JPH08504589A - 改変クチナーゼ、ｄｎａ、ベクター及び宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アニオン界面活性剤との相容性が改善されるようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体を提供する。特に、アニオン界面活性剤と酵素との結合を低減することによりアニオン界面活性剤との相容性が改善された。

Description

【発明の詳細な説明】 改変クチナーゼ、ＤＮＡ、ベクター及び宿主技術分野 本発明は一般に、脂肪分解酵素の分野に関する。本発明はとりわけ、組換えＤ ＮＡ技術により改変した脂肪分解酵素、その産生方法、及び特に酵素洗剤組成物 でのその使用に関する。背景及び従来技術 脂肪分解酵素は、トリグリセリドを遊離脂肪酸やジグリセリド、モノグリセリ ド、場合によってはグリセロールに加水分解できる酵素である。前記酵素は更に 、より複雑なエステル（例えば植物のクチン層又は皮脂）を分解し得る。脂肪分 解酵素は、業界ではトリグリセリドのエステル交換やエステル合成のような種々 の酵素法で使用されている。前記酵素は更に、洗剤製品の脂肪除去性を改善する ために洗剤組成物で使用されている。 最も広範に使用されている脂肪分解酵素は、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３） である。例えば、ヨーロッパ特許出願公開第２５８ ０６８号及びヨーロッパ特 許出願公開第３０５ ２１６号（共にＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は共に、ｒＤ ＮＡ技術による異種宿主微生物を介した真菌リ パーゼの産生、特にＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ／Ｈｕｍ ｉｃｏｌａｌ ａｎｕｇｉｎｏｓａ に由来するリパーゼの産生を記載している。 ヨーロッパ特許出願公開第３３１ ３７６号（Ａｍａｎｏ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ 由来のリパーゼのアミノ酸配列を含め、リパーゼ、並 びにそのｒＤＮＡ技術による産生及び使用を記載している。ｒＤＮＡ技術により 産生されるリパーゼの別の例はＷＯ−Ａ−８９／０９２６３号やヨーロッパ特許 出願公開第２１８ ２７２号（共にＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載されて いる。リパーゼやその改変に関する刊行物が多数あるにもかかわらず、現在のと ころ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼだけが洗剤製品 用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商品名で広く市販されている。 リパーゼの特徴は界面で活性を示すことである。これは、完全に溶解した基質 よりも、界面又はミセルを形成した基質への酵素活性が遥かに高いことを意味し ている。界面活性は、基質濃度が基質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高くな って、界面が形成されたときに脂肪分解活性の急増となって表れる。実験では、 この現象を酵素活性対基質濃 度のグラフで非連続性として観察することができる。 リパーゼの界面での活性化機構は、リパーゼ分子のタンパク質構造のコンホー メーション変化によって解明されてきた。遊離した未結合の状態では、らせん状 リッド（lid）が触媒結合部位を包囲している。脂質基質との結合時には、リッ ドが移動して、触媒部位が露出する。らせん状リッドは、脂質界面と相互作用し て、酵素を界面と結合した状態のままにするとも考えられている。 ＷＯ−Ａ−９２／０５２４９号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、脂質接触領 域が改変された遺伝子工学的改変リパーゼ、特にＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇ ｉｎｏｓａ 由来のリパーゼを開示している。脂質接触領域は本明細書では、活性 形のときにらせん状リッドにより覆われた表面と定義する。改変は、脂質接触領 域の１個以上のアミノ酸残基を欠失又は置換して、静電荷を増加させ、及び／又 は脂質接触領域の疎水性を減少させ、又は脂質接触領域の表面コンホーメーショ ンを変えることからなる。これは、脂質接触領域の１個以上の陰電荷アミノ酸残 基を欠失させ、又はこれらの残基を中性又はより陽性電荷のアミノ酸で置換し及 び／又は脂質接触領域の１個以上の中性アミノ酸残基 を陽電荷アミノ酸で置換し、及び／又は脂質接触領域の１個以上の親水性アミノ 酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を疎水性アミノ酸で置換することにより達 成される。 クチナーゼは、ろうエステル加水分解酵素の一種である（ＥＣ３．１．１．５ ０）。これらの酵素は、植物で葉や茎の保護膜として生じるエステル化長鎖脂肪 酸／脂肪アルコール網状体のクチンを分解し得る。更には、前記酵素はある程度 の脂肪分解活性を有し、即ちトリグリセリドを加水分解し得る。従って、前記酵 素は、特殊なリパーゼとみなすことができる。しかしながら、クチナーゼは、リ パーゼとは異なり実質的な界面での活性を示さない。 クチナーゼは、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から 得ることができる。クチナーゼは、その脂肪分解性のために、酵素洗剤組成物の 成分として提案されている。例えば、ＷＯ−Ａ−８８／０９３６７号（Ｇｅｎｅ ｎｃｏｒ）は、界面活性剤と実質的に純粋な細菌クチナーゼ酵素とを組み合わせ た効果的な洗浄組成物の製造を提案している。グラム陰性菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ ５３５５２から得たクチナーゼを含む洗剤組成 物が開示されている。しかしながら、 より最近のヨーロッパ特許出願公開第４７６ ９１５号（Ｃｌｏｒｏｘ）では、 従来の方法を使用した場合、リパーゼと称する前記酵素は織物の油汚れ除去に対 して他のリパーゼほどの効果はないと開示されている。 最近、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ由来のクチナーゼの三次元 構造が解明された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ等（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，６ １５−６１８）。このクチナーゼが触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たな いことが知見された。その代わり、活性部位のセリン残基が溶媒とアクセスし得 るように思える。これらの知見は、リパーゼの界面での活性化機構に関する現在 の理論を確定するように思える。 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子はクロー ニングされ、配列決定されている（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ ２６，７８８３−７８９２）。ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号 （Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｅ．ｃｏｌｉでの前記 遺伝子のクローニングや産生を記載している。クチナーゼは、クチナーゼと基質 との界面の存在下及び不在下で、水性及び非水性媒質中のエ ステルの合成や加水分解を効果的に触媒し得る。その一般的な安定性に基づき、 このクチナーゼを使用して、洗濯洗剤のような洗浄剤や、化粧品組成物やシャン プーのような他の特定の脂肪溶解製剤を製造することができる。経済的に可能な 酵素産生方法も、クチナーゼを含む特定の酵素洗剤組成物も開示されていない。 この特徴のため、即ち界面での活性作用がないために、本明細書中ではクチナ ーゼを、実質的に界面で活性を示さない脂肪分解酵素と定義する。従って、クチ ナーゼは、触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たない点が従来のリパーゼと 異なる。 前述したように、現在のところ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由 来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商 品名で広く市販されている。Ｈｅｎｒｉｋ Ｍａｌｍｏｓは、Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ １９９０，１８３−１８６ページに記載する論 文で、洗濯プロセス中のリパーゼ活性は一般に低く、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商 標）も例外でないことは周知であると指摘している。乾燥プロセス中に、織物の 含水率が低下すると、酵素は活性を取り 戻し、脂肪汚れは加水分解される。次の洗濯サイクル中に、加水分解された物質 が除去される。これで、リパーゼ作用が１回目の洗濯サイクルの後は低いのに、 以後のサイクルで有意となる理由の説明もつく。従って、洗濯プロセス中に有意 な活性を示す脂肪分解酵素が更に必要である。 クチナーゼ、特にＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ由来のクチナー ゼが明らかな洗濯中（in-the-wash）作用を示すことが知見された。しかしなが ら、アニオン洗剤含量の多い洗剤組成物での洗濯中脂肪分解活性を改善したクチ ナーゼ変異体やこのような酵素の産生方法が更に必要である。 本発明によれば、アニオン界面活性剤との相容性（compatibility）が改善さ れるようにアミノ酸配列を改変したクチナーゼ変異体を提供する。特に、真核生 物クチナーゼ、特にＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔ ｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ 、Ｃｏｉｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅ ｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ由来のクチ ナーゼのアニオン洗剤含量の多い洗剤組成物中での脂肪分解活性が、アニオン界 面活性剤と酵素との結合を低減することに より改善され得ることが知見された。発明の定義 アニオン界面活性剤との相容性が改善されるように、特にアニオン界面活性剤 と酵素との結合を低減することによりアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのク チナーゼ変異体。発明の説明 本発明は、クチナーゼ酵素の変異体に関する。前述したように、クチナーゼは 、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができ る。親クチナーゼとして、即ち組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出 発材料として使用すべきクチナーゼは、真核生物クチナーゼの群の中から選択す る。真核生物クチナーゼは、植物（例えば花粉）又は真菌のような種々の産生源 から得ることができる。 （真核生物）真菌クチナーゼの群は、葉特異性及び茎特異性と特異性の異なる ２つのファミリーからなるように思える。葉特異性クチナーゼは、酸性又は中性 ｐＨ最適値を有する傾向にあり、茎特異性クチナーゼはアルカリ性ｐＨ最適値を 有する傾向にある。アルカリ性ｐＨ最適値を有す るクチナーゼは、ヘビィーデューティ織物粉末／液体洗剤のようなアルカリ性ビ ルダー入り洗剤組成物での使用により適し、酸性又は中性ｐＨ最適値を有するク チナーゼは、ライトデューティ製品又はリンスコンディショナーだけでなく、工 業洗浄製品により適している。 以下の表Ｉに、４種の異なる茎特異性クチナーゼとそのｐＨ最適値を示す。 表Ｉ 茎特異性クチナーゼの例 pH最適値 Fusarium solani pisi 9Fusarium roseum culmorum 10Rhizoctonia solani 8.5Alternaria brassicicola（PNBase I） 9 野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉから誘導され得るクチナー ゼ（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等，１９８７）が本発明で特に好ましい。このクチナーゼ は、特定の洗剤組成物で使用すると明白な“洗濯中”作用を示す。 アミノ酸配列がＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉ ｓｉ 由来のクチナーゼと高度の相同性を示すクチナーゼも、親クチナーゼ、即ち 組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出発材料として適している。Ｃｏ ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ 、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ由 来のクチナーゼがその例である。図１１にこれらのクチナーゼの部分アミノ酸配 列を示す。高度の相同性を示すことが知見され得る。 遺伝子改変によるＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼの改 良に代わる方法として、（プロ）クチナーゼをコードするＦｕｓａｒｉｕｍ ｓ ｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ 、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏ ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 、及びＭａｇｎａｐ ｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｃＤＮＡに由来する５’及び３’ＤＮＡプローブや 、他のクチナーゼの保存配列を認識するプローブを用いて他の真核生物に由来す るクチナーゼをコードする遺伝子情報を単離することができ、また必要とあれば これらのプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ技術を使用してク チナーゼを産生する真核細胞のメッセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増殖させることができる（例えばＷＯ−Ａ−９２ ／０５２４９号参照）。このようにして得られたクチナーゼコード化遺伝子を標 準的な手順に従ってＥ．ｃｏｌｉにクローニングして発現した後に、クチナーゼ の（脂肪）汚れ除去性能を適切な条件下で試験する。このようにして、洗濯中性 能の改善された前記クチナーゼの天然変異体を多数得ることができる。更には、 これらの天然クチナーゼの配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの別のタンパク質を製造するための優れた基礎となる。 脂肪分解酵素の“洗濯中”活性を決定する因子に関する新たな考えや、Ｆｕｓ ａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの３Ｄ構造の細心の検査（Ｍａ ｒｔｉｎｅｚ等（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，６１５−６１８）や、Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの３Ｄ構造の検査に基づいて 、このクチナーゼ、また一般にクチナーゼとアニオン界面活性剤との相容性を組 換えＤＮＡ技術で改善するための幾つかの可能性を見出した。 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼの既知の３Ｄ構造を出 発点とし、ＳＹＢＹＬ分子モデル化 ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＣＯＭＰＯＳＥＲモジュールで実施される ようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈ ｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 由来のクチナーゼの３Ｄ構造を得た。得ら れたＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓクチナーゼ モデルを、ＢＩＯＳＹＭ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＢＩＯＳＹＭ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施されるようなエネルギー最 小化（ＥＭ）や分子力学（ＭＤ）技術を適用して修正した。モデルのＥＭ及びＭ Ｄ処理中に、知識をベースとするアプローチを適用した。可能なエネルギー関数 の詳細なエネルギー項（terms）や既知の構造基準について、モデルを同時に最 適化した。モデル品質を、水素結合の数や品質、二次構造要素での水素結合パタ ーン、ペプチド単位の配向、主鎖二面角の値、芳香族基の相互作用角及びキャビ ティー寸法のような基準により評価した。更には、不適切に埋封された電荷、極 端に露出した疎水性残基、及びジスルフィド架橋のエネルギー的に好ましくない 位置についてモデルを検査した。関係 する側鎖ロータマー（rotamers）は、Ｐｏｎｄｅｒ ＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓロー タマーライブラリーから選択した（Ｐｏｎｄｅｒ等（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ．１９３，７７５−７９１）。このライブラリーからの特定側鎖ロータマ ーの最終的な選択は、前述したような構造基準の評価を基準とした。ＭＤを使用 して、側鎖原子を所定位置にアニーリングした。同様の方法を使用して、Ｍａｇ ｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ に由来するクチナーゼの３Ｄ構造を得た。 本発明は、改変クチナーゼの“洗濯中”性能を変化させずにアニオン界面活性 剤との相互作用を低減できるようにクチナーゼを改変できることを示している。 これは、幾つかの方法で実施され得る。まず、アニオン界面活性剤と酵素との 相互静電作用を低減することにより、例えば、アニオン界面活性剤の非極性（ap olair）テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置する１個以上の陽電荷アル ギニン残基をリシン残基で置換することによりアニオン界面活性剤と酵素との結 合を低減することができる。前記アルギニンから約６オングストロームの距離内 に陰電荷（例えばグルタミン酸残基）を導入することにより、こ のようなアルギニン残基の陽電荷を遮蔽するアニオン界面活性剤と酵素との相互 静電作用を低減することも可能である。あるいは、アニオン界面活性剤の非極性 テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置する１個以上の陽電荷アルギニン残 基を非帯電アミノ酸残基で置換することにより、アニオン界面活性剤と酵素との 相互静電作用を低減することができる。更には、アニオン界面活性剤の非極性テ ールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置する１個以上の陽電荷アルギニン残基 を陰電荷アミノ酸残基で置換することにより、アニオン界面活性剤と酵素との相 互静電作用を低減することができる。 アニオン界面活性剤と酵素との結合を低減する別の方法は、アニオン界面活性 剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置する１個以上のアミノ酸 残基を疎水性がより小さいアミノ酸残基で置換することである。これらの疎水性 がより小さいアミノ酸残基は、グリシン、セリン、アラニン、アスパラギン酸及 びトレオニンからなる群の中から選択することが好ましい。 アニオン界面活性剤との相容性が改善されることにより、本発明で産生したク チナーゼ変異体は、アニオン洗剤含量 の多い洗剤や洗浄組成物の一部分として使用した際に酵素活性で利点をもたらし 得る。本発明では、アニオン洗剤含量の多いとは、洗剤又は洗浄組成物が、５％ 以上、一般には１０％以上、特に２０％以上のアニオン界面活性剤からなる界面 活性剤系を含んでいることを意味する。 本発明のクチナーゼ変異体は、洗濯プロセスの主サイクル中に改善された洗濯 中性能を示すことが判明した。洗濯プロセスの主サイクル中の洗濯中性能とは、 酵素を含む洗剤組成物が、濃度、水の硬度、温度に関しては通常の洗濯条件を用 い、ヨーロッパタイプの自動洗濯機により、１回の洗濯プロセスで汚れた織物か らかなりの量の油汚れを除去できることを意味する。市販されている従来の脂肪 分解酵素Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ製）は、同 一の条件下で油汚れに対して有意な洗濯中作用を示すとは全く思えないことに留 意すべきである。 酵素の油汚れへの洗濯中作用は、以下のアッセイを用いて評価することができ る。綿含量が１０％未満の新しいポリエステル試験布を以下に示すような酵素非 含有洗剤製品を用いて予洗し、その後十分に濯ぐ。次いで、このような汚れてい ない布にオリーブ油又は他の適切な加水分解可能 な油しみをつける。各試験布（重量約１ｇ）を１００ｍｌのポリスチレンビン内 の３０ｍｌの洗液でインキュベートする。洗液は以下に示す洗剤製品を１ｇ／ｌ 含んでいる。通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れたＭｉｅｌ ｅ ＴＭＴ洗濯機でビンを３０分間撹拌する。予め３ＬＵ／ｍｌのクチナーゼ変 異体を洗液に添加する。対照は酵素を含んでいない。粉末洗剤の組成を以下に示 す（重量％）： ＬＡＳ 6.9 セッケン 2.0 非イオン界面活性剤 10.0 ゼオライト 27.0 炭酸ナトリウム 10.2 硫酸ナトリウム 13.0 洗濯した後に、布を冷水で十分に濯ぎ、冷風式回転乾燥機で乾燥し、残留脂肪 量を評価する。これは幾つかの方法で実施することができる。通常の方法は、試 験布をＳｏｘｈｌｅｔ抽出装置中、石油エーテルで抽出し、溶媒を留去してから 計量し、布の最初の脂肪量の分数としての残留脂肪分パーセンテージを決定する ことである。 更に高感度の第２の方法では、臭素化オリーブ油を用いて、試験布を汚す（Ｒ ｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．及びＡｒｋｌａｙ，Ｔ．Ｈ．（ １９６８），Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ３８，１０ ５−１０７）。次いで、各試験布を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌ の洗液でインキュベートする。次いで、通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、 水を一杯に入れた洗濯機で一連のビンを撹拌する。主洗濯の後、試験布を冷水中 で５秒間入念に濯ぐ。濯いだ直後に試験布を冷風式乾燥機で乾燥する。乾燥後、 Ｘ線蛍光スペクトル分析で布の臭素含量を測定して脂肪残量を決定することがで きる。脂肪除去は、以下のように試験布に最初に存在していた量のパーセンテー ジとして決定することができる。 前記式中、臭素_bwは洗濯前の布上の臭素パーセンテージを示し、臭素_awは洗濯後 の臭素パーセンテージを示す。 酵素活性の別の評価方法は、標準的な技術に従って４６０ｎｍで反射率を測定 することからなる。 本発明では、改変、突然変異もしくは突然変異体酵素、 又は酵素変異体は、突然変異体遺伝子を発現している突然変異微生物によって産 生された酵素を意味する。（サイレント突然変異のみを含むもの以外の）突然変 異体遺伝子は、直接的又は間接的に誘導され、１カ所以上の場所で対応する親酵 素の配列と異なるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。親 酵素とは、対応する未変化遺伝子の遺伝子産物を意味する。遺伝子のサイレント 突然変異とは、遺伝子のポリヌクレオチド配列で生じる変化又は相違のうち、（ コドン−アミノ酸関係での縮重（redundancy）のために）前記遺伝子によってコ ードされる酵素のアミノ酸配列が変化しない場合を意味する。 突然変異体又は突然変異微生物とは、酵素に対する遺伝子が突然変異を起こし た親微生物又はその子孫である微生物を意味する。微生物のこのような突然変異 は、（ａ）既に親微生物に存在している対応遺伝子（親遺伝子）を突然変異させ るか、又は（ｂ）他の起源から直接又は間接的に得た対応遺伝子を突然変異微生 物となるべき微生物に移入（導入）する（例えば遺伝子を突然変異させる）こと により実施され得る。宿主微生物は、その突然変異体遺伝子又は他の起源の移入 遺伝子が一部分を構成している微生物で ある。一般に、宿主微生物は、株又は種源又は血統が親微生物と同一であっても 異なってもよい。 本発明は特に、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に開示されているＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉ ｓｉ クチナーゼ、またＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌ ｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 、及びＭａｇｎａｐｏ ｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ 由来のクチナーゼの突然変異体形態を提供する。これら のクチナーゼ変異体は、ｒＤＮＡ技術で得た又は製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ 改変微生物により産生され得る。 アミノ酸残基が同定されると、それを他のアミノ酸残基、例えばＦｕｓａｒｉ ｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ又はその相同体の配列に関する突然変 異Ｒ１７Ｅで置換すべきである。 当業者には自明の通り、このような改変はクチナーゼの構造に影響する。明ら かに、活性部位周辺の静電荷にそれほど影響しない改変が好ましい。本発明者ら は酵素のコンホーメーションの不可避的な歪みと酵素活性増加の利点とのバラン スについて必要レベルの理解を深めた。これによ り、高い成功率で有望なクチナーゼ変異体を予測して、製造することができる。 以下の表IIや明細書の他の箇所では、ペプチド配列のアミノ酸やアミノ酸残基を 以下に示す１文字及び３文字の略字で示す。 表II Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン 本明細書では、タンパク質のアミノ酸配列に存在する突然変異、従って突然変 異体タンパク質自体は、突然変異の位置及び種類により以下の略記法で、即ち突 然変異を受けた元のアミノ酸残基のアイデンティティー、突然変異の （配列番号による）部位、及び元のアミノ酸残基にとって代わるアミノ酸残基の アイデンティティーにより記載され得る。余分のアミノ酸が配列に挿入されると 、その位置は、正規の配列又は基準配列の挿入直前の残基の番号に１個以上の下 付き文字を付けて示す。 例えば、１７位のアルギニンがグルタミンで置換されたことを特徴とする突然 変異体はＡｒｇ１７Ｇｌｕ又はＲ１７Ｅで表す。（仮に）アルギニンの後にプロ リンのような別のアミノ酸残基を挿入すると、Ａｒｇ１７ＡｒｇＰｒｏ又はＲ１ ７ＲＰで表すか、１７ａ位を示す挿入残基を用いて＊１７ａＰとして表す。（仮 に）同じ位置でアルギニンが欠失すると、Ａｒｇ１７＊又はＲ１７＊で表す。＊ は、実際の欠失によって存在しないとみなされる場合は欠失を意味し、この位置 に残基を有する他の配列又は基準配列との単なる比較又は相同性によって存在し ないとみなされる場合はアミノ酸残基の不在を意味する。 複数の突然変異は十記号で分けて表す。例えばＲ１７Ｅ＋Ｓ５４Ｉ＋Ａ１２８ Ｆは、アミノ酸配列の前記３つの位置の各々で前述したような置換による３つの 突然変異を有する突然変異体タンパク質を表す。所望とあれば、以下の 表に示す突然変異を組み合わせてもよい。 以下の表IIIは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ及びＭａｇｎａ ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ 由来のクチナーゼの配列に基づく本発明のクチナー ゼ変異体の特定の有用な例を示している。 表III Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの変異体： Ｒ１７Ｌ，Ｒ１７Ｋ，Ｒ１７Ｅ，Ｌ５１Ａ，Ｌ５１Ｓ，Ｒ７８Ｌ，Ｔ８０Ｄ，Ｒ ８８Ｅ，Ｒ９６Ｎ，Ｒ９６Ｑ，Ｒ１５６Ｌ，Ａ１９５Ｓ，Ｒ１９６Ａ，Ｒ１９６ Ｋ，Ｒ１９６Ｅ。Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ クチナーゼの変異体： Ａ８０Ｄ，Ａ８８Ｅ，Ｒ１５６Ｌ。 本発明の別の態様によれば、本発明のクチナーゼ変異体の産生方法を提供する 。天然クチナーゼを産生する微生物は通常植物病原体であり、これらの微生物は 改変クチナーゼ遺伝子用宿主細胞としての作用にはあまり適さない。従って、ｒ ＤＮＡ技術のために好ましい宿主微生物内に移入す ることのできるｒＤＮＡベクターに、改変（プロ）クチナーゼをコードする遺伝 子を取り込んだ。このため、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号に記載のｒＤＮＡベ クターと本質的に同様のｒＤＮＡベクターを使用することができる。 天然クチナーゼを産生する微生物は、発酵法にはあまり適さない。発酵法の収 率を改善するため、改良されたクチナーゼをコードする遺伝子を、安い培地で急 速増殖し得、また多量のクチナーゼの合成や分泌が可能な微生物に移入すべきで ある。本発明のこのような適したｒＤＮＡ改変（宿主微生物）は、細菌（とりわ けＢａｃｉｌｌｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｉ 及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は下等な真核生物（例えばＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 及び関連種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ 及び関連種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ 及び関連種、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種）である。好ましい宿主微生物 は下等な真核生物である。何故ならば、これらの微生物は、発酵法で非常によく 酵素を産生分泌し、クチナーゼ分子を解糖し得るからである。グリコシル化は、 洗浄系でのクチナーゼの安定性に寄与し得 る。 本発明は更に、改変真核生物クチナーゼ遺伝子（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ ｓ ｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ 由来の遺伝子）をクローニングｒＤＮＡベクターに導入し て得られる遺伝子材料、及び新しい宿主細胞の形質転換やクチナーゼ変異体遺伝 子の新しい宿主細胞での発現のための前記遺伝子材料の使用を提供する。 ｒＤＮＡ技術によって製造又は改変されて前記クチナーゼ変異体をコードする ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むｒＤＮＡベクター、並びに前記ポ リヌクレオチド及び／又は前記ｒＤＮＡベクターを含むｒＤＮＡ改変微生物も本 発明で提供する。本発明は更に、改変真核生物クチナーゼをコードする対応ポリ ヌクレオチド（例えば成熟クチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有し、最終 翻訳コドンの次に終結コドンが来るポリヌクレオチドであるが、場合によっては 成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナー ゼ変異体のプレプロ又はプロ配列をコードするヌクレオチド配列を有する）を提 供する。 このようなポリヌクレオチドでは、産生源の微生物から 誘導される、クチナーゼをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個のコ ドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが‘サイレント’突然変異の対象に対 し、新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコド ンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定 性の改善された導入遺伝子用ｍＲＮＡを提供することができる。 プロ又は成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列の上流には、特定宿主 に適したシグナル又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置し得る。従 って、本発明の一実施態様は、クチナーゼ変異体又はその前駆体をコードするヌ クレオチド配列が内部に挿入されたｒＤＮＡベクターに関する。 ヌクレオチド配列は例えば、以下の配列から誘導され得る： （ａ）（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉで産生したプロプレ 又はプロクチナーゼの元のアミノ酸配列をコードする）天然ヌクレオチド配列； （ｂ）新しい宿主に好まれるコドンと、新しい宿主で安定なメッセンジャーＲＮ Ａを生じさせるヌクレオチド配列と からなり、依然として元のアミノ酸配列をコードする化学合成ヌクレオチド配列 ； （ｃ）アミノ酸配列は異なるが、洗剤系で優れた安定性及び／又は活性を示す、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼをコードする前項ａ又は ｂに記載したヌクレオチド配列の一方に由来する遺伝子工学的に作成されたヌク レオチド配列。 要するに、好ましい宿主のひとつで前述したようなクチナーゼ遺伝子をコード するヌクレオチド配列の発現を指令し得るｒＤＮＡベクターは好ましくは、以下 の成分を含んでなる： （ａ）成熟クチナーゼ、又はプレクチナーゼ、又は（選択される宿主細胞にとっ て好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去され た対応プレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ。但し、翻訳されるべ き遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始していない場合、ＡＴＧコドンを前に置く べきである。また、遺伝子の翻訳部分は常に適切な終結コドンで終了すべきであ る； （ｂ）クチナーゼをコードするｄｓ ＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の上流に 位置する、（選択される宿主微生物に 適した）発現レギュロン； （ｃ）クチナーゼをコードするｄｓ ＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の下流に 位置する、（選択される宿主微生物に適した）ターミネーター配列； （ｄ１）選択される宿主のゲノム内へのｄｓ ＤＮＡの組み込みを容易にするヌ クレオチド配列、又は （ｄ２）選択される宿主で適した複製起点； （ｅ１）場合によっては（栄養要求性）選択マーカー。栄養要求性マーカーは、 栄養要求性マーカーのコード領域と欠陥プロモーターとからなり得る； （ｅ２）場合によっては、選択される宿主での一前駆体形態のクチナーゼの成熟 及び／又は分泌に関与するタンパク質をコードするｄｓ ＤＮＡ配列。 このようなｒＤＮＡベクターは更に、前述したようなポリヌクレオチドの上流 及び／又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を有し得る。栄 養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領 域とからなり得る。 本発明の他の実施態様は、前述の種々のクチナーゼ変異体の一種の発酵による 産生である。このような発酵は、通 常のバッチ発酵であっても、フェドバッチ（fed-batch）発酵であっても、連続 発酵であってもよい。使用すべき方法の選択は、宿主株や（公知の）好ましい下 流処理（down stream processing）法に依存する。従って、本発明は更に、本明 細書に記載するようなクチナーゼ変異体の産生方法を提供し、本方法は、クチナ ーゼのアミノ酸配列に作用する少なくとも１つの突然変異をもたらすｒＤＮＡ技 術により製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養して、クチナーゼ の活性を対応する親酵素と比べて改善し、微生物により産生されたクチナーゼを 発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチ ナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮 又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼ変異体を濃縮又は 部分精製する段階からなる。クチナーゼ変異体が微生物によって発酵ブロス内に 分泌され、酵素が濾過又は遠心分離による細胞除去後にブロスから回収されるよ うな条件を選択することが好ましい。場合によっては、次いで、クチナーゼ変異 体を所望の程度に濃縮、精製することができる。これらの発酵法自体は微生物の 特殊性を除けば、既知の発酵技術や、 通常使用されている発酵／下流処理装置を基本とし得る。 ｒＤＮＡ技術によりクチナーゼ変異体を産生し得る改変微生物の産生方法を更 に本発明で提供する。本方法は、微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコー ドする遺伝子が５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な （改変）プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することを特徴とする。 本発明の別の態様では、クチナーゼ変異体遺伝子を含み、該遺伝子によってコ ードされるクチナーゼ変異体を産生し得るｒＤＮＡ改変微生物を提供する。ｒＤ ＮＡ改変微生物では、天然クチナーゼをコードする遺伝子が元々存在するならば 、これを除去（例えば他の構造遺伝子で置換）することが好ましい。 本発明の別の態様では、本発明のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物を提 供する。このような組成物は、クチナーゼ変異体及び通常洗剤系で使用されてい る他の成分（例えば洗剤組成物用添加剤、全配合洗剤及び例えばヨーロッパ特許 出願公開第２５８ ０６８号に記載されいている既知の種類の洗浄組成物の成分 類）を組み合わせたものである。 このような洗剤組成物の他の成分は、例えば英国特許出願公開第１ ３７２ ０３４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、米国特許第３ ９５０ ２７７号、米国特許第 ４ ０１１ １６９号、ヨーロッパ特許出願公開第１７９ ５３３号（Ｐｒｏｃ ｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）、ヨーロッパ特許出願公開第２０５ ２０８号及び ヨーロッパ特許出願公開第２０６ ３９０号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、特開昭６３ −０７８０００号（１９８８）、１９８８年６月の調査レポート（Research Dis closure）２９０５６号や、本明細書で引用した幾つかの明細書の各々に記載さ れているような多数の既知の種類のいずれであってもよい。前記特許出願明細書 は全て、参考として本明細書に組み入れる。 本発明のクチナーゼ変異体は、任意の適切な形態で、即ち酵素の顆粒組成物、 溶液もしくはスラリーの形態で、又は担体材料（例えばヨーロッパ特許出願公開 第２５８ ０６８号に記載の材料や、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ製Ｓａｖｉｎａ ｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標））と共に洗剤組成物に有効 に添加することができる。 クチナーゼ変異体の添加量は、洗剤組成物１ｇ当たり例えば１０〜２０，００ ０ＬＵ、好ましくは５０〜２，００ ０ＬＵと広範囲で選択することができる。本明細書でのＬＵ、即ちリパーゼ単位 は、ヨーロッパ特許出願公開第２５８ ０６８号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ） で定義されている通りである。 更に存在し得るプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼのような他の酵素の場 合も同様の規定を準用する。ｐＩが１０未満のプロテアーゼを選択し、このプロ テアーゼをクチナーゼ変異体と共に前記洗剤組成物に存在させると有利であり得 る。ヨーロッパ特許出願公開第２７１ １５４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、この ようなプロテアーゼを多数記載している。クチナーゼ変異体と共に使用されるプ ロテアーゼは、例えばＢＰＮ’型又は文献に開示されている多数の型のサブチリ シン、例えばヨーロッパ特許出願公開第１３０ ７５６号又はヨーロッパ特許出 願公開第２５１ ４４６号（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許第４ ７６０ ０２５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ヨーロッパ特許出願公開第２１４ ４３５号 （Ｈｅｎｋｅｌ）；ＷＯ−Ａ−８７／０４６６１号（Ａｍｇｅｎ）；ＷＯ−Ａ− ８７／０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）；Ｔｈｏｍａｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１ ９８７）１９３，８０３−８１３；Ｒｕｓ ｓｅｌ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２８，４９６−５００に記載の突然変異 体プロテアーゼを包含し得る。 以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。核酸物質の遺伝子操作や分析で 使用した全ての技術は、特に明記しない限り本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９ ８９）が記載した方法で実施した。 添付図面の説明： 図１Ａ： 合成Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の カセット１及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレ オチドトランジションをカセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオ チド位置を示す。 図１Ｂ： 合成Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の カセット２及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレ オチドトランジションをカセット配列に示す。 図１Ｃ： 合成Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の カセット３及び構成する オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションを カセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。 図１Ｄ： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレープロ−クチナーゼ をコードする合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。クチナーゼのプレ配列 、プロ配列及び成熟配列を示す。クローニングやオリゴヌクレオチドトランジシ ョンに使用する部位も示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。 図２： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプロクチナーゼをコードす る配列を、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプレ配列の誘導体をコードする配列と連結する ための合成ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。クローニングで使用する制限酵素部 位やリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を示す。コードされたｐｈｏＡシグナル配列 やクチナーゼ遺伝子の一部のアミノ酸配列も１文字コードを用いて示す。 図３： インベルターゼプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼのコード配列の融合点をコードするカセ ット８、ＳａｃＩ−ＢｃｌＩ断片のヌクレオチド配列。 図４： ｐＵＲ２７４０由来の０．２ｋｂ ＳａｌＩ−ＮｒｕＩの欠失によって 得られたプラスミドｐＵＲ２７４１は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミ ドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母１ｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母 ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領 域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ− Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シャトルベクターである。 図５： プラスミドｐＵＲ７２１９は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミ ドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母 ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領 域と成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼをコードする領 域との融合物とを含んでなるＥ． ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シャトルベクターである。 図６： プラスミドｐＵＲ２７４０は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミ ドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母 ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領 域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ− Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シャトルベクターである。 図７： ｅｘｌＡプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼのコード配列の結合の型が異なるカセット５、６及び７のヌクレオチ ド配列。 図８： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉゲノムＤＮ Ａの５．３ｋｂ ＳａｌＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入して得られた プラスミドｐＡＷ１４Ｂ。 図９： ｐＡＷ１４ＢのｅｘｌＡ読み取り枠を含むＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片 を、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓ ｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ プレ−プロ−クチナーゼコード配列を含むＢｓｐＨＩ−Ａ ｆｌ ＩＩ断片で置換して得られたプラスミドｐＵＲ７２８０。従って、プラスミ ドｐＵＲ７２８０は、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉプロモータ及びター ミネーターの制御下にあるＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレ−プ ロ−クチナーゼ遺伝子を含んでいる。 図１０： Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍ ｏｒｉ ｐｙｒＧの両方の選択マーカーをｐＵＲ７２８０に導入して得られたプ ラスミドｐＵＲ７２８１。 図１１： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ ｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ 、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏ ｒｉｏｄｅｓ 、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの 部分アミノ酸配列であって、３Ｄ構造中の残基の位置を示す。 図１２： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉク チナーゼ及びクチナーゼ変異体の、ＬＡＳを主成分とする洗剤組成物に対する相 容性。 図１３： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナー ゼ変異体の、ＰＡＳを主成分とする洗剤組成物に対する相容性。 図１４： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナー ゼ変異体の、高非イオン洗剤組成物に対する相容性。 図１５： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナー ゼ変異体の、ＳＤＳに対する相容性。 図１６： Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナー ゼ変異体Ｒ１７Ｅの洗濯中作用。参考文献 実施例１ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ プレ−プロ−クチナーゼをコードす る合成遺伝子の構築 本質的にヨーロッパ特許出願公開第４０７ ２２５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に 記載の方法に従って、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレ−プロ− クチナーゼをコードする合成遺伝子を構築した。発表されているＦｕｓａｒｉｕ ｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ 遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて（Ｓｏｌｉｄ ａｙ等（１９８４）及びＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号，Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ ｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレ− プロ−クチナーゼポリペプチドをコードする領域を含む完全合成ＤＮＡ断片を設 計した。この合成クチナーゼ遺伝子は、元のＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ 遺伝子のヌクレオチド配列に比べて幾つかのヌクレオチド変化を含み、 これにより制限酵素認識部位が、コードされたアミノ酸配列に影響することなく 遺伝子内の好都合な位置に導入されている。全合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオ チド配列を図１Ｄに示す。 合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから開始する３個の異な るカセットを集合させて合成クチナーゼ遺伝子を構築した。各合成ＤＮＡカセッ トは、最初にＥｃｏＲＩ部位を、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えている。Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ａ ＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌ クレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。各カセット を構築するため、以下に示す手順を用いた。所定のカセットを構成する等モル量 （５０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチドを標準的な技術に従って混合し、５’末 端でリン酸化し、アニールし、結合した。得られた二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分画 し、電気溶出でゲルから回収した。得られた合成ＤＮＡカセットをｐＵＣ９の２ ．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ に形質転換した。適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて幾つ かのクローンのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートを両方向で完全に配列決 定し、合成カセットの配列を確定した。この手順を用いて、ｐＵＲ７２０７（カ セット１を含む、図１Ａ）、ｐＵＲ７２０８（カセット２を含む、図１Ｂ）及び ｐＵＲ７２０９（カセット３を含む、図 １Ｃ）を構築した。最後に、ｐＵＲ７２０７の２．９ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ａｐａ Ｉ断片をｐＵＲ７２０８の０．２ｋｂ ＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片及びｐＵＲ７２ ０９の０．３ｋｂ ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合させて、合成クチナー ゼ遺伝子を作成し、ｐＵＲ７２１０を得た。このプラスミドは、Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ の完全プレ−プロ−クチナーゼをコードする読み取 り枠を含んでいる（図１Ｄ）。実施例２ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ でのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉ ｓｉ （プロ）クチナーゼの発現 合成クチナーゼ遺伝子を用いて、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に記載のものと機能的に同様のＥ．ｃｏｌ ｉ 用発現ベクターを構築した。Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプロ クチナーゼをコードする合成遺伝子の部分の前に、適切なＥ．ｃｏｌｉ発現シグ ナル、即ち（ｉ）誘導性プロモーター、（ii）リボソーム結合部位、及び（iii ）翻訳開始コドンを提供し、またプロクチナーゼの細胞質膜からの送出に必要な 情報を提供するシグナル配列が位置する構 築物を設計した。 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡシグナル配列の誘導体（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ等、１９ ８３）を合成クチナーゼ遺伝子のプロ配列と融合するための合成リンカーを設計 した（図２参照）。シグナルペプチドの開裂やプロクチナーゼの分泌を最適化す るため、このリンカーのヌクレオチド配列は、ｐｈｏＡシグナル配列の３個のＣ 末端アミノ酸残基（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ）をＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａに変換 し、クチナーゼプロ配列のＮ末端アミノ酸残基（Ｌｅｕ１、図１Ｄ参照）をＡｌ ａに変換するようなものであった。この構築により、クチナーゼのペリプラスム 間隙内への分泌は確実である（ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号参照、Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。 このような構築物を得るため、クチナーゼプレ配列とプロ配列の一部を含む６ ９ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＵＲ７２１０から取り出し、Ｅ．ｃｏｌ ｉ ｐｈｏＡプレ配列の誘導体及びクチナーゼプロ配列の改変Ｎ末端アミノ酸残 基を提供する合成ＤＮＡリンカー配列（ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片）で置換した （図２）。得られたプラスミドをｐＵＲ７２５０と名付け、これを使用して、リ ボソ ーム結合部位及びｐｈｏＡシグナル配列コード領域に融合したプロクチナーゼコ ード領域を含む０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。この 断片をｐＭＭＢ６７ＥＨの８．９ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｆｕ ｒｓｔｅ等、１９８６）と連結して、ｐＵＲ７２２０を得た。このプラスミドで は、プロクチナーゼをコードする合成遺伝子をｐｈｏＡシグナル配列の変種と融 合して、誘導性ｔａｃプロモーターの制御下に置く。 ｐＵＲ７２２０を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６を、 ０．０１７Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０１７Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １２ｇ／ｌ バクト−トリプトン ２４ｇ／ｌ バクト−酵母抽出物 ０．４％グリセロール（ｖ／ｖ） からなる０．５リットルのＩＸＴＢ培地（Ｔａｒｔｏｆ及びＨｏｂｂｓ，１９８ ８）を含む２リットルの振盪フラスコで増殖させた。 培養物を強く振盪しながら（１５０ｒｐｍ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリ ンの存在下、２５℃〜３０℃で一晩増殖させた。６１０ｎｍでのＯＤは１０〜１ ２であった。 次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し て、最終濃度を１０μＭとし、更に１２〜１６時間インキュベーションを継続し た。培養物から取り出した試料の分析判定で、生じた脂肪分解活性の量に更なる 顕著な増加が観察できなかったときには、細胞を遠心分離で収集し、最初の培養 容量の２０％スクロース含有緩衝液に０℃で再度懸濁させた。細胞を遠心分離で 収集し、最初の培養容量の氷冷水に再度懸濁させると、浸透圧ショックで細胞が 溶解した。細胞破片を遠心分離で除去し、無細胞抽出物に酢酸を添加してｐＨ４ ．８に酸性化し、４℃で一晩放置し、得られた沈殿物を除去した。この段階で、 無細胞抽出物の超濾過／凍結乾燥により、殆ど内在性リパーゼを含まない純度７ ５％以上のクチナーゼ調製物が得られた。あるいは、ＳＰ−ｓｅｐｈａｄｅｘ上 に酸性化無細胞抽出物を負荷し、酵素をｐＨ８．０の緩衝液で溶出し、濃アルカ リ性溶液を適量のＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｗｈａｔｍａｎ ＤＥ−５２ ）に通し、ＤＥＡＥ通過液を直接Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）カラムに通すことによって、クチナーゼを均一になるまで精製（純度９ ５％以上）することができる。塩勾配で 溶出すると、典型的には７５％以上の総収率で、均一なクチナーゼ調製物が得ら れた。実施例３ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの変異体をコードする遺 伝子の構築 実施例１に記載のＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレ−プロ−ク チナーゼの合成遺伝子を使用して、コード化したアミノ酸配列に変化を含む変異 体遺伝子を構築した。この構築では、完全合成遺伝子を構成する３個のカセット の構築について実施例１で説明したのと本質的に同じ方法を適用した。例えば、 突然変異を起こすべき位置のコード化トリプレットをカバーする２個のオリゴを 除いて、実施例１に記載したのと同じオリゴヌクレオチド（オリゴ）を用いて新 種のカセット１を作成した。代わりには、２個の新しい合成オリゴを使用した。 これらのオリゴは、突然変異体配列を含んでいるが、これ以外は置換前のオリゴ と同一である。実施例３Ａ ＣＵＴＩ１Ｃ ＩＧ及びＣＵＴＩ１Ｉ ＩＧの代わりにそれぞれＣＵＴＩ１Ｃ ＩＧ変異体（ＡＧＡの代わりにＧ ＡＧを含む）及びＣＵＴＩ１Ｉ ＩＧ変異体（ＴＣＴの代わりにＣＴＣを含む） を取り込むカセット１の変異体を用いて、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐ ｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅをコードする遺伝子を構築した（図１Ａ参照） 。本質的に実施例１に記載した方法で新しいカセット１をクローニングして配列 決定し、突然変異Ｒ１７Ｅを含む約１２０ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＮｒｕＩ ＤＮＡ 断片をｐＵＲ７２１０の対応断片と置換してｐＵＲ７２４０（Ｒ１７Ｅ）を得た 。このプラスミドに由来する０．６ｋＢＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用し て、ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７ ２２２（Ｒ１７Ｅ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株 ＷＫ６に形質転換した。形質転換細胞を実施例２に記載した方法で増殖させ、変 異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で回収し、精製した 。同様に、Ａｒｇ １７をＬｙｓ又はＬｅｕで置換することができた。実施例３Ｂ ＣＵＴＩ３Ｆ ＭＨ及びＣＵＴＩ３Ｍ ＭＨの代わりにそれぞれＣＵＴＩ３Ｆ ＭＨ変異体（ＣＧＧの代わりにＧ ＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３Ｍ ＭＨ変異体（ＣＣＧの代わりにＣＴＣを含む） を取り込むカセット３の変異体を用いて、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐ ｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１９６Ｅをコードする遺伝子を構築した（図３Ａ参照 ）。本質的に実施例１に記載した方法で新しいカセット３をクローニングして配 列決定し、突然変異Ｒ１９６Ｅを含む約１２０ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＮｒｕＩ Ｄ ＮＡ断片をｐＵＲ７２１０の対応断片と置換してｐＵＲ７２４１（Ｒ１９６Ｅ） を得た。このプラスミドに由来する０．６ｋＢ ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片 を使用して、ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミド ｐＵＲ７２２５（Ｒ１９６Ｅ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドをＥ． ｃｏｌｉ 株ＷＫ６に形質転換した。形質転換細胞を実施例２に記載した方法で増 殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で回収し 、精製した。ＣＵＴＩ３Ｆ ＭＨ及びＣＵＴＩ３Ｍ ＭＨの代わりにそれぞれＣ ＵＴＩ３Ｆ ＭＨ変異体（ＣＧＧの代わりにＡＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３Ｍ ＭＨ変異体（ＣＣＧの代わりにＣＴＴを含む）を用いて、同一の方法でＡｒｇ １９６をＬｙｓ（Ｒ１９６Ｋ）で置 換した。同様に、ＣＵＴＩ３Ｆ ＭＨ及びＣＵＴＩ３Ｍ ＭＨの代わりにそれぞ れＣＵＴＩ３Ｆ ＭＨ変異体（ＣＧＧの代わりにＣＴＴを含む）及びＣＵＴＩ３ Ｍ ＭＨ変異体（ＣＣＧの代わりにＡＡＧを含む）を用いて、Ａｒｇ １９６を Ｌｅｕ（Ｒ１９６Ｌ）で置換した。同一の方法を使用して、Ａｒｇ １９６をＡ ｌａ（Ｒ１９６Ａ）で置換した。実施例３Ｃ ＣＵＴＩ１Ｆ ＩＧ及びＣＵＴＩ１Ｌ ＩＧの代わりにそれぞれＣＵＴＩ１Ｆ ＩＧ変異体（ＣＴＣの代わりにＧＣＴを含む）及びＣＵＴＩ１Ｌ ＩＧ変異体 （ＧＡＧの代わりにＡＧＣを含む）を取り込むカセット１の変異体を用いて、Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｌ５１Ａをコードす る遺伝子を構築した（図１Ａ参照）。本質的に実施例１に記載した方法で新しい カセット１をクローニングして配列決定し、突然変異Ｌ５１Ａを含む約１２０ｂ ｐ ＥｃｏＲＩ／ＮｒｕＩ ＤＮＡ断片をｐＵＲ７２１０の対応断片と置換して ｐＵＲ７２４２（Ｌ５１Ａ）を得た。このプラスミドに由来する０．６ｋＢＳｐ ｅ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用して、ｐＵＲ７２２ ０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７２４５（Ｌ５１Ａ ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６に形質転換 した。形質転換細胞を実施例２に記載した方法で増殖させ、変異体プロクチナー ゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で回収し、精製した。同様にＬｅｕ ５１をＳｅｒで置換することができた。実施例３Ｄ 実施例３Ａ及び３Ｂで構築したカセットを用いて、２個の改変を含むクチナー ゼ変異体を構築することができる。実施例３Ａでは、ｐＵＲ７２４０（Ｒ１７Ｅ ）の構築を説明した。実施例３Ｂでは、突然変異Ｒ１９６Ｅを含むＥａｇＩ／Ｈ ｉｎ ｄｌＩＩ ＤＮＡ断片の構築を説明した。ｐＵＲ７２４０（Ｒ１７Ｅ）のＡ ｐａ Ｉ／ＨｉｎｄｌＩＩＤＮＡ断片をｐＵＲ７２４１のＡｐａＩ／ＨｉｎｄｌＩ Ｉ ＤＮＡ断片で置換して、ｐＵＲ７２４３（Ｒ１７Ｅ＋Ｒ１９６Ｅ）を得た。 このプラスミドに由来する０．６ｋＢ ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用し て、ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７ ２２６（Ｒ１７Ｅ＋Ｒ１９６Ｅ）を得た。このＥ． ｃｏｌｉ 発現プラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６に形質転換した。形 質転換細胞を実施例２に記載した方法で増殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を 本質的に実施例２に記載した方法で回収し、精製した。実施例３Ｅ 実施例３Ａ及び３Ｃで構築したカセットを用いて、２個の改変を含むクチナー ゼ変異体を構築することができる。実施例３Ａでは、ｐＵＲ７２４０（Ｒ１７Ｅ ）の構築を説明した。実施例３Ｃでは、突然変異Ｌ５１Ａを含むＤＮＡ断片の構 築を説明した。ｐＵＲ７２４２のＢｃｌＩ／ＡｐａＩ 断片をｐＵＲ７２４０の 対応する断片で置換して、ｐＵＲ７２４４（Ｒ１７Ｅ＋Ｌ５１Ａ）を得た。この プラスミドに由来する０．６ｋＢ ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用して、 ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７２４ ６（Ｒ１７Ｅ＋Ｌ５１Ａ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドを使用して 、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６に形質転換した。形質転換細胞を実施例２に記載した方 法で増殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で 回収し、精製した。実施例４ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ でのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓ ｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの発現 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ合成遺伝子の発現のために、成熟クチナーゼ をコードする合成遺伝子の前に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼのプ レ配列（Ｔａｕｓｓｉｇ及びＣａｒｌｓｓｏｎ，１９８３）及び強い誘導性ｇａ ｌ７プロモーター（Ｎｏｇｉ及びＦｕｋａｓａｗａ，１９８３）が存在する発現 ベクターを構築した。このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生する ため、インベルターゼプレ配列のコード配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコー ド配列と融合するアダプター断片を合成した。この断片を、本質的に実施例１に 記載したようなｐＵＣ９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットとして作成して （カセット８、図３参照）、ｐＵＲ７２１７を得た。プラスミドｐＵＲ７２１０ 及びｐＵＲ７２１７をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１１０（ｄａｍメチラーゼ活性の欠失 した株）に形質転換し、ｐＵＲ７２１７の２． ８ｋｂ ＢｃｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１０の０．６ｋｂ Ｂｃｌ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結することにより、成熟クチナーゼポリペプチドの コード化ヌクレオチド配列がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列 コード領域の一部と融合したｐＵＲ７２１８を得た。 ｐＵＲ２７４０の８．９ｋｂ ＮｒｕＩ−ＳａｌＩ断片を単離し、ＳａｌＩ突 出末端をクレノーポリメラーゼで充填し（fill in）、断片を再度円形にして（r ecircularization）、ｐＵＲ２７４０（Ｖｅｒｂａｋｅｌ，１９９１，図６参照 ）から発現ベクターｐＵＲ２７４１（図４参照）を誘導した。ｐＵＲ２７４１の ７．３ｋｂ ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１８の０．７ｋｂ Ｓ ａｃ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結して、ｐＵＲ７２１９を得た（図５参照）。 場合によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｏｌＩＩターミネーターをクチナ ーゼ遺伝子の後ろのＨｉｎｄＩＩＩ部位に置くことができるが、これはクチナー ゼ遺伝子の効果的な発現には重要ではないことが判明した。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シャトルプラスミドｐＵＲ７２１９は、２μプラスミドを 保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 株（ｃｉｒ⁺株）の複製起点と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ ｌｅｕ２^-株での高コピー数形質転換細胞の選択を可能とするプロモー ター欠失種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｌｅｕ２遺伝子と、強い誘導性Ｓ．ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇａｌ７プロモーターの制御下にあってＳ．ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ インベルターゼプレ配列に操作的に連結したＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌ ａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの成熟部分をコードする合成遺伝子とを含んでいる 。 酵母細胞の電気穿孔法の標準的なプロトコルを用いて、株ＹＴ６−２−ｌＬ（ Ｅｒｈａｒｔ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，１９８１）と同一のＳ．ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ 株ＳＵ５０（ａ，ｃｉｒ⁰，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１）を、２μ のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプラスミドとｐＵＲ７２１９との等モル混合物で同 時形質転換した。ロイシン原栄養性について形質転換細胞を選択し、幾つかの形 質転換細胞から全ＤＮＡを単離した。全ての形質転換細胞は、２μプラスミド及 びｐＵＲ７２１９の両方を含むように思え、このことは、ｐＵＲ７２１９上に含 まれるプロモーター欠失種のｌｅｕ２遺伝子が、２μ酵母プラスミドと共存 するために高いコピー数で存在すると、ｌｅｕ２欠失株を単に機能的に補い得る ことを示している。完全培地で４０世代以上培養し、次いで固形の選択及び完全 培地でレプリカ平板培養して１個の形質転換細胞をｐＵＲ７２１９プラスミドに ついて処理（cure）し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１（ａ，ｃｉｒ⁺， ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎｌ）を得た。 ｐＵＲ７２１９を保有するＳ．ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ 株ＳＵ５１を、 −アミノ酸を含まない酵母窒素塩基（YNB） 6.7g/l −ヒスチジン 20mg/l −グルコース 20g/l からなる０．２リットルのＭＭ培地を含む１リットルの振盪フラスコ内で増殖さ せた。 培養物を強く振盪（１５０ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させた。６１０ ｎｍでのＯＤは２〜４であった。細胞を遠心分離により収集し、２リットルの振 盪フラスコ内で、 −酵母抽出物 10g/l −バクトペプトン 20g/l −ガラクトース 50g/l からなる１リットルのＹＰＧＡＬ培地に再度懸濁させ、更に１２〜１６時間イン キュベーションを継続した。一定の間隔で、試料を培養物から取り出し、遠心分 離にかけてバイオマスを除去した。オリーブ油を基質として用い、上清のクチナ ーゼ活性を滴定法で分析した。各試料に対し、５．０ｍｌのリパーゼ基質（Ｓｉ ｇｍａ、リパーゼの基質としてオリーブ油を含む）と２５．０ｍｌの緩衝液（５ ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ９．０，４０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ）の撹拌混合物に１００〜２００μｌの濾液を添加した。３０℃でアッセイを実 施し、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＤＬ２５滴定装置を用い、０．０５Ｍ ＮａＯＨによる ｐＨ９．０までの自動滴定により脂肪酸の放出を測定した。滴定液量対時間の曲 線が得られた。試料中に含まれるリパーゼ活性の量を、この曲線の最大勾配から 計算した。１酵素活性単位は、前述の条件下で、１分間でオリーブ油から１μｍ ｏｌの脂肪酸を放出させる酵素の量として定義する。このような測定法は、当業 者には公知である。 クチナーゼ活性の発生量が増加しなくなると、細胞を遠心分離にかけて除去し 、無細胞抽出物に酢酸を加えてｐＨ４．８に酸性化して、クチナーゼを実施例１ に記載した方 法で回収した。実施例５ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ でのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチ ナーゼの変異体の発現 ｐＵＲ７２４１（Ｒ１９６Ｅ）の０．５ｋｂ ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片 を使用してｐＵＲ７２１８の類似断片を置換し、変異を含む遺伝子がＳ．ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ シグナル配列をコードする配列に操作的に融合したｐＵＲ７２２ ９（Ｒ１９６Ｅ）を得た。ｐＵＲ２７４１の７．０ｋｂ ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩ ＩＩ断片を、ｐＵＲ７２２９（Ｒ１９６Ｅ）の０．７ｋｂ ＳａｃＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片に連結して、ｐＵＲ７２３５（Ｒ１９６Ｅ）を得た。このプラスミド を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１に形質転換した。得られた形 質転換細胞を実施例４に記載した方法でインキュベートし、産生した変異体酵素 を実施例４及び１に記載した方法で培養ブロスから回収した。実施例６ ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナー ゼの発現 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａ ｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の発現のために、Ｆｕｓａ ｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ プレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺 伝子をＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉの強い誘導性ｅｘｌＡプロモーター （Ｍａａｔ等，１９９２，ｄｅ Ｇｒａａｆｆ等１９９２）の制御下に置いた発 現ベクターを構築した。 プラスミドｐＡＷ１４Ｂからプレ−プロ−クチナーゼ発現プラスミド（ｐＵＲ ７２８０）を構築した。前記ｐＡＷ１４Ｂは、１９９０年５月３１日にＣＢＳ２ ３７．９０の番号でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅ ｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにＥ．ｃｏ ｌｉ 株ＪＭ１０９で寄託されたものであり、０．７ｋｂのエンドキシラナーゼII （ｅｘｌＡ）遺伝子が２．５ｋｂの５’フランキング配列及び２．０ｋｂの３’ フランキング配列と共に存在する約５．３ｋｂのＳａｌＩ断片を含んでいる（図 ８）。ｐＡＷ１４Ｂで、ｅｘｌＡコード化領域をプレ−プロ−クチナーゼコード 化領域で置換した。ｅｘｌＡ遺伝子の開始コドン（Ａ ＴＧ）を含むＢｓｐＨＩ部位（５’−ＴＣＡＴＧＡ−３’）及びｅｘｌＡ遺伝子 の終結コドン（ＴＡＡ）を含むＡｆｌＩＩ部位（５’−ＣＴＴＡＡＧ−３’）は 、ｐＵＲ７２８０の構築を容易にした。 以下の方法で構築した：ｐＡＷ１４Ｂ（７．９ｋｂ）をＢｓｐＨＩで部分的に 切断し、線状化プラスミド（７．９ｋｂ）をアガロースゲルから単離した。その 後、単離した７．９ｋｂ断片を、問題のＢｓｐＨＩ部位の数ヌクレオチド下流で 切断するＢｓｍＩで切断して、他のＢｓｐＨＩ部位で線状化したプラスミドを除 去した。断片をアガロースゲルで分離し、７．９ｋｂ ＢｓｐＨＩ−ＢｓｍＩ断 片を単離した。これをＡｆｌＩＩで部分的に切断し、得られた７．２ｋｂ Ｂｓ ｐ ＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を単離した。 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコード する全読み取り枠を含むｐＵＲ７２１０の０．７ｋｂ ＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ 断片を、ｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂ ＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片と連結して、 ｐＵＲ７２８０を得た。その後、構築したベクター（ｐＵＲ７２８０）を従来の 同時形質転換技術によりカビ（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａ ｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 変異株ａｗａｍｏｒｉ等）に移植することができ 、次いでプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子をエンドキシラナーゼIIプロモーターの 誘導により発現させることができる。構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の 選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ）ヒグロマイシン等）を備えていて もよく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク 質を産生してもよい。一例としては、ａｍｄＳ及びｐｙｒＧ選択マーカーを発現 ベクターに導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生した。このため、合成オリ ゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を用いて（プレ−プ ロ−クチナーゼ遺伝子のＡＴＧコドンの１．２ｋｂ上流に存在する）ＥｃｏＲＩ 部位をＮｏｔＩ部位に変換してＮｏｔＩ部位を生成して、ｐＵＲ７２８２を産生 した。全Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗ ａｍｏｒｉ ｐｙｒＧ遺伝子をそれら自体のプロモーターやターミネーターと共 に含んでいる適切なＤＮＡ断片は、フランキングＮｏｔＩ部位を備えており、こ れをｐＵＲ７２８２のＮｏｔＩ部位に導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生 した。 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａ ｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ遺伝子の代替の発現方法として、 成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前にそれ自体のプレ−プロ配列ではな く、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ ｅｘｌＡのプレ配列が存在する発現 ベクターを構築した。 このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するために、ｅｘｌＡプ レ配列のコード化配列が種々の方法で成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列に 結合した数個のアダプター断片を合成した。カセット５では、この結合は、ｅｘ ｌＡプレ配列をクチナーゼのプロ配列と融合して行う。カセット６では、ｅｘｌ Ａプレ配列を成熟クチナーゼのＮ末端残基と融合する。カセット７はカセット６ と同一であるが、コード化成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端残基を元のグリ シンからセリン残基に変えて、シグナルペプチドの開裂要件により適合するよう にした。本質的に実施例１に記載したように、カセット５、６及び７を合成オリ ゴヌクレオチドから作成した（図７参照）。カセット５を使用して、ｐＵＲ７２ １０の０．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を置換してｐＵＲ７２８７を産生 した。カ セット６、７を使用して、ｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断 片を置換し、それぞれｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９を産生した。プラスミ ドｐＵＲ７２８７、ｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９の各々について、０．７ ｋｂ ＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片をｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂ ＢｓｐＨＩ−Ａｆｌ ＩＩ断片と連結して、それぞれｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１及びｐＵ Ｒ７２９２を得た。 その後、従来の同時形質転換技術により、構築したｒＤＮＡベクターをカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変 異株ａｗａｍｏｒｉ）に移植し、エンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導によ りプレ−（プロ）−クチナーゼ遺伝子を発現した。本実施例でｐＵＲ７２８０に ついて説明したように（上記参照）、構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の 選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ）ヒグロマイシン）を備えていても よく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク質 を産生してもよい。 （対応するプロ配列を備えた又は備えていないＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎ ｉ ｐｉｓｉ 成熟クチナーゼコード 領域と、（Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ ｅｘｌＡプロモーター及びタ ーミネーターの制御下のクチナーゼシグナル配列又はｅｘｌＡシグナル配列とを 含む）発現ベクターｐＵＲ７２８０、ｐＵＲ７２８１、ｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ ７２９１、ｐＵＲ７２９２の各々で形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株を、 以下の条件下で増殖させた：４００ｍｌの合成培地（ｐＨ６．５）を含む多数の １リットル振盪フラスコに、胞子（最終濃度：１０Ｅ６／ｍｌ）を接種した。培 地組成を以下に示す（ＡＷ培地）： スクロース １０ｇ／ｌ ＮａＮＯ₃ ６．０ｇ／ｌ ＫＣｌ ０．５２ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．４９ｇ／ｌ 酵母抽出物 １．０ｇ／ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２２ｍｇ／ｌ Ｈ₃ＢＯ₃ １１ｍｇ／ｌ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ５ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ５ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １．７ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ₄・ ５Ｈ₂Ｏ １．６ｍｇ／ｌ ＮａＨ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ １．５ｍｇ／ｌ Ｎａ₂ＥＤＴＡ ５０ｍｇ／ｌ Ｍｋ Ｘインキュベーターシェーカーで、２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間イ ンキュベートした。増殖後、細胞を濾過（０．４５μｍフィルター）して収集し 、スクロース及び酵母抽出物を含まないＡＷ培地（塩溶液）で２度洗浄し、５０ ｍｌの塩溶液に再度懸濁させ、キシロースを添加して１０ｇ／ｌの最終濃度にし た５０ｍｌの塩溶液（誘導培地）を含む３００ｍｌの振盪フラスコに移した。上 記と同一条件下でのインキュベーションを一晩継続した。得られた培養物をミラ クロス（miracloth）で濾過してバイオマスを除去し、クチナーゼを本質的に実 施例２に記載した方法で回収した。実施例７ ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナー ゼの変異体の発現 本質的に実施例６に記載した方法により、但し真菌発現ベクターの構築のため にｐＵＲ７２１０の代わりにプラス ミドｐＵＲ７２４０（Ｒ１７Ｅ）又はｐＵＲ７２４１（Ｒ１９６Ｅ）又はｐＵＲ ７２４２（Ｌ５１Ａ）を用いて、前述の変異を含むＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａ ｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼの変異体をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変異 株ａｗａｍｏｒｉで産生した。実施例８ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ遺伝子に関連する遺伝子 の同定及び単離 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼとの相同性の程度が異 なるクチナーゼのコード化遺伝子を種々の真菌から単離した。Ｈａｎｋｉｎ及び Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ（１９６８）が記載する培地２００ｍｌに０．２５％グ ルコースを補充したものを含む５００ｍｌの振盪フラスコで真菌培養物を増殖さ せ、Ｍｋ Ｘインキュベーターシェーカー（１００ｒｐｍ）で、２８℃で４日間 インキュベートした。この時点で、グルコースが消費され、本質的にＥｔｔｉｎ ｇｅｒ等（１９８７）が記載したようにクチン水解物を添加してクチナーゼの産 生を誘導した。一定の間隔で試料を培養物から取り出し、標準的な技術に従って （実施例４参照）脂肪分解活性の存在を分析した。通常、 誘導から約２日後に、脂肪分解活性を実証することができ、この時点で、標準的 な技術を用いて細胞を濾過して収集した。標準的な技術に従って、菌糸を洗浄し 、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。グアニジニウムチオシアネート法を用い て全細胞ＲＮＡ調製物を単離し、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）が記 載したように、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。ｐｏｌｙＡＴ管 （tract）ｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｇａ）を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲ ＮＡ画分を単離した。標準的な技術に従い、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ遺伝子に由来するｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ｐ ｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分をノーザンハイブリダイゼーション分析で使用して 、クチナーゼ関連遺伝子の発現を検証した。ＺＡＰ ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を供給業者の指示に従って用いて、プロ ーブとハイブリダイズし得る物質を含むｍＲＮＡ調製物でｃＤＮＡを合成して、 ｐｏｌｙ−Ａ領域に隣接しているＸｈｏＩ付着端と、他端にＥｃｏＲＩアダプタ ーを有するｃＤＮＡ断片を得た。得られたｃＤＮＡ断片を用い、λＺＡＰＩＩベ クタ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ ｏｌｌａ）でのセンス方向のダイレクショナルクローニングにより発現ライブラ リーを構築すると、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（Ｈｕｓｅ等、１９８ ８）を発現することができた。Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチ ナーゼに対する抗血清を用いて、これらのライブラリーをスクリーニングした。 あるいは、クチナーゼ特異的プライマー（表２参照）を用いて、合成ｃＤＮＡ 画分をＰＣＲスクリーニングにかけた。これらのプライマーは、数種の真菌クチ ナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）の比較により得 られたものである。Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ由来 のｃＤＮＡを対照として用いて、ＰＣＲ反応の条件を、各組のプライマーについ て最適化した。同一条件下で、長さがＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓ ｉ クチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣＲ断片と同様である（又はそれ以 上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得るｃＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ 断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。 代替の方法としては、クチナーゼ特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニ ング技術は更に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ のゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることにより、 幾つかの真菌株のゲノムＤＮＡに直接適用される。同一条件下で、長さがＦｕｓ ａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣ Ｒ断片と同様である（又はそれ以上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得る 真菌ゲノムＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動で精製して、ゲル から単離した。 発現ライブラリー法又は（ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを用いる）ＰＣＲス クリーニング法で陽性と評価された株や、他の幾つかの株について、高分子量ゲ ノムＤＮＡを単離した。株を本質的にＥｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）の記載し た方法で増殖させ、ゲノムＤＮＡをＧｒａａｆｆ等（１９８８）が記載した方法 で単離した。ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、類似ｃＤＮＡインサート （発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）又はＦｕｓ ａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ遺伝子（他の株）をプローブと して用いて、サザンハイブリダイゼーションで分析し、クチナーゼ遺伝子の物理 マップを構築した。ゲノムＤＮＡの適切な消化物をゲ ル電気泳動でサイズ分画し、適切サイズの断片をゲルから単離し、ｐＵＣ１９に サブクローニングした。これらのゲノムライブラリーを対応するｃＤＮＡインサ ート（発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）でスク リーニングして、クチナーゼ遺伝子のゲノムコピーを含むクローンを産生した。 これらの遺伝子を両方向に配列決定した。対応ｃＤＮＡを配列決定するか又は他 のクチナーゼ配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）と比較してイントロンを同 定した。成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端を更にこのような比較から推定し た。標準的なＰＣＲ技術を用いて、イントロンを除去し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を 読み取り枠のすぐ下流で作成し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ インベルターゼ遺伝子（前にＳａｃＩ部位が存在する、カセット８を比較 、図３）のプレ配列のコード化配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列 に融合した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列をコードする配 列に操作的に連結したクチナーゼ遺伝子を含む産生ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断 片を、ｐＵＲ７２４１（図４参照）の７．３ｋｂ ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断 片と連結し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ 株ＳＵ５１に形質転換した。真菌クチナーゼを発現し、本質的に実施例４に 記載したように培養ブロスから回収した。実施例９ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅ、Ｒ１９ ６Ｅ、Ｒ１７Ｅ＋Ｒ１９６Ｅと種々のアニオン界面活性剤との相容性 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅ、Ｒ１９６Ｅ、Ｒ１７Ｅ＋ Ｒ１９６Ｅと種々のアニオン界面活性剤との相容性を以下の方法で試験した。種 々の洗剤製品中の酵素溶液を調製した。溶液を４０℃でインキュベートし、一定 の間隔で試料を取り出した。次いで、実施例４に記載するアッセイに従って、酵 素活性を決定した。以下の洗剤製品Ａ〜Ｃを使用した。：製品Ａ 製品Ｂ 製品Ｃ 組成物Ａ−Ｃの結果を図１２〜１４に示す。特にアニオン含量の多い組成物Ａ で、クチナーゼ変異体が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチ ナーゼよりも安定である。実施例１０ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１ ９６Ｌとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）との相容性 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１９６Ｋ、Ｒ１９６Ｌとドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）との相容性を以下の方法で試験した。０．４ｍＭ Ｓ ＤＳ及び１０ｍＭトリス中の０゜ＦＨでの酵素溶 液を調製した。溶液を４０℃でインキュベートし、一定の間隔で試料を取り出し 、実施例４に記載のアッセイに従って残留酵素活性を決定した。結果を図１５に 示す。両方のクチナーゼ変異体が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉ ｓｉ クチナーゼよりもアニオン界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウムに対して安 定であることが判明し得る。実施例１１ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅの洗濯中 活性の測定 ポリエステル／綿織布から作った試験布を純粋なオリーブ油で汚した。次いで 、各試験布を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌの洗液でインキュベー トした。通常の４０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れたＭｉｅｌｅ ＴＭＴ洗濯機でビンを撹拌した。洗液は、実施例９の粉末洗剤Ａ、Ｂを２ｇ／ｌ （２７゜ＦＨ）を含んでいた。 結果を図１６に示す。種々の洗濯条件下で、クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅの洗濯 中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチ ナーゼに比べ て改善されることは明白である。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ （登録商標）を用いて実施した。全ての条件下で、クチナーゼ変異体Ｒ１７Ｅの 方が優れていた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．（ａ）アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に 位置する１個以上の陽電荷アルギニン残基を、リシン残基、非帯電アミノ酸残基 もしくは陰電荷アミノ酸残基で置換してアニオン界面活性剤と酵素との相互静電 作用を低減することにより、及び／又は （ｂ）アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置 する１個以上のアミノ酸残基を疎水性がより小さいアミノ酸残基で置換すること によりアニオン界面活性剤と酵素との結合を低減してアニオン界面活性剤との相 容性が改善されるようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異 体。 ２．疎水性がより小さいアミノ酸残基が、グリシン、セリン、アラニン、アスパ ラギン酸及びトレオニンからなる群の中から選択される請求項１に記載のクチナ ーゼ変異体。 ３．親クチナーゼが真核生物クチナーゼである請求項１又は２に記載のクチナー ゼ変異体。 ４．親酵素が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ由来のクチナーゼに 対する抗体と免疫学的に交差反応す るクチナーゼである請求項１から３のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 ５．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼのアミ ノ酸配列又は異なるクチナーゼの対応するアミノ酸の以下の位置： １７，５１，７８，８０，８８，９６，１５６，１９５及び１９６ の１つ以上に位置する請求項１から４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体 。 ６．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼのアミ ノ酸５１及び１９５又は異なるクチナーゼの対応するアミノ酸の周辺の疎水性パ ッチに位置する請求項１から５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 ７．Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｉｅａクチナーゼの変異体であり、以下 の変異：Ａ８０Ｄ、Ａ８８Ｅ、Ｒ１５６Ｌの１個以上を含む請求項１から６のい ずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 ８．ｒＤＮＡ技術により製造されてクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を含む ｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養し、 微生物で産生されたクチナーゼ変異体を発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞 を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した 細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前 記細胞からクチナーゼを濃縮又は部分精製する段階を包含する請求項１から７の いずれか一項に記載のクチナーゼ変異体の産生方法。 ９．請求項１から７のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする遺伝 子を保有するｒＤＮＡベクターによって形質転換されて、前記クチナーゼ変異体 を発現し得るｒＤＮＡ改変微生物。 １０．５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な（改変） プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することによって微生物内に導入される クチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有する請求項９に記載のｒＤＮＡ改変 微生物。 １１．宿主微生物が真核生物、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 属もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母菌、又はＡｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ 属の真菌である請求項９又は１０に記載のｒＤＮＡ改変微 生物。 １２．請求項１から７のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする組 換えＤＮＡベクターを保有し、かつ先祖細胞のひとつで栄養要求性マーカーをコ ードする遺伝子を置換して栄養要求性突然変異体となった請求項９から１１のい ずれか一項に記載のｒＤＮＡ改変微生物。 １３．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素を コードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼのプレ配列をコードす るヌクレオチド配列を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の成熟クチ ナーゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。 １４．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素を コードするヌクレオチド配列のすぐ上流に対応プレ配列の少なくとも一部分、及 び／又は選択される宿主微生物に適したシグナル配列もしくは分泌配列をコード するヌクレオチド配列を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のクチナー ゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。 １５．請求項１から７のいずれか一項に記載の成熟クチナ ーゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、産生源の 微生物から誘導される、クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を、少 なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが‘サイレント’突 然変異の対象に対し、請求項９から１２のいずれか一項に記載の新しい宿主に好 まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように 改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入 遺伝子用ｍＲＮＡを提供する前記ポリヌクレオチド。 １６．プロ又は成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列の上流に、 請求項９から１２のいずれか一項に記載の宿主に適したシグナル配列又は分泌配 列をコードするヌクレオチド配列が位置する請求項１３から１５のいずれか一項 に記載のポリヌクレオチド。 １７．請求項１から７のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤 組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 フアン・デル・ヘイデン，ヘンドリクス・ テオドールス・ウエー・エム オランダ国、エヌ・エル―2907・カー・ベ ー・カペレ・アー／デー・イエツセル、エ イダ・64 (72)発明者 ミユステルス，ウオウテル オランダ国、エヌ・エル―3141・エル・デ ー・マースルイス、ウイペルスパーク・ 138 (72)発明者 ペーテルス，ハンス オランダ国、エヌ・エル―3051・イツク ス・ベー・ロツテルダム、サフイエルスト ラート・12 (72)発明者 フエルリツプス，コルネリス・テオドール ス オランダ国、エヌ・エル―3142・カー・ベ ー・マースルイス、ハーヘドールン・18 (72)発明者 デ・フレイグ，ヤーコブ オランダ国、エヌ・エル―3142・アー・ペ ー・マースルイス、カスタニエーダル・32

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アニオン界面活性剤との相容性が改善されるようにアミノ酸配列を改変した 親クチナーゼのクチナーゼ変異体。 ２．アニオン界面活性剤と酵素との結合を低減することによりアニオン界面活性 剤との相容性を改善した請求項１に記載のクチナーゼ変異体。 ３．アニオン界面活性剤と酵素との相互静電作用を低減することによりアニオン 界面活性剤と酵素との結合を低減した請求項１又は２に記載のクチナーゼ変異体 。 ４．アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置す る１個以上の陽電荷アルギニン残基をリシン残基で置換することによりアニオン 界面活性剤と酵素との相互静電作用を低減する請求項１から３のいずれか一項に 記載のクチナーゼ変異体。 ５．アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置す る１個以上の陽電荷アルギニン残基を非帯電アミノ酸残基で置換することにより アニオン界面活性剤と酵素との相互静電作用を低減する請求項１から３のいずれ か一項に記載のクチナーゼ変異体。 ６．アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水 性パッチ付近に位置する１個以上の陽電荷アルギニン残基を陰電荷アミノ酸残基 で置換することによりアニオン界面活性剤と酵素との相互静電作用を低減する請 求項１から３のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 ７．アニオン界面活性剤の非極性テールと結合し得る疎水性パッチ付近に位置す る１個以上のアミノ酸残基を疎水性がより小さいアミノ酸残基で置換することに よりアニオン界面活性剤と酵素との結合を低減する請求項１から３のいずれか一 項に記載のクチナーゼ変異体。 ８．疎水性がより小さいアミノ酸残基が、グリシン、セリン、アラニン、アスパ ラギン酸及びトレオニンからなる群の中から選択される請求項７に記載のクチナ ーゼ変異体。 ９．親クチナーゼが真核生物クチナーゼである請求項１から８のいずれか一項に 記載のクチナーゼ変異体。 １０．親酵素が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ に対する抗体と免疫学的に交差反応するクチナーゼである請求項１から９のいず れか一項に記載のクチナーゼ変異体。 １１．Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈ ｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ 、Ｃｏｌｌｅ ｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ 、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｉｅａ に由来するクチナーゼをコードする遺伝子の５’及び／もしく は３’末端並びに／又はクチナーゼの保存された配列と広範な相同性を示す遺伝 子によってコードされる請求項１から１０のいずれか一項に記載のクチナーゼ変 異体。 １２．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼのア ミノ酸配列又は異なるクチナーゼの対応するアミノ酸の以下の位置： １７，５１，７８，８０，８８，９６，１５６，１９５及び１９６ の１つ以上に位置する請求項１から１１のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異 体。 １３．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉクチナーゼのア ミノ酸５１及び１９５又は異なるクチナーゼの対応するアミノ酸の周辺の疎水性 パッチに位置する請求項１から１２のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 １４．Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｉｅａクチナーゼの変異体であり、以 下の変異：Ａ８０Ｄ、Ａ８８Ｅ、Ｒ １５６Ｌの１個以上を含む請求項１から１３のいずれか一項に記載のクチナーゼ 変異体。 １５．ｒＤＮＡ技術により製造されてクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を含 むｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養し、微生物で産生されたクチナーゼ変異体を発 酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナ ーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又 は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼを濃縮又は部分精製 する段階を包含する請求項１から１４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体 の産生方法。 １６．請求項１から１４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする 遺伝子を保有するｒＤＮＡベクターによって形質転換されて、前記クチナーゼ変 異体を発現し得るｒＤＮＡ改変微生物。 １７．５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な（改変） プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することによって微生物内に導入される クチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有する請求項１６に記載のｒＤＮＡ改 変微生物。 １８．宿主微生物が真核生物、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 属もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母菌、又はＡｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ 属の真菌である請求項１６又は１７に記載のｒＤＮＡ改変微生物。 １９．請求項１から１４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする 組換えＤＮＡベクターを保有し、かつ先祖細胞のひとつで栄養要求性マーカーを コードする遺伝子を置換して栄養要求性突然変異体となった請求項１６から１８ のいずれか一項に記載のｒＤＮＡ改変微生物。 ２０．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素を コードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼのプレ配列をコードす るヌクレオチド配列を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の成熟ク チナーゼ変異体又はその機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を 有するポリヌクレオチド。 ２１．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素を コードするヌクレオチド配列のすぐ上流に対応プレ配列の少なくとも一部分、及 び／又は選択される宿主微生物に適したシグナル配列もしくは分泌配列 をコードするヌクレオチド配列を有する請求項１から１４のいずれか一項に記載 のクチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。 ２２．請求項１から１４のいずれか一項に記載の成熟クチナーゼ変異体又はその 機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド であって、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼ変異体をコードするヌク レオチド配列を、少なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドン が‘サイレント’突然変異の対象に対し、請求項１６から１９のいずれか一項に 記載の新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコ ドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安 定性の改善された導入遺伝子用ｍＲＮＡを提供する前記ポリヌクレオチド。 ２３．プロ又は成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列の上流に、 請求項１６から１９のいずれか一項に記載の宿主に適したシグナル配列又は分泌 配列をコードするヌクレオチド配列が位置する請求項２０から２２のいずれか一 項に記載のポリヌクレオチド。 ２３．（ａ）成熟クチナーゼ変異体、又はプレクチナーゼ、 又は（選択された宿主細胞にとって好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配 列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄ ｓ）ＤＮＡであるが、但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始 していない場合はＡＴＧコドンを前に置くべきとし、更に翻訳されるべき遺伝子 部分は適切な終結コドンで終了する即ち前記コドンを付加するものとする、前記 ＤＮＡ； （ｂ）クチナーゼ変異体をコードするｄｓ ＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の 上流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）発現レギュロン； （ｃ）クチナーゼ変異体をコードするｄｓ ＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の 下流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）ターミネーター配列； （ｄ１）選択される宿主のゲノム内へのｄｓ ＤＮＡの取り込みを容易にするヌ クレオチド配列、又は （ｄ２）選択される宿主に適した複製起点； （ｅ１）場合によっては（栄養要求性）選択マーカー； （ｅ２）場合によっては、選択される宿主でのクチナーゼ変異体の一前駆体形態 の成熟及び／又は分泌に関与するタ ンパク質をコードするｄｓ ＤＮＡ配列 を含んでなる、クチナーゼ変異体遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を 指令し得る組換えＤＮＡベクター。 ２５．前記定義のポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に、クチナーゼの機能 発現を容易にする別の配列を更に保有する請求項２４に記載の組換えＤＮＡベク ター。 ２６．栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなる栄 養要求性マーカーを保有する請求項２４又は２５に記載の組換えＤＮＡベクター 。 ２７．請求項１から１４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体を含む酵素洗 剤組成物。