CN117916366A - 含有脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂 - Google Patents

含有脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种含有耐热性优异、1,3位特异性高的脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂。根据本发明，提供一种含有由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列构成的脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂。

Description

含有脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂
技术领域
本发明涉及含有脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂和其用途。
背景技术
作为油脂的物性的改性方法，存在化学法酯交换和酶法酯交换这2种。但是，由于化学法酯交换的环境负荷高，因此对酶法酯交换的期待提高。作为用于油脂的酶法酯交换的酶，可以使用具有酯交换能力的一部分脂肪酶。
油脂的酶法酯交换中可以使用假丝酵母菌属(Candida)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola，商品名：Novozymes公司，Lipozyme TLIM)等来源的脂肪酶，但能够实际应用于食品用途的酶很少。
另一方面，专利文献1中记载了一种嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)来源脂肪酶，并记载了作为生物燃料的合成反应(油酸丁酯合成)的催化剂和酯化反应的催化剂使用。非专利文献1中记载了一种嗜热篮状菌来源脂肪酶，并记载了作为生物燃料的合成反应(脂肪酸甲酯合成)的催化剂使用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:突尼斯专利申请号TN/P/2011/193
非专利文献
非专利文献1:Gene Volume 494,Issue 1,15February 2012,Pages112-118
发明内容
如上所述，正在研究利用酶法酯交换对油脂的物性进行改性。由于具有硬脂酸和棕榈酸作为构成脂肪酸的油脂在常温下为固体，因此在反应时需要将油脂保持在熔点以上的温度进行反应。由于脂肪酶一般热稳定性低，因此需要开发出耐热性更优异的脂肪酶。此外，还需要开发出1,3位特异性高的脂肪酶。
本发明所要解决的课题在于提供一种含有耐热性优异、1,3位特异性高的脂肪酶作为有效成分的酯交换用酶剂。本发明所要解决的课题进一步在于提供一种使用上述酯交换用酶剂而得的经改性的油脂的制造方法。
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，从1万株以上的菌株库中筛选出耐热性脂肪酶，结果发现了2种嗜热篮状菌NBRC31798T菌株(也有时称为Thermomyces dupontiiNBRC31798T菌株)来源的耐热性脂肪酶，从而完成了本发明。根据本发明，提供以下的发明。
＜1＞一种酯交换用酶剂，含有由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列构成的脂肪酶作为有效成分。
＜2＞根据＜1＞所述的酶剂，其中，脂肪酶来源于蓝状菌属即Talaromyces(也有时称为嗜热真菌属即Thermomyces)细菌。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的酶剂，其中，脂肪酶来源于嗜热篮状菌即Talaromyces Thermophilus(也有时称为杜邦嗜热菌即Thermomyces duponti)。
＜4＞一种经酯交换所得的油脂的制造方法，包含使＜1＞～＜3＞中任一项所述的酶剂作用于油脂的步骤。
＜5＞根据＜4＞所述的方法，使酶剂在60℃以上的温度下作用于油脂。
＜6＞一种脂肪酶，由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成，即便在50mM PIPES缓冲液(pH7.0)中以70℃处理30分钟后也残留酶活性。
＜7＞一种脂肪酶的制造法，包含以下的步骤(1)和(2)：
(1)培养具有＜6＞所述的脂肪酶的产生能力的微生物的步骤；
(2)由培养后的培养液和/或菌体回收脂肪酶的步骤。
＜8＞根据＜7＞所述的制造法，其中，微生物为嗜热篮状菌(也有时称为杜邦嗜热菌)NBRC31798T菌株。
本发明的酯交换用酶剂中的脂肪酶的耐热性高，并且1,3位特异性也高。
附图说明
图1示出耐热性评价的结果。
具体实施方式
＜1＞酯交换用酶剂及其有效成分(脂肪酶)
本发明的酯交换用酶剂含有由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列构成的脂肪酶作为有效成分。
本发明中的脂肪酶优选为来源于蓝状菌属或嗜热真菌属细菌的脂肪酶，更优选为来源于嗜热篮状菌(Talaromyces Thermophilus)(也有时称为杜邦嗜热菌(Thermomycesdupontii))的脂肪酶。“来源于嗜热篮状菌(Talaromyces Thermophilus)”是指被分类为嗜热篮状菌的微生物(可以为野生株，也可以为突变株)生产的脂肪酶、或者利用嗜热篮状菌(可以为野生株，也可以为突变株)的脂肪酶基因通过基因工程方法得到的脂肪酶。因此，由导入了从嗜热篮状菌取得的脂肪酶基因(或者改变该基因所得的基因)或者具有与其等价的碱基序列的基因的宿主微生物生产的重组体也属于来源于嗜热篮状菌的脂肪酶。将作为本酶的来源的嗜热篮状菌称为本酶的来源菌。另外，将用于生产本酶的微生物(嗜热篮状菌，宿主微生物)称为生产菌。
嗜热篮状菌的具体例为嗜热篮状菌NBRC31798T菌株。NBRC31798T菌株为保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构(千叶县木更津市上总镰足2－5－8)的菌株(NBRCCulture目录中记录为NBRC31798T)，可以通过规定的手续而得到。
确定了NBRC31798T菌株产生的脂肪酶的氨基酸序列(序列号2和序列号4)。本发明中的脂肪酶的一个方式由具有序列号2或序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质构成。一般，在对某蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变的情况下，有时改变后的蛋白质具有与改变前的蛋白质同等的功能。即，有时氨基酸序列的改变不对蛋白质的功能产生实质影响，蛋白质的功能在改变前后得到保持。本发明中，也可以使用由与序列号2或序列号4所示的氨基酸序列等价的氨基酸序列构成且具有酯交换活性的蛋白质(以下，也称为“等价蛋白质”)。
本发明涉及一种对油脂的酯交换有用的酶剂(酯交换用酶剂)。本发明的酶剂(以下，也称为“本酶剂”)含有酯交换脂肪酶(以下，也称为“本酶”)作为有效成分。有效成分的酯交换脂肪酶即本酶由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列构成。
“等价的氨基酸序列”是指虽然与基准的氨基酸序列(序列号2的氨基酸序列或序列号4的氨基酸序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(这里为酯交换能力)造成实质影响的氨基酸序列。因此，具有等价的氨基酸序列的酶催化酯交换反应。活性的程度只要能够发挥作为酯交换脂肪酶的功能，就没有特别限定。其中，优选与作为基准的氨基酸序列构成的酶为相同程度或比其更高。
“氨基酸序列的一部分不同”例如通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1个或多个氨基酸的缺失、取代、对氨基酸序列附加、插入1个或多个氨基酸、或者它们的任意组合而产生。只要保持酯交换活性，就允许氨基酸序列的一部分不同(可以活性稍有变化)。只要满足该条件，氨基酸序列的有区别的位置就没有特别限定。另外，氨基酸序列的不同可以在多个位置(部位)产生。
导致氨基酸序列的一部分不同的氨基酸的个数为相当于构成氨基酸序列的所有氨基酸的例如约小于30％的个数，优选为相当于约小于20％的数，更优选为相当于约15％的数，进一步优选为相当于约小于10％的数，更进一步优选为相当于约小于7％的数，再更进一步优选为相当于约小于5％的数，更加优选为相当于约小于3％的数，再更加优选为相当于约小于2％的数，最优选为相当于约小于1％的数。因此，等价蛋白质与基准的氨基酸序列具有例如约70％以上、优选约80％以上、更优选约85％以上、进一步优选约90％以上、更进一步优选约93％以上、再更进一步优选约95％以上、更加优选约97％以上、再更加优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性。
“氨基酸序列的一部分不同”的典型例之一是通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1～40个(优选为1～30个，更优选为1～10个，进一步优选为为1～7个，更进一步优选为1～5个，再更加优选为1～3个)的氨基酸的缺失、取代、对氨基酸序列附加、插入1～40个(优选为1～30个，更优选为1～10个，进一步优选为为1～7个，更进一步优选为1～5个，再更加优选为1～3个)氨基酸、或者它们的组合而使氨基酸序列产生突变(变化)。
优选通过在并非酯交换能力所需的氨基酸残基中发生保守氨基酸取代而得到等价的氨基酸序列。这里的“保守氨基酸取代”是指将某一氨基酸残基取代为具有相同性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的若干家族。保守氨基酸取代优选为同一家族内的氨基酸残基间的取代。
两个氨基酸序列的同源性(％)可以通过例如以下的步骤来确定。首先，以能够实现最佳比较的方式对两个序列进行排列(例如，向第一序列中导入间隙来优化与第二序列的比对)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子为相同的。两个序列的同源性是这两个序列中共同的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选也考虑比对优化所需的间隙的数量和尺寸。
两个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于序列比较的数学算法的具体例，有Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68中记载并在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77中被改良后的算法，但并不限定于此。氨基酸序列的同源性可以通过例如National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的blastp(protein-protein BLAST)而得到。参数使用默认的参数即可，例如使用BLOSUM62矩阵并将Gap Costs设定为Existence:11、Extension:1即可。
作为本酶剂的有效成分的酯交换脂肪酶即本酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白)的一部分。作为在融合蛋白中附加的序列，例如，可举出多重组氨酸残基这样有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。
作为本酶剂的有效成分的本酶对酯交换反应进行催化。酯交换反应是指将酯化合物中的酸基(羧酸基)交换为另一酸(羧酸)的反应，可与酯化反应(由羧酸和醇生成酯的反应)区别。本发明中的酯交换反应是指将构成受体底物(油脂(甘油三酯)、脂肪酸甘油酯(二甘油酯、单甘油酯))的脂肪酸残基与供体底物(脂肪酸、酯化合物(脂肪酸酯等)或油脂(可以与受体底物相同))的脂肪酸进行交换的反应。
如果将本酶剂用于油脂、油脂加工品等的物性的改性和改良，则能够对熔点高的油脂进行酯交换，通过成为与处理前不同的脂肪酸组成(特别是2位的脂肪酸不同的组成)的油脂，可以期待品质的提高(获得所期望的物性)。
本酶剂中的有效成分(本酶)的含量没有特别限定，例如，可以设定或调整有效成分的含量以使每1g本酶剂的酶活性为1U～100000U、优选为10U～30000U。本发明的酶剂通常以固体状(例如，颗粒，粉体，或者将该酶固定化于二氧化硅、硅藻土、以及多孔聚合物等能将酶固定于载体表面或内部的材料中所得的固定化酶)或液体状提供。
本酶剂除了有效成分(本酶)以外，也可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糊精、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
本发明还涉及一种由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成的脂肪酶，该脂肪酶即便在50mM PIPES缓冲液(pH7.0)中以70℃处理30分钟后也残留酶活性。本发明还涉及由序列号2或序列号4的氨基酸序列构成的脂肪酶。
＜2＞本酶的制造方法
本酶可以通过培养产生酯交换脂肪酶的微生物(酯交换脂肪酶产生菌株)而得到。
本发明的脂肪酶的制造法可以包含以下的步骤(1)和(2)。
(1)培养具有脂肪酶产生能力的微生物的步骤，所述脂肪酶由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成，即便在50mM PIPES缓冲液(pH7.0)中以70℃处理30分钟后也残留酶活性；
(2)从培养后的培养液和/或菌体中回收脂肪酶的步骤。
酯交换脂肪酶产生菌株可以是野生株，也可以是突变株(例如通过紫外线照射而得到突变株)。本酶的产生菌株的具体例为嗜热篮状菌(嗜热篮状菌)NBRC31798T菌株。突变株可以通过照射紫外线、X射线、γ射线等、基于亚硝酸、羟胺、N－甲基－N’－硝基－N－亚硝基胍等的处理等而得到。突变株只要产生本酶，就没有限定。作为突变株，可举出本酶的生产率提高了的菌株、夹杂物的生产率降低了的菌株、培养变得容易的菌株、从培养液中的回收变得容易的菌株等。
作为本酶的制造方法，可以进行培养产生本酶的微生物的步骤(步骤(1))、以及从培养后的培养液和/或菌体中回收脂肪酶的步骤(步骤(2))。
培养条件、培养方法只要可产生本酶，就没有特别限定。即，以可生产本酶为条件，可以适当设定适合所使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养方法，可以为液体培养、固体培养中的任一种，优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。
作为培养基，只要是所使用的微生物可生长繁殖的培养基，就没有特别限定。例如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源、还有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦麸、肉提取物等氮源、还有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所使用的微生物的生长繁殖，可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH调节为例如约3～8、优选约4～7左右，培养温度通常约为20～40℃，优选约为25～35℃左右，在需氧条件下培养1～20天、优选3～10天左右。作为培养方法，可以利用例如振荡培养方法、使用小型发酵罐(Jar fermentor)的需氧深部培养方法。
按照以上条件培养后，从培养液或菌体中回收目标酶(步骤(2))。从培养液中回收的情况下，例如可以通过将培养上清进行过滤、离心处理等除去不溶物后，适当组合基于超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种色谱法等进行分离、纯化而得到本酶。另一方面，从菌体内进行回收的情况下，例如可以通过将菌体利用加压处理、超声波处理等粉碎后，与上述同样地进行分离、纯化而得到本酶。应予说明，也可以利用过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的粉碎、分离、纯化)。
本酶也可以通过基因工程方法而容易地制备。例如，可以通过用编码本酶的DNA(作为一个例子，将编码由序列号2的氨基酸序列构成的本酶的DNA序列表示为序列号1，将编码由序列号4的氨基酸序列构成的本酶的DNA序列表示为序列号3)对适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)进行转化，回收在转化体内表达的蛋白质来制备。将回收的蛋白质根据目的进行适当纯化。如果是这样得到作为重组蛋白的本酶，则能够进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入到相同载体中并使用该载体进行重组蛋白的生产，则能够得到由连接有任意肽或蛋白质的重组蛋白构成的本酶。另外，也可以实施糖链和/或脂质的附加、或者产生N末端或C末端加工这样的修饰。通过如上的修饰而能够实现重组蛋白的提取、纯化的简化、或者生物学功能的附加等。
通常，如上利用适当的宿主－载体系统进行基因的表达～表达产物(本酶)的回收，但也可以利用无细胞合成系统。这里，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，而使用活细胞来源的(或由基因工程方法得到的)核糖体、转录/翻译因子等由作为模板的核酸(DNA、mRNA)将其所编码的mRNA、蛋白质在体外(invitro)进行合成。无细胞合成系统中，一般使用将细胞破碎液根据需要纯化而得到的细胞提取液。细胞提取液一般含有蛋白质合成所需的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质合成所需的其它物质。当然，在蛋白质合成时，可以根据需要补充另外准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。
还报道了重建蛋白质合成所需的各分子(因子)的转录/翻译系统的开发(Shimizu,Y.et al.:Nature Biotech.,19,751-755,2001)。该合成系统中，将由构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种延伸因子、参与终止的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酰基tRNA合成酶、以及甲硫氨酰基tRNA甲酰基转移酶所构成的31种因子的基因由大肠杆菌基因组进行扩增，并使用它们在体外重建蛋白质合成系统。本发明中也可以利用这样的重建的合成系统。
术语“无细胞转录/翻译系统”可与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。体外翻译系统中将RNA作为模板使用来合成蛋白质。作为模板RNA，使用全RNA、mRNA、体外转录产物等。在另一体外转录/翻译系统中将DNA作为模板使用。模板DNA应该包含核糖体结合区，而且优选包含适当的终止序列。应予说明，体外转录/翻译系统中，以转录反应和翻译反应连续进行的方式设定添加各反应所需的因子的条件。
也可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等粉末化而提供。此时，也可以使纯化酶预先溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-HCl缓冲液或GOOD的缓冲液中。可以优选使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，这里，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。
酶的纯化度没有特别限定，可以纯化成例如水解活性的比活性为1～100000(U/μg)、优选比活性为10～20000(U/μg)的状态。另外，最终形态可以为液体状，也可以为固体状(包含粉体状)。
＜3＞本酶剂/本酶的用途(油脂的酯交换法)
根据本发明，提供一种经酯交换所得的油脂的制造方法，该制造方法包含使本酶剂作用于油脂的步骤。即，根据本发明，提供一种使用本酶剂的油脂的酯交换法。本发明的酯交换法中，进行使本酶剂或本酶作用于油脂的步骤，通过该步骤来进行油脂的酯交换，即，使油脂中的三酰甘油(简称为TG或TAG)的构成脂肪酸进行重编(重排)。
作为可通过本发明的酯交换法来处理的油脂，可以例示大豆油、菜籽油、米糠油、玉米油、向日葵籽油、棉籽油、花生油、红花油、棕榈油、棕榈软质油、棕榈分馏油、棕榈仁油、椰子油、可可脂等植物油脂、鱼油、猪油、牛脂、乳脂等动物油脂和它们的分馏油、固化油、甘油三月桂酸酯、甘油三油酸酯、甘油三棕榈酸酯等合成油脂。本发明的酯交换法除了油脂彼此的酯交换以外，也可以用于油脂与脂肪酸或脂肪酸酯之间的酯交换。脂肪酸的例子为硬脂酸、棕榈酸、月桂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸，脂肪酸酯的例子为硬脂酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯。
本发明的酯交换法中，将本酶剂或本酶添加到油脂中，在例如10～110℃、20～110℃、30～105℃、40～105℃、优选50～100℃、更优选60℃～100℃、进一步优选70℃～100℃、更加优选80℃～100℃的条件下反应规定时间(例如10分钟～72小时、1小时～48小时、2小时～24小时)。为了促进反应，可以在反应中进行搅拌。
可以将本酶剂或本酶供于固定化处理，利用固定化酶来进行反应。利用固定化酶而进行的反应中，可以采用分批式搅拌槽型反应器、流通式搅拌槽型反应器、填充层型反应器、流动层型反应器等。
本发明的酯交换法对油脂或油脂加工品(例如起酥油、人造黄油、代可可脂)的物性的改性和改良是有用的。例如，可以以提高延展性、提高乳液稳定性、优化固体脂含有值(SFC)、提高固化性、选择性浓缩特定脂肪酸、制造低反式脂肪酸油脂或低反式脂肪酸油脂加工品等为目的而应用本发明的酯交换法。应用本发明的酯交换法而得到的油脂或含有该油脂的油脂加工品与处理前相比物性得到改善，产业上的利用价值高。
可以根据本发明的酯交换法来制造酯交换油脂。即，本发明还提供一种酯交换油脂的制造方法。典型而言，在本发明的酯交换油脂的制造方法中，准备受体底物(油脂(甘油三酯)、脂肪酸甘油酯(二甘油酯、单甘油酯))和供体底物(脂肪酸、酯化合物(脂肪酸酯等)或油脂(可以与受体底物相同))，使本酶剂或本酶发挥作用(即，在受体底物和供体底物的存在下进行酶反应)。受体底物、供体底物中使用的油脂、脂肪酸、脂肪酸酯可以使用上述的油脂、脂肪酸、脂肪酸酯。酶反应的条件可以采用上述条件(例如在30～100℃、优选40～100℃、更优选60℃～100℃、进一步优选70～90℃的条件下反应规定时间(例如1小时～48小时))。根据本发明的一个例子，提供一种作为可可脂的主成分的SOS脂(S：硬脂酸，O：油酸)的制造方法，该制造方法包含：准备作为受体底物的甘油三油酸酯(OOO)(O：油酸)和作为供体底物的硬脂酸或硬脂酸甲酯的工序，和使本酶剂或本酶在40～100℃、优选60～100℃、更优选70～90℃的条件下作用于准备好的受体底物和供体底物的工序。SOS脂是指使硬脂酸(S)和油酸(O)按照SOS的顺序与甘油键合而成的甘油三酯。
实施例
实施例1：序列的确定
＜印迹杂交用TDL2基因探针的制备＞
使用嗜热篮状菌NBRC31798T的基因组DNA作为模板，设计表1的引物，通过使用PCRDIG合成试剂盒(Roche公司制)的PCR标记来制备TDL2基因探针。
[表1]
使用将嗜热篮状菌NBRC31798T的基因组DNA用BamHI以37℃处理过夜的样品以及TDL2基因探针进行印迹杂交，结果，检测到2个条带。推测约3.0kbp的条带为包含TDL2基因全长的片段，约5.0kbp的条带检测到包含TDL1全长的片段。使用认为分别含有TDL1基因和TDL2基因的约5.0kbp和约3.0kbp的各片段进行连接反应，使DNA自身环化。
为了进行包含TDL1基因的DNA片段的扩增，使用自身环化的DNA(约5.0kbp)作为模板，利用表2的引物F2和引物R2进行PCR。
为了进行包含TDL2基因的DNA片段的扩增，使用自身环化的DNA(约3.0kbp)作为模板，利用表2.的引物F3和引物R3进行PCR。
将扩增的DNA片段纯化，进行序列分析。
[表2]
明确了的TDL1基因和TDL2基因的序列记载于表3，基于明确了的TDL1基因和TDL2基因的序列翻译的氨基酸序列记载于表4。
[表3]
[表4]
基于明确了的耐热性脂肪酶基因通过FGENESH(FGENESH-HMM-based genestructure prediction(softberry.com))来推断cDNA序列。
TDL1的cDNA序列(序列号1)
ATGAGGAGCTCGCTCGTGCTGTTCTTCGTTTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCAGTCCTGTCCGACGAGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTGACCAGTTCAACCTCTTTGCGCAGTACTCGGCGGCCGCATACTGCGCGAAGAACAACGATGCCCCGGCAGGTGGGAACGTAACGTGCAGGGGAAGTATTTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAGGATTCTGGAGTTGGCGATGTCACCGGGTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACAGACTGATCGTCCTCTCTTTCCGCGGCTCTCGTTCCCTGGAAAACTGGATCGGGAATATCAACTTGGACTTGAAAGGAATTGACGACATCTGCTCTGGCTGCAAGGGACATGACGGCTTCACTTCCTCCTGGAGGTCCGTTGCCAATACCTTGACTCAGCAAGTGCAGAATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTACCGCGTCGTCTTCACTGGGCACAGCTTGGGTGGTGCATTGGCAACTGTGGCCGGGGCATCTCTGCGTGGAAATGGGTACGATATAGATGTGTTCTCATATGGCGCTCCCCGCGTCGGAAACAGGGCTTTTGCGGAATTCCTGACCGCACAGACCGGCGGCACCTTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCGCCACGCGAATTGGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAGTATTGGATCACGTCTGGAACCCTCGTCCCAGTGACCAAGAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATCGATTCCACCGATGGAAACAACCAGCCAAATACCCCGGACATTGCTGCGCACCTATGGTACTTCGGGTCAATGGCGACGTGTTTGTAA
TDL2的cDNA序列(序列号3)
ATGAGAGGTTTTCTCGTGCTGTTCTTCATCTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCAGGCCTGTTCGACGAGAAGTCTCGCAGGATCTGCTCGATCTGTTCAACCTCTTTGCACAATACTCGGCAGCCGCCTACTGCGCGGAAAACAACGACGCTCCAGTGGGCTCGAACGTAACGTGCTCGGAGAATGTCTGTCCCAAGGTAGAGGAGGCGGACGCAACATTCCTCTATTCTTTTGAAGATTCTGGACTGGGCGATGTCACCGGCCTTCTCGCGCTCGACAACACGAACAAACTGATCGTCCTTGCTTTCCGCGGCTCTCGCTCAATAGAGAACTGGATCGGGAATCTCATCGTCGGTCTGCGAGATATCGACGATATCTGCTCCGGCTGCGAGGGGCATACCGGCTTCGTGGCTTCCTGGAAGTCCGTAGCCAATACCCTGAGAGGACAGGTCGAGAATGCCGTGAAGGAGCATCCCGACTACCGCGTGGTCTTCACAGGACATAGTTTGGGTGGTGCACTGGCAACCATTGCTGGAGCCGCTCTGCGTGGGAATGGGTATAATATCGACGTGTTCTCATATGGCGCCCCCCGCGTCGGCAACAGGGCTTTTGCAGAATTTCTGACCGCACAGACCGGTGGCACCCTGTACCGCATCACCCACACCAATGATATTGTCCCCAGACTCCCACCGCGAGACTGGGGTTACAGTCACTCCAGCCCAGAGTACTGGATCACGTCCGGCAATGACGCCCCAGTGACCGCAAACGATATCGTCAAGGTGGAGGGCATTGATTCCACCGACGGTAACAACCAGCCGAATATCCCGGACATTCCTTCACATCTATGGTACTTTGGAGCCATTGCAGAGTGTGATTAA
实施例2；耐热性的评价
＜纯化酶的制备＞
将嗜热篮状菌NBRC31798T用高压灭菌处理后的小麦麦麸培养基进行固体培养(40℃，4天培养)，对得到的培养液进行过滤后，在20mM磷酸缓冲液(pH8.0)和含有1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)的线性梯度条件下进行阴离子交换色谱(GE Healthcare制HiPrep DEAE FF)后，在含有1.0M硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)和20mM磷酸缓冲液(pH7.0)的线性梯度条件下通过疏水性色谱(GE Healthcare制Hitrap Butyl FF)得到纯化酶。
＜热处理＞
将TDL1和TDL2的纯化酶使用含有cOmplete ULTRA片剂(Roche公司制蛋白酶抑制剂)的50mM PIPES缓冲液(pH7.0)进行2倍稀释后，用水浴进行热处理(70℃或者100℃30分钟)，制成热处理样品。
实施例3：脂肪酶的甘油三油酸酯水解活性的确认方法
＜方法＞
使用硅胶柱，从葵花籽油中分离提取出甘油三油酸酯后，与聚乙烯醇溶液混合，进行乳化。将各样品添加到乳化甘油三油酸酯溶液中，进行水解反应(40℃，1小时)。在反应液中添加乙酸乙酯，提取甘油三油酸酯和反应产物(甘油二油酸酯，甘油单油酸酯，油酸)。将提取液在氯仿:丙酮＝96:4的展开溶剂条件下利用薄层色谱进行分离和检测。
＜结果＞
耐热性评价的结果(图1)，TDL1在70℃处理样品中也可以看到反应产物(甘油二油酸酯，油酸)，因此判定在70℃下30分钟处理后活性仍残留。
另一方面，TDL2在70℃和100℃处理样品中也可以看到反应产物(甘油二油酸酯，油酸)，因此确认在70℃和100℃下处理30分钟活性仍残留，具有高耐热性。
实施例4：脂肪酶的酯交换活性的确认
＜重组酶表达菌株的取得＞
通过以嗜热篮状菌NBRC31798T(杜邦嗜热菌NCBI：txid28565)的基因组DNA为模板的PCR对TDL1基因(序列号5)和TDL2基因(序列号6)进行扩增。将扩增的DNA与丝状菌表达载体(插入了米曲霉(Aspergillus oryzae)来源α-淀粉酶修饰启动子、米曲霉来源FAD－GDH的终止子和pyrG基因的pUC19)连接，利用原生质体－PEG法导入到米曲霉(A.oryzae)中。
＜重组酶的取得方法＞
将得到的转化体接种到含有淀粉、酵母提取物、无机盐类的液体培养基(pH6.0)中，在30℃通气搅拌培养90小时。将培养上清通过硅藻土过滤除去生产菌体后，用超滤膜进行浓缩，通过冷冻干燥得到酶的干燥粉末。
＜固定化酶的制备方法＞
使用硅藻土作为固定化载体。利用Bradford法试剂盒(BIO－RAD)来测定酶的干燥粉末中的蛋白质量，基于测定值以达到蛋白质量0.1g的方式将酶的干燥粉末溶解于纯化水1mL，制成酶溶解液。按照常规方法，固定化于固定化载体(Celite No.535(Celite公司制))，制备固定化酶(TDL1-IM，TDL2-IM)。
<评价方法>
向50mL试管中加入3.4g的甘油三油酸酯(Olein rich，昭和工业制)和5g的棕榈酸甲酯(Wako制)，在反应温度(40℃，80℃)下保温30分钟。使用Lipozyme TL-IM(Novozymes公司)、TDL1-IM、TDL2-IM作为固定化酶。加入各固定化酶0.05g后，进行振荡使其反应。20小时后回收上清作为反应样品。
对反应样品中含有的成分通过气相色谱(GC)进行分析。在1.5mL试管中加入990μL己烷和10μL反应样品，使用涡流式混合器进行充分搅拌。用0.45μm的膜过滤器进行过滤得到GC分析用样品。按照以下条件实施GC分析。根据区域面积算出所有成分中的油酸甲酯(OAME)的比率。生成的OAME越多，暗示了越进行了酯交换反应，酯交换活性越高。
使用仪器：Agilent8890GC
柱子：DB-1HT(5m，0.25mm，0.10μm)
进样口温度：370℃
进样量：1μL
分流比：50
检测器温度：370℃
升温条件：
[表5]
速度(℃/min) 温度(℃) 保持(min)
120 4
20 150 -
30 315 3
1.5 325 -
30 370 2
进而，通过HPLC对反应样品中含有的甘油三酯中的POP(在甘油的1位和3位与棕榈酸形成酯键，在2位与油酸形成酯键)与PPO(在甘油的1位和2位与棕榈酸形成酯键，在3位与油酸形成酯键)的比率进行分析。在西林瓶中加入0.9mL己烷和0.1mL GC分析用样品，使用涡流式混合器进行充分搅拌后，按照以下条件实施HPLC分析。根据POP和PPO的区域面积，由POP/(POP+PPO)算出POP比率(％)。POP比率越高，暗示了1,3位特异性越高。
使用仪器：HPLC(Shimadzu)
柱子：Silver column KANTO 250-4.6(5μm)
柱子温度：25℃
洗脱液：丙酮/己烷＝3/97
流速：1.0mL/min
检测：ELSD-LT II(350kPa,40℃,gain 1)
进样量：20μL
＜结果＞
在所有的脂肪酶中确认了生成OAME。TDL1―IM与Lipozyme TL－IM为同等生成量，TDL2－IM与其它两者相比为60％左右的生成量。将使用各脂肪酶时的POP比率(％)示于表6。
[表6]
TDL1―IM、TDL2－IM都在80℃下显示出高POP比率。暗示了与Lipozyme TL－IM相比在高温反应中的1,3位特异性高。
为了对OAME生成量同等时的1,3位特异性进行评价，以OAME生成量约为20％的方式用各脂肪酶反应后，对POP比率进行评价。在按照上述评价方法的方法中反应温度在80℃下实施。适当地调整酶添加量、反应时间在OAME生成量约为20％的时刻回收上清。
将使用各脂肪酶时的POP比率(％)示于表2。
[表7]
POP/(POP+PPO)(％)
Lipozyme TL-IM 77
TDL1-IM 92
TDL2-IM 86
OAME生成量同等时，TDL1-IM、TDL2-IM都显示出比Lipozyme TL-IM更高的POP比率。
产业上的可利用性
本发明的酶剂适合在食品、医疗用途的领域中使用，产业上的利用价值高。特别是，含有耐热性高、1，3位特异性高的脂肪酶的本发明的酯交换用酶剂在代可可脂制造用途中是有用的。
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离专利保护范围的记载并在本领域技术人员可容易想到的范围内的各种变形方式也包含于该发明中。本说明书中明确记载的论文和专利文献等内容通过援引来引用其全部内容。

Claims (8)

1.一种酯交换用酶剂，含有脂肪酶作为有效成分，所述脂肪酶由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列构成。
2.根据权利要求1所述的酶剂，其中，脂肪酶来源于蓝状菌属细菌即Talaromyces，蓝状菌属也有时称为嗜热真菌属即Thermomyces。
3.根据权利要求1或2所述的酶剂，其中，脂肪酶来源于嗜热篮状菌即TalaromycesThermophilus，也称为杜邦嗜热菌即Thermomyces duponti。
4.一种经酯交换而得到的油脂的制造方法，包含使权利要求1～3中任一项所述的酶剂作用于油脂的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，使酶剂在60℃以上的温度下作用于油脂。
6.一种脂肪酶，由与序列号2或序列号4的氨基酸序列具有99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成，即便在50mM、pH7.0的PIPES缓冲液中以70℃处理30分钟后也残留酶活性。
7.一种脂肪酶的制造法，包含以下的步骤(1)和(2)，
(1)培养具有权利要求6所述的脂肪酶的产生能力的微生物的步骤；
(2)由培养后的培养液和/或菌体回收脂肪酶的步骤。
8.根据权利要求7所述的制造法，其中，微生物为嗜热篮状菌NBRC31798T菌株，嗜热篮状菌也称为杜邦嗜热菌。
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