CN1526013A - 脂解酶基因 - Google Patents

脂解酶基因 Download PDF

Info

Publication number
CN1526013A
CN1526013A CNA028054725A CN02805472A CN1526013A CN 1526013 A CN1526013 A CN 1526013A CN A028054725 A CNA028054725 A CN A028054725A CN 02805472 A CN02805472 A CN 02805472A CN 1526013 A CN1526013 A CN 1526013A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
ala
ser
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028054725A
Other languages
English (en)
Inventor
诺里科・楚楚米
诺里科·楚楚米
・文德
杰斯珀·文德
特・A・帕特卡尔
沙姆坎特·A·帕特卡尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN1526013A publication Critical patent/CN1526013A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)

Abstract

本发明已经分离了与T.lanuginosus脂酶基因具有高度同源性的新基因，因此而适于应用于基因改组中。因此，本发明通过两个或多个编码脂解酶的同源基因的家族改组提供了一种产生脂解酶遗传多样性的方法。该DNA改组技术用于生成改组基因的库，其在合适的表达系统中表达，筛选具有脂解酶活性的表达的蛋白质。进一步筛选表达的蛋白质以鉴定具有改进特性的脂解酶。本发明还提供一种包括编码脂解酶的核苷酸序列的多核苷酸和脂解酶(具有脂解酶活性的多肽)。

Description

脂解酶基因
发明领域
本发明涉及一种通过利用所谓的同源基因的家族改组(family shufful)而产生脂解酶多样性的方法。本发明还涉及该方法中所用到的多核苷酸，以及由该多核苷酸编码的脂解酶。
发明背景
已知Thermomyces lanuginosus(也称Humicola lanuginosa)的脂酶可以用于诸如洗涤剂和烘烤等各种工业目的(EP 258068，WO 9404035)。其氨基酸和DNA序列在US 5869438中显示。
现有技术描述了修饰T.lanuginosus脂酶的氨基酸序列产生变体以达到改变酶特性的目的。因此US 5869438，WO 9522615，WO 9704079和WO0032758公开了利用脂酶基因突变制备所述的变体。WO 0032758还公开了通过PCR反应构建具有T.lanuginosus脂酶主链和尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)磷脂酶C-末端的变体。
Crameri等，1998，Nature，391：288-291公开了对来源于多种种属的天然存在的同源基因家族的DNA改组以产生蛋白质的多样性。US 6159687公开了编码T.lanuginosus脂酶变体的基因改组。WO 9841623公开了异源多核苷酸序列的改组。
下面公布的曲霉属菌株的脂解酶的序列与T.lanuginosus脂酶具有49-51％的同一性：臭曲霉(A.foetidus)的溶血磷脂酶(EMBL A93428，US6140094)，塔宾曲霉(A.tubingensis)的脂酶(EMBL A84589，WO 9845453)，米曲霉(A.oryzae)的磷脂酶A1(EMBL E16314，EP 575133，JP 10155493 A)和黑曲霉(A.niger)的溶血磷脂酶(EMBL A90761，WO 98/31790)。
R.Lattmann等，Biocatalysis，3(1-2)，137-144(1990)公开了嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的酯酶。V.W.Ogundero，Mycologia，72(1)，118-126(1980)描述了嗜热踝节菌脂酶的活性。US 4275011和EP 258068中提到源于Thermomyces ibadanensis的脂酶。B.A.Oso，Canadian Journal ofBotany，56：1840-1843(1978)描述了Talaromyces emersonii脂酶的活性。
发明概述
发明人已经分离了与T.lanuginosus脂酶基因具有高度同源性的新的脂解酶基因，极适用于基因改组。该新基因如SEQ ID NO：3，5，7，9和11所示。一些蛋白和DNA序列同一性的表格在下面显示。所述的新序列鉴定如下：
·  源于嗜热踝节菌的Talthe 1M：SEQ ID NO：3和4。
·  源于Thermomyces ibadanensis的Theiba 1M：SEQ ID NO：5和6。
·  源于Talaromyces emersonii的Taleme 1M：SEQ ID NO：7和8。
·  源于Talaromyces byssochlamydoides的Talbys 1M：SEQ ID NO：9和10。
包括下面已知的序列用于比较：
·Thelan 1M：源于Thermomyces lanuginosus的脂酶，SEQ ID NO：1和2。
·Asptub 2M：源于塔宾曲霉的脂酶EMBL A84589。
·Aspory 3M：源于米曲霉的磷脂酶EMBL E16314。
·Aspnig 2M：源于黑曲霉的溶血磷脂酶EMBL A90761。
下面是成熟蛋白的同一性表：
  Thelan1   Talthe1   Theiba1   Taleme1   Talbys1   Asptub2   Aspory3   Aspnig2
Thelan 1M   100.0   88.1   78.1   61.9   57.4   50.6   50.4   49.1
Talthe 1M   88.1   100.0   78.8   61.5   59.2   48.7   47.8   48.0
Theiba 1M   78.1   78.8   100.0   61.8   58.0   49.4   50.4   48.0
Taleme 1M   61.9   61.5   61.8   100.0   83.1   54.8   56.1   53.7
Talbys 1M   57.4   59.2   58.0   83.1   100.0   50.9   54.9   49.1
Asptub 2M   50.6   48.7   49.4   54.8   50.9   100.0   55.9   93.7
Aspory 3M   50.4   47.8   50.4   56.1   54.9   55.9   100.0   53.7
Aspnig 2M   49.1   48.0   48.0   53.7   49.1   93.7   53.7   100.0
下面是编码成熟蛋白的DNA序列(省略终止密码子)的同一性表格：
  Thelan1   Talthe1   Theiba1   Taleme1   Talbys1   Asptub2   Aspory3   Aspnig2
Thelan1M   100.0   86.0   79.3   62.0   58.4   57.0   55.6   56.2
Talthe1M   86.0   100.0   79.1   62.6   60.0   57.8   55.7   57.1
Theiba1M   79.3   79.1   100.0   63.5   60.4   56.6   57.8   55.6
Taleme1M   62.0   62.6   63.5   100.0   84.1   58.2   58.4   58.7
Talbys1M   58.4   60.0   60.4   84.1   100.0   57.5   56.5   56.8
Asptub2MAspory3M   57.055.6   57.855.7   56.657.8   58.258.4   57.556.5   100.058.7   58.7100.0   91.756.5
Aspnig2M   56.2   57.1   55.6   58.7   56.8   91.7   56.5   100.0
因此，本发明提供一种通过两个或多个同源基因的家族改组产生脂解酶遗传多样性的方法，所述的同源基因编码脂解酶。一个基因编码与T.lanuginosus脂酶具有至少90％同一性的脂解酶，另一个基因编码与T.lanuginosus脂酶具有55-90％同一性的脂解酶。DNA改组技术用于产生嵌合改组基因库，其可在合适的表达载体系统中表达并且筛选有脂解酶活性的表达蛋白。进一步筛选表达的蛋白以鉴定具有改进特性的脂解酶。
本发明还提供一种包含编码脂解酶的核苷酸序列的多核苷酸和脂解酶(具有脂解酶活性的多肽)。
多核苷酸可以是克隆入质粒的DNA序列，该质粒存在于保藏号为DSM14047，14048，14049或14051的大肠杆菌中，可以是编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示成熟肽的DNA序列或衍生于它们的经过取代，缺失和/或插入一个或多个核苷酸的DNA序列。该多核苷酸与编码SEQ ID NO：3所示的成熟肽的DNA序列具有至少90％的同一性，与编码SEQ ID NO：5所示的成熟肽的DNA序列具有至少80％的同一性，与编码SEQ ID NO：7所示的成熟肽的DNA序列具有至少65％的同一性，与编码SEQ ID NO：9所示的成熟肽的DNA序列具有至少60％的同一性。其还可以是编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的DNA序列的等位基因变体；或其可以在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列(subsequence)的互补链杂交。
脂解酶可以由克隆入质粒的DNA序列编码，该质粒存在于保藏号为DSM14047或14049的大肠杆菌中，或可以具有SEQ ID NO：6或10所示成熟肽的氨基酸序列，或具有衍生于它们的经过取代，缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。脂解酶可以与SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％的同一性，与SEQ ID NO：10的多肽具有至少60％的同一性。脂解酶可以进一步地与抗纯化形式的SEQ ID NO：6或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或可以是SEQ ID NO：6或10所示的成熟肽的等位基因变体；或可以由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：5或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
附图说明
图1显示的是实施例7中所使用的PCR方案。
具体实施方式
基因组DNA的来源
使用基于本说明书中的DNA序列所设计的探针，本发明的脂解酶基因可以衍生自踝节菌属(Talaromyces)或Thermomyces属的菌株，尤其是嗜热踝节菌，Thermomyces ibadanensis，Talaromyces emersonii或Talaromycesbyssochlamydoides。
因此，序列表中所示的基因和多肽分离自下面所示的生物。本发明人按照布达佩斯条约在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg1b，D-38124 Braunschweig DE)保藏了含有该基因的大肠杆菌菌株，如下所示：
生物来源  基因和多肽序列  克隆保藏号  克隆保藏日期
嗜热踝节菌ATCC10518  SEQ ID NO：3和4  DSM 14051  2001年2月8日
Thermomyces ibadanensis CBS 281.67＝ATCC22716  SEQ ID NO：5和6  DSM 14049  2001年2月8日
Talaromyces emersonii UAMH 5005＝NRRL 3221＝ATCC 16479＝IMI 116815＝CBS 393.64  SEQ ID NO：7和8  DSM 14048  2001年2月8日
Talaromyces byssochla mydoides CBS 413.71＝IMI 178524＝NRRL 3658  SEQ ID NO：9和10  DSM 14047  2001年2月8日
根据贸易条款，上述来源的生物可以容易地从下面保藏中心得到：
DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeg lb，D-38124Braunschweig DE。
ATCC(美国典型培养物保藏中心American Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。
CBS(荷兰真菌菌种保藏中心Centraalbureau voor Schimmelcultures)，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，The Netherlands。
UAMH(加拿大阿尔伯达大学植物霉菌培养物保藏中心University ofAlberta Mold Herbarium & Culture Collection)，Devonian Botanic Garden，Edmonton，Alberta，Canada T6G 3GI。
IMI：国际微生物研究所(International Mycological Institute)，BakehamLane，Englefield Green，EGHAM，Surrey TW20 9TY，United Kingdom。
多核苷酸
用于重组(改组)的多核苷酸是两个或多个编码脂解酶的基因，包括一个与T.lanuginosus脂酶具有至少90％同一性的基因，一个与T.lanuginosus脂酶具有55-90％同一性的基因。这些多核苷酸至少有一个核苷酸不同。
起始材料可以包括SEQ ID NO：1，3，5，7和/或9的两个或多个(例如3个，4个或5个)成熟部分。它还可以包括编码两个或多个(例如3个，4个或5个)SEQ ID NO：2，4，6，8或10变体的基因，该变体通过缺失，取代，和/或插入一个或多个氨基酸或通过将延伸的肽片段附着在N和/或C-末端得到。T.lanuginosus脂酶变体的实例在例如US 5869438，WO 9522615，WO 9704079和WO 0032758中描述，并且类似的变体可通过在其它序列中改变相应的氨基酸得到。
基因中的内含子可以任选地在改组前除去。
DNA重组(改组)
在两个或多个同源输入型多核苷酸(input polynucleotides)(起点多核苷酸)间的改组涉及片段化该多核苷酸并重组所述的片段，以获得输出型(output)多核苷酸(即已经过改组循环的多核苷酸)，与输入型多核苷酸相比其中已经有许多核苷酸片段发生了交换。
DNA重组或改组可以是(部分)随机方法，其中，嵌合基因库从两个或多个起始基因产生的。可利用多种已知的形式实施该改组或重组方法。
该方法涉及亲代DNA随机片段化，接着通过PCR重新组装成新的全长基因，例如US5605793，US5811238，US5830721，US6117679中所述。基因的体外重组可以按照例如如US6159687，WO98/41623，US6159688，US5965408，US6153510中所述的实施。重组的方法可以在体内例如如WO97/07205和WO 98/28416中所述在活细胞中进行。
亲代DNA可以通过DNA酶I处理或如Kikuchi等(2000a，Gene 236：159-167)所述的用限制性核酸内切酶消化成片段。如Kikuchi等(2000b，Gene 243：133-137)所述两个亲代的改组可以通过改组两亲代的单链亲代DNA进行。
具体的改组方法按在Crameri等，1998，Nature，391：288-291和Ness等Nature Biotechnology 17：893-896中所述的方法进行。其它的方法描述在US6159687：实施例1和2。
脂解酶特性
本发明得到的脂解酶能水解羧酸酯键，根据酶分类命名法1992Academic Press，Inc分类为EC 3.1.1。它特别具有脂酶(三酰基甘油脂酶)(EC3.1.1.3)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)和/或半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)的活性。
热稳定性通过差示扫描量热器(DSC)评价。与现有技术的T.lanuginosus脂酶的稍高于70℃的变性峰相比，在pH5，以90deg/hr加热时，来源于T.ibadanensis脂解酶的变性峰(Td)稍高于75℃的温度。来源于T.ibadanensis的脂解酶在碱性pH最佳的活性(类似于T.lanuginosus脂酶)，且其等电点约4.3(比T.lanuginosus脂酶稍低)。
同源性和序列对比
SEQ ID NO：2，4，6，8和10成熟部分的最好的序列对比通过在SEQ IDNO：2，4和6的Q249和P/G250之间插入一个氨基酸的缺口得到。  这种序列对比确定相应的氨基酸。
同源性程度可以通过本领域已知的计算机程序诸如GCG程序包中提供的GAP进行测定(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)，利用GAP进行多肽序列比较时采用下列设定值：GAP生成罚分(creation penalty)为3.0和GAP延伸罚分(extension penalty)为0.1。
还可以使用来自fasta package version v20u6的Align进行同源性的测定。Align是Needleman-Wunsch序列对比(即总体序列对比)，用于蛋白质和DNA的序列对比。默认得分矩阵(default scoring matrices)BLOSUM50和同一性矩阵(identity matrix)分别用于蛋白质和DNA的序列对比。缺口中的第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16。而缺口中的其它残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。
本说明书中所讨论的同源性可以相当于是具有至少60％同源性，尤其至少是70％或至少是80％的同一性，例如至少90％或至少95％的同一性。
脂解酶的用途
根据底物的特异性，本发明的酶可以用于例如改进过滤，植物油的处理，烘烤，洗涤剂或制备溶血磷脂。因此，根据现有技术类推，它还可以具有脂解酶已知的用途，例如：
*在纸浆和造纸工业中，用以除去树脂(pitch)或从用过的纸除去墨水。WO 9213130，WO 9207138，JP 2160984 A，EP 374700。
*烘烤。WO 94/04035，WO 00/32758。
*洗涤剂。WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，WO 98/08939和WO 97/43375。
*皮革工业。GB 2233665，EP 505920。
*具有脂酶活性的酶可以用于脂水解和修饰甘油三酯以及制备甘油一酯和甘油二酯。
*具有脂酶活性的酶可以用于大多数脂肪的酯交换，制备炸用脂油，起酥油和人造奶油成分。
*具有磷脂酶(A1，A2)活性的酶可以用于植物油的脱胶和制备溶血磷脂。
改进滤清(filtration)
具有溶血磷脂酶活性的酶可以用于改进碳水化合物源的水溶液或浆的滤过性，是通过用变体处理进行的。这特别适用于包含淀粉水解产物尤其是小麦淀粉水解产物(由于这往往是很难过滤的并且过滤后是浑浊的滤液)的溶液或浆。该处理可以类似于EP 219,269(CPC International)进行。
洗涤剂
由本发明制备的脂解酶可以用作洗涤剂添加剂，例如浓度(表示为纯酶蛋白)为0.001-10(例如0.01-1)mg/g洗涤剂或0.001-100(例如0.01-10)mg/l的洗涤溶液。
本发明的洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，包括适合用于污染织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或制成通常家庭硬表面清洗操作中使用的洗涤剂组合物。在洗衣洗涤剂中，该变体可以有效地除去脂污染，保持洁白和除脏。洗衣洗涤剂组合物可以按照WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，PCT/DK WO98/08939和WO 97/43375中所述制成。
本发明洗涤剂组合物尤其可以配制用于在手洗或机洗餐具洗涤过程中使用，如GB 2,247,025(Unilever)或WO 99/01531(Procter & Gamble)中所述。在餐具洗涤组合物中，该变体可有效地除去油脂/油污，有效地防止高色成分对餐具和餐具清洗机塑料成分的染色/变色和避免钙皂在餐具表面的沉积。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如可以是棒，片，粉末，颗粒，糊或液体。液体洗涤剂可以是水溶液，通常包含70％水和0-30％有机溶剂或非水物。
洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，其可以是包括半极性的非离子物质和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子物质。表面活性物存在的通常的重量比为0.1％-60％，例如0.5-40％，例如1-30％，典型的是1.5-20％。
生面团和烘烤产品
脂解酶可在生面团和由生面团制得的烘烤产品例如面包和蛋糕的制备中使用，以提高生面团的稳定性和生面团的可操作性能，或改进面包或蛋糕的弹性。因此，它可以在制备面包的方法中使用，包括将它添加到生面团成分中，揉捏并烘培该面团以制成面包。可以按照US 4,567,046(KyowaHakko)，JP-A 60-78529(QP Corp.)，JP-A 62-111629(QP Corp.)，JP-A63-258528(QP Corp.)或EP 426211(Unilever)中所述操作。与WO 99/53769(Novo Nordisk)类似，脂解酶可以和抗变味(anti-staling)淀粉酶尤其是内淀粉酶诸如麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)一起使用。因此脂解酶可以掺入面粉组合物例如生面团或生面团的预拌和料(premix)中。
材料与方法
菌株和质粒
质粒pMT2188
米曲霉(Aspergillus oryzae)表达质粒pCaHj 483(WO 98/00529)由表达盒组成，该表达盒基于与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)丙糖磷酸异构酶非翻译的前导序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)融合的黑曲霉(Aspergillus niger)中性淀粉酶II启动子。来源于能在以乙酰胺为唯一氮源下生长的构巢曲霉的曲霉选择性标记amdS也存在于该质粒中。将这些元件克隆入大肠杆菌载体pUC19(New England Biolabs)。用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3标记替换能在该质粒的大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性标记，URA3标记可以弥补大肠杆菌中的pyrF突变，这种替换按照下面的方式进行：
自pCaHj483用引物142779(SEQ ID NO：35)和142780(SEQ ID NO：36)PCR扩增pUC19的复制起点。
引物142780在PCR片段中引入Bbul位点。按照制造商的说明使用Expand PCR系统(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switserland)进行该引入以及后面的PCR扩增。
使用引物140288(SEQ ID NO：37)和142778(SEQ ID NO：38)自一般的酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca，USA)扩增URA3基因。
引物140288在PCR片段中引入EcoRl位点。这两种PCR片段通过将它们混合并使用引物142780和140288扩增由重叠的方法在剪接中得以融合(Horton et al(1989)Gene，77，61-68)。
所得的片段用EcoRI和BbuI消化并连接到用相同的酶消化的最大的pCaHj 483片段。连接的混合物用于转化用Mandel和Higa(Mandel，M.andA.Higa(1970)J.Mol.Biol.45，154)的方法制备的感受态pyrF大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)。在添加有1g/l酪蛋白氨基酸，500μg/l硫铵和10mg/l卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook et.al(1989)Molecularcloning，a laboratory manual，2.edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)上筛选转化体。
来自所筛选的转化体的质粒命名为pCaHj 527。将存在于pCaHj527上的Pna2/tpi启动子通过单PCR方法进行定点突变。
使用致突变引物141223(SEQ ID NO：41)将核苷酸134-144自SEQ IDNO：39改变为SEQ ID NO：40。
使用致突变引物141222(SEQ ID 44)将核苷酸423-436自SEQ ID NO：42改变为SEQ ID NO：43。
所得的质粒命名为pMT2188。
质粒pENI1861
制备质粒pENI1861使其在表达质粒中具有曲霉属菌株启动子作用状态以及具有许多用于克隆的唯一的限制性位点。
利用pMT2188(见上)作为模板以及利用引物051199J1(SEQ ID 45)和1298TAKA(SEQ ID 46)制备PCR片段(约620bp)。
用BssHII和Bgl II切割，并克隆入同样用BssHII和Bgl II切割的pENI1849。所述克隆通过测序验证。制备质粒pENI1902以使其具有的启动子可以在大肠杆菌和曲霉菌属菌株中起作用。这可利用Stratagene推荐的″Chameleon双链定点突变试剂盒″通过唯一位点的消除来进行。
质粒pENI1861
质粒pENI1861用作模板并且下面具有5′磷酸化的引物用作筛选引物：177996(SEQ ID 47)，135640(SEQ ID 48)和135638(SEQ ID 49)。
具有5′磷酸化的080399J19引物(SEQ ID NO：50)用作突变引物以在曲霉属菌株表达载体中引入-35和-10启动子共有序列(自大肠杆菌)。引入的突变通过测序验证。
质粒pENI1960
利用Gateway VectorTM转化系统(Lifetechnology cat no.11828-019)制备质粒pENI1960，是通过用BamHI切割pENI1902，使用Klenow片段聚合酶和核苷酸填充DNA末端(由此制备钝末端)，接着连接到读框A GatewayTMPCR片段进行的。通过测序证实处于正确方向的克隆。
培养基和底物
YPG：4g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4-7aq，5g/L葡萄糖，pH6.0。
实施例
实施例1：携带脂解酶基因的质粒
制备基因组DNA
使用Thermomyces ibadanensis，Talaromyces emersonii，Talaromycesbyssochlamydoides和嗜热踝节菌菌株作为基因组DNA供体。将各菌株在100ml的YPG中于合适的温度培养几天。收获菌丝体并在液氮中研磨。用2ml的其中包括100mM NaCl，25mM EDTA和1％SDS的50mM Tris-HCI(pH8.0)缓冲液悬浮，然后添加12μl蛋白酶K(25mg/ml)。悬浮液于65℃温育30-60分钟。进行酚提取以除去蛋白质而DNA通过0.7体积的异丙醇沉淀。用已灭菌的水溶解沉淀并添加RNase。酚/异戊醇提取后，DNA通过EtOH沉淀。
PCR筛选脂解酶基因
用基于脂解酶对比而设计的HL 2和HL12(SEQ ID NO：51和52)或HL2和HL6(SEQ ID NO：51和53)进行各基因组DNA的PCR反应。
将反应成分(2.6ng/μl基因组DNA，250mM各dNTP，引物各250nM，1X缓冲液中的(Roche Diagnostics，Japan)0.1U/μlTaq聚合酶)混合并在下面的条件下进行PCR。
    步骤     温度     时间
    1     94℃     1分钟
    3     50℃     1分钟
    4     72℃     2分钟
    5     72℃     10分钟
    6     4℃     始终
步骤1到3重复30次。
分别由引物组HL2/H 12和HL2/HL6扩增540bp片段和380bp片段。用GFXTM PCR DNA和Gel Band Purification试剂盒(amersham pharmaciabiotech)对它们进行凝胶纯化。对各DNA测序并与脂酶比较，显示克隆编码脂酶的内部部分。
克隆脂酶基因
按照制造商的说明使用LA PCRTM体外克隆试剂盒(TaKaRa)克隆所有的脂酶基因。因此，用各种限制性内切酶切割基因组DNA并且将各DNA连接到试剂盒中合适的表达盒。将各种连接溶液应用于PCR，所用引物为按照内部序列设计的引物和试剂盒的表达盒引物。对扩增的DAN片段测序。重复该步骤直到确定ORF。
试剂盒LA-taq聚合酶的保真性不好，所以为得到正确的序列按照制造商的说明通过Expand高保真性聚合酶扩增全部基因。
扩增的DNA片段用GFXTM PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)进行凝胶纯化并用ligation high(TOYOBO，日本)连接到pT7Blue载体或pST BLue-1 AccepTor载体(Novagen)。将连接混合物转化入大肠杆菌JM109或DH5α。测定各基因4种质粒的序列并且比较它们的序列。大多数的序列确定为正确的核苷酸序列。
实施例2：脂酶克隆入曲霉菌表达载体
在下面的反应中进行3种不同的PCR反应，使用PWO聚合酶(94℃5分钟，30*(94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟)，72℃5分钟)。在各情形中，模板为如实施例1中制备的携带脂解酶基因的质粒，使用下面的引物：
A：具有来自嗜热踝节菌的基因的质粒和寡05 1200j1/051200j8(SEQ IDNO：11和18)。
B：具有来自Talaromyces emersonii的基因的质粒和寡051200j9/051200j16(SEQ ID NO：19和26)。
C：具有来自Thermomyces Ibadanensis的基因的质粒和寡051200j17/051200j24(SEQ ID NO：27和34)。
自1％琼脂糖凝胶对PCR片段进行电泳并纯化，如供货商(LifeTechnologies)所推荐的使用Gateway克隆法克隆入pENI1960(参见上述)，转化入大肠杆菌DH10b(Life Technologies，Gaithersburg，MD)并测序，由此生成pENI 2146(Talaromyces emersonii脂酶基因)，pENI2147(ThermomycesIbadanensis脂酶基因)和pENI2148(嗜热踝节菌脂酶基因)
将它们转化入JaI250(在WO 00/39322中描述)而且如专利WO 00/24883中所提到的鉴定脂酶活性。
实施例3：构建内含子较少的脂酶基因
自Talaromvces thermophilus脂酶基因中除去内含子
使用PWO聚合酶和利用pENI2148为模板以及下面的寡核苷酸(oligoes)进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)：
1：051200j1和051200j3(SEQ ID NO：11和13)。
2：051200j2和051200j5(SEQ ID NO：12和15)。
3：051200j4和051200j7(SEQ ID NO：14和17)。
4：051200j6和051200j8(SEQ ID NO：16和18)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j1和051200j8(SEQ ID NO：11和18，总量为50μl，按照供应商Boehringer Mannheim的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱(cat no.732-6225)纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI(以切割ccdB基因)切割的pENI1960，转化大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的嗜热踝节菌脂酶基因。
从Talaromvces emersonii脂酶基因中去除内含子
使用PWO聚合酶和利用pENI2146为模板以及下面的寡核苷酸进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)：
1：051200j9和051200j11(SEQ ID NO：19和21)。
2：051200j10和051200j13(SEQ ID NO：20和23)。
3：051200j12和051200j15(SEQ ID NO：22和25)。
4：051200j14和051200j16(SEQ ID NO：24和26)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j9和051200j16(SEQ ID NO：19和26，总量为50μl，按照供应商的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI切割的pENI1960，转化入大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的Talaromyces emersonii脂酶基因。
从Talaromvces Ibadanensis脂酶基因中去除内含子
使用PWO聚合酶和利用pENI2147为模板以及下面的寡核苷酸进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)。：
1：051200j17和051200j19(SEQ ID NO：27和29)。
2：051200j18和051200j21(SEQ ID NO：28和31)。
3：051200j20和051200j23(SEQ ID NO：30和33)。
4：051200j22和051200j24(SEQ ID NO：32和34)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j17和051200j24(SEQ IDNO：27和34，总量为50μl，按照供应商Boehringer Mannheim的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI切割的pENI1960，转化大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的Talaromyces Ibadanensis脂酶基因
实施例4：脂解酶基因的改组
包含编码脂解酶的DNA序列的质粒等摩尔混合。下面的成分在微量管中混合：
2μl质粒混合物(0.15μg/μl)，侧接该基因的特异引物(1pmol/μ，2μl 2.5mM dNTP，2.5mM MgCl2，2μl 10*taq缓冲液(Perkin Elmer)，0.5μl taq酶，总体积为20μl。
将管放置在Perkin Elmer 2400热循环仪上，运行下面的PCR-程序(94℃，5分钟)1个循环：
(94℃，30秒，70℃，0秒)99个循环(72℃，2分钟，4℃不限定)1个循环。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。从琼脂糖凝胶上切下特定预测长度的DNA泳带，使用JETsorb(来自GENOMED Inc.)纯化。将纯化的PCR产物克隆入TA-载体(来自Invitrogen(最初的TA克隆试剂盒)。将连接产物转化入标准的大肠杆菌菌株(DH5a)。
然后将改组序列自大肠杆菌TA载体亚克隆入酵母载体pJS0026(WO9928448)为BamHI-XbaI片段(见WO 97/07205)，并且例如筛选具有改进特性的新改组的序列，所述特性例如在洗涤剂中改进的性能(见WO97/07205)。
实施例5：脂解酶基因的改组
如前面实施例所述制备脂解酶基因的PCR产物并以等摩尔汇聚。在合适的管中制备下面的混合物：1μl PCR混合物(0.1μg)，十聚体(decamer)随机引物，(300pmol)，2μl10*Klenow缓冲液(Promega)，0.25mM dNTP，2.5mMMgCl2，总体积为20μl。
将混合物置于PE 2400热循环仪中，运行下面的程序：96℃，5分钟，25℃，5分钟，添加0.5ml Klenow酶，25℃，60分钟，35℃，90分钟。
这种方法产生大量小的源于该基因所有部分的DNA聚合物。
取出10μl用于在琼脂糖凝胶上检测。
将10μl PCR混合物(0.25mM dNTP，1μl 10*Taq缓冲液(PerkinElmer)，2.5mM MgCl2，0.5μl Taq酶)添加到热循环仪的管中至10μl。然后运行下面的标准PCR程序：(94℃，5分钟)1个循环，(94℃，30秒，45℃，30秒，72℃，30秒)25个循环，72℃，7分钟，4℃不限定。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。观察到清晰的不偏的成片条带。在400和800bp间的DNA自凝胶中分离。
一半该纯化的PCR产物在管中与侧接于目的基因的两种特异引物(40pmol)，0.25mM dNTP，2μl10*Taq缓冲液，2.5mM MgCl2混合。然后运行下面的标准PCR程序(94℃，5分钟)1个循环，(94℃，30秒，50℃，30秒，72℃，30秒)25个循环，72℃，7分钟，4℃不限定。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。分离所需大小的带。使用特异引物再进行其它的PCR(如上面所提到的)以在克隆前扩增PCR产物。
PCR产物和所需的载体用合适的限制酶(BamHI/XhoI)切割。将载体和PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并且从胶中纯化。
切割的PCR产物和切割的载体在连接缓冲液中与T4 DNA连接酶(Promega)混合。在16℃过夜连接后，将该混合物转化到大肠杆菌菌株DH5a。
实施例6：生成内含子较少的脂酶基因
将许多与Thermomyces lanuginosus脂酶基因具有同源性的脂酶基因克隆。这些基因克隆为基因组DNA并因此已知包含内含子。
本发明改组这些基因以获得嵌合基因。为最大可能的获得高质量的库，必须要除去内含子。这通过生成与外显子的各侧翼序列匹配并且与下一个相邻的外显子具有同源性的DNA寡核苷酸进行的。
这些寡核苷酸用于标准的PCR中(本领域的技术人员已知)，由此生成PCR片段携带有基因中的每个外显子(编码序列)。在1％琼脂糖凝胶上纯化这些PCR片段。在第二次PCR中使用侧翼于整个基因的DNA寡核苷酸为引物，将这些PCR片段装配成全长基因。
如专利申请PCT/DK02/00050所述，将包含内含子较少的编码脂酶的全长基因的PCR片段克隆入pENI 1960。
下面的引物用于组装各内含子较少的基因：嗜热踝节菌：051200j1，051200J2，051200J3，051200J4，051200J5，051200J6，051200J7和051200J8(SEQ ID NO：11-18)，从而在克隆入pENI1960时生成pENI2178。
Talaromyces emersonii：051200J9，051200J10，051200J11，051200J12，051200J13，051200J14，051200J15和051200J16(SEQ ID NO：19-26)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2159。
Thermomyces ibadanensis：051200J 17，051200J 18，051200J 19，051200J20，051200J21，051200J22，051200J23和051200J24(SEQ ID NO：27-34)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2160。
Talaromyces byssochlamydoides：080201 P1，080201 P2，080201 P3，080201 P4，080201 P5，080201 P6，080201 P7和080201 P8(SEQ ID NO：54-61)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2230。
实施例7：改组内含子较少的脂酶基因
实施使用dUTP和尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法以制备充足量的DNA片段进行DNA改组。3种基因T.lanuginosus，嗜热踝节菌和T.ibadanensis彼此间具有极大的同源性(由此命名为组A)，同样地T.emersonii和T.byssochlamydoides也具有极大的同源性(命名为组B)。由此为了改进在两组间的重组而实施下面的PCR方案(见图1)，利用下述的作为模板：pENI2178，pENI2159，pENI2160，pENI2230，并且将T.lanuginosus基因克隆入pENI1902(BamHI和SacII切割)(专利PCT/DK02/00050)。
下面的寡核苷酸在图1中显示：1298-taka，19670，19672，115120和050401 P6(SEQ ID NO：62-65和68)。050401 P1(SEQ ID NO：66)与5′T.lanuginose脂酶基因杂交。030501 P1(SEQ ID NO：67)与其它4种脂酶基因的5′杂交。
最终的PCR片段首先用BstEII切割然后用SfiI切割，同样地切割载体pENI2376。pEM2376是pENI1861的衍生物(专利PCT/DK02/00050)。
将载体和PCR片段在1％凝胶中纯化并过夜连接。将连接的DNA库转化到电致感受态大肠杆菌细胞DH10B，由此生成约700.000个独立的克隆的库。
针对各种底物诸如卵磷脂，DGDG，甘油三酸酯例如三丁酸甘油酯，橄榄油，PNP-戊酸酯或PNP-棕榈酸酯的活性可在不同条件如高pH，低pH，高温，在有洗涤剂，在有离子或没有离子的条件下筛选所述的库。
这种筛选可用来发现例如热稳定脂酶，洗涤剂磷脂酶，具有首洗性能的洗涤剂脂酶，和在中性PH时没有活性的洗涤剂脂酶等。
DNA-寡核苷酸(oligoes)：1298-taka：
gcaagcgcgcgcaatacatggtgttttgatcat
19670：ccccatcctttaactatagcg
19672：ccacacttctcttccttcctc
115120：gctttgtgcagggtaaatc
050401P1：cggccgggccgcggaggccagggatccaccatgaggagctcccttgtgctg
030501P1：cggccgggccgcggaggccacaagtttgtacaaaaaagcagg(与其它4种脂酶基因5′杂交)
050401P6：cggccgggtcaccccccatcctttaactatagcg
实施例8：脂解酶的特征
Thermomyces ibadanensis和嗜热踝节菌脂解酶按照上述制备，纯化并用于鉴定特征。
特异性脂酶活性通过WO 0032758中所述的LU方法测定，用280nm的最佳密度测定脂酶蛋白的量。对于Th.ibadanensis脂酶发现特异性活性为3181LU/mg和嗜热踝节菌脂酶为1000LU/mg。
通过LU方法在pH5，6，7，8，9和10测定脂酶寻找pH-活性之间的关系。两种酶在pH10均有最高的脂酶活性。Th.ibadanensis脂酶显示宽的适宜度，在pH6-10时其活性高于最大活性的50％，而嗜热踝节菌脂酶在较低pH时活性降低较大，在pH5-8时其活性低于最大活性的30％。
通过差示扫描量热法(DSC)在pH5(50mM醋酸缓冲液)，pH7(50mMHEPES缓冲液)和pH10(50mM甘氨酸缓冲液)时，以90℃/小时的扫描率测定热稳定性。在变性峰顶的温度(Td)如下：
pH               Td(℃)
    T.ibadanesis     嗜热踝节菌
    5     74*     72*
    7     72     75
    10     64     69
实施例9：溶血磷脂酶活性
通过在pH5和7温育作为底物的溶血卵磷脂，检测纯化自T.ibadanensis和嗜热踝节菌的脂解酶，使用NEFA试剂盒了解反应的程度。
结果显示：来自T.ibadanensis的酶在pH5显示高的溶血磷脂脂酶活性并在pH7显示一些活性。来自嗜热踝节菌的酶显示微活性。
  0-10-1-1   表-PCT/RO/134(EASY)关于制备使用的微生物或其它生物材料保藏的说明(PCT Rule 13bis)   PCT-EASY Version 2.92(2002年01月01日修改)
  0-2   国际申请号
  0-3   申请人或代理人文件参考   10130-WO
  11-1，1-2   以下说明涉及在说明书中提及的被保藏的微生物或其他生物材料：页行 411-16
  1-31-3-11-3-21-3-31-3-4   保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，德国2001年2月8日DSMZ 14047
  1-4   附加信息   无
  1-5   本说明所适用的国家   所有指定的国家
  1-6   另外的说明(后来提交国际局)   无
  22-12-2   保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 411-16
  2-32-3-12-3-22-3-32-3-4   保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，德国2001年2月8日DSMZ 14048
  2-4   附加信息   无
  2-5   本说明所适用的国家   所有指定的国家
  2-6   另外的说明(这些说明以后将提交国际局)   无
    33-13-2     保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 411-16
    3-33-3-13-3-23-3-33-3-4     保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，德国2001年2月8日DSMZ 14049
    3-4     附加信息 无
    3-5     本说明所适用的国家 所有指定的国家
    3-6     另外的说明(这些说明以后将提交国际局) 无
    44-14-2     保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 411-16
    4-34-3-14-3-24-3-34-3-4     保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，德国2001年2月8日DSMZ 14051
    4-4     附加信息 无
    4-5     本说明所适用的国家 所有指定的国家
    4-6     另外的说明(这些说明以后将提交国际局) 无
             仅用于接受局
0-4 国际局收到该表格：(是或否)
0-4-1 被授权的官员
             仅用于国际局
0-5 国际局收到该表格的日期：
0-5-1 被授权的官员
                            序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>脂解酶基因
<130>10130
<160>68
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>918
<212>DNA
<213>Thermomyces lanuginosus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(873)
<223>
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(66)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>1
atg agg agc tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tct gcg tgg acg gcc ttg     48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc     96
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
aat ctc ttt gca cag tat tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat    144
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
                15                  20                  25
gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc    192
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
            30                  35                  40
gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct    240
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa    288
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
ttg atc gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc    336
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc      384
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat      432
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat      480
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
cgc gtg gtg ttt acc gga cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt      528
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
gcc gga gca gac ctg cgt gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca      576
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
tat ggc gcc ccc cga gtc gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc      624
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
gta cag acc ggc gga aca ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att      672
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
gtc cct aga ctc ccg ccg cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca      720
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
gag tac tgg atc aaa tct gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat      768
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
    220                 225                 230
atc gtg aag ata gaa ggc atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct      816
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
aac att ccg gat atc cct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg      864
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
                255                 260                 265
aca tgt ctt tagtggccgg cgcggctggg tccgactcta gcgagctcga gatct        918
Thr Cys Leu
<210>2
<211>291
<212>PRT
<213>Thermomyces lanuginosus
<400>2
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
                15                  20                  25
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
                255                 260                 265
Thr Cys Leu
<210>3
<211>1083
<212>DNA
<213>嗜热踝节菌属(Talaromyces thermophilus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(67)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(139)..(307)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(370)..(703)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(778)..(1080)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>3
atg agg agc tcg ctc gtg ctg ttc ttc gtt tct gcg tgg acg gcc ttg     48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcc agt cct gtc cga cga g gtatgtaaat cacggggtat acttttcatg          97
Ala Ser Pro Val Arg Arg
    -5              -1
cattgcatgt cgaacctgct gtactaagat tgcgcgcaca g ag  gtc tcg cag gat  152
                                              Glu Val Ser Gln Asp
ctg ttt gac cag ttc aac ctc ttt gcg cag tac tcg gcg gcc gca tac      200
Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr
                10                  15                  20
tgc gcg aag aac aac gat gcc ccg gca ggt ggg aac gta acg tgc agg      248
Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Gly Asn Val Thr Cys Arg
            25                  30                  35
gga agt att tgc ccc gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac      296
Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr
        40                  45                  50
tcg ttt gag ga gtaggtgtca acaagagtac aggcacccgt agtagaaata           347
Ser Phe Glu Asp
    55
gcagactaac tgggaaatgt ag t tct gga gtt ggc gat gtc acc ggg ttc       397
                           Ser Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe
                                   60                  65
ctt gct ctc gac aac acg aac aga ctg atc gtc ctc tct ttc cgc ggc      445
Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly
            70                  75                  80
tct cgt tcc ctg gaa aac tgg atc ggg aat atc aac ttg gac ttg aaa      493
Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys
        85                  90                  95
gga att gac gac atc tgc tct ggc tgc aag gga cat gac ggc ttc act      541
Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly Phe Thr
    100                 105                 110
tcc tcc tgg agg tcc gtt gcc aat acc ttg act cag caa gtg cag aat      589
Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn
115                 120                 125                 130
gct gtg agg gag cat ccc gac tac cgc gtc gtc ttc act ggg cac agc      637
Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser
                135                 140                 145
ttg ggt ggt gca ttg gca act gtg gcc ggg gca tct ctg cgt gga aat      685
Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn
            150                 155                 160
ggg tac gat ata gat gtg gtatgtagga aaaatgatcc ccgtggagcg             733
Gly Tyr Asp Ile Asp Val
        165
gtcatgtgga aatgtgcagg ggtgtctaat acacagacca acag ttc tca tat ggc     789
                                                 Phe Ser Tyr Gly
                                                     170
gct ccc cgc gtc gga aac agg gct ttt gcg gaa ttc ctg acc gca cag      837
Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln
        175                 180                 185
acc ggc ggc acc ttg tac cgc atc acc cac acc aat gat att gtc ccc    885
Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro
    190                 195                 200
aga ctc ccg cca cgc gaa ttg ggt tac agc cat tct agc cca gag tat    933
Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr
205                 210                 215                 220
tgg atc acg tct gga acc ctc gtc cca gtg acc aag aac gat atc gtc    981
Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val
                225                 230                 235
aag gtg gag ggc atc gat tcc acc gat gga aac aac cag cca aat acc   1029
Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr
            240                 245                 250
ccg gac att gct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tca atg gcg acg tgt   1077
Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Ser Met Ala Thr Cys
        255                 260                 265
ttg taa                                                           1083
Leu
<210>4
<211>291
<212>PRT
<213>嗜热踝节菌属(Talaromyces thermophilus)
<400>4
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn
                15                  20                  25
Asp Ala Pro Ala Gly Gly Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Gly Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn
            110                 115                 120
Thr Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
Ala Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
Asn Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Ser Met Ala
                255                 260                 265
Thr Cys Leu
<210>5
<211>1070
<212>DNA
<213>Thermomyces ibadanensis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(67)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(128)..(296)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(357)..(690)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(765)..(1067)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>5
atg cgg agc tcc ctc gtg ctg ttc ttc ctc tct gcg tgg acg gcc ttg       48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcg cgg cct gtt cga cga g gtatgtagca agggacacta ttacatgttg            97
Ala Arg Pro Val Arg Arg
    -5              -1
accttggtga ttctaagact gcatgcgcag cg  gtt ccg caa gat ctg ctc gac     150
                                 Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp
                                                 5
cag ttt gaa ctc ttt tca caa tat tcg gcg gcc gca tac tgt gcg gca      198
Gln Phe Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala
    10                  15                  20
aac aat cat gct cca gtg ggc tca gac gta acg tgc tcg gag aat gtc      246
Asn Asn His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val
25                  30                  35                  40
tgc cct gag gta gat gcg gcg gac gca acg ttt ctc tat tct ttt gaa      294
Cys Pro Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu
                45                  50                  55
ga  gtgggtgtcg acaaagcaca gagacagtag tagagacagc agtctaactg           346
Asp
agatgtgcag t tct gga tta ggc gat gtt acc ggc ctt ctc gct ctc gac     396
             Ser Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp
                     60                  65                  70
aac acg aat aaa ctg atc gtc ctc tct ttc cgc ggc tct cgc tca gta      444
Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val
                75                  80                  85
gag aac tgg atc gcg aac ctc gcc gcc gac ctg aca gaa ata tct gac      492
Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp
            90                  95                  100
atc tgc tcc ggc tgc gag ggg cat gtc ggc ttc gtt act tct tgg agg      540
Ile Cys Ser Gly Cys Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg
        105                 110                 115
tct gta gcc gac act ata agg gag cag gtg cag aat gcc gtg aac gag      588
Ser Val Ala Asp Thr Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu
    120                 125                 130
cat ccc gat tac cgc gtg gtc ttt acc gga cat agc ttg gga ggc gca      636
His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala
135                 140                 145                 150
ctg gca act att gcc gca gca gct ctg cga gga aat gga tac aat atc      684
Leu Ala Thr Ile Ala Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile
                155                 160                 165
gac gtg gtatgtggga agaagccacc cagacaaaca attatgtgga aacatgcaag       740
Asp Val
gatggctaat acacggtcca acag ttc tca tat ggc gcg ccc cgc gtc ggt       791
                           Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly
                               170                 175
aac agg gca ttt gca gaa ttc ctg acc gca cag acg ggc ggc acc ctg      839
Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu
        180                 185                 190
tat cgc atc acc cat acc aat gat atc gtc cct aga ctc cct cct cga      887
Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg
    195                 200                 205
gac tgg ggt tac agc cac tct agc ccg gag tac tgg gtc acg tct ggt      935
Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Val Thr Ser Gly
210                 215                 220                 225
aac gac gtc cca gtg acc gca aac gac atc acc gtc gtg gag ggc atc      983
Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp Ile Thr Val Val Glu Gly Ile
                230                 235                 240
gat tcc acc gac ggg aac aac cag ggg aat atc cca gac atc cct tcg     1031
Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ser
            245                 250                 255
cat cta tgg tat ttc ggt ccc att tca gag tgt gat tag                 1070
His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Glu Cys Asp
        260                 265
<210>6
<211>291
<212>PRT
<213>Thermomyces ibadanensis
<400>6
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Arg Pro Val Arg Arg Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Asn Asn
                15                  20                  25
His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Ala Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
Thr Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu His Pro Asp Tyr
        125                130                  135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Ile
    140                 145                 150
Ala Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Val Thr Ser Gly Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Thr Val Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly
235                 240                 245                 250
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ser His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser
                255                 260                 265
Glu Cys Asp
<210>7
<211>1064
<212>DNA
<213>Talaromyces emersonii
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(88)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(88)..()
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(142)..(310)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(362)..(695)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(756)..(1061)
<223>
<400>7
atg ttc aaa tcg gcc gct gtg cgg gcc att gct gcc ctc gga ctg act       48
Met Phe Lys Ser Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr
                -25                 -20                 -15
gcg tca gtc ttg gct gct cct gtt gaa ctg ggc cgt cga g gtaaggaagc      98
Ala Ser Val Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Gly Arg Arg
            -10                 -5              -1
atgacggaga gaacaccctg tgcgacctgc tgacatcctt cag at  gtt tct cag      152
                                                Asp Val Ser Gln
gac ctc ttc gac cag ctc aat ctt ttc gag cag tac tcg gcg gct gcg      200
Asp Leu Phe Asp Gln Leu Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala Ala
5                   10                  15                  20
tac tgt tca gct aac aat gag gcc tct gcc ggc acg gca atc tct tgc      248
Tyr Cys Ser Ala Asn Asn Glu Ala Ser Ala Gly Thr Ala Ile Ser Cys
                25                  30                  35
tcc gca ggc aat tgc ccg ttg gtc cag cag gct gga gca acc atc ctg      296
Ser Ala Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Ile Leu
            40                  45                  50
tat tca ttc aac aa  gtgggtgtca cggaaaagat tgttgatacc aacatgttga      350
Tyr Ser Phe Asn Asn
        55
cgtgttgtca g c att ggc tct ggc gat gtg acg ggt ttt ctc gct ctc       398
               Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu
                       60                  65
gac tcg acg aat caa ttg atc gtc ttg tca ttc cgg gga tca gag act      446
Asp Ser Thr Asn Gln Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Glu Thr
70                  75                  80                  85
ctc gaa aac tgg atc gct gac ctg gaa gct gac ctg gtc gat gcc tct      494
Leu Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Glu Ala Asp Leu Val Asp Ala Ser
                90                  95                  100
gcc atc tgt tcc ggc tgt gaa gca cac gat ggg ttc ctt tca tcc tgg      542
Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Leu Ser Ser Trp
            105                 110                 115
aat tca gtc gcc agc act ctg aca tcc aaa atc tcg tcg gcc gtc aac      590
Asn Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Ala Val Asn
        120                 125                 130
gaa cat ccc agc tac aag ctg gtc ttc acc ggc cac agt ctc gga gcc      638
Glu His Pro Ser Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Ala
    135                 140                 145
gcc ttg gct aca ctt gga gcc gtt tct ctt aga gag agc gga tat aat      686
Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly Tyr Asn
150                 155                 160                 165
att gac ctc gtaagtttcc ggcacgggcg tcgtcatcat cgagcggaaa              735
Ile Asp Leu
gactgaccgg ttaactgcag tac aat tat ggc tgc ccc cgg gtc ggt aac acc    788
                      Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
                          170                 175
gcg ctc gca gac ttc atc acc acg caa tcc gga ggc aca aat tac cgc      836
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
gtc acg cat tcc gat gac cct gtc ccc aag ctg cct ccc agg agt ttt      884
Val Thr His Ser Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
gga tac agc caa ccg agc cca gag tac tgg atc acc tca ggg aac aat      932
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
gta act gtt caa ccg tcc gac atc gag gtc atc gaa ggc gtc gac tcc      980
Val Thr Val Gln Pro Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
act gca ggc aac gac ggc acc cct gct ggc ctt gac att gat gct cat     1028
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Ala Gly Leu Asp Ile Asp Ala His
    245                 250                 255
cgg tgg tac ttt gga ccc att agc gca tgt tcg tga                     1064
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Ala Cys Ser
260                 265                 270
<210>8
<211>299
<212>PRT
<213>Talaromyces emersonii
<400>8
Met Phe Lys Ser Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr
                -25                 -20                 -15
Ala Ser Val Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Gly Arg Arg Asp Val Ser
            -10                 -5              -1  1
Gln Asp Leu Phe Asp Gln Leu Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala
    5                   10                  15
Ala Tyr Cys Ser Ala Asn Asn Glu Ala Ser Ala Gly Thr Ala Ile Ser
20                  25                  30                  35
Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Ile
                40                  45                  50
Leu Tyr Ser Phe Asn Asn Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu
            55                  60                  65
Ala Leu Asp Ser Thr Asn Gln Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser
        70                  75                  80
Glu Thr Leu Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Glu Ala Asp Leu Val Asp
    85                  90                  95
Ala Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Leu Ser
100                 105                 110                 115
Ser Trp Asn Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Ala
                120                 125                 130
Val Asn Glu His Pro Ser Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu
            135                 140                 145
Gly Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly
        150                 155                 160
Tyr Asn Ile Asp Leu Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
    165                 170                 175
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
Val Thr His Ser Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
Val Thr Val Gln Pro Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Ala Gly Leu Asp Ile Asp Ala His
    245                 250                 255
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Ala Cys Ser
260                 265                 270
<210>9
<211>1074
<212>DNA
<213>Talaromyces byssochlamydoides
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(85)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(150)..(318)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(376)..(709)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(760)..(1071)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)..()
<223>
<400>9
atg ttc aaa tca act gtc cgg gcc atc gcc gcc ctc gga ctg acc tcg       48
Met Phe Lys Ser Thr Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr Ser
            -25                 -20                 -15
tca gtc ttt gct gct cct atc gaa ctg ggc cgt cga g gtaaggggca          95
Ser Val Phe Ala Ala Pro Ile Glu Leu Gly Arg Arg
        -10                 -5              -1
tgaaaactcc ctgtatggca tctcatctgg cagcatatct actgacatcc tcag at       151
                                                            Asp
gtt tcg gag cag ctc ttc aac cag ttc aat ctc ttc gag cag tat tcc      199
Val Ser Glu Gln Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser
            5                   10                  15
gcg gct gcg tac tgt cca gcc aac ttt gag tcc gct tcc ggc gcg gca      247
Ala Ala Ala Tyr Cys Pro Ala Asn Phe Glu Ser Ala Ser Gly Ala Ala
        20                  25                  30
att tct tgt tcc aca ggc aat tgc ccg ctc gtc caa cag gct ggc gca      295
Ile Ser Cys Ser Thr Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala
    35                  40                  45
acc acc ctg tat gca ttc aac aa  gtgagtgtca tggaaaggct tgttggtaca     348
Thr Thr Leu Tyr Ala Phe Asn Asn
50                  55
ccgtacgggt atgttgactg tcatcag c atc ggc tct ggc gat gtg acg ggt      400
                                Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly
                                        60                  65
ttt ctt gct gtc gat ccg acc aac cga ctc atc gtc ttg tcg ttc cgg      448
Phe Leu Ala Val Asp Pro Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg
                70                  75                  80
ggg tca gag agt ctc gag aac tgg atc act aat ctc agc gcc gac ctg      496
Gly Ser Glu Ser Leu Glu Asn Trp Ile Thr Asn Leu Ser Ala Asp Leu
            85                  90                  95
gtc gat gcc tct gca atc tgt tcc ggg tgt gaa gcc cat gac gga ttc      544
Val Asp Ala Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe
        100                 105                 110
tat tcg tct tgg caa tca gtt gcc agc act ctg acc tcc caa atc tcg      592
Tyr Ser Ser Trp Gln Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Gln Ile Ser
    115                 120                 125
tcg gcc ctc tcg gca tat cca aac tac aag ctg gtc ttc acc ggc cac      640
Ser Ala Leu Ser Ala Tyr Pro Asn Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His
130                 135                 140                 145
agt ctc gga gcc gcc tta gct aca ctt gga gct gtc tct ctc agg gag      688
Ser Leu Gly Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu
                150                 155                 160
agt gga tac aat atc gac ctc gtaagttcct ggcattgcca tcatggaaag         739
Ser Gly Tyr Asn Ile Asp Leu
            165
agactcacag ttaactgtag tac aac ttt ggc tgt ccc cgg gtc ggc aac act    792
                      Tyr Asn Phe Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
                          170                 175
gcg ctc gca gac ttt att acc aac caa acc ggt ggc aca aat tac cgg      840
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Asn Gln Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
gta acg cat tac gag gac cct gtc ccc aag ctg cct ccc agg agt ttt      888
Val Thr His Tyr Glu Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
gga tac agc caa cct agc ccg gaa tac tgg atc acg tcg gga aac aat      936
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
gtg act gtg act tcg tcc gac atc gat gtc gtc gtg ggt gtc gac tcg      984
Val Thr Val Thr Ser Ser Asp Ile Asp Val Val Val Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
act gca ggc aac gac ggg acg cct gat ggc ctt gac act gct gcc cat     1032
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Asp Gly Leu Asp Thr Ala Ala His
    245                 250                 255
agg tgg tat ttt gga cct act acc gaa tgt tcg tcg tca tga             1074
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Thr Thr Glu Cys Ser Ser Ser
260                 265                 270
<210>10
<211>300
<212>PRT
<213>Talaromyces byssochlamydoides
<400>10
Met Phe Lys Ser Thr Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr Ser
           -25                 -20                 -15Ser Val Phe Ala Ala Pro Ile Glu Leu Gly Arg Arg Asp Val Ser Glu
       -10                 -5              -1  1Gln Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala Ala5                   10                  15                  20Tyr Cys Pro Ala Asn Phe Glu Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ile Ser Cys
               25                  30                  35Ser Thr Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Thr Leu
           40                  45                  50Tyr Ala Phe Asn Asn Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala
       55                  60                  65Val Asp Pro Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Glu
   70                  75                  80Ser Leu Glu Asn Trp Ile Thr Asn Leu Ser Ala Asp Leu Val Asp Ala85                  90                  95                  100Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Tyr Ser Ser
               105                 110                 115Trp Gln Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Gln Ile Ser Ser Ala Leu
           120                 125                 130Ser Ala Tyr Pro Asn Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly
       135                 140                 145Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly Tyr
   150                 155                 160Asn Ile Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr Ala165                 170                 175                 180Leu Ala Asp Phe Ile Thr Asn Gln Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Arg Val
               185                 190                 195Thr His Tyr Glu Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe Gly
           200                 205                 210
Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn Val
        215                 220                 225
Thr Val Thr Ser Ser Asp Ile Asp Val Val Val Gly Val Asp Ser Thr
    230                 235                 240
Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Asp Gly Leu Asp Thr Ala Ala His Arg
245                 250                 255                 260
Trp Tyr Phe Gly Pro Thr Thr Glu Cys Ser Ser Ser
                265                 270
<210>11
<211>51
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200j1
<400>11
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggacc atgaggagct cgctcgtgct g              51
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J2
<400>12
ccagtcctgt ccgacgagag gtctcgcagg atctgtttg                            39
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J3
<400>13
caaacagatc ctgcgagacc tctcgtcgga caggactgg                            39
<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J4
<400>14
tctctactcg tttgaggatt ctggagttgg cgatgtcac                           39
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J5
<400>15
acatcgccaa ctccagaatc ctcaaacgag tagaga                               36
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J6
<400>16
gggtacgata tagatgtgtt ctcatatggc gctccc                               36
<210>17
<211>36
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J7
<400>17
gggagcgcca tatgagaaca catctatatc gtaccc                               36
<210>18
<211>48
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J8
<400>18
ggggaccact ttgtacaaga aagctggtta caaacacgtc gccattga                  48
<210>19
<211>51
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J9
<400>19
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggacc atgttcaaat cggccgctgt g             51
<210>20
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J10
<400>20
ctgttgaact gggccgtcga gatgtttctc aggacctctt cg                       42
<210>21
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J11
<400>21
cgaagaggtc ctgagaaaca tctcgacggc ccagttcaac ag                       42
<210>22
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J12
<400>22
catcctgtat tcattcaaca acattggctc tggcgatgtg ac                       42
<210>23
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J13
<400>23
gtcacatcgc cagagccaat gttgttgaat gaatacagga tg                        42
<210>24
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J14
<400>24
agcggatata atattgacct ctacaattat ggctgccccc gg                        42
<210>25
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J15
<400>25
ccgggggcag ccataattgt agaggtcaat attatatccg ct                        42
<210>26
<211>48
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J16
<400>26
ggggaccact ttgtacaaga aagctggtca cgaacatgcg ctaatggg                  48
<210>27
<211>51
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J17
<400>27
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggacc atgcggagct ccctcgtgct g              51
<210>28
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J18
<400>28
tggcgcggcc tgttcgacga gcggttccgc aagatctgct cg                        42
<210>29
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J19
<400>29
cgagcagatc ttgcggaacc gctcgtcgaa caggccgcgc ca                        42
<210>30
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J20
<400>30
gtttctctat tcttttgaag attctggatt aggcgatgtt ac                        42
<210>31
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J21
<400>31
gtaacatcgc ctaatccaga atcttcaaaa gaatagagaa ac                        42
<210>32
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J22
<400>32
aatggataca atatcgacgt gttctcatat ggcgcgcccc gc                        42
<210>33
<211>42
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J23
<400>33
gcggggcgcg ccatatgaga acacgtcgat attgtatcca tt                       42
<210>34
<211>48
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051200J24
<400>34
ggggaccact ttgtacaaga aagctggcta atcacactct gaaatggg                 48
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>142779
<400>35
ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c                                   31
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>142780
<400>36
ttgcatgcgt aatcatggtc atagc                                          25
<210>37
<211>26
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>140288
<400>37
ttgaattcat gggtaataac tgatat                                          26
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>142778
<400>38
aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt                                32
<210>39
<211>11
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>gtactaaaacc
<400>39
gtactaaaac c                                                        11
<210>40
<211>11
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>ccgttaaattt
<400>40
ccgttaaatt t                                                        11
<210>41
<211>45
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>141223
<400>41
ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc                   45
<210>42
<211>14
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>atgcaatttaaact
<400>42
atgcaattta aact                                                     14
<210>43
<211>14
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>cggcaatttaacgg
<400>43
cggcaattta acgg                                                      14
<210>44
<211>44
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>141222
<400>44
ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc                      44
<210>45
<211>59
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>051199J1
<400>45
cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctggatcc ccagttgtg      59
<210>46
<211>33
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>1298TAKA
<400>46
gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat                                  33
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>177996
<400>47
gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac                                     30
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>135640
<400>48
cttattagta ggttggtact tcgag                                          25
<210>49
<211>37
<212>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>135638
<400>49
gtccccagag tagtgtcact atgtcgaggc agttaag                             37
<210>50
<211>64
<21>DNA
<213>人工的/未知的
<220>
<221>misc_feature
<223>080399J19
<400>50
gtatgtccct tgacaatgcg atgtatcaca tgatataatt actagcaagg gaagccgtgc     60
ttgg                                                                  64
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>I
<220>
<221>misc_feature
<223>HL-2
<400>51
wsngcngcng cntaytgy                                                   18
<210>52
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>HL12
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>I
<400>52
ggnacnrkrt crttnnnrtg ngtnaync                                        28
<210>53
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>HL6
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>I
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>I
<400>53
avngcnccnc cnarnswrtg nccngt                                          26
<210>54
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P1
<400>54
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggacc atgttcaaat caactgtccg g              51
<210>55
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<400>55
gctccgaaac atctcgacgg cccagttcga taggagc                              37
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P3
<400>56
gggccgtcga gatgtttcgg agcagctctt caaccag                              37
<210>57
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>ccagagccgatgttgttgaatgcatacagggtggttg
<400>57
ccagagccga tgttgttgaa tgcatacagg gtggttg                              37
<210>58
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P5
<400>58
tgcat tcaac aacatcggct ctggcgatgt gacggg                                36
<210>59
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P6
<400>59
gccaaagttg tagaggtcga tattgtatcc actctcc                             37
<210>60
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P7
<400>60
caatatcgac ctctacaaac tttggctgtc cccgggtc                            38
<210>61
<211>53
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>080201P8
<400>61
ggggaccact ttgtacaaga aagctggtta tcatgacgac gaacattcgg tag           53
<210>62
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>1298-taka
<400>62
gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat                                  33
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>19670
<400>63
ccccatcctt taactatagc g                                               21
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>19672
<400>64
ccacacttct cttccttcct c                                               21
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<400>65
gctttgtgca gggtaaatc                                                  19
<210>66
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>050401P1
<400>66
cggccgggcc gcggaggcca gggatccacc atgaggagct cccttgtgct  g             51
<210>67
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>030501P1
<400>67
cggccgggcc gcggaggcca caagtttgta caaaaaagca gg                        42
<210>68
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>050401P6
<400>68
cggccgggtc accccccatc ctttaactat agcg                                 34

Claims (17)

1.一种制备脂解酶的方法，包括：
a)改组至少两种多核苷酸，包括：
i)一种编码多肽的多核苷酸，该多肽具有脂解酶的活性并且具有与SEQ ID NO：2的成熟肽具有至少90％同一性的氨基酸序列，和
ii)一种编码多肽的多核苷酸，该多肽具有脂解酶的活性并且具有与SEQ ID NO：2的成熟肽具有55-90％同一性的氨基酸序列，
b)表达该改组多核苷酸以形成重组多肽，
c)筛选该多肽以选择具有脂解酶活性的多肽，和
d)制备所选择的多肽。
2.权利要求1的方法，其中由(ii)多核苷酸编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：4，6，8或10的成熟部分具有至少90％的同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸包括这样的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO：1，3，5，7或9的成熟部分有至少90％同一性的核苷酸序列。
4.一种多核苷酸，包括编码脂解酶的核苷酸序列，并且其：
a)是克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列，或
b)是编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示成熟肽的DNA序列或衍生于它们的一个或多个核苷酸发生取代，缺失和/或插入的DNA序列，或
c)与编码SEQ ID NO：3所示的成熟肽的DNA序列具有至少90％的同一性，与编码SEQ ID NO：5所示的成熟肽的DNA序列具有至少80％的同一性，与编码SEQ ID NO：7所示的成熟肽的DNA序列具有至少65％的同一性，与编码SEQ ID NO：9所示的成熟肽的DNA序列具有至少60％的同一性，或
d)是编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的DNA序列的等位基因变体；或
e)在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示成熟肽的核酸序列其或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交。
5.权利要求4中的多核苷酸，进一步包括一个或多个控制序列，该控制序列可操纵地与所述的核苷酸序列连接，并且能够在合适的表达宿主中指导脂解酶的表达。
6.一种重组表达载体，包括权利要求5的多核苷酸，启动子和转录与翻译终止信号。
7.一种重组宿主细胞，转化有权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体。
8.一种制备具有脂解酶活性的多肽的方法，包括在适宜制备该多肽的条件下培养权利要求7的宿主细胞，并且回收该多肽。
9.一种多肽，具有脂解酶活性并且：
f)由克隆入保藏号DSM 14047或14049的大肠杆菌的质粒中的DNA序列编码，或
g)具有SEQ ID NO：6或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或
h)具有与SEQ ID NO：6的成熟肽具有至少80％同一性或与SEQ ID NO：10的成熟肽具有至少60％同一性的氨基酸序列，或
i)能与抗纯化形式的SEQ ID NO：6或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或
j)是SEQ ID NO：6或10所示的成熟肽的等位基因变体；或
k)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：5或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
10.权利要求9的多肽，是Talaromyces或Thermomyces，尤其是Thermomyces ibadanensis或Talaromyces byssochlamydoides菌株天然的。
11.一种核酸序列，包括编码权利要求9或10多肽的核酸序列。
12.一种水解溶血磷脂中脂酰基的方法，包括用多肽处理溶血磷脂，该多肽具有溶血磷脂酶的活性并且其：
a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或
b)具有编码SEQ IDNO：4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或
c)具有与SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或
d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或
e)是SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或
f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
13.权利要求12的方法，用以改进包含溶血磷脂的碳水化合物源的水溶液或浆的滤过性。
14.前述权利要求任一项的方法，其中所述的溶液或浆包含淀粉水解物，尤其是小麦淀粉水解物。
15.一种洗涤剂组合物，包含表面活性剂和具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽：
a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或
b)具有编码SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或
c)具有与SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或
d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或
e)是SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或
f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
16.一种面粉组合物，包括面粉和具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽：
a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或
b)具有编码SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或
c)具有与SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或
d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或
e)是SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或
f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
17.一种制备生面团或制备自生面团的烘烤产品的方法，包括添加到生面团中一种具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽：
g)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或
h)具有编码SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或
i)具有与SEQ ID NO：4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或
j)能与抗纯化形式的SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或
k)是SEQ ID NO：4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或
l)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO：3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
CNA028054725A 2001-02-23 2002-02-25 脂解酶基因 Pending CN1526013A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200100304 2001-02-23
DKPA200100304 2001-02-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1526013A true CN1526013A (zh) 2004-09-01

Family

ID=8160293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028054725A Pending CN1526013A (zh) 2001-02-23 2002-02-25 脂解酶基因

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20040101928A1 (zh)
EP (1) EP1404827A2 (zh)
JP (2) JP2004522448A (zh)
CN (1) CN1526013A (zh)
AU (1) AU2002234513B2 (zh)
CA (1) CA2432375C (zh)
WO (1) WO2002066622A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312792A (zh) * 2016-12-14 2019-10-08 瓦赫宁根大学 热稳定的Cas9核酸酶
CN112175967A (zh) * 2020-10-10 2021-01-05 安徽农业大学 一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的pen1基因及其应用

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996039851A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Danisco A/S A method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
ES2182986T5 (es) 1995-06-07 2009-03-01 Danisco A/S Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su produccion y utilizacion de dicha enzima.
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US8178090B2 (en) 1995-06-07 2012-05-15 Danisco A/S Recombinant hexose oxidase
US7745599B1 (en) 1995-06-07 2010-06-29 Danisco A/S Hexose oxidase-encoding DNAs and methods of use thereof
GB0112226D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
EP1803353A3 (en) * 2001-05-18 2007-07-18 Danisco A/S Method of preparing a dough with an enzyme
JP4309137B2 (ja) 2001-05-18 2009-08-05 ダニスコ エイ／エス 酵素を使用した練り粉の調製方法
EP2302046B1 (en) 2002-10-01 2012-01-04 Novozymes A/S Family GH 61 polypeptides
CA2538349C (en) 2003-06-25 2014-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
DK1776455T3 (da) 2004-07-16 2015-06-22 Dupont Nutrition Biosci Aps Lipolytisk enzym, anvendelser deraf i fødevareindustrien
ATE489404T1 (de) 2004-12-22 2010-12-15 Novozymes As Hybridenzyme, bestehend aus einer ersten endoamylaseaminosäuresequenz und einem kohlenhydratbindenden modul als zweiter aminosäuresequenz
WO2006084470A2 (en) * 2005-02-10 2006-08-17 Novozymes A/S Enzymatic enantioselective ester or amide hydrolysis or synthesis
CN101511997B (zh) 2006-07-14 2013-09-04 诺维信股份有限公司 用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法
DK2044188T3 (en) 2006-07-14 2015-12-14 Novozymes As Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding them
DE102006046857A1 (de) 2006-10-02 2008-04-03 Ab Enzymes Gmbh Klonierung, Expression und Verwendung saurer Lysophospholipasen
DE102006046719A1 (de) 2006-10-02 2008-04-03 Ab Enzymes Gmbh Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen
US8460905B2 (en) * 2007-09-11 2013-06-11 Bunge Oils, Inc. Enzymatic degumming utilizing a mixture of PLA and PLC phospholipases with reduced reaction time
US8956853B2 (en) * 2007-01-30 2015-02-17 Bunge Oils, Inc. Enzymatic degumming utilizing a mixture of PLA and PLC phospholipases
ES2526646T3 (es) 2007-04-09 2015-01-14 Novozymes A/S Tratamiento enzimático para el desengrasado de pieles y pellejos
US8241876B2 (en) 2008-01-07 2012-08-14 Bunge Oils, Inc. Generation of triacylglycerols from gums
US20120315689A1 (en) 2009-12-21 2012-12-13 Danisco Us Inc. Surfactants that improve the cleaning of lipid-based stains treated with lipases
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
JP6216495B2 (ja) * 2011-04-19 2017-10-18 三菱ケミカルフーズ株式会社 小麦粉膨化食品の製造方法
US9949409B2 (en) * 2016-05-11 2018-04-17 Facebook, Inc. Modular network switches, associated structures, and associated methods of manufacture and use
CN106676084B (zh) * 2017-02-09 2019-11-29 浙江工业大学 一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用
CN112175976B (zh) * 2020-11-12 2021-12-28 武汉轻工大学 一种耐高温脂肪酶基因tllgold及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN117916366A (zh) * 2021-08-30 2024-04-19 天野酶制品株式会社 含有脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂
AU2023256853A1 (en) 2022-04-20 2024-08-22 Novozymes A/S Process for producing free fatty acids

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5584397A (en) * 1978-12-20 1980-06-25 Ajinomoto Kk Fat and oil ester exchange using lipase
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
US5869438A (en) * 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
ATE169678T1 (de) * 1991-05-01 1998-08-15 Novo Nordisk As Stabilisierte enzyme
ES2180541T5 (es) 1992-06-16 2008-12-01 Sankyo Lifetech Company Limited Nueva fosfolipasa a1, procedimiento para su preparacion y uso de la misma.
ATE222604T1 (de) * 1994-02-22 2002-09-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes
DE69633825T2 (de) 1995-07-14 2005-11-10 Novozymes A/S Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität
DK0843725T3 (da) * 1995-08-11 2002-08-12 Novozymes As Fremgangmåde til fremstilling af polypeptidvarianter
DE19701348A1 (de) * 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US6159687A (en) * 1997-03-18 2000-12-12 Novo Nordisk A/S Methods for generating recombined polynucleotides
WO1998041622A1 (en) * 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Method for constructing a library using dna shuffling
EP0973399B1 (en) 1997-04-09 2002-07-17 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
WO2000032758A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
AU2002229513A1 (en) * 2001-02-07 2002-08-19 Novozymes A/S Lipase variants

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312792A (zh) * 2016-12-14 2019-10-08 瓦赫宁根大学 热稳定的Cas9核酸酶
CN110352241A (zh) * 2016-12-14 2019-10-18 瓦赫宁根大学 热稳定的Cas9核酸酶
CN110352241B (zh) * 2016-12-14 2024-04-09 瓦赫宁根大学 热稳定的Cas9核酸酶
CN110312792B (zh) * 2016-12-14 2024-04-09 瓦赫宁根大学 热稳定的Cas9核酸酶
CN112175967A (zh) * 2020-10-10 2021-01-05 安徽农业大学 一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的pen1基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002066622A3 (en) 2004-01-08
US20070010418A1 (en) 2007-01-11
WO2002066622A2 (en) 2002-08-29
CA2432375A1 (en) 2002-08-29
JP2008035867A (ja) 2008-02-21
JP2004522448A (ja) 2004-07-29
US20040101928A1 (en) 2004-05-27
JP4130693B2 (ja) 2008-08-06
EP1404827A2 (en) 2004-04-07
CA2432375C (en) 2015-09-08
US7271139B2 (en) 2007-09-18
AU2002234513B2 (en) 2006-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1526013A (zh) 脂解酶基因
CN1491278A (zh) 脂酶变体
CN1128875C (zh) 制备多肽变异体的方法
CN1262639C (zh) 新的宿主细胞和生产蛋白质的方法
CN1234854C (zh) 具有碱性α－淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的核酸
CN1311075C (zh) 表达超热稳定蛋白的系统
CN1169961C (zh) 基因转变作为工具用于构建重组的工业化丝状真菌
CN1509330A (zh) 具有纤维二糖酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
CN1426463A (zh) 角质酶变体
CN1902310A (zh) 具有β－葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸
CN1890367A (zh) 耐表面活性剂的纤维素酶及其修饰方法
CN1620501A (zh) 具有纤维二糖水解酶i活性的多肽和编码多肽的多核苷酸
CN1235636A (zh) 新型磷脂酶,及其生产和应用
CN1842598A (zh) 适合含油酵母内的基因表达的甘油醛－3－磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶启动子
CN1211483C (zh) 具有分支酶活性的多肽及其编码核酸
CN1681942A (zh) 使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和该脂肪酶
CN1852983A (zh) 蛋白质从酵母的分泌
CN1993377A (zh) 丙氨酸2,3氨基变位酶
CN1757721A (zh) 碱性蛋白酶
CN1513057A (zh) 宿主微生物
CN1331742A (zh) 脂解酶变体
CN1198939C (zh) 来自绿色木霉的纤维素酶cbh1基因的调控序列以及利用该序列的蛋白质或多肽的大量生产体系
CN1993475A (zh) 用dna文库转化和表达筛选丝状真菌细胞的方法
CN1541264A (zh) 脂肪氧合酶
CN1875106A (zh) 重组微生物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication