JP2004522448A - 脂質分解酵素遺伝子 - Google Patents
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Abstract
本発明者は、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子に対し高い相同性を有し従ってまた遺伝子シャッフリングに好適である新規の脂質分解酵素遺伝子を単離した。従って本発明は、脂質分解酵素をコードする２以上の相同遺伝子のファミリーシャッフリングにより脂質分解酵素に遺伝的多様性を引き起こす方法を提供する。このＤＮＡシャッフリング技術を用いて組換え遺伝子ライブラリーを創出し、該ライブラリーを好適な発現系で発現させ、発現したタンパク質を脂質分解酵素活性の点からスクリーニングする。性質の改善が見られる脂質分解酵素を求めて、発現したタンパク質をさらにスクリーニングしてもよい。本発明はまた、脂質分解酵素をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと脂質分解酵素（脂質分解酵素活性を有するポリペプチド）とを提供する。
Description
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、相同遺伝子のいわゆるファミリーシャッフリングにより脂質分解酵素に多様性を引き起こす方法に関連する。本発明は該方法に使用するポリヌクレオチドに、また該ポリヌクレオチドがコードする脂質分解酵素にも関連する。
【０００２】
発明の背景技術
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） （異名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））のリパーゼが洗剤や製パン・製菓など多様な産業目的に有用であることは周知のとおりである（欧州特許第２５８０６８号、国際公開公報Ｎｏ． ＷＯ ９４／０４０３５）。そのアミノ酸及びＤＮＡ配列は米国特許第５，８６９，４３８号で開示されている。
【０００３】
先行技術は酵素特性の改変を目的としたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼのアミノ酸配列の改変による変異体の創製を開示している。たとえば米国特許第５，８６９，４３８号、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ００／３２７５８はリパーゼ遺伝子の突然変異誘発法によるそうした変異体の産生を開示している。ＷＯ ００／３２７５８はまたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ由来の骨格とフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ホスホリパーゼ由来のＣ末端とを備えた変異体の、ＰＣＲ法による構築を開示している。
【０００４】
Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：２８８−２９１は多様な種に由来する天然相同遺伝子ファミリーのＤＮＡシャッフリングによるタンパク質の多様化を開示している。米国特許第６，１５９，６８７号はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの変異体をコードする遺伝子のシャッフリングを開示し、またＷＯ ９８／４１６２３は非相同ポリヌクレオチド配列のシャッフリングを開示している。
【０００５】
以下のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来脂質分解酵素の公開配列はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとのアミノ酸同一性が４９〜５１％である： アスペルギルス・フェチダス（Ａ． ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来リゾホスホリパーゼ（ＥＭＢＬ Ａ９３４２８、米国特許第６，１４０，０９４号）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ） （ＥＭＢＬ Ａ８４５８９、ＷＯ ９８／４５４５３）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来ホスホリパーゼＡ１ （ＥＭＢＬ Ｅ１６３１４、欧州特許第５７５１３３号、日本特許第１０１５５４９３ Ａ号）及びアスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来リゾホスホリパーゼ（ＥＭＢＬ Ａ９０７６１、ＷＯ ９８／３１７９０）。
【０００６】
Ｒ． Ｌａｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ， ３ （１−２）， １３７−１４４ （１９９０） はタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼを開示している。Ｖ．Ｗ． Ｏｇｕｎｄｅｒｏ， Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ， ７２（１）， １１８−１２６ （１９８０）はタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリパーゼ活性について記述している。米国特許第４，２７５，０１１号及び欧州特許第２５８０６８号はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼに言及している。Ｂ．Ａ． Ｏｓｏ， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， ５６： １８４０−１８４３ （１９７８）はタラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）のリパーゼ活性について記述している。
【０００７】
発明の要約
本発明者は、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子に対し高い相同性を有し、従ってまた遺伝子シャッフリングに好適である新規の脂質分解酵素遺伝子を単離した。該新規遺伝子を配列番号： ３、５、７、９及び１１として示す。若干のタンパク質とＤＮＡ配列に関する同一性を次表に示す。該新規配列は次の記号で識別する：
・ Ｔａｌｔｈｅ１Ｍ： タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の配列番号：３ ＆ ４
・ Ｔｈｅｉｂａ１Ｍ： サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来の配列番号：５ ＆ ６
・ Ｔａｌｅｍｅ１Ｍ： タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）由来の配列番号：７ ＆ ８
・ Ｔａｌｂｙｓ１Ｍ： タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）由来の配列番号：９ ＆ １０
【０００８】
以下の既知配列は比較のために含める：
・ Ｔｈｅｌａｎ１Ｍ： サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来リパーゼ、配列番号： １ ＆ ２
・ Ａｓｐｔｕｂ２Ｍ： ＥＭＢＬ Ａ８４５８９、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来リパーゼ
・ Ａｓｐｏｒｙ３Ｍ： ＥＭＢＬ Ｅ１６３１４、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来ホスホリパーゼＡ１
・ Ａｓｐｎｉｇ２Ｍ： ＥＭＢＬ Ａ９０７６１、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来リゾホスホリパーゼ
【０００９】
以下は成熟タンパク質に関する同一性表である：
【表１】
【００１０】
以下は成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する同一性表である（終止コドンは除外）：
【表２】
【００１１】
従って本発明は、脂質分解酵素をコードする２以上の相同遺伝子のファミリーシャッフリングにより脂質分解酵素を多様化する方法を提供する。一方の遺伝子はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとの同一性９０％以上の脂質分解酵素をコードし、他方の遺伝子はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとの同一性９０％以上の脂質分解酵素をコードする。該ＤＮＡシャッフリング技術を使用してキメラ遺伝子ライブラリーを創出し、該ライブラリーを好適な発現系で発現させ、発現したタンパク質を脂質分解酵素活性でスクリーニングする。発現したタンパク質をさらにスクリーニングして改良型の脂質分解酵素を同定してもよい。
【００１２】
本発明はまた、脂質分解酵素をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチド及び脂質分解酵素（脂質分解酵素活性を有するポリペプチド）を提供する。
ポリヌクレオチドは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中に存在するプラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列でもよいが、該ＤＮＡ配列は成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列もしくは該ＤＮＡ配列から１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入により誘導しうるＤＮＡ配列である。
【００１３】
該ポリヌクレオチドは成熟ペプチドをコードする配列番号： ３のＤＮＡ配列との同一性が９０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ５のＤＮＡ配列との同一性が８０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ７のＤＮＡ配列との同一性が６５％以上、又は成熟ペプチドをコードする配列番号： ９のＤＮＡ配列との同一性が６０％以上でもよい。該ポリヌクレオチドはまた、成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体でもよいし、成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしてもよい。
【００１４】
脂質分解酵素は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７又は１４０４９）内に存在するプラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列によってコードされてもよいし、配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有してもよいし、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導しうるアミノ酸配列を有してもよい。脂質分解酵素は配列番号： ６の成熟ペプチドとの同一性が８０％以上であるアミノ酸配列又は配列番号： １０の成熟ペプチドとの同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
【００１５】
脂質分解酵素はさらに、配列番号： ６又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有してもよいし、配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体でもよいし、又は成熟ペプチドをコードする配列番号： ５又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列がコードしてもよい。
【００１６】
発明の詳細な説明
ゲノム ＤＮＡ ソース
本発明の脂質分解酵素遺伝子はタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）又はサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属特にタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の菌株から、本明細書に記載のＤＮＡ配列を基に設計したプローブを使用して派生させてもよい。
たとえば配列リスト中の遺伝子とポリペプチドは下記の生物から単離した。該遺伝子を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は本発明者がブダペスト条約に基づきＤＳＭＺ（ドイツ微生物・培養細胞保存機構、所在地Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， ＤＥ）に次のとおり寄託した。
【００１７】
【表３】
【００１８】
以上のソース生物は以下の菌株保存機構から商業ベースで自由に分譲が受けられる：
ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ．
ＣＢＳ （Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ ８， ３５８４ ＣＴ Ｕｔｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．
ＵＡＭＨ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ ＆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｄｅｖｏｎｉａｎ Ｂｏｔａｎｉｃ Ｇａｒｄｅｎ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ， Ｔ６Ｇ ３ＧＩ．
ＩＭＩ： Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｂａｋｅｈａｍ Ｌａｎｅ， Ｅｎｇｌｅｆｉｅｌｄ Ｇｒｅｅｎ， ＥＧＨＡＭ， Ｓｕｒｒｅｙ ＴＷ２０ ９ＴＹ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．
【００１９】
ポリヌクレオチド
遺伝子組換え（シャッフリング）に使用するポリヌクレオチドは脂質分解酵素をコードする２以上の遺伝子であり、該酵素のうちの１個はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号： ２）との同一性が９０％以上、もう１個は同一性が５５〜９０％である。使用ポリヌクレオチドは１個以上のヌクレオチドが異なる。
【００２０】
出発物は配列番号： １、３、５、７及び／又は９のうちの２以上（たとえば３、４又は５）配列の成熟部分を含んでもよい。また、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換及び／又は挿入によって得られる、及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端へのペプチド延長鎖の付加によって得られる配列番号： ２、４、６、８及び／又は１０のうちの複数種（たとえば３、４又は５種）の変異体をコードする遺伝子を含んでもよい。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの変異体の例はたとえば米国特許第５，８６９，４３８号、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ００／３２７５８号に記載されており、また類似の変異体は他配列の対応するアミノ酸の改変により創製することができる。
遺伝子中のイントロンは随意に組換え前に除去してもよい。
【００２１】
ＤＮＡ 組換え （ シャッフリング ）
２以上の相同インプット・ポリヌクレオチド（出発ポリヌクレオチド）間のシャッフリングはアウトプット・ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリングサイクルを経た後のポリヌクレオチド）の獲得を目的としたポリヌクレオチドの断片化と断片の組換えを伴い、インプット・ポリヌクレオチドに対し多数のヌクレオチド断片の組換えが行われよう。
ＤＮＡ組換え又はシャッフリングは、２以上の出発遺伝子からキメラ遺伝子ライブラリーを生成するような（部分）ランダム法でもよい。このシャッフリング又は組換え法の実行には多数の公知方式を用いることができる。
【００２２】
該組換え法はたとえば米国特許第５，６０５，７９３号、５，８１１，２３８号、５，８３０，７２１号、６，１１７，６７９号で開示されている、親ＤＮＡのランダム断片化とそれに続くＰＣＲ法による再構成で新しい完全長遺伝子を生成するという方法でもよいし、米国特許第６，１５９，６８７号、ＷＯ ９８／４１６２３、米国特許第６，１５９，６８８号、５，９６５，４０８号、６，１５３，５１０号で開示されているｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組換え法でもよいし、またＷＯ ９７／０７２０５及びＷＯ ９８／２８４１６で開示されている生細胞中でのｉｎ ｖｉｖｏ組換え法でもよい。
親ＤＮＡの断片化にはＤＮアーゼＩ処理を用いても、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （２０００ａ， Ｇｅｎｅ ２３６：１５９−１６７）が記述している制限酵素消化を用いてもよい。２つの親ＤＮＡのシャッフリングはＫｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （２０００ｂ， Ｇｅｎｅ ２４３：１３３−１３７）が記述している２親ＤＮＡの１本鎖のシャッフリングによって行ってもよい。
ある特定のシャッフリング方式はＣｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１： ２８８−２９１及びＮｅｓｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６に記載の方法に依拠する。別の方式は米国特許第６，１５９，６８７号の実施例１及び２に記載の方法に依拠しよう。
【００２３】
脂質分解酵素の性質
本発明によって得られる脂質分解酵素はカルボン酸エステル結合を加水分解することができ、また「酵素命名法１９９２年」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）に従ってＥＣ ３．１．１として分類される。該酵素は特にリパーゼ（トリグリセロールリパーゼ）（ＥＣ ３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ１ （ＥＣ ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２ （ＥＣ ３．１．１．４）、コレステロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３）及び／又はガラクトリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．２６）としての活性をもとう。
【００２４】
その熱安定性は示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって評価した。ｐＨを５として９０℃／時で加熱したときの変性ピーク温度（Ｔｄ）はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来脂質分解酵素では７５℃強であるが、先行技術のサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素では７０℃強である。サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来脂質分解酵素は（サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素と同様に）アルカリ性ｐＨで至適活性を示し、また （サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素をやや上回る）約４．３の等電点を有する。
【００２５】
相同性とアラインメント
配列番号： ２、４、６、８及び１０の成熟部分の最適アラインメントは配列番号： ２、４及び６のＱ２４６とＰ／Ｇ２５０の間に１アミノ酸のギャップを挿入することにより実現される。このアラインメントは対応するアミノ酸を明確にする。
相同性の度合いは技術上周知のコンピュータープログラムたとえばＧＣＧプログラムパッケージとして提供されるＧＡＰ （Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５）を用いて、ポリペプチド配列比較のための設定をギャップ挿入ペナルティー３．０、ギップ伸長ペナルティー０．１として判定してもよい。
【００２６】
相同性の判定はまた、ＦＡＳＴＡパッケージｖｅｒｓｉｏｎ ｖ２０ｕ６のＡｌｉｇｎを用いて行ってもよい。Ａｌｉｇｎは一種のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント（すなわちグローバルアラインメント）ソフトウェアでありタンパク質とＤＮＡの両方のアラインメントに有効である。タンパク質とＤＮＡのアラインメントにはデフォルト得点行列ＢＬＯＳＵＭ５０と一致行列をそれぞれ使用する。ギャップ中の第１残基に対応するペナルティーはタンパク質では−１２、ＤＮＡでは−１６である。ギャップ中の追加残基に対応するペナルティーはタンパク質では−２、ＤＮＡでは−４である。
本明細書で述べている相同性は６０％以上の同一性、特に７０％以上又は８０％以上の同一性、たとえば９０％以上又は９５％以上の同一性に対応する。
【００２７】
脂質分解酵素の用途
本発明の酵素は基質特異性次第で、たとえばろ過処理の改善、植物性油の処理、製パン・製菓、洗剤、又はリゾリン脂質の調製に使用することができる。該酵素は、先行技術と同様の方法でたとえば次のような既知の脂質分解酵素用途に使用してもよい。
・ 紙パルプ産業のピッチコントロール又は古紙脱墨処理。ＷＯ ９２／１３１３０、ＷＯ ９２／０７１３８、日本特許第２１６０９８４ Ａ号、欧州特許第３７４７００号。
・ 製パン・製菓。ＷＯ ９４／０４０３５、ＷＯ ００／３２７５８。
【００２８】
・ 洗剤。ＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５。
・ 皮革産業。英国特許第２２３３６６５号、欧州特許第５０５９２０号。
・ リパーゼ活性をもつ酵素は油脂のけん化、トリグリセリドの変性、及びモノ−及びジ−グリセリドの生産に使用してもよい。
・ リパーゼ活性をもつ酵素はバルク油脂のエステル交換、フライ油脂やショートニング類、マーガリン成分の生産に使用してもよい。
・ ホスホリパーゼ（Ａ１、Ａ２）活性をもつ酵素は植物性油の脱ガムやリゾリン脂質の生産に使用してもよい。
【００２９】
ろ過処理の改善
リゾホスホリパーゼ活性をもつ酵素はその変異体による処理で糖質起源の水溶液又は懸濁液のろ過処理適性を向上させることができる。これは特に、ろ過しにくく濁ったろ液になりがちなデンプン糖質特に小麦デンプン糖質を含む溶液又は懸濁液に適用される。この処理は欧州特許第２１９，２６９号（ＣＰＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に記載の要領で行うことができる。
【００３０】
洗剤
本発明の脂質分解酵素は洗剤添加剤として、たとえば０．００１〜１０ｍｇ （たとえば０．０１〜１ｍｇ）／グラム−洗剤又は０．００１〜１００ｍｇ （たとえば０．０１〜１０ｍｇ）／リットル−洗浄液の濃度（純酵素タンパク質ベース）で使用してもよい。
本発明の洗剤組成物は、たとえば汚れた布地の前処理に適した洗濯用添加剤組成物やすすぎ水用柔軟剤を含む手洗い又は機械洗い用洗濯洗剤組成物として調製してもよいし、家庭用硬質表面クリーナーに使用する洗剤組成物として調製してもよい。洗濯洗剤では本発明の変異体が油汚れの洗い落とし、白さの維持及び黒ずみ解消に有効であろう。洗濯洗剤組成物はＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＰＣＴ／ＤＫ ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５に記載の要領で調製してもよい。
【００３１】
本発明の洗剤組成物は特に、たとえば英国特許第２，２４７，０２５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）又はＷＯ ９９／０１５３１ （Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）に記載の要領で食器手洗い又は機械洗い用として調製してもよい。食器洗い機用組成物では、本発明の変異体が油汚れの除去、高度に着色された部品による食器及び食器洗い機プラスチック部品の染み／変色の防止、及び石灰質水あかの付着防止に有効であろう。
【００３２】
本発明の洗剤組成物は任意幸便な形態たとえばバー、タブレット、粉末、顆粒、ペースト又は液体などでよい。液体洗剤は一般に７０％以下の水と０〜３０％の有機溶媒を含む水性でもよいし、非水性でもよい。
洗剤組成物は１種又は複数種の界面活性剤を含み、界面活性剤は半極性を含む非イオン系でも、陰イオン系、陽イオン系、双生イオン系でもよい。界面活性剤の含有量は一般に０．１〜６０ （重量）％たとえば０．５〜４０％、１〜３０％、特に１．５〜２０％である。
【００３３】
ベーカリー製品と生地
脂質分解酵酵素はパンやケーキなどのベーカリー製品とその生地の調製に使用して、たとえば生地の安定性や取扱い適性を改善し又はパンやケーキの弾力性を高めることができる。脂質分解酵酵素はたとえば製パン工程に使用することができるが、その場合の工程は脂質分解酵酵素をパン生地材料に添加するステップ、生地をこねるステップ、生地をパンに焼き上げるステップを含む。これは米国特許第４，５６７，０４６号（協和発酵）、日本特許第６０−７８５２９−Ａ号（キューピー）、日本特許第６２−１１１６２９−Ａ号（キューピー）、日本特許第６３−２５８５２８−Ａ号（キューピー）又は欧州特許第４２６２１１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載の要領で行うことができる。脂質分解酵酵素はＷＯ ９９／５３７６９ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載の要領で、硬化防止用アミラーゼ特にエンドアミラーゼたとえば麦芽アミラーゼと併用してもよい。脂質分解酵酵素はたとえば穀粉組成物たとえば生地や生地用プレミックスに添加してもよい。
【００３４】
材料と方法
菌株とプラスミド
プラスミドｐＭＴ２１８８
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）発現プラスミドｐＣａＨｊ ４８３ （ＷＯ ９８／００５２９）はアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）リン酸トリオース・イソメラーゼ非翻訳リーダー配列（Ｐｎａ２／ｔｐｉ）とアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アミログリコシダーゼ・ターミネーター（Ｔａｍｇ）とに融合したアスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼＩＩプロモーターを基本とする発現カセットからなる。該プラスミド上には、唯一の窒素源としてのアセトアミド上での増殖を可能にするアスペルギルス・ニドランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカーａｍｄＳも存在する。
【００３５】
これらのエレメントを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターｐＵＣ１９ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングする。このプラスミドの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中での選択を可能にするアンピシリン耐性マーカーを、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｐｙｒＦ突然変異を補完しうるサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３マーカーで置き換えたが、この置き換えは次のようにして行った：
【００３６】
プライマー１４２７７９ （配列番号： ３５）及び１４２７８０ （配列番号： ３６）を用いてｐＵＣ１９の複製起点をｐＣａＨｊ ４８３からＰＣＲ増幅した。
プライマー１４２７８０はＰＣＲ断片にＢｂｕＩ部位を導入する。この増幅にはＥｘｐａｎｄ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をこの増幅と後続の増幅に関するメーカーの説明書に従って使用した。
【００３７】
プライマー１４０２８８ （配列番号： ３７）及び１４２７７８ （配列番号： ３８）を用いてＵＲＡ３遺伝子を汎用サッカロミセス・セレビシエー（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クローニングベクターｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ， ＵＳＡ）から増幅した。
プライマー１４０２８８はＰＣＲ断片にＥｃｏＲＩ部位を導入する。２つのＰＣＲ断片を、混合とプライマー１４２７８０及び１４０２８８使用による増幅の後、オーバーラップ法によるスプライシング［Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｇｅｎｅ， ７７， ６１−６８］で融合した。
【００３８】
得られた断片をＥｃｏＲＩとＢｂｕＩで消化し、これらの同じ酵素で消化しておいたｐＣａＨｊ ４８３の最大断片にライゲートした。このライゲーション反応液を使用して、ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの方法［Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ． ａｎｄ Ａ． Ｈｉｇａ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４５， １５４］でコンピテントにしたｐｙｒＦ Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＢ６５０７ （ＡＴＣＣ ３５６７３）を形質転換した。形質転換体を、１ｇ／ｌカザミン酸、５００ μｇ／ｌチアミン及び１０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した固形Ｍ９培地［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］上で選択した。
【００３９】
選択した形質転換体に由来するプラスミドをｐＣａＨｊ ５２７と命名した。ｐＣａＨｊ ５２７上のＰｎａ２／ｔｂｉプロモーターに単純ＰＣＲ法により部位指定突然変異誘発を起こした。
ヌクレオチド１３４−１４４の配列番号： ３９から配列番号： ４０への改変には変異原プライマー１４１２２３ （配列番号： ４１）を使用した。
ヌクレオチド４２３−４３６の配列番号： ４２から配列番号： ４３への改変には変異原プライマー１４１２２２ （配列番号： ４４）を使用した。
得られたプラスミドはｐＭＴ２１８８と命名した。
【００４０】
プラスミド ｐＥＮＩ１８６１
プラスミドｐＥＮＩ１８６１は、発現プラスミド中に最新技術アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）プロモーター並びに多数のクローニング用特定制限部位を導入するために調製した。
ｐＭＴ２１８８（前述）を鋳型としプライマー０５１１９９Ｊ１ （配列番号： ４５）及び１２９８ＴＡＫＡ （配列番号： ４６）を使用してｐＣＲ断片（約６２０ｂｐ）を調製した。
【００４１】
該断片をＢｓｓＨＩＩとＢｇｌＩＩで切断し、やはりＢｓｓＨＩＩとＢｇｌＩＩで切断しておいたｐＥＮＩ１８４９にクローニングした。このクローニングを配列解析で確認した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）とアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の両方で作動するプロモーターを導入するためにプラスミドｐＥＮＩ１９０２を調製した。これは特定部位削除法により、「カメレオン２本鎖部位指定突然変異誘発キット」を用いてメーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）推奨に従って実行した。
【００４２】
プラスミド ｐＥＮＩ１８６１
プラスミドｐＥＮＩ１８６１は鋳型として、また１７７９９６ （配列番号： ４７）、１３５６４０ （配列番号： ４８）及び１３５６３８ （配列番号： ４９）の５’リン酸化プライマーは選択プライマーとして用いた。
５’リン酸化０８０３９９Ｊ１９プライマー（配列番号： ５０）を変異原プライマーとして用いて、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現プロモーターに−３５及び−１０プロモーターコンセンサス配列（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来）を導入した。この突然変異の導入は配列解析で確認した。
【００４３】
プラスミド ｐＥＮＩ１９６０
Ｇａｔｅｗａｙ ＶｅｃｔｏｒＴＭ変換システム［Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）カタログ番号１１８２８−０１９］を用いてプラスミドｐＥＮＩ１９６０を調製した。これは、ｐＥＮＩ１９０２をＢａｍＨＩで切断し、クレノウ酵素とヌクレオチドを用いてＤＮＡ末端を埋め（て平滑端とし）、次いでリーディングフレームのＡ ＧａｔｅｗａｙＴＭ ＰＣＲフラグメントにライゲートする方法で行った。正しい方向のクローニングを配列解析で確認した。
【００４４】
培地と基質
ＹＰＧ： ４ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４−７ａｑ、５ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ ６．０。
【００４５】
実施例
実施例 １．脂質分解酵素遺伝子を収めたプラスミド
ゲノム ＤＮＡ の調製
ゲノムＤＮＡソースとしてサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）、タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株を用いた。１００ｍｌのＹＰＧ中で各菌株を適正温度で数日間培養した。菌糸体を集めて液体窒素中で破砕し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ ＳＤＳを添加した２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）緩衝液中に懸濁させ、次に１２μｌのプロテイナーゼＫ （２５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。懸濁液を３０〜６０分間６５℃に保った。フェノール抽出によりタンパク質を除去し０．７体積のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を滅菌水で溶解しＲＮアーゼを添加した。フェノール／イソアミルアルコール抽出後、ＥｔＯＨを加えてＤＮＡを沈殿させた。
【００４６】
脂質分解酵素遺伝子の ＰＣＲ スクリーニング
アラインメントリパーゼを土台にして設計したＨＬ２及びＨＬ１２ （配列番号： ５１及び５２）又はＨＬ２及びＨＬ６ （配列番号： ５１及び５３）を用いて、各ゲノムＤＮＡを対象にＰＣＲを行った。
反応成分［２．６ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ、各々２５０ｍＭのｄＮＴＰ、各々２５０ｎＭのプライマー、０．１Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ／１×緩衝液 （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｊａｐａｎ）］を混合し次の条件でＰＣＲを行った：
【００４７】
【表４】
【００４８】
ステップ１〜３は３０回繰り返した。
５４０ｂｐの断片と３８０ｂｐの断片をそれぞれプライマーセットＨＬ２／ＨＬ１２及びＨＬ２／ＨＬ６から増幅した。増幅断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル精製した。各ＤＮＡを配列解析し、リパーゼと比較すると、クローンがリパーゼの内側部分をコードしていると判明した。
【００４９】
リパーゼ遺伝子のクローニング
ＬＡ ＰＣＲＴＭ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ）を用いてメーカーの説明書に従って各リパーゼ遺伝子をクローニングした。たとえばゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、各ＤＮＡを同キットの好適カセットでライゲートした。各ライゲーション溶液を、内側配列から設計したプライマーとキットのカセットプライマーによるＰＣＲにかけた。増幅ＤＮＡ断片の配列を解析した。ＯＲＦが決定されるまでこのステップを繰り返した。
【００５０】
同キットのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼは忠実度が高くないので、適正配列を得るためにメーカーの説明書に従って全遺伝子をＥｘｐａｎｄ高忠実度ポリメラーゼで増幅した。
増幅ＤＮＡ断片はＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｐＴ７Ｂｌｕｅベクター又はｐＳＴ Ｂｌｕｅ−１ ＡｃｃｅｐＴｏｒベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲートした。このライゲーション反応液を使用して大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９又はＤＨ５αを形質転換した。各遺伝子の４プラスミドの配列を決定し、比較した。多数派の配列を正しいヌクレオチド配列とする。
【００５１】
実施例 ２．アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 発現ベクターへのリパーゼ遺伝子のクローニング
ＰＷＯポリメラーゼを使用して３件のＰＣＲを次の条件で行った： ９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間。いずれの場合も使用鋳型（脂質分解酵素遺伝子を収めたプラスミド。実施例１の要領で調製）及びプライマーは次のとおり：
【００５２】
Ａ： タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ１／０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１ ＆ １８）
Ｂ： タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ９／０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９ ＆ ２６）
Ｃ： サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ１７／０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７ ＆ ３４）。
【００５３】
ＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製し、ｐＥＮＩ１９６０（前述） へとＧａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に導入し、配列を解析し、もってｐＥＮＩ２１４６ （タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）リパーゼ遺伝子）、ｐＥＮＩ２１４７ （サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼ遺伝子）、ｐＥＮＩ２１４８ （タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ遺伝子）を調製した。
これらをＪａｌ２５０ （ＷＯ ００／３９３２２で開示）に導入し、ＷＯ ００／２４８８３に記載の要領でリパーゼ活性を評価した。
【００５４】
実施例 ３．イントロンレス・リパーゼ遺伝子の構築
タラロミセス・サーモフィルス （Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４８及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ１ ＆ ０５１２００Ｊ３ （配列番号： １１ ＆ １３）
２： ０５１２００Ｊ２ ＆ ０５１２００Ｊ５ （配列番号： １２ ＆ １５）
３： ０５１２００Ｊ４ ＆ ０５１２００Ｊ７ （配列番号： １４ ＆ １７）
４： ０５１２００Ｊ６ ＆ ０５１２００Ｊ８ （配列番号： １６ ＆ １８）
【００５５】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ１及び０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１及び１８、メーカーのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
【００５６】
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラム（カタログ番号７３２−６２２５）で精製した。
ＰＣＲ断片を（ｃｃｄＢ遺伝子の切断を目的に） ＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００５７】
タラロミセス・エメルソニル （Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４６及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ９ ＆ ０５１２００Ｊ１１ （配列番号： １９ ＆ ２１）
２： ０５１２００Ｊ１０ ＆ ０５１２００Ｊ１３ （配列番号： ２０ ＆ ２３）
３： ０５１２００Ｊ１２ ＆ ０５１２００Ｊ１５ （配列番号： ２２ ＆ ２５）
４： ０５１２００Ｊ１４ ＆ ０５１２００Ｊ１６ （配列番号： ２４ ＆ ２６）
【００５８】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ９及び０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９及び２１、メーカーの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラムで精製した。
ＰＣＲ断片をＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのタラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００５９】
サーモミセス・イバダネンシス （Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４７及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ１７ ＆ ０５１２００Ｊ１９ （配列番号： ２７ ＆ ２９）
２： ０５１２００Ｊ１８ ＆ ０５１２００Ｊ２１ （配列番号： ２８ ＆ ３１）
３： ０５１２００Ｊ２０ ＆ ０５１２００Ｊ２３ （配列番号： ３０ ＆ ３３）
４： ０５１２００Ｊ２２ ＆ ０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ３２ ＆ ３４）
【００６０】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ１７及び０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７及び３４、メーカーの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラムで精製した。
ＰＣＲ断片をＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００６１】
実施例 ４．脂質分解酵素遺伝子のシャッフリング
脂質分解酵素をコードするＤＮＡ配列を収めた複数のプラスミドを等量混合する。以下の成分をマイクロチューブ中で混合する：
２μｌのプラスミド混合液（０．１５μｇ／μｌ）、遺伝子を挟む特異的プライマー（１ｐｍｏｌ／μ）、２μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、０．５μｌのＴａｑ酵素（全量２０μｌ）。
チューブをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００サーモサイクラーにセットする。以下のＰＣＲプログラムを実行する： （９４℃５分間） １サイクル、（９４℃３０秒間、７０℃ ０秒間） ９９サイクル、（７２℃２分間、４℃不定） １サイクル。
【００６２】
ＰＣＲ反応液を１．５％アガロースゲルにかける。特定期待サイズのＤＮＡバンドをアガロースゲルから切り出し、ＪＥＴｓｏｒｂ （ＧＥＮＯＭＥＤ Ｉｎｃ．）を用いて精製する。精製ＰＣＲ産物を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＡクローニングキットに含まれる） ＴＡベクターにクローニングする。このライゲーション産物を標準大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株（ＤＨ５ａ）に導入する。
組換え配列は次にＥ． ｃｏｌｉ ＴＡベクターからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片（ＷＯ ９７／０７２０５を参照）として酵母ベクターｐＪＳＯＯ２６ （ＷＯ ９９／２８４４８）にサブクローニングし、また性質の改善たとえば洗剤の性能向上（ＷＯ ９７／０７２０５を参照）につながる新しい組換え配列のスクリーニングなどに回すことができる。
【００６３】
実施例 ５．脂質分解酵素遺伝子のシャッフリング
脂質分解酵素遺伝子のＰＣＲ産物を前実施例の要領で調製し、等量を混合する。適当なチューブを用いて以下の成分を混合する：
１μｌのＰＣＲ産物混合液（０．１μｇ）、デカマー・ランダムプライマー（３００ ｐｍｏｌ）、２μｌの１０×クレノウ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ （全量２０μｌ）。 この混合液をＰＥ ２４００サーモサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行する： ９６℃５分間、２５℃５分間、０．５ｍｌクレノウ酵素添加、２５℃６０分間、３５℃９０分間。
【００６４】
この手順により、遺伝子のすべての部分に由来するきわめて多数の小ＤＮＡポリマーが得られる。
１０μｌを分取してアガロースゲルで試験する。
１０μｌのＰＣＲ反応液［０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μｌ Ｔａｑ酵素］をサーモサイクラー中のチューブの１０μｌに加える。次に以下の標準ＰＣＲプログラムを実行する：（９４℃５分間） １サイクル、（９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃３０秒間） ２５サイクル、７２℃７分間、４℃不定。
【００６５】
ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにかける。期待サイズのバンドを切り出す。ＰＣＲ産物をクローニング前に増幅するために追加のＰＣＲを、特異的プライマー（前述）を使用して行う。
ＰＣＲ産物と所望ベクターを好適な制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）で切断する。ベクターとＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにかけ、ゲルから精製する。
切断後のＰＣＲ産物とベクターをリガーゼ緩衝液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合する。１６℃で一晩ライゲーション後、反応液を使用して大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａを形質転換する。
【００６６】
実施例 ６．イントロンレス・リパーゼ遺伝子の創出
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）と相同性を有する多数のリパーゼ遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子はゲノムＤＮＡとしてクローニングしており、従ってイントロンを含んでいた。
これらの遺伝子のシャッフリングによりキメラ遺伝子を得ることにした。可能な限り高品質のライブラリーを得るには、イントロンを除去する必要があった。これは、エキソンの上流側と下流側にそれぞれマッチすると同時にすぐ隣のエキソンと相同のＤＮＡ配列を有するＤＮＡオリゴを創出することにより実行した。
【００６７】
これらのオリゴを技術上周知の標準ＰＣＲに使用して、遺伝子中の各エキソンをことごとくカバーするＰＣＲ断片を創出した。これらのＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製した。精製したＰＣＲ断片を２回目のＰＣＲで完全長遺伝子へと再構成したが、そこでは全遺伝子を挟むＤＮＡオリゴをプライマーとして使用した。
リパーゼをコードする完全長イントロンレス遺伝子を収めたＰＣＲ断片を、特許出願ＰＣＴ／ＤＫ０２／０００５０に記載の要領でｐＥＮＩ１９６０にクローニングした。
【００６８】
各イントロンレス遺伝子の再構成には以下のプライマーを使用した：
タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）： ０５１２００Ｊ１、０５１２００Ｊ２、０５１２００Ｊ３、 ０５１２００Ｊ４、０５１２００Ｊ５、０５１２００Ｊ６、０５１２００Ｊ７、０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１−１８）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１７８が生成。
タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）： ０５１２００Ｊ９、０５１２００Ｊ１０、０５１２００Ｊ１１、 ０５１２００Ｊ１２、０５１２００Ｊ１３、０５１２００Ｊ１４、０５１２００Ｊ１５、０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９−２６）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１５９が生成。
【００６９】
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）： ０５１２００Ｊ１７、０５１２００Ｊ１８、０５１２００Ｊ１９、０５１２００Ｊ２０、０５１２００Ｊ２１、０５１２００Ｊ２２、０５１２００Ｊ２３、０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７−３４）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１６０が生成。
タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）： ０８０２０１Ｐ１、０８０２０１Ｐ２、０８０２０１Ｐ３、０８０２０１Ｐ４、０８０２０１Ｐ５、０８０２０１Ｐ６、０８０２０１Ｐ７、０８０２０１Ｐ８ （配列番号： ５４−６１）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２２３０が生成。
【００７０】
実施例 ７．イントロンレス・リパーゼ遺伝子のシャッフリング
ｄＵＴＰとウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼとを使用する方法でＤＮＡシャッフリング用に十分な量のＤＮＡ断片を調製するようにした。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）の３遺伝子は互いに相同性がきわめて高い（ので、Ａ群と命名）し、またタラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）とタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の場合も同様である（Ｂ群と命名）。そこで両群間の組換えを改善するために、ｐＥＮＩ２１７８、ｐＥＮＩ２１５９、ｐＥＮＩ２１６０及びｐＥＮＩ２２３０を鋳型とするＰＣＲスキーム（図１参照）を採用し、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）遺伝子をｐＥＮＩ１９０２ （ＢａｍＨＩとＳａｃＩＩで切断）にクローニングした（特許ＰＣＴ／ＤＫ／０００５０）。
【００７１】
次のオリゴヌクレオチドは図１に示すとおりである： １２９８−ｔａｋａ、１９６７０、１９６７２、１１５１２０及び０５０４０１Ｐ６ （配列番号： ６２−６５及び６８）。０５０４０１Ｐ１ （配列番号： ６６）はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子の５’末端にハイブリダイズする。０３０５０１Ｐ１ （配列番号： ６７）は他の４リパーゼ遺伝子の５’末端にハイブリダイズする。
最終ＰＣＲ断片をまずＢｓｔＥＩＩで、次にＳｆｉＩでそれぞれ切断した。ベクターｐＥＮＩ２３７６もまた同様である。ｐＥＮＩ２３７６はｐＥＮＩ１８６１の誘導体である（特許ＰＣＴ／ＤＫ／０２／０００５０）。
【００７２】
このベクターとＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製し、一晩ライゲートした。ライゲートしたＤＮＡをエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入して、約７０万個の独立クローンからなるライブラリーを創出した。
このライブラリーを対象に、高ｐＨ、低ｐＨ、高温、洗剤の存在下、イオンの存在下又はイオンの不存在下といった種々の条件下での種々の基質たとえばレシチン、ＤＧＤＧ、トリグリセリド（トリブチリンなど）、オリーブ油、吉草酸ｐ−ニトロフェニル又はパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルなどに対する活性をスクリーニングすることができる。
こうしたスクリーニングにより、たとえば熱安定リパーゼ、洗剤用ホスホリパーゼ、一次洗浄効果に優れかつ中性ｐＨで無活性である洗剤用リパーゼなどを見つけ出すことができる。
【００７３】
ＤＮＡオリゴ：
１２９８−ｔａｋａ：
ｇｃａａｇｃｇｃｇｃ ｇｃａａｔａｃａｔｇ ｇｔｇｔｔｔｔｇａｔ ｃａｔ
１９６７０：
ｃｃｃｃａｔｃｃｔｔ ｔａａｃｔａｔａｇｃ ｇ
１９６７２：
ｃｃａｃａｃｔｔｃｔ ｃｔｔｃｃｔｔｃｃｔ ｃ
【００７４】
１１５１２０：
ｇｃｔｔｔｇｔｇｃａ ｇｇｇｔａａａｔｃ
０５０４０１Ｐ１：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃ ｇｃｇｇａｇｇｃｃａ ｇｇｇａｔｃｃａｃｃ ａｔｇａｇｇａｇｃｔ ｃｃｃｔｔｇｔｇｃｔ ｇ
０３０５０１Ｐ１：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃ ｇｃｇｇａｇｇｃｃａ ｃａａｇｔｔｔｇｔａ ｃａａａａａａｇｃａ ｇｇ
（他の４リパーゼ遺伝子の５’にハイブリダイズ）
０５０４０１Ｐ６：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｔｃ ａｃｃｃｃｃｃａｔｃ ｃｔｔｔａａｃｔａｔ ａｇｃｇ
【００７５】
実施例 ８．脂質分解酵素の特性解析
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の脂質分解酵素を前述の要領で調製し、精製し、特性解析に使用した。
リパーゼの比活性はＷＯ ００／３２７５８に記載のＬＵ法で測定し、酵素タンパク質の量は２８０ｎｍの光学密度から求めた。比活性はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼでは３１８１ ＬＵ／ｍｇ、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼでは１０００ ＬＵ／ｍｇであると判明した。
【００７６】
ｐＨ−活性関係はＬＵ法でｐＨ ５、６、７、８、９、１０でのリパーゼ活性を測定することにより求めた。両酵素ともｐＨ １０で最大リパーゼ活性を示すことが判明した。サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼは至適範囲が広く、ｐＨ ６〜１０で最大活性の５０％余りを示したが、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼは低ｐＨでより強い活性を示し、ｐＨ ５〜８では最大活性の３０％未満を示したにすぎない。
熱安定性は示差走査熱量計（ＤＳＣ）により走査速度を９０℃／時としてｐＨ ５ （５０ｍＭ酢酸緩衝液）、ｐＨ ７ （５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）、ｐＨ １０ （５０ｍＭグリシン緩衝液）で測定した。変性ピーク温度（Ｔｄ）は次のとおりであった：
【００７７】
【表５】
【００７８】
実施例 ９．リゾホスホリパーゼ活性
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の精製脂質分解酵素をｐＨ ５及びｐＨ ７で基質としてのリゾレシチンとインキュベートし、ＮＥＦＡキットで反応の度合いを追跡することにより試験した。
その結果、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来酵素はｐＨ ５で高いリゾホスホリパーゼ活性を示し、またｐＨ ７である程度の活性を示した。タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来酵素は若干の活性を示した。
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は実施例７で使用したＰＣＲのスキームを示す。
発明の技術分野
本発明は、相同遺伝子のいわゆるファミリーシャッフリングにより脂質分解酵素に多様性を引き起こす方法に関連する。本発明は該方法に使用するポリヌクレオチドに、また該ポリヌクレオチドがコードする脂質分解酵素にも関連する。
【０００２】
発明の背景技術
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） （異名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））のリパーゼが洗剤や製パン・製菓など多様な産業目的に有用であることは周知のとおりである（欧州特許第２５８０６８号、国際公開公報Ｎｏ． ＷＯ ９４／０４０３５）。そのアミノ酸及びＤＮＡ配列は米国特許第５，８６９，４３８号で開示されている。
【０００３】
先行技術は酵素特性の改変を目的としたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼのアミノ酸配列の改変による変異体の創製を開示している。たとえば米国特許第５，８６９，４３８号、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ００／３２７５８はリパーゼ遺伝子の突然変異誘発法によるそうした変異体の産生を開示している。ＷＯ ００／３２７５８はまたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ由来の骨格とフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ホスホリパーゼ由来のＣ末端とを備えた変異体の、ＰＣＲ法による構築を開示している。
【０００４】
Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：２８８−２９１は多様な種に由来する天然相同遺伝子ファミリーのＤＮＡシャッフリングによるタンパク質の多様化を開示している。米国特許第６，１５９，６８７号はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの変異体をコードする遺伝子のシャッフリングを開示し、またＷＯ ９８／４１６２３は非相同ポリヌクレオチド配列のシャッフリングを開示している。
【０００５】
以下のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来脂質分解酵素の公開配列はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとのアミノ酸同一性が４９〜５１％である： アスペルギルス・フェチダス（Ａ． ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来リゾホスホリパーゼ（ＥＭＢＬ Ａ９３４２８、米国特許第６，１４０，０９４号）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ） （ＥＭＢＬ Ａ８４５８９、ＷＯ ９８／４５４５３）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来ホスホリパーゼＡ１ （ＥＭＢＬ Ｅ１６３１４、欧州特許第５７５１３３号、日本特許第１０１５５４９３ Ａ号）及びアスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来リゾホスホリパーゼ（ＥＭＢＬ Ａ９０７６１、ＷＯ ９８／３１７９０）。
【０００６】
Ｒ． Ｌａｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ， ３ （１−２）， １３７−１４４ （１９９０） はタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来エステラーゼを開示している。Ｖ．Ｗ． Ｏｇｕｎｄｅｒｏ， Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ， ７２（１）， １１８−１２６ （１９８０）はタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリパーゼ活性について記述している。米国特許第４，２７５，０１１号及び欧州特許第２５８０６８号はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼに言及している。Ｂ．Ａ． Ｏｓｏ， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， ５６： １８４０−１８４３ （１９７８）はタラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）のリパーゼ活性について記述している。
【０００７】
発明の要約
本発明者は、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子に対し高い相同性を有し、従ってまた遺伝子シャッフリングに好適である新規の脂質分解酵素遺伝子を単離した。該新規遺伝子を配列番号： ３、５、７、９及び１１として示す。若干のタンパク質とＤＮＡ配列に関する同一性を次表に示す。該新規配列は次の記号で識別する：
・ Ｔａｌｔｈｅ１Ｍ： タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の配列番号：３ ＆ ４
・ Ｔｈｅｉｂａ１Ｍ： サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来の配列番号：５ ＆ ６
・ Ｔａｌｅｍｅ１Ｍ： タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）由来の配列番号：７ ＆ ８
・ Ｔａｌｂｙｓ１Ｍ： タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）由来の配列番号：９ ＆ １０
【０００８】
以下の既知配列は比較のために含める：
・ Ｔｈｅｌａｎ１Ｍ： サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来リパーゼ、配列番号： １ ＆ ２
・ Ａｓｐｔｕｂ２Ｍ： ＥＭＢＬ Ａ８４５８９、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来リパーゼ
・ Ａｓｐｏｒｙ３Ｍ： ＥＭＢＬ Ｅ１６３１４、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来ホスホリパーゼＡ１
・ Ａｓｐｎｉｇ２Ｍ： ＥＭＢＬ Ａ９０７６１、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来リゾホスホリパーゼ
【０００９】
以下は成熟タンパク質に関する同一性表である：
【表１】
以下は成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する同一性表である（終止コドンは除外）：
【表２】
従って本発明は、脂質分解酵素をコードする２以上の相同遺伝子のファミリーシャッフリングにより脂質分解酵素を多様化する方法を提供する。一方の遺伝子はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとの同一性９０％以上の脂質分解酵素をコードし、他方の遺伝子はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼとの同一性９０％以上の脂質分解酵素をコードする。該ＤＮＡシャッフリング技術を使用してキメラ遺伝子ライブラリーを創出し、該ライブラリーを好適な発現系で発現させ、発現したタンパク質を脂質分解酵素活性でスクリーニングする。発現したタンパク質をさらにスクリーニングして改良型の脂質分解酵素を同定してもよい。
【００１２】
本発明はまた、脂質分解酵素をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチド及び脂質分解酵素（脂質分解酵素活性を有するポリペプチド）を提供する。
ポリヌクレオチドは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中に存在するプラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列でもよいが、該ＤＮＡ配列は成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列もしくは該ＤＮＡ配列から１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入により誘導しうるＤＮＡ配列である。
【００１３】
該ポリヌクレオチドは成熟ペプチドをコードする配列番号： ３のＤＮＡ配列との同一性が９０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ５のＤＮＡ配列との同一性が８０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ７のＤＮＡ配列との同一性が６５％以上、又は成熟ペプチドをコードする配列番号： ９のＤＮＡ配列との同一性が６０％以上でもよい。該ポリヌクレオチドはまた、成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体でもよいし、成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしてもよい。
【００１４】
脂質分解酵素は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７又は１４０４９）内に存在するプラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列によってコードされてもよいし、配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有してもよいし、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導しうるアミノ酸配列を有してもよい。脂質分解酵素は配列番号： ６の成熟ペプチドとの同一性が８０％以上であるアミノ酸配列又は配列番号： １０の成熟ペプチドとの同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
【００１５】
脂質分解酵素はさらに、配列番号： ６又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有してもよいし、配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体でもよいし、又は成熟ペプチドをコードする配列番号： ５又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列がコードしてもよい。
【００１６】
発明の詳細な説明
ゲノム ＤＮＡ ソース
本発明の脂質分解酵素遺伝子はタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）又はサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属特にタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の菌株から、本明細書に記載のＤＮＡ配列を基に設計したプローブを使用して派生させてもよい。
たとえば配列リスト中の遺伝子とポリペプチドは下記の生物から単離した。該遺伝子を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は本発明者がブダペスト条約に基づきＤＳＭＺ（ドイツ微生物・培養細胞保存機構、所在地Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， ＤＥ）に次のとおり寄託した。
【００１７】
【表３】
以上のソース生物は以下の菌株保存機構から商業ベースで自由に分譲が受けられる：
ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ．
ＣＢＳ （Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ ８， ３５８４ ＣＴ Ｕｔｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．
ＵＡＭＨ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ ＆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｄｅｖｏｎｉａｎ Ｂｏｔａｎｉｃ Ｇａｒｄｅｎ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ， Ｔ６Ｇ ３ＧＩ．
ＩＭＩ： Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｂａｋｅｈａｍ Ｌａｎｅ， Ｅｎｇｌｅｆｉｅｌｄ Ｇｒｅｅｎ， ＥＧＨＡＭ， Ｓｕｒｒｅｙ ＴＷ２０ ９ＴＹ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．
【００１９】
ポリヌクレオチド
遺伝子組換え（シャッフリング）に使用するポリヌクレオチドは脂質分解酵素をコードする２以上の遺伝子であり、該酵素のうちの１個はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号： ２）との同一性が９０％以上、もう１個は同一性が５５〜９０％である。使用ポリヌクレオチドは１個以上のヌクレオチドが異なる。
【００２０】
出発物は配列番号： １、３、５、７及び／又は９のうちの２以上（たとえば３、４又は５）配列の成熟部分を含んでもよい。また、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換及び／又は挿入によって得られる、及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端へのペプチド延長鎖の付加によって得られる配列番号： ２、４、６、８及び／又は１０のうちの複数種（たとえば３、４又は５種）の変異体をコードする遺伝子を含んでもよい。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの変異体の例はたとえば米国特許第５，８６９，４３８号、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ００／３２７５８号に記載されており、また類似の変異体は他配列の対応するアミノ酸の改変により創製することができる。
遺伝子中のイントロンは随意に組換え前に除去してもよい。
【００２１】
ＤＮＡ 組換え （ シャッフリング ）
２以上の相同インプット・ポリヌクレオチド（出発ポリヌクレオチド）間のシャッフリングはアウトプット・ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリングサイクルを経た後のポリヌクレオチド）の獲得を目的としたポリヌクレオチドの断片化と断片の組換えを伴い、インプット・ポリヌクレオチドに対し多数のヌクレオチド断片の組換えが行われよう。
ＤＮＡ組換え又はシャッフリングは、２以上の出発遺伝子からキメラ遺伝子ライブラリーを生成するような（部分）ランダム法でもよい。このシャッフリング又は組換え法の実行には多数の公知方式を用いることができる。
【００２２】
該組換え法はたとえば米国特許第５，６０５，７９３号、５，８１１，２３８号、５，８３０，７２１号、６，１１７，６７９号で開示されている、親ＤＮＡのランダム断片化とそれに続くＰＣＲ法による再構成で新しい完全長遺伝子を生成するという方法でもよいし、米国特許第６，１５９，６８７号、ＷＯ ９８／４１６２３、米国特許第６，１５９，６８８号、５，９６５，４０８号、６，１５３，５１０号で開示されているｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組換え法でもよいし、またＷＯ ９７／０７２０５及びＷＯ ９８／２８４１６で開示されている生細胞中でのｉｎ ｖｉｖｏ組換え法でもよい。
親ＤＮＡの断片化にはＤＮアーゼＩ処理を用いても、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （２０００ａ， Ｇｅｎｅ ２３６：１５９−１６７）が記述している制限酵素消化を用いてもよい。２つの親ＤＮＡのシャッフリングはＫｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （２０００ｂ， Ｇｅｎｅ ２４３：１３３−１３７）が記述している２親ＤＮＡの１本鎖のシャッフリングによって行ってもよい。
ある特定のシャッフリング方式はＣｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１： ２８８−２９１及びＮｅｓｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６に記載の方法に依拠する。別の方式は米国特許第６，１５９，６８７号の実施例１及び２に記載の方法に依拠しよう。
【００２３】
脂質分解酵素の性質
本発明によって得られる脂質分解酵素はカルボン酸エステル結合を加水分解することができ、また「酵素命名法１９９２年」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）に従ってＥＣ ３．１．１として分類される。該酵素は特にリパーゼ（トリグリセロールリパーゼ）（ＥＣ ３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ１ （ＥＣ ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２ （ＥＣ ３．１．１．４）、コレステロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３）及び／又はガラクトリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．２６）としての活性をもとう。
【００２４】
その熱安定性は示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって評価した。ｐＨを５として９０℃／時で加熱したときの変性ピーク温度（Ｔｄ）はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来脂質分解酵素では７５℃強であるが、先行技術のサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素では７０℃強である。サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来脂質分解酵素は（サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素と同様に）アルカリ性ｐＨで至適活性を示し、また （サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来脂質分解酵素をやや上回る）約４．３の等電点を有する。
【００２５】
相同性とアラインメント
配列番号： ２、４、６、８及び１０の成熟部分の最適アラインメントは配列番号： ２、４及び６のＱ２４６とＰ／Ｇ２５０の間に１アミノ酸のギャップを挿入することにより実現される。このアラインメントは対応するアミノ酸を明確にする。
相同性の度合いは技術上周知のコンピュータープログラムたとえばＧＣＧプログラムパッケージとして提供されるＧＡＰ （Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５）を用いて、ポリペプチド配列比較のための設定をギャップ挿入ペナルティー３．０、ギップ伸長ペナルティー０．１として判定してもよい。
【００２６】
相同性の判定はまた、ＦＡＳＴＡパッケージｖｅｒｓｉｏｎ ｖ２０ｕ６のＡｌｉｇｎを用いて行ってもよい。Ａｌｉｇｎは一種のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント（すなわちグローバルアラインメント）ソフトウェアでありタンパク質とＤＮＡの両方のアラインメントに有効である。タンパク質とＤＮＡのアラインメントにはデフォルト得点行列ＢＬＯＳＵＭ５０と一致行列をそれぞれ使用する。ギャップ中の第１残基に対応するペナルティーはタンパク質では−１２、ＤＮＡでは−１６である。ギャップ中の追加残基に対応するペナルティーはタンパク質では−２、ＤＮＡでは−４である。
本明細書で述べている相同性は６０％以上の同一性、特に７０％以上又は８０％以上の同一性、たとえば９０％以上又は９５％以上の同一性に対応する。
【００２７】
脂質分解酵素の用途
本発明の酵素は基質特異性次第で、たとえばろ過処理の改善、植物性油の処理、製パン・製菓、洗剤、又はリゾリン脂質の調製に使用することができる。該酵素は、先行技術と同様の方法でたとえば次のような既知の脂質分解酵素用途に使用してもよい。
・ 紙パルプ産業のピッチコントロール又は古紙脱墨処理。ＷＯ ９２／１３１３０、ＷＯ ９２／０７１３８、日本特許第２１６０９８４ Ａ号、欧州特許第３７４７００号。
・ 製パン・製菓。ＷＯ ９４／０４０３５、ＷＯ ００／３２７５８。
【００２８】
・ 洗剤。ＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５。
・ 皮革産業。英国特許第２２３３６６５号、欧州特許第５０５９２０号。
・ リパーゼ活性をもつ酵素は油脂のけん化、トリグリセリドの変性、及びモノ−及びジ−グリセリドの生産に使用してもよい。
・ リパーゼ活性をもつ酵素はバルク油脂のエステル交換、フライ油脂やショートニング類、マーガリン成分の生産に使用してもよい。
・ ホスホリパーゼ（Ａ１、Ａ２）活性をもつ酵素は植物性油の脱ガムやリゾリン脂質の生産に使用してもよい。
【００２９】
ろ過処理の改善
リゾホスホリパーゼ活性をもつ酵素はその変異体による処理で糖質起源の水溶液又は懸濁液のろ過処理適性を向上させることができる。これは特に、ろ過しにくく濁ったろ液になりがちなデンプン糖質特に小麦デンプン糖質を含む溶液又は懸濁液に適用される。この処理は欧州特許第２１９，２６９号（ＣＰＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に記載の要領で行うことができる。
【００３０】
洗剤
本発明の脂質分解酵素は洗剤添加剤として、たとえば０．００１〜１０ｍｇ （たとえば０．０１〜１ｍｇ）／グラム−洗剤又は０．００１〜１００ｍｇ （たとえば０．０１〜１０ｍｇ）／リットル−洗浄液の濃度（純酵素タンパク質ベース）で使用してもよい。
本発明の洗剤組成物は、たとえば汚れた布地の前処理に適した洗濯用添加剤組成物やすすぎ水用柔軟剤を含む手洗い又は機械洗い用洗濯洗剤組成物として調製してもよいし、家庭用硬質表面クリーナーに使用する洗剤組成物として調製してもよい。洗濯洗剤では本発明の変異体が油汚れの洗い落とし、白さの維持及び黒ずみ解消に有効であろう。洗濯洗剤組成物はＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＰＣＴ／ＤＫ ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５に記載の要領で調製してもよい。
【００３１】
本発明の洗剤組成物は特に、たとえば英国特許第２，２４７，０２５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）又はＷＯ ９９／０１５３１ （Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）に記載の要領で食器手洗い又は機械洗い用として調製してもよい。食器洗い機用組成物では、本発明の変異体が油汚れの除去、高度に着色された部品による食器及び食器洗い機プラスチック部品の染み／変色の防止、及び石灰質水あかの付着防止に有効であろう。
【００３２】
本発明の洗剤組成物は任意幸便な形態たとえばバー、タブレット、粉末、顆粒、ペースト又は液体などでよい。液体洗剤は一般に７０％以下の水と０〜３０％の有機溶媒を含む水性でもよいし、非水性でもよい。
洗剤組成物は１種又は複数種の界面活性剤を含み、界面活性剤は半極性を含む非イオン系でも、陰イオン系、陽イオン系、双生イオン系でもよい。界面活性剤の含有量は一般に０．１〜６０ （重量）％たとえば０．５〜４０％、１〜３０％、特に１．５〜２０％である。
【００３３】
ベーカリー製品と生地
脂質分解酵酵素はパンやケーキなどのベーカリー製品とその生地の調製に使用して、たとえば生地の安定性や取扱い適性を改善し又はパンやケーキの弾力性を高めることができる。脂質分解酵酵素はたとえば製パン工程に使用することができるが、その場合の工程は脂質分解酵酵素をパン生地材料に添加するステップ、生地をこねるステップ、生地をパンに焼き上げるステップを含む。これは米国特許第４，５６７，０４６号（協和発酵）、日本特許第６０−７８５２９−Ａ号（キューピー）、日本特許第６２−１１１６２９−Ａ号（キューピー）、日本特許第６３−２５８５２８−Ａ号（キューピー）又は欧州特許第４２６２１１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載の要領で行うことができる。脂質分解酵酵素はＷＯ ９９／５３７６９ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載の要領で、硬化防止用アミラーゼ特にエンドアミラーゼたとえば麦芽アミラーゼと併用してもよい。脂質分解酵酵素はたとえば穀粉組成物たとえば生地や生地用プレミックスに添加してもよい。
【００３４】
材料と方法
菌株とプラスミド
プラスミドｐＭＴ２１８８
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）発現プラスミドｐＣａＨｊ ４８３ （ＷＯ ９８／００５２９）はアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）リン酸トリオース・イソメラーゼ非翻訳リーダー配列（Ｐｎａ２／ｔｐｉ）とアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アミログリコシダーゼ・ターミネーター（Ｔａｍｇ）とに融合したアスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼＩＩプロモーターを基本とする発現カセットからなる。該プラスミド上には、唯一の窒素源としてのアセトアミド上での増殖を可能にするアスペルギルス・ニドランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカーａｍｄＳも存在する。
【００３５】
これらのエレメントを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターｐＵＣ１９ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングする。このプラスミドの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中での選択を可能にするアンピシリン耐性マーカーを、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｐｙｒＦ突然変異を補完しうるサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３マーカーで置き換えたが、この置き換えは次のようにして行った：
【００３６】
プライマー１４２７７９ （配列番号： ３５）及び１４２７８０ （配列番号： ３６）を用いてｐＵＣ１９の複製起点をｐＣａＨｊ ４８３からＰＣＲ増幅した。
プライマー１４２７８０はＰＣＲ断片にＢｂｕＩ部位を導入する。この増幅にはＥｘｐａｎｄ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をこの増幅と後続の増幅に関するメーカーの説明書に従って使用した。
【００３７】
プライマー１４０２８８ （配列番号： ３７）及び１４２７７８ （配列番号： ３８）を用いてＵＲＡ３遺伝子を汎用サッカロミセス・セレビシエー（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クローニングベクターｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ， ＵＳＡ）から増幅した。
プライマー１４０２８８はＰＣＲ断片にＥｃｏＲＩ部位を導入する。２つのＰＣＲ断片を、混合とプライマー１４２７８０及び１４０２８８使用による増幅の後、オーバーラップ法によるスプライシング［Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｇｅｎｅ， ７７， ６１−６８］で融合した。
【００３８】
得られた断片をＥｃｏＲＩとＢｂｕＩで消化し、これらの同じ酵素で消化しておいたｐＣａＨｊ ４８３の最大断片にライゲートした。このライゲーション反応液を使用して、ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの方法［Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ． ａｎｄ Ａ． Ｈｉｇａ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４５， １５４］でコンピテントにしたｐｙｒＦ Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＢ６５０７ （ＡＴＣＣ ３５６７３）を形質転換した。形質転換体を、１ｇ／ｌカザミン酸、５００ μｇ／ｌチアミン及び１０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した固形Ｍ９培地［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］上で選択した。
【００３９】
選択した形質転換体に由来するプラスミドをｐＣａＨｊ ５２７と命名した。ｐＣａＨｊ ５２７上のＰｎａ２／ｔｂｉプロモーターに単純ＰＣＲ法により部位指定突然変異誘発を起こした。
ヌクレオチド１３４−１４４の配列番号： ３９から配列番号： ４０への改変には変異原プライマー１４１２２３ （配列番号： ４１）を使用した。
ヌクレオチド４２３−４３６の配列番号： ４２から配列番号： ４３への改変には変異原プライマー１４１２２２ （配列番号： ４４）を使用した。
得られたプラスミドはｐＭＴ２１８８と命名した。
【００４０】
プラスミド ｐＥＮＩ１８６１
プラスミドｐＥＮＩ１８６１は、発現プラスミド中に最新技術アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）プロモーター並びに多数のクローニング用特定制限部位を導入するために調製した。
ｐＭＴ２１８８（前述）を鋳型としプライマー０５１１９９Ｊ１ （配列番号： ４５）及び１２９８ＴＡＫＡ （配列番号： ４６）を使用してｐＣＲ断片（約６２０ｂｐ）を調製した。
【００４１】
該断片をＢｓｓＨＩＩとＢｇｌＩＩで切断し、やはりＢｓｓＨＩＩとＢｇｌＩＩで切断しておいたｐＥＮＩ１８４９にクローニングした。このクローニングを配列解析で確認した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）とアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の両方で作動するプロモーターを導入するためにプラスミドｐＥＮＩ１９０２を調製した。これは特定部位削除法により、「カメレオン２本鎖部位指定突然変異誘発キット」を用いてメーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）推奨に従って実行した。
【００４２】
プラスミド ｐＥＮＩ１８６１
プラスミドｐＥＮＩ１８６１は鋳型として、また１７７９９６ （配列番号： ４７）、１３５６４０ （配列番号： ４８）及び１３５６３８ （配列番号： ４９）の５’リン酸化プライマーは選択プライマーとして用いた。
５’リン酸化０８０３９９Ｊ１９プライマー（配列番号： ５０）を変異原プライマーとして用いて、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現プロモーターに−３５及び−１０プロモーターコンセンサス配列（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来）を導入した。この突然変異の導入は配列解析で確認した。
【００４３】
プラスミド ｐＥＮＩ１９６０
Ｇａｔｅｗａｙ ＶｅｃｔｏｒＴＭ変換システム［Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）カタログ番号１１８２８−０１９］を用いてプラスミドｐＥＮＩ１９６０を調製した。これは、ｐＥＮＩ１９０２をＢａｍＨＩで切断し、クレノウ酵素とヌクレオチドを用いてＤＮＡ末端を埋め（て平滑端とし）、次いでリーディングフレームのＡ ＧａｔｅｗａｙＴＭ ＰＣＲフラグメントにライゲートする方法で行った。正しい方向のクローニングを配列解析で確認した。
【００４４】
培地と基質
ＹＰＧ： ４ｇ／Ｌ酵母抽出物、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４−７ａｑ、５ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ ６．０。
【００４５】
実施例
実施例 １．脂質分解酵素遺伝子を収めたプラスミド
ゲノム ＤＮＡ の調製
ゲノムＤＮＡソースとしてサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）、タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株を用いた。１００ｍｌのＹＰＧ中で各菌株を適正温度で数日間培養した。菌糸体を集めて液体窒素中で破砕し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ ＳＤＳを添加した２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）緩衝液中に懸濁させ、次に１２μｌのプロテイナーゼＫ （２５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。懸濁液を３０〜６０分間６５℃に保った。フェノール抽出によりタンパク質を除去し０．７体積のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を滅菌水で溶解しＲＮアーゼを添加した。フェノール／イソアミルアルコール抽出後、ＥｔＯＨを加えてＤＮＡを沈殿させた。
【００４６】
脂質分解酵素遺伝子の ＰＣＲ スクリーニング
アラインメントリパーゼを土台にして設計したＨＬ２及びＨＬ１２ （配列番号： ５１及び５２）又はＨＬ２及びＨＬ６ （配列番号： ５１及び５３）を用いて、各ゲノムＤＮＡを対象にＰＣＲを行った。
反応成分［２．６ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ、各々２５０ｍＭのｄＮＴＰ、各々２５０ｎＭのプライマー、０．１Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ／１×緩衝液 （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｊａｐａｎ）］を混合し次の条件でＰＣＲを行った：
【００４７】
【表４】
ステップ１〜３は３０回繰り返した。
５４０ｂｐの断片と３８０ｂｐの断片をそれぞれプライマーセットＨＬ２／ＨＬ１２及びＨＬ２／ＨＬ６から増幅した。増幅断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル精製した。各ＤＮＡを配列解析し、リパーゼと比較すると、クローンがリパーゼの内側部分をコードしていると判明した。
【００４９】
リパーゼ遺伝子のクローニング
ＬＡ ＰＣＲＴＭ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ）を用いてメーカーの説明書に従って各リパーゼ遺伝子をクローニングした。たとえばゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、各ＤＮＡを同キットの好適カセットでライゲートした。各ライゲーション溶液を、内側配列から設計したプライマーとキットのカセットプライマーによるＰＣＲにかけた。増幅ＤＮＡ断片の配列を解析した。ＯＲＦが決定されるまでこのステップを繰り返した。
【００５０】
同キットのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼは忠実度が高くないので、適正配列を得るためにメーカーの説明書に従って全遺伝子をＥｘｐａｎｄ高忠実度ポリメラーゼで増幅した。
増幅ＤＮＡ断片はＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｐＴ７Ｂｌｕｅベクター又はｐＳＴ Ｂｌｕｅ−１ ＡｃｃｅｐＴｏｒベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲートした。このライゲーション反応液を使用して大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９又はＤＨ５αを形質転換した。各遺伝子の４プラスミドの配列を決定し、比較した。多数派の配列を正しいヌクレオチド配列とする。
【００５１】
実施例 ２．アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 発現ベクターへのリパーゼ遺伝子のクローニング
ＰＷＯポリメラーゼを使用して３件のＰＣＲを次の条件で行った： ９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間。いずれの場合も使用鋳型（脂質分解酵素遺伝子を収めたプラスミド。実施例１の要領で調製）及びプライマーは次のとおり：
【００５２】
Ａ： タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ１／０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１ ＆ １８）
Ｂ： タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ９／０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９ ＆ ２６）
Ｃ： サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来遺伝子を収めたプラスミド及びオリゴ０５１２００Ｊ１７／０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７ ＆ ３４）。
【００５３】
ＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製し、ｐＥＮＩ１９６０（前述） へとＧａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に導入し、配列を解析し、もってｐＥＮＩ２１４６ （タラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）リパーゼ遺伝子）、ｐＥＮＩ２１４７ （サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼ遺伝子）、ｐＥＮＩ２１４８ （タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ遺伝子）を調製した。
これらをＪａｌ２５０ （ＷＯ ００／３９３２２で開示）に導入し、ＷＯ ００／２４８８３に記載の要領でリパーゼ活性を評価した。
【００５４】
実施例 ３．イントロンレス・リパーゼ遺伝子の構築
タラロミセス・サーモフィルス （Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４８及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ１ ＆ ０５１２００Ｊ３ （配列番号： １１ ＆ １３）
２： ０５１２００Ｊ２ ＆ ０５１２００Ｊ５ （配列番号： １２ ＆ １５）
３： ０５１２００Ｊ４ ＆ ０５１２００Ｊ７ （配列番号： １４ ＆ １７）
４： ０５１２００Ｊ６ ＆ ０５１２００Ｊ８ （配列番号： １６ ＆ １８）
【００５５】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ１及び０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１及び１８、メーカーのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
【００５６】
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラム（カタログ番号７３２−６２２５）で精製した。
ＰＣＲ断片を（ｃｃｄＢ遺伝子の切断を目的に） ＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００５７】
タラロミセス・エメルソニル （Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４６及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ９ ＆ ０５１２００Ｊ１１ （配列番号： １９ ＆ ２１）
２： ０５１２００Ｊ１０ ＆ ０５１２００Ｊ１３ （配列番号： ２０ ＆ ２３）
３： ０５１２００Ｊ１２ ＆ ０５１２００Ｊ１５ （配列番号： ２２ ＆ ２５）
４： ０５１２００Ｊ１４ ＆ ０５１２００Ｊ１６ （配列番号： ２４ ＆ ２６）
【００５８】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ９及び０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９及び２１、メーカーの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラムで精製した。
ＰＣＲ断片をＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのタラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００５９】
サーモミセス・イバダネンシス （Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ） リパーゼ遺伝子からのイントロンの除去
４件のＰＣＲ ［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を、ＰＷＯポリメラーゼ、鋳型としてのｐＥＮＩ２１４７及び次のオリゴを使用して実施した：
１： ０５１２００Ｊ１７ ＆ ０５１２００Ｊ１９ （配列番号： ２７ ＆ ２９）
２： ０５１２００Ｊ１８ ＆ ０５１２００Ｊ２１ （配列番号： ２８ ＆ ３１）
３： ０５１２００Ｊ２０ ＆ ０５１２００Ｊ２３ （配列番号： ３０ ＆ ３３）
４： ０５１２００Ｊ２２ ＆ ０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ３２ ＆ ３４）
【００６０】
１．５％アガロースゲルから特異的バンドを精製した。等量のＰＣＲ断片をＰＷＯポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、オリゴ０５１２００Ｊ１７及び０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７及び３４、メーカーの推奨に従い全量を５０μｌとした）と混合し、２回目のＰＣＲを実施した［９４℃５分間、３０×（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間）、７２℃５分間］。
１．５％アガロースゲル上で正しいバンドサイズをチェックし（約９００ｂｐ）、残りのＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄスピンカラムで精製した。
ＰＣＲ断片をＳｃａＩで消化したｐＥＮＩ１９６０に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いてメーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）推奨の要領でクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入し配列を解析し、もってイントロン無しのサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼ遺伝子を創出した。
【００６１】
実施例 ４．脂質分解酵素遺伝子のシャッフリング
脂質分解酵素をコードするＤＮＡ配列を収めた複数のプラスミドを等量混合する。以下の成分をマイクロチューブ中で混合する：
２μｌのプラスミド混合液（０．１５μｇ／μｌ）、遺伝子を挟む特異的プライマー（１ｐｍｏｌ／μ）、２μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、０．５μｌのＴａｑ酵素（全量２０μｌ）。
チューブをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００サーモサイクラーにセットする。以下のＰＣＲプログラムを実行する： （９４℃５分間） １サイクル、（９４℃３０秒間、７０℃ ０秒間） ９９サイクル、（７２℃２分間、４℃不定） １サイクル。
【００６２】
ＰＣＲ反応液を１．５％アガロースゲルにかける。特定期待サイズのＤＮＡバンドをアガロースゲルから切り出し、ＪＥＴｓｏｒｂ （ＧＥＮＯＭＥＤ Ｉｎｃ．）を用いて精製する。精製ＰＣＲ産物を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＡクローニングキットに含まれる） ＴＡベクターにクローニングする。このライゲーション産物を標準大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株（ＤＨ５ａ）に導入する。
組換え配列は次にＥ． ｃｏｌｉ ＴＡベクターからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片（ＷＯ ９７／０７２０５を参照）として酵母ベクターｐＪＳＯＯ２６ （ＷＯ ９９／２８４４８）にサブクローニングし、また性質の改善たとえば洗剤の性能向上（ＷＯ ９７／０７２０５を参照）につながる新しい組換え配列のスクリーニングなどに回すことができる。
【００６３】
実施例 ５．脂質分解酵素遺伝子のシャッフリング
脂質分解酵素遺伝子のＰＣＲ産物を前実施例の要領で調製し、等量を混合する。適当なチューブを用いて以下の成分を混合する：
１μｌのＰＣＲ産物混合液（０．１μｇ）、デカマー・ランダムプライマー（３００ ｐｍｏｌ）、２μｌの１０×クレノウ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ （全量２０μｌ）。 この混合液をＰＥ ２４００サーモサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行する： ９６℃５分間、２５℃５分間、０．５ｍｌクレノウ酵素添加、２５℃６０分間、３５℃９０分間。
【００６４】
この手順により、遺伝子のすべての部分に由来するきわめて多数の小ＤＮＡポリマーが得られる。
１０μｌを分取してアガロースゲルで試験する。
１０μｌのＰＣＲ反応液［０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μｌ Ｔａｑ酵素］をサーモサイクラー中のチューブの１０μｌに加える。次に以下の標準ＰＣＲプログラムを実行する：（９４℃５分間） １サイクル、（９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃３０秒間） ２５サイクル、７２℃７分間、４℃不定。
【００６５】
ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにかける。期待サイズのバンドを切り出す。ＰＣＲ産物をクローニング前に増幅するために追加のＰＣＲを、特異的プライマー（前述）を使用して行う。
ＰＣＲ産物と所望ベクターを好適な制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）で切断する。ベクターとＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにかけ、ゲルから精製する。
切断後のＰＣＲ産物とベクターをリガーゼ緩衝液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合する。１６℃で一晩ライゲーション後、反応液を使用して大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａを形質転換する。
【００６６】
実施例 ６．イントロンレス・リパーゼ遺伝子の創出
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）と相同性を有する多数のリパーゼ遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子はゲノムＤＮＡとしてクローニングしており、従ってイントロンを含んでいた。
これらの遺伝子のシャッフリングによりキメラ遺伝子を得ることにした。可能な限り高品質のライブラリーを得るには、イントロンを除去する必要があった。これは、エキソンの上流側と下流側にそれぞれマッチすると同時にすぐ隣のエキソンと相同のＤＮＡ配列を有するＤＮＡオリゴを創出することにより実行した。
【００６７】
これらのオリゴを技術上周知の標準ＰＣＲに使用して、遺伝子中の各エキソンをことごとくカバーするＰＣＲ断片を創出した。これらのＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製した。精製したＰＣＲ断片を２回目のＰＣＲで完全長遺伝子へと再構成したが、そこでは全遺伝子を挟むＤＮＡオリゴをプライマーとして使用した。
リパーゼをコードする完全長イントロンレス遺伝子を収めたＰＣＲ断片を、特許出願ＰＣＴ／ＤＫ０２／０００５０に記載の要領でｐＥＮＩ１９６０にクローニングした。
【００６８】
各イントロンレス遺伝子の再構成には以下のプライマーを使用した：
タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）： ０５１２００Ｊ１、０５１２００Ｊ２、０５１２００Ｊ３、 ０５１２００Ｊ４、０５１２００Ｊ５、０５１２００Ｊ６、０５１２００Ｊ７、０５１２００Ｊ８ （配列番号： １１−１８）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１７８が生成。
タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）： ０５１２００Ｊ９、０５１２００Ｊ１０、０５１２００Ｊ１１、 ０５１２００Ｊ１２、０５１２００Ｊ１３、０５１２００Ｊ１４、０５１２００Ｊ１５、０５１２００Ｊ１６ （配列番号： １９−２６）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１５９が生成。
【００６９】
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）： ０５１２００Ｊ１７、０５１２００Ｊ１８、０５１２００Ｊ１９、０５１２００Ｊ２０、０５１２００Ｊ２１、０５１２００Ｊ２２、０５１２００Ｊ２３、０５１２００Ｊ２４ （配列番号： ２７−３４）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２１６０が生成。
タラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）： ０８０２０１Ｐ１、０８０２０１Ｐ２、０８０２０１Ｐ３、０８０２０１Ｐ４、０８０２０１Ｐ５、０８０２０１Ｐ６、０８０２０１Ｐ７、０８０２０１Ｐ８ （配列番号： ５４−６１）。これらをｐＥＮＩ１９６０にクローニングするとｐＥＮＩ２２３０が生成。
【００７０】
実施例 ７．イントロンレス・リパーゼ遺伝子のシャッフリング
ｄＵＴＰとウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼとを使用する方法でＤＮＡシャッフリング用に十分な量のＤＮＡ断片を調製するようにした。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）の３遺伝子は互いに相同性がきわめて高い（ので、Ａ群と命名）し、またタラロミセス・エメルソニル（Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）とタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔ． ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の場合も同様である（Ｂ群と命名）。そこで両群間の組換えを改善するために、ｐＥＮＩ２１７８、ｐＥＮＩ２１５９、ｐＥＮＩ２１６０及びｐＥＮＩ２２３０を鋳型とするＰＣＲスキーム（図１参照）を採用し、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）遺伝子をｐＥＮＩ１９０２ （ＢａｍＨＩとＳａｃＩＩで切断）にクローニングした（特許ＰＣＴ／ＤＫ／０００５０）。
【００７１】
次のオリゴヌクレオチドは図１に示すとおりである： １２９８−ｔａｋａ、１９６７０、１９６７２、１１５１２０及び０５０４０１Ｐ６ （配列番号： ６２−６５及び６８）。０５０４０１Ｐ１ （配列番号： ６６）はサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子の５’末端にハイブリダイズする。０３０５０１Ｐ１ （配列番号： ６７）は他の４リパーゼ遺伝子の５’末端にハイブリダイズする。
最終ＰＣＲ断片をまずＢｓｔＥＩＩで、次にＳｆｉＩでそれぞれ切断した。ベクターｐＥＮＩ２３７６もまた同様である。ｐＥＮＩ２３７６はｐＥＮＩ１８６１の誘導体である（特許ＰＣＴ／ＤＫ／０２／０００５０）。
【００７２】
このベクターとＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから精製し、一晩ライゲートした。ライゲートしたＤＮＡをエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ１０ｂに導入して、約７０万個の独立クローンからなるライブラリーを創出した。
このライブラリーを対象に、高ｐＨ、低ｐＨ、高温、洗剤の存在下、イオンの存在下又はイオンの不存在下といった種々の条件下での種々の基質たとえばレシチン、ＤＧＤＧ、トリグリセリド（トリブチリンなど）、オリーブ油、吉草酸ｐ−ニトロフェニル又はパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルなどに対する活性をスクリーニングすることができる。
こうしたスクリーニングにより、たとえば熱安定リパーゼ、洗剤用ホスホリパーゼ、一次洗浄効果に優れかつ中性ｐＨで無活性である洗剤用リパーゼなどを見つけ出すことができる。
【００７３】
ＤＮＡオリゴ：
１２９８−ｔａｋａ：
ｇｃａａｇｃｇｃｇｃ ｇｃａａｔａｃａｔｇ ｇｔｇｔｔｔｔｇａｔ ｃａｔ
１９６７０：
ｃｃｃｃａｔｃｃｔｔ ｔａａｃｔａｔａｇｃ ｇ
１９６７２：
ｃｃａｃａｃｔｔｃｔ ｃｔｔｃｃｔｔｃｃｔ ｃ
【００７４】
１１５１２０：
ｇｃｔｔｔｇｔｇｃａ ｇｇｇｔａａａｔｃ
０５０４０１Ｐ１：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃ ｇｃｇｇａｇｇｃｃａ ｇｇｇａｔｃｃａｃｃ ａｔｇａｇｇａｇｃｔ ｃｃｃｔｔｇｔｇｃｔ ｇ
０３０５０１Ｐ１：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃ ｇｃｇｇａｇｇｃｃａ ｃａａｇｔｔｔｇｔａ ｃａａａａａａｇｃａ ｇｇ
（他の４リパーゼ遺伝子の５’にハイブリダイズ）
０５０４０１Ｐ６：
ｃｇｇｃｃｇｇｇｔｃ ａｃｃｃｃｃｃａｔｃ ｃｔｔｔａａｃｔａｔ ａｇｃｇ
【００７５】
実施例 ８．脂質分解酵素の特性解析
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の脂質分解酵素を前述の要領で調製し、精製し、特性解析に使用した。
リパーゼの比活性はＷＯ ００／３２７５８に記載のＬＵ法で測定し、酵素タンパク質の量は２８０ｎｍの光学密度から求めた。比活性はサーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼでは３１８１ ＬＵ／ｍｇ、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼでは１０００ ＬＵ／ｍｇであると判明した。
【００７６】
ｐＨ−活性関係はＬＵ法でｐＨ ５、６、７、８、９、１０でのリパーゼ活性を測定することにより求めた。両酵素ともｐＨ １０で最大リパーゼ活性を示すことが判明した。サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）リパーゼは至適範囲が広く、ｐＨ ６〜１０で最大活性の５０％余りを示したが、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼは低ｐＨでより強い活性を示し、ｐＨ ５〜８では最大活性の３０％未満を示したにすぎない。
熱安定性は示差走査熱量計（ＤＳＣ）により走査速度を９０℃／時としてｐＨ ５ （５０ｍＭ酢酸緩衝液）、ｐＨ ７ （５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）、ｐＨ １０ （５０ｍＭグリシン緩衝液）で測定した。変性ピーク温度（Ｔｄ）は次のとおりであった：
【００７７】
【表５】
実施例 ９．リゾホスホリパーゼ活性
サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）及びタラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の精製脂質分解酵素をｐＨ ５及びｐＨ ７で基質としてのリゾレシチンとインキュベートし、ＮＥＦＡキットで反応の度合いを追跡することにより試験した。
その結果、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔ． ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）由来酵素はｐＨ ５で高いリゾホスホリパーゼ活性を示し、またｐＨ ７である程度の活性を示した。タラロミセス・サーモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来酵素は若干の活性を示した。
【００７９】
【表６】
【表７】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は実施例７で使用したＰＣＲのスキームを示す。
Claims (17)
- 脂質分解酵素を生産する方法であって、
ａ） ｉ） 脂質分解酵素活性を有しかつ配列番号：２の成熟ペプチドとの同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
ｉｉ） 脂質分解酵素活性を有しかつ配列番号：２の成熟ペプチドとの同一性が５５〜９０％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む２以上のポリヌクレオチドをシャッフリングするステップ；
ｂ）シャッフリングしたポリヌクレオチドを発現させて組換えポリペプチドを産生させるステップ；
ｃ）ポリペプチドのスクリーニングにより脂質分解酵素活性を有するポリペプチドを選択するステップ；及び
ｄ）選択されたポリペプチドを生産するステップ；
を含む方法。 - 前記ポリヌクレオチド（ｉｉ）によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号： ４、６、８又は１０の成熟部分に対して９０％以上の同一性を有する請求項１の方法。
- 前記２以上のポリヌクレオチドが、配列番号： ３、５、７又は９の成熟部分に対して９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１又は２の方法。
- 脂質分解酵素をコードし、かつ
ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ配列であり、又は
ｂ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列であり、又は該ＤＮＡ配列から１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｃ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３のＤＮＡ配列との同一性が９０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ５のＤＮＡ配列との同一性が８０％以上、成熟ペプチドをコードする配列番号： ７のＤＮＡ配列との同一性が６５％以上、又は成熟ペプチドをコードする配列番号： ９のＤＮＡ配列との同一性が６０％以上であり、又は
ｄ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９のＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体であり、又は
ｅ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。 - ヌクレオチド配列と作用可能に連結されていて好適な発現宿主中での脂質分解酵素の発現を支配しうる１又は複数の調節配列をさらに含む請求項４のポリヌクレオチド。
- 請求項５のポリヌクレオチド、プロモーター及び転写・翻訳終結シグナルを含む組換え発現ベクター。
- 請求項５のポリヌクレオチド又は請求項６のベクターで形質転換した組換え宿主細胞。
- 脂質分解酵素活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの産生につながる条件下で請求項７の宿主細胞を培養するステップ、及び該ポリペプチドを回収するステップを含む方法。
- 脂質分解酵素活性を有するポリペプチドであって、
ｆ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７又は１４０４９）中に存在するプラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列によってコードされ、又は
ｇ）配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有し、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｈ）配列番号： ６の成熟ペプチドとの同一性が８０％以上であるアミノ酸配列又は配列番号： １０の成熟ペプチドとの同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を有し、又は
ｉ）配列番号： ６又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有し、又は
ｊ）配列番号： ６又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体であり、又は
ｋ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ５又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、
ポリペプチド。 - タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、特にサーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の菌株を原産とする請求項９のポリペプチド。
- 請求項９又は１０のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸配列。
- リゾリン脂質中の脂肪アシル基を加水分解する方法であって、該リゾリン脂質を、リゾホスホリパーゼ活性を有し、かつ
ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ配列によってコードされ、又は
ｂ）配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有し、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｃ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドとの同一性が５５％以上であるアミノ酸配列を有し、又は
ｄ） 配列番号： ４、６、８又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有し、又は
ｅ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体である、又は
ｆ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、
ポリペプチドで処理するステップを含む方法。 - リゾリン脂質を含む糖質起源の水溶液又は懸濁液のろ過処理適性を改善するための請求項１２に記載の方法。
- 溶液又は懸濁液がデンプン加水分解物特に小麦デンプン加水分解物を含む請求項１〜１３のいずれか１項の方法。
- 界面活性剤と脂質分解酵素活性を有し、かつ
ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ配列によってコードされ、又は
ｂ）配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有し、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｃ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドとの同一性が５５％以上であるアミノ酸配列を有し、又は
ｄ） 配列番号： ４、６、８又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有し、又は
ｅ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体であり、又は
ｆ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、
ポリペプチドとを含む洗剤組成物。 - 穀粉と脂質分解酵素活性を有し、かつ
ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ配列によってコードされ、又は
ｂ）配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有する、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｃ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドとの同一性が５５％以上であるアミノ酸配列を有し、又は
ｄ） 配列番号： ４、６、８又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有し、又は
ｅ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体であり、又は
ｆ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、
ポリペプチドとを含む穀粉組成物。 - ベーカリー製品又はその生地を生産する方法であって、該生地に脂質分解酵素活性を有し、かつ
ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （寄託番号ＤＳＭ １４０４７、１４０４８、１４０４９又は１４０５１）中のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ配列によってコードされ、又は
ｂ）配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドであるアミノ酸配列を有する、又は該アミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により誘導することができ、又は
ｃ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドとの同一性が５５％以上であるアミノ酸配列を有し、又は
ｄ） 配列番号： ４、６、８又は１０の精製成熟ペプチドに対する抗体と免疫反応性を有し、又は
ｅ） 配列番号： ４、６、８又は１０の成熟ペプチドの対立遺伝子変異体であり、又は
ｆ）成熟ペプチドをコードする配列番号： ３、５、７又は９の核酸配列又は少なくとも１００ヌクレオチドを有するその部分配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、
ポリペプチドを添加するステップを含む方法。
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