源得到的核苷酸序列：

（a）天然形式的核苷酸序列（例如，编码由茄病镰孢产生的前原或原角质酶的原始氨基酸序列）;

（b）由新宿主优选的密码子组成的化学合成的核苷酸序列，并且在新的宿主中该核苷酸序列产生稳定的信使RNA，该核苷酸序列仍编码原始的氨基酸序列;

（c）采用遗传工程手段从上面（a）或（b）中介绍的核苷酸序列之一衍生到的核苷酸序列，该序列编码有不同氨基酸序列但其在洗涤剂系统中有更优选的稳定性和/或活性的茄病镰孢角质酶。

概括地讲，能指导为上文中描述的角质酶基因编码的核苷酸序列在优选的一种宿主中表达的重组DNA载体优选包括下列成分：

（a）为成熟角质酶或前角质酶或一种相应的前角质酶编码的双链（ds）DNA，其中在已直接从分泌信号（为选定的宿主细胞优选）的下游移走了至少部分前序列。假如应该被转译的部分基因没有以ATG密码子作为起始密码子，则应在前面放置一个ATG密码子。转译的基因部分应总是以合适的终止密码子终止;

（b）一种定位于编码角质酶的ds DNA的正链（成分（a））的上游的表达调节子（适合于选定的宿主微生物）;

（c）一种定位于编码角质酶的ds DNA的正链（成分（a））的下游的终止子序列（适合于选定的宿主有机体）;

（d1）促进ds RNA整合到选定的宿主的基因组中的核苷酸序列或，

（d2）适合于所选定宿主的复制源;

（e1）非强制性地含有一个（营养缺陷型）选择标记。该自养型标记由营养缺陷型标记的编码区以及一个缺陷型启动子组成;

（e2）非强制性地含有为与宿主细胞中的角质酶的一种前体形式的成熟和/或分泌有关的蛋白质编码的ds DNA序列。

上述的重组DNA载体还可以在以前定义的多核苷酸的上游和/或下游携带促进角质酶功能性质表达的其他序列。该营养缺陷型标记可以由该营养缺陷型标记的编码区以及一人缺陷型启动子区组成。

本发明的另一个实施例是发酵生产上面所述的各种角质酶变异体之一。这种发酵可以是一般的间歇发酵，分批补料发酵或连续发酵。选择使用那种方法根据宿主菌株以及优选的以及优选的后处理方法（本领域已知）决定。因此，本发明还提供了生产如本文定义的角质酶变异体的方法，其中包括发酵培养一种重组DNA修饰的微生物的步骤，该微生物含有采用重组DNA技术制备的至少携带一个突变的基因，这种突变影响了所述角质酶的氨基酸序列;从而使之与相应的亲本酶相比具有改进的角质酶活性，通过从发酵液中分离出由微生物产生的角质酶，或通过从发酵液中分离出微生物细胞并破碎分离到的细胞而分离出该酶，再采用物理或化学浓缩或纯化方法将从所说发酵液或从所说细胞得到的角质酶变异体浓缩或部分纯化，从而得到了角质酶变异体制剂。优选选择的条件是能使微生物将角质酶变异体分泌到发酵液中，并采用过滤或离心法移走后可从发酵液中回收该酶。或者还采用，后将角质酶变异体浓缩并纯化到所需的程度。基于已知的发酵技术以及普通使用的发酵和后处理设备得到其本身并不考虑微生物特性的发酵方法。

本发明还提供了采用重组DNA技术制备一种能产生角质酶变异体的改进微生物的方法，其特征在于将导入到微生物中并为角质酶变异体编码的基因的5′-末端与为一种（改进的）前功能序列编码的基因片段相融合，其中的功能前序列作为宿主微生物的信号或分泌序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种含有一个角质酶变异体基因的重组DNA修饰的微生物并且它能产生由所说基因编码的角质酶变异体。在一种重组DNA修饰的微生物中，优选除去编码天然角质酶的基因（如果原始存在），例如由另一种结构基因替代。

根据本发明的另一个方面，提供了含有本发明角质酶变异体的酶促洗涤剂组合物。该组合物是由角质酶变异体与通常用于洗涤剂系统中的其他成分结合得到，这些其它成分包括在如本领域内已知的和在EP-A-258 068中例举的那些洗涤剂组合物和全料配制的洗涤剂和清洁组合物类型中使用的添加剂。

该洗涤组合物中的其他成分可以是许多已知种类中的任何一种，例如在GB-A-1 372034（Unilever），US-A-3 950 277，US-A-4 011 169，EP-A-179533（Procter & Gamble），EP-A-205 208以及EP-A-206 390（Unilever），JP-A-63-078000（1988），以及Research Disclosure 29056 of June 1988，以及本文提到的几种说明书的公开的组合物，上述文献引入本文作为参考。

本发明的角质变异体适用于加入到任何合适形式的洗涤剂组合物中，即粒状组合物形式，该酶的溶液或浆液或添加了载体物质。

（例如，EP-A-258 068中公开的以及Novo Nordisk的Savinase（TM）以及Lipolase（TM）产品）。

所加入的角质酶变异体的量可以在很宽范围内选择，例如在每克洗涤剂组合物为10-20，000LU，并且优选的是在50-2，000LU的范围内。在本说明书中，LU或脂酶单位的定义是相同于在EP-A-258 068（Novo Nordisk）中的定义。

同样可以考虑应用（细节略作改变）其他酶，如蛋白酶，淀粉酶，也可以存在纤维素酶。通过容具有PI值低于10的蛋白酶中选出一种，与该角质酶变体一起加入该洗涤组合物中时有优点。EP-A-271 154（Unilever）描述了许多种这样的蛋白酶。与角质酶变异体一起使用的蛋白酶包括如BPN型的枯草杆菌蛋白酶或在文献中公开的此类型的多种枯草菌蛋白酶中任何一种，例如在EP-A-130 756或EP-A-251 446（两个均属Genentech）;US-A-4 760 025（Genencor）;EP-A-214 435（Henkel）;WO-A-87/04661（Amgen）;WO-A-87/05050（Genex）;Thomas et al.J.Mol.Biol.（1987）193，803-813;Russel et al.Nature（1987）328，496-500中描述的突变体蛋白酶。

在下面的实施例中将对本发明作进一步描述。除非另有说明，在核酸物质的操作及分析中使用的所有技术基本上按照Sambrook et al.（1989）的描述进行。

附图描述如下：

图1A.合成的茄病镰孢角质酶基因的盒1和含有的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中标出了寡核苷酸变化。小写字母是指开放式阅读框架外的核苷酸位置。

图1B.合成的茄病镰孢角质酶基因的盒2和含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中标出了寡核酸的变化。

图1C.合成的茄病镰孢角质酶基因的盒3和其含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中标出了寡核酸的变化。小与字母是指该开放式阅读框架以外的核苷酸位。

图1D.编码茄病镰孢前原角质酶的合成角质酶基因的核苷酸序列。标出了角质酶前序列，原序列以及成熟序列。也标出了用于克隆的位点以及寡核苷酸的变化。小写字母是指开放式阅读框架外的核苷酸位点。

图2.用于将茄病镰孢原角质酶的编码序列连接到大肠杆菌PhoA前序列的衍生物的编码序列上的合成DNA片段的核苷酸序列。标出了核糖体结合位点（RBS）以及用于克隆的限制性酶位点。还用一个字母密码子标出了所编码的Pho信号序列以及部分角质酶基因的氨基酸序列。

图3.盒8，一个SacⅠ-BclⅠ片段的核苷酸序列，该序列编码转化酶前序列和成熟茄病镰孢角质酶两者的编码序列之间的融合位点。

图4.通过从pUR 2740中缺失0.2Kb SalⅠ-NruⅠ而获得的pUR 2741质粒，它是一种大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，它包含有部分PBR 322，源于2μm质粒的在酵母细胞中起作用的复制源点，一种酵母Leu2D基因，以及酵母转化酶信号序列编码区与受酵母gal 7启动子控制的一种植物α-半乳糖苷酶基因的融合体。

图5，质粒pUR 7219是一种大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，它含有部分pBR 322，源于2μm质粒的在酵母细胞中起作用的复制源点，一种酵母Leu 2D基因以及酵母转化酶信号序列编码区与受酵母gal 7启动子控制的成熟茄病镰孢角质酶的编码区的融合体。

图6.质粒pUR 2740是大肠杆菌-啤酒酵母穿梭载体，它含有部分pBR 322，源于2μm质粒的在酵母细胞中起作用的复制源点，一个酵母Leu 2D基因，以及酵母转化酶信号序列编码区与受酵母gal 7启动子控制的一个植物α-半乳糖苷酶基因的融合体。

图7.盒5，6和7的核苷酸序列，包括exlA前序列和成熟茄病镰孢角质酶的编码序列的不同类型的连接体。

图8.将黑曲霉awamori变种基因组DNA的5.3Kb SalⅠ片段插入到pUC 19的Sal Ⅰ位点获得的pAW 14B质粒。

图9.用含有茄病镰孢前原角质酶编码序列的BspHⅠ-AflⅡ片段替代pAW 14B中包括exlA开放式框架的BspHⅠ-AflⅡ片段而获得的pUR 7280质粒。因此pUR 7280质粒含有受黑曲霉awamori变种启动子和终止子控制的茄病镰孢前原角质酶基因。

图10.将构巢曲霉amdS和黑曲霉awamori变种pyrG选择标记导入pUR 7280中获得的pUR 7281质粒。

图11.来自于茄病镰孢，Colletotrichum capsici，盘长孢状毛盘孢以及Magnaporthe grisea的角质酶的部分氨基酸序列，表示在3D结构中残基的位置。

图12.茄病镰孢角质酶和角质酶变异体与基于LAS的洗涤剂组合物具相容性。

图13.茄病镰孢角质酶和角质酶变异体与基于PAS的洗涤剂组合物具相容性。

图14.茄病镰孢角质酶和角质酶变异体与一种强非离子洗涤剂组合物具相容性。

图15.茄病镰孢角质酶和角质酶变异体与SDS具相容性。

图16.茄病镰孢角质酶和角质酶变异体R17E的洗涤用效果。

参考文献附于此

REFERENCES

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实施例1

构建编码茄病镰孢前原角质酶的合成基因。

基本上按照EP-A-407225（Unilever）描述的方法构建编码茄病镰孢前原角质酶的合成基因。基于公开的茄病镰孢基因的核苷酸序列（Soliday et al.（1984）和WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems），设计一种全部合成的DNA片段，使之含有编码茄病镰孢前原角质酶多肽的一个区域。与原始的茄病镰孢基因的核苷酸序列相比，该合成的角质酶基因含有几个核苷酸变化，通过这些变化在该基因的便利位置上导入限制性酶识别位点但并不影响所编码的氨基酸序列。在图1D中列出了整个合成角质酶基因的核苷酸序列。

将从合成的DNA寡核苷酸开始将三个分隔的盒装配在一起而构建成合成的角质酶基因。在各个合成DNA盒的起始点上装配一个EcoRⅠ位点，并在末端装配一个HindⅢ位点。使用一个Applied Biosystem 380A，DNA合成仪合成寡核苷酸，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。为了构建每一个盒，下面概括地描述操作步骤。将构成一个给定盒的等摩尔量（50 pmol）的寡核酸混合，根据标准技术，使其5′末端磷酸化，退火并连接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割得到的双链DNA分子的混合物，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分级分离，通过电洗脱从凝胶上回收分子。将得到的合成DNA盒与2.7Kb的pUC9的EcoRⅠ-HindⅢ片段相连接并将其转移至大肠杆菌上。利用合适的寡核苷酸引物从两个方向对许多克隆中的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段全面测序，以验证合成盒的序列。使用该步骤，构建pUR 7207（含有盒1，图1A），pUR7208（含有盒2，图1B），以及pUR7209（含有盒3，图1C）。最后，通过将2.9Kb的pUR7207的EcoRⅠ-ApaⅠ片段与0.2Kb的pUR 7208ApaⅠ-NheⅠ片段以及pUR7209的0.3Kb的NheⅠ-HindⅢ片段结合在一起产生pUR 7210，从而装配成合成角质酶基因。该质粒含有编码整个茄病镰孢的前原角质酶的开放式阅读框架（图1D）。

实施例2

在大肠杆菌中表达茄病镰孢（原）角质酶。

构建带有合成角质酶基因的用在大肠杆菌中表达载体，该载体功能相似于在WO-A-90/09446（Plant Genetic Systems）中描述的载体。设计一种构建体，其中编码茄病镰孢原-角质酶的合成基因部分由合适的大肠杆菌表达信号引导，这些信号是（ⅰ）一种诱导型启动子，（ⅱ）一个核糖体结合位点以及（ⅲ）一种提供一个转译起始密码子并提供使原角质酶穿过细胞质膜输出所需的信息的信号序列。

设计一种用于将大肠杆菌phoA信号序列衍生物（Michaelis et al.，1983）融合到合成角质酶基因的原序列上的合成接头（见图2）。为了最大程度地切割信号肽并分泌原-角质酶，在该接头的核苷酸序列中，将phoA信号序列的三个C-末端氨基酸残基（Thr-Lys-Ala）改变为Ala-Asn-Ala以及角质酶原序列的N-末端氨基酸残基（Leu 1，参见图1D）改变为Ala。该构建形式可确保角质酶分泌到胞外空间（参见WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems）。

为了获得这样一种构建体，从pUR 7210上移走含有角质酶前序列和部分原序列的69bp的EcoRⅠ-SpeⅠ片段，并用合成的DNA接头序列（EcoRⅠ-SpeⅠ片段）替代，该接头序列提供了大肠杆菌phoA前序列以及经改变的角质酶原序列的N-末端氨基酸残基的衍生物（图2）。将得到的质粒命名为pUR 7250，并用于分离0.7Kb BamHⅠ-HindⅢ片段，该片段含有一个核糖体结合位点以及与phoA信号序列编码区相融合的原角质酶编码区。将该片段与pMMB67EH（Furste et al.，1986）的8.9Kb BamHⅠ-HindⅢ片段连接，以产生pUR7220。在该质粒中将编码合成基因的原角质酶融合到phoA信号序列的变化变体上并置于诱导型tac启动子控制下。

将携带pUR7220的大肠杆菌菌株WK6在含有0.5升IXTB培养基（Tartof and Hobbs，1988）的2升摇瓶中培养，该培养基组成如下：

0.017M KH₂PO₄

0.017M K₂HPO₄

12克/升细菌用胰蛋白胨

24克/升细菌用酵母抽提物

0.4% 甘油（V/V）

在100μg/ml氨苄霉素存在下，25℃-30℃，将培养物进行剧烈振荡（150rpm）培养过夜，生长到在610nm处的OD值为10-12。加入IPTG（异丙基-β-D-吡喃半乳硫苷）到终浓度为10μm，并继续培养12-16小时。如果没有观察到所产生的脂解活性量进一步显著增加（通过分析从培养物回收的样品判断），则通过离心而收集细胞并且重悬于原始培养物体积的含20%蔗糖的0℃缓冲液中。通过离心收集细胞，并重悬于原培养物体积的冰水中，以引起渗透休克而导致细胞溶解，通过离心除去细胞碎片，并用乙酸将该无细胞提取物酸化至PH 4.8，置于4℃过夜，并除去得到沉淀。通过超滤在该阶段获得纯度高于75%的基本上无内源脂酶的纯化角质酶制剂并冷冻干燥该无细胞提取物。换种方法，通过将酸化的无细胞提取物加样到SP-Sephadex上，用PH8.0的缓冲液洗脱该酶，将该浓缩的碱溶液传递过适当体积的DEAE-纤维素（Whatman DE-52）并直接将该流过DEAE的溶液加到Q-Sepharose HP（Pharmacia）柱上纯化，从而将该角质酶纯化到匀质（即纯度高于95%）。用盐梯度洗脱后产生均匀的角质酶制剂，通常该制剂的总产量在75%以上。

实施例3

编码茄病镰孢角质酶变体的基因的构建。

利用实施例1中描述的编码茄病镰孢前原角质酶的合成基因，构建在其编码的氨基酸序列中有变化的变异体基因。为了完成该构建过程，基本上按照实施例1中描述的相同方法，构建组成整个合成基因的三个盒。例如，使用相同于实施例1描述的寡核苷酸（Oligos）装配新的盒1变异体，不同之处在于将覆盖该位点三联体密码的两Oligos进行突变。代替该方法，可用两个新的Oligos，它们含有突变序列组同样也与它们取代的原始Oligos相同。

实施例3A

利用掺入了CUTⅠ1C ⅠG的变异体（含有替代AGA的GAG）以及CUTⅠ1Ⅰ ⅠG的变异体（含有替代TCT的CTC）以替代CUTⅠ1C ⅠG以及CUTⅠ1 ⅠG（参见图1A）的盒1变异体构建为茄病镰孢角质酶变异体R17E编码的基因。基本上按照实施例1中描述将新盒1克隆和测序，并用含有R17E突变的约120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段与pUR 7210中相应片段进行交换，产生pUR7240（R17E）。用来自该质粒的0.6KbSpeⅠ-HindⅢ片段代替PUR 7220中的相应片段，以产生大肠杆菌表达质粒pUR 7222（R17E）。将该大肠杆菌表达质粒转化到大肠杆菌WK6菌株中。按实施例2概括的方法培养该转化体，并基本上按照实施例2的描述回收和纯化该变异的原角质酶。同样用Lys或Leu替代Arg17。

实施例3B

利用掺入了CUTⅠ 3F MH变异体（含代替CGG的GAG），以及CUTⅠ 3M MH变异体（含代替CCG的CTC）以代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH（见图3A）的盒3变异体构建为茄病镰孢角质酶变异体R196E编码的基因，基本上按实施例1中描述的方法将新盒3进行克隆和测序并用R196E突变约120bp EcoRⅠ/Nru Ⅰ DNA片段与pUR 7210中相应片段进行变换产生pUR 7241（R196E）。用该质粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相应片段，产生大肠杆菌表达质粒pUR 7225（R196E）。将该大肠杆菌表达质粒转化到大肠杆菌WK6菌株上。按实施例2是概括的方法培养转化体，并基本上按实施例2中描述的方法回收和纯化变异的原角质酶。基于相同方法，CCUTⅠ 3F MH变异体（含代替CGG的AAG）以及CUTⅠ 3M MH变异体（含代替CCG的CTT）代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，从而由Lys（R196K）代替Arg 196。同样，用CUTⅠ 3F MH变异体（含代替CGG的CTT）以及CUTⅠ 3F MH的变异体（含代替CCG的AAG）代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，而由Leu（R196L）代替Arg196。基于同样方法由Ala代替Arg 196（R196A）。

实施例3C

用掺入了CUTⅠ1F ⅠG的变异体（含有替代CTC的GCT）以及CUTⅠ1L ⅠG的变异体（含有替代GAG和AGC）以替代CUTⅠ1F ⅠG和CUTⅠ1L ⅠG（参见图1A）的盒1变异体构建为茄病镰孢角质酶变异体L51A编码的基因。基本上按照实施例1中描述将新盒1进行克隆和测序，并用含有L51A突变的约120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段与pUR7210中相应片段进行交换，以产生pUR7242（L51A）。用该质粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相应片段，产。生大肠杆菌表达质粒pUR 7245（L51A）。将该大肠杆菌表达质粒转化到大肠杆菌WK6菌株。按实施例2概述的方法培养该转化体，并基本上按实施例2的描述方法回收和纯化该变异的原角质酶。同样用Ser替代Leu 51。

实施例3D

利用实施例3A和3B中构建的盒，构建带有两个修饰的角质酶变异体。在实施例3A中已经描述了pUR 7240（R17E）的构建过程。在实施例3B中已经描述了含有R196E突变的EagⅠ/HindⅢDNA片段的构建过程。用pUR 7241的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段替代pUR 7240（R17E）的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段，产生pUR 7243（R17E+R196E）。用该质粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相应片段，产生大肠杆菌表达质粒pUR 7226（R17E+R196E）。用该大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌WK6菌株。按实施例2概述的方法培养转化体，并基本上按实施例2描述的方法回收和纯化变异原角质酶。

实施例3E

用实施例3A和3C中构建的盒，构建带有两个修饰的角质酶变体。在实施例3A中已经描述了pUR 7240（R17E）的构建。在实施例3C中已经描述了含有L51A突变的DNA片段的构建。用pUR 7242的BclⅠ/ApaⅠ片段与pUR 7240的相应片段进行交换，以产生pUR 7244（R17E+L51A）。用该质粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相应片段，产生大肠杆菌表达质粒pUR 7246（R17E+L51A）。用该大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌WK6菌株。按实施例2概述的方法培养转化体，并基本上按实施例2描述的方法回收和纯化变异原角质酶。

实施例4

在啤酒酵母中表达茄病镰孢角质酶

为了在啤酒酵母中表达合成的茄病镰孢角质酶基因，构建一个表达载体，其中把啤酒酵母转化酶前序列（Taussig and Carlsson，1983）和诱导型gal 7强启动子（Nogi and Fukasawa，1983）置于编码成熟角质酶的合成基因前面。为了制备该融合体的合成角质酶基因，合成一个衔接头片段，其中将转化酶前序列的编码序列融合到编码成熟角质酶的N-末端的序列上。基本上按实施例1中描述的方法（盒8，见图3），将该片段装配作为pUC9中的EcoRⅠ-HindⅢ盒，产生pUR 7217。将pUR 7210和pUR 7217质粒转化大肠杆菌JM 110（该菌株丧失了dam甲基化酶活性），并将pUR 7217的2.8Kb BclⅠ-HindⅢ片段与pUR 7210的0.6Kb的BclⅠ-HindⅢ片段连接。产生pUR 7218，其中将为成熟角质酶多肽的核苷酸序列与啤酒酵母转化酶前序列的编码区部分融合。

通过分离pUR 2740中的8.9Kb NruⅠ-SalⅠ片段，用Klenow多聚酶填充SalⅠ伸出末端，以及使片段重新形成环状而从pUR 2740（Verba kel，1991，见图6）衍生出表达载体pUR 2741（见图4）。将pUR 2741的7.3Kb SacⅠ-HindⅢ片段与pUR 7218的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相连接，产生pUR 7219（参见图5）。或者还可使用，将啤酒酵母pol.Ⅱ终止子置于角质酶基因后面的HindⅢ位点，该终止子不是角质酶基因有效表达所必需的。大肠杆菌-啤酒酵母穿梭质粒pUR 7219含有在含有2μ质粒的啤酒酵母菌株（Cir⁺菌株）起作用的复制源点，一种便于在啤酒酒酵母Leu 2^-菌株中选择高拷贝数转化体的啤酒酵母Leu 2基因的启动子缺陷型变体，以及编码茄病镰孢角质酶的成熟部分的合成基因，该基因已通过操作后连接到受诱导型啤酒酵母gal 7强启动子调节的啤酒酵母转化酶前序列上。

根据电击穿酵母细胞的标准方案，将相同于YT6-2-1L菌株（Erhart and Hollenberg，1981）的啤酒酵母SU 50菌株（a，Cir°，Leu 2，his4，can1）与2μ啤酒酵母质粒与pUR 7219的等摩尔混合物共转化。选择亮氨酸原养型转化体，从许多个转化体中分离总DNA。所有转化子表现出含有2μ质粒以及pUR 7219，举例如下，当以高拷贝数存在百，由于自发地产生2μ酵母质粒，因而pUR 7219中含有的Leu 2基因的启动子缺陷型变异体仅能在功能上与Leu 2缺陷型菌株互补。通过在完全培养基上培养40代以上，然后影印至选择性的完全固体培养基上平板培养，产生啤酒酵母菌株SU51（a，Cir⁺，Leu2，his4，can1），从而使一种转化体中的pUR 7219质粒稳定。

在含有0.2升基本培养基的1升摇瓶中培养含有pUR 7219的啤酒酵母SU 51菌株，该培养基含有：

无氨基酸的酵母氮剂 6.7g/l

组氨酸 20mg/l

-葡萄糖 20g/l

在剧烈振荡（150rpm），30℃的条件下，将培养物培养过夜生长至610nm处OD值为2-4。通过离心收集细胞，并重悬于2升摇瓶中的1升YPGAL培养基中，该培养基含有：

-酵母抽提物 10克/升

-细菌用蛋白胨 20克/升

-半乳糖 50克/升

并继续培养12-16小时。在有规律的时间间隔点，从培养物中回收样品，离心移走生物质。利用橄榄油作底物，进行滴定分析以分析上清液中的角质酶活性。对于每一个样品，将100至200μl之间的滤液加到5.0ml的脂酶底物（Sigma，含有作为脂酶底物的橄榄油）以及25.0ml的缓冲液（5mM Tris-HCl PH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl₂）的振荡混合物中。上述滴定，分析是在30℃完成的，用Mettler DL25滴定仪用0.05M NaOH自动滴定至PH9.0而测定脂肪酸的释放。获得一条滴定剂量相对时间的曲线。从该曲线的最大斜率计算出样品中含有的脂酶活性的量。1个脂酶活性单位的定义是在上面限定的条件下在1分钟内使橄榄油释入出1μmol脂肪酸所需的酶的量。上述测定方法是本领域内技术人员已知的。

当产生的角质酶活性不再增加时，可通过离心移走细胞，并用乙酸将无细胞提取物酸化至PH4.8，按实施例1所述回收角质酶。

实施例5

在啤酒酵母中表达茄病镰孢角质酶变异体

用pUR7241（R196E）的0.5Kb ApaⅠ-HindⅢ片段替代pUR7218的类似片段，产生pUR7229（R196E），其中编码突变的基因可操作地融合到啤酒酵母信号序列的编码序列上。将pUR 2741的7.0Kb SacⅠ-HindⅢ片段与pUR 7229（R196E）的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相连接，产生pUR 7235（R196E）。用该质粒转化啤酒酵母SU51菌株。按实施例4中描述培养得到的转化体，按实施例4和1描述从培养液中回收产生的变异酶。

实施例6

在曲霉中表达茄病镰孢角质酶

为了在黑曲霉awamori变种中表达合成的茄病镰孢角质酶基因，构建一个表达载体，其中将编码茄病镰孢前原角质酶的合成基因置于黑曲霉awamori变种的诱导型exl A强启动子（Maat et al.，1992 de Graaff et al.，1992）控制下。

从pAW 14B质粒开始构建前原角质酶表达质粒（pUR 7280），于1990年5月31日，由大肠杆菌JM 109菌株携带该质粒，一起寄存于Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherlands，N°CBS 237.90，并且该质粒含有一个约5.3Kb SalⅠ片段，在该片段上定位了0.7Kb内切木聚糖酶Ⅱ（exl A）基因，以及2.5Kb的5′侧端序列和2.0Kb的3′一侧端序列（图8）。在pAW 14B中由前原角质酶编码区替代了exl A编码区。含有exl A基因的第一个密码子（ATG）的Bsp HⅠ位点（5′-TCATGA-3′）以及含有exlA基因的终止密码子（TAA）的AF 1Ⅱ位点（5′-CTTAAG-3′）有利于构建pUR 7280。

按如下所述进行构建：用Bsp HⅠ部分切割pAW 14B（7.9Kb），并以琼脂糖凝胶上分离线性化的质粒（7.9Kb）随后用BsmⅠ切割分离到的7.9Kb片段，该酶能切割处于所BspHⅠ位点下游的几个核苷酸，从而移走另一BspHⅠ位点处的线性化质粒。在琼脂糖凝胶上分离这些片段，分离出7.9Kb BspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割该片段，分离得到的7.2Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段。

将含有编码茄病镰孢前角质酶的整个开放阅读框架的pUR 7210的0.7Kb BspHⅠ-AflⅡ片段与pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相连接，产生pUR 7280。随后采常规的共转化技术将构建的载体（pUR 7280）转移到霉菌（例如黑曲霉，黑曲霉awamori变种等）中，通过诱导内切木聚糖酶Ⅱ启动子而使前原角质酶基因表达。还可以提供带常规选择性标记（例如amdS或pyrG，潮霉素等）的构建型重组DNA载体。用得到的重组DNA载体转化霉菌以产生所需的蛋白质。作为一个例子，在表达载体中导入amd S和pyr G选择标记，以产生pUR 7281（图10）。为了达到上述目的，通过用一个合成的寡核苷酸（5′-AATTGCGGCCGC-3′）将EcoRⅠ位点（存在于前原角质酶基因ATG密码子上游的1.2Kb）转变为NotⅠ位点，产生pUR 7282，而产生了一个NotⅠ位点。在含有整个构巢曲霉amd S基因，黑曲霉awamori变种pyr G基因以及它们各自的启动子和终止子的合适DNA片段上装配侧端NotⅠ位点，并导入到pUR 7282的Not Ⅰ位点，产生pUR 7281（图10）。

在黑曲霉awamori变种内表达合成的茄病镰孢角质酶基因的另一种可选择方法是，构建一个表达载体，其中在编码成熟角质酶的合成基因前并不加上其自身的前原序列而是加是黑曲霉awamori变种exlA的前序列。

为了制备上述融合体的合成角质酶基因，合成几个衔接片段，其中以不同方式将exlA前序列的编码序列连接到编码成熟角质酶N-末端的序列上。在盒5中，这种连接是通过将exlA前序列与角质酶的原序列相融合而完成的。在盒6中，将exlA前序列与成熟角质酶的N-末端相融合。盒7与盒6相同，但其中为了更好地适合切除信号肽的要求，将所编码的成熟角质酶多肽的N-末端残基从原始的甘氨酸转变为丝氨酸残基。基本上按实施例1中描述从合成的寡核苷酸装配盒5，6和7（参见图7）。用盒5替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，产生pUR 7287。分别用盒6和7替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-BclⅠ片段，以产生pUR 7288和pUR 7289。对于质粒pUR 7287，pUR 7288以及pUR7289中每一个，将0.7Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段与pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相连接，分别产生pUR7290，pUR7291以及pUR7292。

随后采用常规共转化技术将构建的重组DNA载体转移至霉菌（黑曲霉，黑曲霉awamori变种），通过诱导内切木聚糖酶Ⅱ启动子表达前-（原）-角质酶基因。还可以给构建的重组DNA载体提供常规选择标记（例如，amd S或pyr G，潮霉素），如在实施例中描述的用于pUR7280（见上文）的方法，将得到的重组DNA载体转化霉菌，以产生所需的蛋白质。

在下列条件下培养用表达载体pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7282（含有带有或没有相应原序列以及角质酶信号序列或受黑曲霉awamori变种exlA启动子和终止子控制的exlA信号序列的茄病镰孢成熟角质酶编码区）中任一种转化的黑曲霉菌株：用孢子接种多个含400ml合成培养基（PH6.5）的1升摇瓶（终浓度为10E6/ml）。该培养基有下列组份（AW培养基）：

蔗糖 10克/升

NaNO₃6.0克/升

KCl 0.52克/升

KH₂PO₄1.52克/升

MgSO₄·7H₂O 0.49克/升

酵母抽提物 1.0克/升

ZnSO₄·7H₂O 22mg/升

H₃BO₃11mg/升

MnCl₂·H₂O 5mg/升

FeSO₄·7H₂O 5mg/升

CaCl·6H₂O 1.7mg/升

CaSO₄·5H₂O 1.6mg/升

NaH₂MoO₄·2H₂O 1.5mg/升

Na₂EDTA 50mg/升

在MK X培养摇床上30℃以200rpm转速培养24小时，在生长后通过过滤（0.45μm滤器）收集细胞，用无蔗糖和酵母抽提物（盐液）的AW培养基洗二次，重悬于50ml盐溶液中，并转移至含有50ml盐溶液的300ml摇瓶中，该盐溶液中加入了终浓度为10克/升的木聚糖（诱导培养基）。在与上面所述相同条件下继续培养过夜。用miracloth过滤得到的培养物以除去生物质，基本上按上面实施例2描述方法回收角质酶。

实施例7

在曲霉中表达茄病镰孢角质酶变异体

基本上按照实施例6中提及的途经，但现在用质粒pUR 7240（R17E）或pUR 7241（R196E）或pUR7242（L51A）代替pUR7210，用于构建真菌表达载体，在黑曲霉awamori变种内制备含有上述提到突变的茄病镰孢角质酶变异体。

实施例8

鉴定和分离与茄病镰孢角质酶基因相关的基因

从不同真菌中分离与茄病镰孢角质酶有不同程度同源性的角质酶的编码基因。在含有200ml培养基的500ml摇瓶中培养真菌培养物，该培养基是在Hankin和Kolattukudy（1968）描述的培养基中添加了0.25%葡萄糖，并在MKX培养摇床（100rpm）上28℃培养4天。在此时，消耗葡萄糖并加入基本上由Ettinger等人（1987）描述的角质素水解液而诱导角质酶产生。根据标准技术（参见实施例4），以有规律的时间间隔从培养液中回收样品并分析脂解酶活性的存在。正常情况，在诱导后约2天就显示有脂解活性，并在那时利用标准技术通过过滤收集细胞。根据标准技术，洗涤菌丝体，冷冻于液氮中并冻干。基本上按照Sambrook et al.（1989）的描述，利用硫氰酸胍法分离细胞的总RNA制剂，并采用氯化铯密度梯度离心进行纯化。利用多聚AT系统mRNA分离药盒（Promga）分离多A（+）mRNA部分。根据标准技术，用茄病镰孢角质酶基因的cDNA片段作为探针将多A（+）mRNA部分进行Northern杂交分析，以验证角质酶相关基因的表达。根据供应商的说明，用一个ZAP cDNA合成药盒（Stratagene，La Jolla）将含有能与探针杂交的物质的mRNA制剂用于合成cDNA，产生cDNA片段，该片段带有侧端为多聚A区域的Xho Ⅰ粘性末端以及在另一末端为一个EcoRⅠ接头。通过以有意义方向将得到的cDNA片段直接克隆到λZAPⅡ载体（Stratagene，La Jolla）中，并允许表达β-半乳糖苷酶融合蛋白（Huse et al.，1988），而构建到了表达文库。利用针对茄病镰孢角质酶的抗血清筛选这些文库。

另一种可选择方法是，用角质酶特异性引物（见表2），将合成的cDNA部分进行PCR筛选。这些引物是从将几个真菌角质酶基因的氨基酸序列（ettinger et al.，1987）相比较得到的。对于每一套引物，都使用最佳的PCR反应条件，并用茄病镰孢角质酶的cDNA作为对照。对于（合成的）即些cDNA制剂，由他们产生的一个特定PCR片段其长度相似于（或大于）在同样条件下用茄病镰孢角质酶的cDNA产生的PCR片段的长度，通过凝胶电泳纯化该PCR片段并从该凝胶上分离该片段。

另一种可选择方法是，利用角质酶特异性引物的PCR筛选技术也可以直接应用到一些真菌菌株的基因组DNA，用茄病镰孢的基因组DNA作为阳性对照。对于这些真菌基因组DNA制剂。用它们制备的一个特异性PCR片段具有相似于（或大于）在同样条件用来自茄病镰孢角质酶的cDNA制备的PCR片段的长度，通过凝胶电泳纯化该PCR片段并从该凝胶上分离该片段。

对于在表达文库方法或PCR筛选方法（用cDNA或基因组DNA）中评为阳性的菌株以及许多其他菌株，分离到了高分子量基因组DNA。菌株的培养基本上按照Ettinger等人（1987）的描述进行。基因组DNA的分离按照de Graaff等人（1988）描述进行。用各种不同的限制性酶消化基因组DNA，并利用类似的cDNA插入片段（在表达文库方法中）或PCR片段（PCR筛选方法）或茄病镰孢角质酶基因（其他菌株）作为探针进行Southern杂交分析，并绘制该角质酶基因的物理图谱。通过凝胶电泳适当消化的基因组DNA按大小分级分离并从凝胶上分离合适大小的片段，亚克隆到pUC19中。用相应的cDNA插入片段（表达文库方法）或PCR片段（PCR筛选方法）筛选这些基因组文库，产生含有角质酶基因的基因组拷贝的克隆。以两个方向对该基因进行测序。通过分析相应cDNA的序列或通过其他角质酶序列（Ettinger et al.，1987）比较可鉴别内含子。也可以从这种比较中推导出成熟角质酶多肽的N-末端。利用标准的PCR技术。移走内含子。通过遗传操作法将开放式阅读框架的下游紧接一个HindⅢ位点，将啤酒酵母转化酶基因的原序列的编码序列（其前为Sac Ⅰ位点，与盒8对照，图3）融合到编码成熟角质酶的N-末端的序列上。将得到的SacⅠ-HindⅢ片段与pUR7241的7.3Kb Sac Ⅰ-HindⅢ片段（图4）相连接并转化至啤酒酵母SU51菌株，其中的Sac Ⅰ-HindⅢ片段含有可操作地连接到编码啤酒酵母转化酶前序列的序列上的角质酶基因。基本上按照实施例4描述，表达真菌角质酶以及从培养液中回收该酶。

实施例9

茄病镰孢角质酶变异体R17E，R196E和R17E+R196E与各种阴离子表面活性剂的相容性

按如下所述检测茄病镰孢角质以及茄病镰孢角质酶变异体R17E，R196E和R17E+R196E与各种阴离子表面活性剂的相容性，制备含酶的各种洗涤剂产品溶液。将溶液在40℃保温，并间隔地取样。然后按照实施例4描述的方法测定酶活性。使用下列的洗涤产品A-C：

产品A：

化合物	重量％
		线状烷基苯磺酸钠	11.7
非离子表面活性剂 7EO	5.8
		非离子表面活性剂 3EO	3.2
沸石	38.8
		Sokolan CP7	4.8
CMC钠	0.8
		碳酸钠	13.9
过硼酸钠	8.0
		TAED	5.4
硅酸钠	2.5

产品B：

化合物	重量％
		伯烷基硫酸钠	6.5
非离子表面活性剂 7EO	6.5
		非离子表面活性剂 3EO	8.3
皂	2.3
		沸石	38.0
碳酸钠	15.9
		过硼酸钠	8.0
TAED	5.4
		硅酸钠	2.5

产品C：

化合物	重量％
		线状烷基苯磺酸钠	6.9
非离子表面活性剂	10.0
		皂	2.0
沸石	27.0
		碳酸钠	10.2

组合物A-C的结果列于图12-14中。从该结果看出，尤其是在富含阴离子的组合物A中，角质酶变异体比野生型茄病镰孢角质酶更稳定。

实施例10

茄病镰孢角质酶变异体R196K和R196L与十二烷基硫酸钠的相容性

按如下所述检测茄病镰孢角质酶以及茄病镰孢角质酶变异体R196K和R196L与十二烷基硫酸钠（SDS）的相容性。在0°FH制备0.4mMSDS和10mM Tris中的酶溶液。将该溶液在40℃保温并间隔地取样，按实施例4描述的方法测定残留的酶活性。结果显示于图15中。可以看出两种角质酶变异体比野生型茄病镰孢角质酶更能稳定地与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）相容。

实施例11

检测茄病镰孢角质酶变异体R17E的洗涤活性

用纯化的橄榄油将由机织聚酯/棉花制成的检测布弄脏。然后在100ml聚乙烯瓶的30ml洗液中保温每块检测布。在装有水的Miele TMT洗衣机中，用正常的40℃洗涤主程序振荡这些瓶子。该洗涤由每升中2克实施例9的洗衣粉A和B（在27°FH）组成。

结果显示于图16中。已证明，在各种洗涤条件下相对于野生型茄病镰孢角质酶而言，角质酶变异体R17E的洗涤功能（除去油性污渍）有提高。为了比较，用Lipolase（TM）也进行相同实验。在所有条件下，角质酶变异体R17E都有优势。

Claims

1、一种亲本角质酶的角质酶变异体，已将其氨基酸序列以提高与阴离子表面活性剂的相容性的方式进行改变。

2、根据权利要求1的角质酶变异体，其中通过降低阴离子表面活性剂与酶的结合力而提高其与阴离子表面活性剂的相容性。

3、根据前面的任何一项权利要求所述的角质酶变异体，其中通过降低阴离子表面活性剂与酶之间的静电作用而提高其与阴离子表面活性剂的相容性。

4、根据权利要求1-3中任一项所述的角质酶变异体。其中通过用赖氨酸残基替代一个或多个带正电的精氨酸残基而降低阴离子表面活性剂与酶之间的静电作用，其中的精氨酸的定位接近于能结合阴离子表面活性剂的非极性尾的疏水片。

5、根据权利要求1-3中任一项所述的角质酶变异体。其中通过用未带电荷的氨基酸残基替代一个或多个带阳性电荷的精氨酸残基而降低阴离子表面活性剂与酶之间的静电作用，其中的精氨酸的位置接近于能结合阴离子表面活性剂的非极性尾的疏水片。

6、根据权利要求1-3中任一项所述的角质酶变异体。其中通过用带负电荷的氨基酸残基替代一个或多个带正电荷的精氨酸残基而降低阴离子表面活性剂与酶之间的静电作用，其中精氨酸的位置接近于能结合阴离子表面活性剂的非极性尾的疏水片。

7、根据权利要求1-3中任一项所述的角质酶变异体。其中通过用疏水性小的氨基酸残基替代一个或多个的氨基酸残基而降低阴离子表面活性剂与酶的结合，其中氨基酸定位于能结合阴离子表面活性的非极性尾的疏水片上。

8、根据权利要求7所述的角质酶变异体。其中的疏水性小的氨基酸残基选自于由甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，天冬氨酸和苏氨酸组成的组中。

9、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体。其中亲本角质酶是一种真核角质酶。

10、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体，其中亲本酶是一种与针对茄病镰孢的角质酶抗体发生免疫交叉反应的角质酶。

11、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体，它是由与编码茄病镰孢，Colletrichum capsici，盘长孢状毛盘孢，Magnaporthe grisea的角质酶的编码基因的5′和/或3′-末端以及/或与角质酶的保守序列有巨大同源的基因编码的。

12、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体，修饰的残基定位于茄病镰孢角质酶的氨基酸序列，或不同角质酶相应氨基酸的一个或多个下列位点上：17，51，78，80，88，96，156，195，和196。

13、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体，修饰的残基定位于茄病镰孢角质酶的氨基酸51和195周围，或不同角质酶的相应氨基酸周围的疏水片上。

14、根据前面的权利要求任一项所述的角质酶变异体，它是Magnoporthe grisiea角质酶的变异体，并且含有一个或多个下列突变：A80D，A88E，R156L。

15、制备前面任一项所述的角质酶变异体的方法，包括下列步骤：发酵培养含有由重组DNA技术制备的基因的一种重组DNA修饰的微生物，其中的基因编码角质酶变异体，以及通过从发酵液中分离由该微生物产生的角质酶变异体，或通过从发酵液中分离微生物细胞，破碎分离的细胞，并且采用物理或化学浓缩和纯化方法从所说发酵液或从所说细胞中浓缩或部分纯化出角质酶，从而制备角质酶变异体制剂。

16、一种重组DNA修饰的微生物，该微生物已由携带编码权利要求1-14中任一项的角质酶变异体的基因的一个重组DNA载体转化，从而该微生物能表达所说的角质酶变异体。

17、根据权利要求16所述的重组DNA修饰的微生物，它携带的角质酶变异体编码基因是通过在其5′-末端与一个基因片段融合而导入到所述微生物，所述基因片段编码具有作为宿主微生物的信号或分泌序列功能的一个（改进的）前序列。

18、根据权利要求16或17所述的重组DNA修饰的微生物，其中宿主微生物是一种真核生物，例如酵母属或克鲁维氏酵母属或汉逊氏酵母，或曲霉属的真菌。

19、根据权利要求16-18所述的重组DNA修饰的微生物，包携带有为权利要求1-14任一项的角质酶变异体编码的重组DNA载体，所说微生物是通过将其一种祖先细胞中营养缺陷型标记的编码基因进行替代而制备的一个自养型突变体。

20、一种多核苷核酸，它具有为权利要求1-14任一项的成熟角质酶变异体或一种功能等同物或其突变异体编码的碱基序列，其中聚核苷酸的最后转译密码子后跟随一个终止密码子，或者还具有为紧接着在成熟酶的核苷酸序列的上游的该角质酶的前序列的核苷酸编码序列。

21、一种具有为权利要求1-14中任一项所说的角质酶变异体编码的碱基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最后转译密码子后面跟随一个终止密码并且该多核苷酸在其编码成熟酶的核苷酸序列的上游选择性地紧接一个为至少部分相应前序列，和/或适应于选定的宿主有机体的信号或分泌序列编码的一个核苷酸序列。

22、一种具有为权利要求1-14中任一项所述的成熟角质酶变异体编码的一种多核苷酸或一种功能等同物或其突变体，其中已以某种方式对来源生物源的角质酶变异体的核苷酸编码序列进行了改进，该方式是至少使一个密码子并且优选的是尽可能多的密码子遭受“静止”突变以形成为等同的氨基酸残基编码的密码子，并且是在权利要求16-19中限定的新宿主优选的密码子，从而在上述宿主细胞内提供了具有改进的稳定性的所导入基因的信使RNA。

23、根据权利要求20-22任一项所说的多核苷酸，其中在编码原或成熟角质酶变异体的核苷酸的上游定位了一个核苷酸序列，该序列编码适合于权利要求16-19中任一项限定的宿主的信号或分泌序列。

24、一种能指导编码角质酶变体基因的核苷酸序列表达的重组DNA载体，它包括下列成分：

a）为成熟角质酶变异体或前角质酶或一种相应的角质酶（其中至少将紧接分泌信号（对于选定的宿主细胞是优选的）下游的部分前序列移走）编码的双链（ds）DNA，如果应转译的基因部分没有以ATG作为起始密码子，则在该基因前面加一个ATG密码子，并且要转译的基因部分以合适的终止密码子终止或已加上了这样一个终止密码子。

b）一种定位于编码角质酶变异体的ds DNA（成分（a））的正链的上游的表达调节子（适合于选定的宿主微生物）;

c）一种定位编码角质酶变体的ds DNA（成分（a））的正链的下游的终止序列（适合于选定的宿主微生物）;

d1）一种促进该ds DNA整合到选定的宿主的基因组中核苷酸序列或，

d2）一种适合于选定的宿主的复制源点;

e1）选择性地含的一种（营养缺陷型）选择标记;

e2）选择性地含有一个为与选定的宿主中角质酶变异体的前体形式之一的成熟和/或分泌有关的蛋白质编码的ds DNA序列。

25、根据权利要求24所述的重组DNA载体，在前面定义的多核苷酸的上游和/或下游进一步有促进角质酶功能性表达的序列。

26、根据权利要求24-25任一项所述的重组DNA载体，它携带由营养缺陷型标记的编码区和一个缺陷型启动区组成的营养缺陷型标记。

27、一种加酶洗涤剂组合物，含有权利要求1至14中任一项所述的角质酶变异体。