KR100697310B1

KR100697310B1 - 바이오디젤의 생물학적 생산방법

Info

Publication number: KR100697310B1
Application number: KR1020050030490A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 최의성; 이응석
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2005-04-12
Publication date: 2007-03-20
Also published as: KR20060108327A

Abstract

본 발명은 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP) 단백질을 이용하여 리파제를 생산하는 방법 및 이와 같이 생성된 리파제를 이용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤(biodiesel)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 활성이 10배 이상 증가된 변이리파제(CalB14)와 TFP3 단백질이 융합된 리파제를 저비용으로 대량생산하고 이를 담체에 고정화하여 효소를 반복적으로 재사용함으로써 바이오디젤을 경제적으로 대량생산할 수 있는 방법을 제공한다.

바이오디젤(biodiesel), 리파제, TFP3

Description

바이오디젤의 생물학적 생산방법{Biological method for the production of biodiesel}

도 1은 재조합 CalB14의 발현 및 분비를 위한 벡터이다.

도 2는 CalB14를 생산하는 재조합 효모의 배양온도별 분비특성을 분석한 그래프이다.

도 3은 CalB14를 생산하는 재조합 효모의 발효배양 결과이다. A는 세포의 성장 정도 및 배양액 중 리파제의 활성을 분석한 그래프이며 B는 발효액의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 4에서 A는 효모 단백질융합인자를 이용한 4종의 CalB14 생산 벡터 그림이며 B는 트리뷰티린(tributyrin) 배지에서 리파제 활성을 분석한 사진이다.

도 5는 단백질 분비를 촉진하는 단백질융합인자 TFP3에서 UTR을 제거한 후 리파제 분비증진 효과를 분석한 그래프이다.

도 6에서 A는 최종 선별된 벡터 pYGTFP3△U-CalB14를 함유한 재조합 균주의 발효배양 결과이며 B는 배양시간별 발효배지를 SDS-PAGE 분석한 결과이다.

도 7은 고정화 담체의 종류에 따른 바이오디젤 전환율을 비교한 그래프이다.

도 8은 반응 시 수분함량에 따른 바이오디젤 전환율을 비교한 그래프이다.

도 9는 반응 중 메탄올 첨가 방식에 따른 바이오디젤 변환율을 비교한 그래프이다.

도 10에서 A는 반응 중 고정화 효소의 양에 따른 바이오디젤 전환율을 비교한 결과이며 B는 반응온도에 따른 바이오디젤 전환율을 비교한 결과이다.

도 11은 고정화 효소의 양과 이들의 반복사용에 따른 바이오디젤 전환율을 비교한 그래프이다.

도 12는 소규모 바이오디젤 전환반응용 모식도 및 실제 제작 후 사용한 반응조 사진이다.

도 13에서 A는 소규모 반응조를 이용하여 사용효소 농도별 바이오디젤 전환율을 비교한 결과이며 B는 반응시간별 시료를 TLC로 분석한 결과이다.

도 14는 고정화 효소를 장기 재사용한 경우 바이오디젤의 전환율을 분석한 결과이다.

도 15는 단백질융합인자 TFP3과 CalB14의 융합단백질을 분비생산하는 pYGTFP3△U-CalB14 벡터의 그림이다.

본 발명은 단백질융합인자 단백질을 이용하여 리파제를 생산하는 방법 및 상기 방법으로 생산된 리파제를 이용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤 (biodiesel)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

1992년 리우환경회의와 1997년 교토협약 이후 공해물질 규제와 이산화탄소의 배출량을 절감하는 재생산성 순환 에너지원인 바이오연료(biofuel)에 대한 관심이 집중되고 있고 현재 전 세계 수송차량의 30% 이상을 처리하며 동시에 50% 이상의 공해를 발생시키는 디젤차량에 대한 청정 대체연료인 바이오디젤의 개발이 절실한 실정이다. 바이오디젤(biodiesel)은 유기체를 가공하여 직접 만들어 낸 것으로, 동, 식물성 기름이 메탄올 등의 알코올과 '에스테르화(Esterification)' 과정으로 만들어지는데, 에스테르화된 유지에서 ‘글리세린’을 제거하면 FAME(fatty acid methyl esters)가 된다. 바이오디젤은 기존의 석유계 경유와 성질이 매우 유사하며 연소 시 공해가 거의 발생하지 않아 석유계 경유와 섞어서 사용할 경우 대기오염의 주범인 자동차 공해를 획기적으로 줄일 수 있는 선진국형 청정 대체 에너지로 최근 그 수요와 필요성이 대폭 증대되고 있다. 또한, 바이오디젤은 경유 대체 에너지뿐만 아니라 윤활유의 원료, 윤활유 첨가제 등으로 이용될 수 있으며 다양한 무공해 용제 및 생물농약으로 사용이 가능하다. 또한, 바이오디젤은 원유로 오염된 해변정화를 위한 바이오리메디에이션(bioremediation) 촉진을 위한 촉매제로서 이용이 가능하다. 현재까지 이러한 바이오디젤의 생산은 다양한 동. 식물성 유지로부터 강산 또는 강염기 등을 이용하는 화학적 촉매방법을 사용하여 생산되고 있으나 화학적 촉매방법은 고에너지성의 다단계 반응공정이 요구되고 촉매 및 부산물의 회수가 어려울 뿐 아니라 다량의 폐수발생에 의한 2차 환경오염을 유발하는 등 의 부작용이 있기 때문에 향후 대규모 바이오디젤의 수요를 충족할 수 있는 저에너지 요구성의 친환경 생물학적 신공정의 필요성이 대두되고 있다.

1996년 Nelson등(Nelson et al, J. Am. Oil Chem. Soc. 73,1191, 1996)이 미생물 유래의 다양한 리파제를 이용하여 헥산(hexane)등의 용매(solvent)하에서 77.8%의 바이오디젤이 생성됨을 보고하여 최초로 생물학적인 방법으로 바이오디젤 생산 공정 가능성을 시사하였다. 최근 일본을 중심으로 용매를 전혀 사용하지 않고 캔디다 엔탁티카(Candida antarctica), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 캔디다 루고사(Candida rugosa), 뮤코 미에하이(Mucor miehei), 리조푸스 오라이제(Rhizopus orizae) 등의 미생물 유래의 다양한 리파제를 사용하여 90% 이상의 순도로 바이오디젤 생산이 가능함을 보고하였다(Linko et al, J. Biotechnol. 66, 41, 1998; Shimada et al, J. Am. Oil Chem. Soc. 76, 789, 1999; Kaieda et al, J. Biosci. Bioeng. 91, 12, 2001; Ban, Biochem. Eng. J. 8, 39, 2001). 그러나, 생물 촉매인 리파제 효소생산 비용이 바이오디젤의 가격에 비해 매우 고가이기 때문에 바이오디젤 전환반응공정에서 효소를 재사용하지 않으면 경제성이 없어 효소를 다양한 담체에 고정화하고 반응 후 고정화 효소를 분리하여 재사용하는 방식이 개발되었다(Shimada et al, J. Am. Oil Chem. Soc. 76, 789, 1999; De et al, J. Am. Oil Chem. Soc. 76, 451, 1999; Wu et al, J. Am. Oil Chem. Soc. 76, 517, 1999; Abigor et al, Biochem. Soc. Trans. 28, 979, 2000). 고정화 효소의 경우에도 바이오디젤 생산반응에 필수적으로 첨가되어야 하는 메탄 올에 의해 효소의 활성이 감소하여 고정화 효소를 지속적으로 사용할 수 없는 문제가 있었고 효소의 생산단가를 낮추기 위해 리파제 효소활성이 있는 미생물인 리조푸스 오라이제(R. orizae)를 BSP(biomass support particle)에 배양한 전세포 생물 촉매를 이용하는 방법도 개발되었으며(Liu et al, J. Biosci. Bioeng. 89, 554, 2000) 효모의 세포표면에 리파제를 고정화한 상태로 전세포 생물 촉매로 사용하는 방법도 개발되었다(Kondo et al, Enzyme Microb. Technol. 27, 806, 2000; Matsumoto et al, Appl. Environ. Microbiol. 68, 4517, 2002). 전자의 경우에는 리파제가 세포 내 발현이기 때문에 막 투과(membrane permeabilization) 단계가 필요한 문제점이 있었으며 두 경우 모두 반응액의 함수율에 따른 반응효율 저하 및 메탄올에 의한 효소의 불활성화나 세포의 분해로 인한 활성감소 문제는 피할 수 없었다. 바이오디젤 생산을 위한 새로운 방법으로 메탄올의 초임계 유체법을 이용하여 유채유로부터 바이오디젤을 생성하는 방법이 이용되었으나 고온(350도)과 고압(45Mpa)조건에서 진행되는 반응이기 때문에 바이오디젤 대량생산에는 경제성이 없었다(Saka and Kusdiana, Fuel 80, 225, 2001).

현재까지 리파제를 이용하여 개발된 생물학적 바이오디젤 생산방법으로 가장 효율적이고 가능성이 큰 것으로 알려진 방법은 노보짐(Novozym. 덴마크)에서 시판중인 Novo435를 이용하는 방법으로 이는 캔디다 엔탁티카 유래의 리파제 B(CalB)가 담체에 고정화되어 있는 상업화된 고정화 효소이다(Samukawa et al, J. Biosci. Bioeng. 90, 180, 2000; Fukuda et al, J. Bioscience. Bioeng. 92, 405, 2001; Kose et al, Bioresource Technol. 83, 125, 2002; Xu et al, Biotechnol. letter, 25, 1239, 2003). 이 고정화 효소는 다양한 식물성 기질을 사용하여도 90% 이상의 바이오디젤 전환율을 보이며 특히 폐식용유와 같이 수분을 다량함유하고 있어도 바이오디젤을 생성할 수 있는 특성을 보였다. 그러나 상기 효소는 Novozym에서 독점적으로 전 세계적에 생산 공급하고 있고, 현재 매우 고가로 시판되고 있는 효소(240만원/㎏)로서 바이오디젤의 경제적 가치(천원/ℓ)와 비교하였을 때 도저히 이용할 수 없는 문제가 있다. 이에, 상기 효소를 대체할 수 있는 효율적인 효소 및 이의 대량생산 방법이 요구되고 있다.

본 발명자는 변이리파제 CalB14를 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP3)와 융합시켜 재조합적으로 생산하는 경우, 배양온도에 따른 차이가 없이 단위 용적당 높은 활성을 갖는 리파제 생산이 가능하며, 이렇게 생산된 리파제를 담체에 고정화시켜 반복적으로 장기간 동안 안정적으로 바이오디젤 생산에 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 TFP3 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 리파제 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 리파제를 담체에 고정화하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤(biodiesel)을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 단백질융합인자 TFP3 단백질과 융합된 리파제 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제 생산방법에 관한 것이다.

상기 리파제 생산방법에서 리파제는 단백질 융합인자 TFP3 단백질과의 융합단백질 형태로 발현됨을 특징으로 한다.

본 발명에서 “단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)”란 난발현성 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 난발현성 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미한다. 또한, “단백질융합인자 단백질”은 상기한 바와 같은 단백질융합인자 유전자의 의해 코딩되는 아미노산 서열의 단백질을 의미한다.

본 발명자는 대한민국 특허 출원 제10-2004-0003610호(2004년 1월 17일)에서 효모에서 재조합 생산이 어려운 단백질을 발현 및 분비생산 할 수 있는 맞춤형 단백질융합인자를 다양한 유전자원으로부터 초고속으로 선별하는 기술 및 이를 통해 확보된 단백질 융합인자, TFP1, TFP2, TFP3, TFP4등을 밝힌바 있다.

본 발명의 리파제 생산에 바람직한 단백질융합인자 단백질은 TFP3이다. TFP3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며 TFP3과 활성을 나타내는 치환, 결실, 삽입 등의 모든 변이체가 본 발명에 이용된다. 이런 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 특히, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열은 UTR(5'-untranslated region)이 제거된 서열로서, 리파제를 발현시킬 경우, 리파제의 발현량 및 분비가 2배 이상 증가하였다.

TFP3 단백질과 융합시켜 발현시키는 리파제는 바람직하게는 캔디다 엔탁티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B(Candida antarctica lipase B: CalB)이고, 보다 바람직하게는 야생형 CalB의 219번 루이신이 글루타민, 278번 루이신이 프롤린으로 치환된 변이체 CalB14로, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진다. CalB14는 야생형보다 효소 활성이 10배 이상 증가되었으므로 바람직하다(한국특허출원 제2002-0055575, WO02/12509).

본 발명에서 "융합"이란 상이한 2개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한 가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하고, 본 발명의 목적상 융합 단백질은, TFP3 단백질과 리파제의 융합을 의미한다. TFP3 단백질과 리파제는 하나의 프로모터에서 인 프레임(in flame)으로 한 가닥 단백질로 번역된다. 상기 방법으로 TFP3 단백질 융합된 리파제는, 세포질 내에서 대부분 수용성의 형태로 과발현된 후, TFP3 서열을 포함한 상태로 분비된다(도 6).

상기 융합단백질을 코딩하는 핵산서열은 발현 벡터에 삽입되어 발현된다.

본 발명에서, "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 발현벡터는 또한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터는 숙주세포로 형질전환된다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함한다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 숙주 세포는 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 등의 효모가 바람직하다.

재조합 발현벡터의 숙주세포로의 형질전환 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, Li/TE 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체는 통상의 방법으로 배양된다.

이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적 인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 더 많은 시료의 확보를 위해 발효기를 이용할 수 있다. 발효기를 이용하여 단백질을 생산할 때는 숙주세포의 성장속도와 발현산물의 양 등 여러 인자를 고려해야 한다.

숙주세포에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 분리, 정제할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시 양태에서, 갈락토스에 의해 발현이 유도되는 GAL 프로모터를 가지고, TFP3 단백질을 코딩하는 서열번호 2로 기재되는 뉴클레오타이드 서열 및 리파제 활성이 약 10배 이상 증가된 변이 리파제인 CalB14를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pYGTFP3△U-CalB14 발현벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 숙주세포, 균주 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 (MATα pep4::HIS3 prb-Δ 1.6R can1 his3-20 ura3-52)(Sohn 등, J. Microbiol. Biotechnol. 1, 266, 1991) 또는 Y2805gal1 (MATα pep4::HIS3 prb-Δ 1.6R can1 his3-20 ura3-52 gal1::tc)로 형질전환하였다. 형질전환체는 효모추출액, 펩톤, 포도당을 포함하는 배지에서 배양하고, 갈락토스를 단백질 발현 유도제로 사용하였다. TFP3 단백질을 코딩하는 서열번호 2로 기재되는 뉴클레오타이드 서열 및 이를 포함하는 상기 재조 합벡터를 이용하여 리파제를 생산할 경우, 단백질 발현량 및 분비가 증가하고 효모의 배양 적온(30℃)에서도 생산 효율 감소 없이 리파제를 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 리파제를 담체에 고정화하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤(biodiesel)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에 의해 고효율로 대량생산된 리파제를 일반적인 흡착담체에 고정화하여 바이오디젤 생산에 사용할 수 있다. 바이오디젤에 사용될 수 있는 유지는 천연유지, 가공유지 및 폐유지 중에서 선택될 수 있고, 대두유, 채종유, 팜유 등을 예시할 수 있다. 알코올은 바람직하게는 탄소 수 2개 내지 8개이고, 보다 바람직하게는 탄소 수 2개 내지 4개인 알코올이다. 구체적으로, 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 이소-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올 또는 테르-부탄올 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 바이오디젤 생산에 사용되는 유지는 수분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 수분을 포함하는 경우 전체 유지량의 1 내지 10%(v/v)에 해당하는 수분을 포함하는 것이 바람직하며, 전체 유지량의 4 내지 6%(v/v)에 해당하는 수분을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 이와 같이 수분을 포함하는 유지도 사용가능하므로, 폐식용유와 같이 수분을 포함하는 유지를 바이오디젤 생산에 이용할 수 있다.

알코올 첨가 방식은 바이오디젤 생산효율에 영향을 미친다. 1단계 첨가 방 식보다는 여러 단계로 나누어 첨가하는 방식이 적합하다. 바람직하게는, 전체 유지량의 5 내지 15%(v/v)에 해당하는 알코올을 2 내지 5단계에 걸쳐 첨가하도록 한다.

또한, 바이오디젤 전환 반응은 고정화된 효소 농도에 따라 영향을 받는다. 리파제 농도가 전체 유지량의 3 내지 15%(w/v)에 해당하는 것이 바람직하고, 전체 유지량의 8 내지 10%(w/v)에 해당하는 것이 보다 바람직하다.

리파제 효소 활성에 적합한 온도는, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 보다 바람직하게는 35℃ 내지 45℃이다.

본 발명의 방법으로 생산된 리파제, 구체적으로 CalB14는 담체 고정화 후 반복적으로 재사용이 가능하므로 바이오디젤을 경제적으로 대량생산할 수 있다. 리파제를 총 유지량의 6%(w/v) 이상을 사용할 경우, 5회 반복 재사용하여도 50% 이상의 전환율을 보이고, 9%(w/v) 이상을 사용할 경우, 5회 반복 재사용하여도 70% 이상의 전환율을 보이는 것을 알 수 있었다.

TFP3 단백질을 이용하여 생산된 리파제, 보다 구체적으로 CalB14를 이용하여 생산된 바이오디젤은 경우 대체연료, 윤활유의 원료, 윤활유 첨가제뿐만 아니라 페인트나 농약 등의 무공해 용제 및 생물농약 등에 사용가능하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 리파제가 고정화된 담체로 충전된 바이오디젤 생산용 반응기에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이오디젤 생산을 위한 반응기는 고정화 효소를 이용하여 전환반응을 수행하는데 사용되는 반응기, 예를 들어 교반 탱크(Stirred tank) 반응기, 에어 리프트(air lift) 또는 버블 칼럼(bubble column) 반응기, 플루이다이저-베드(Fluidised-bed) 반응기, 팩트베드(Packed-bed) 반응기 등을 들 수 있다. 이중 고정화 효소가 불활성화되는 것을 최소화할 수 있는 팩트베드 반응기가 바람직하게 사용될 수 있다. 구체적 양태에서, 본 발명자는 펌프를 이용하여 기질을 지속적으로 순환시킬 때 펌프 압력에 의하여 고정화 효소가 칼럼 속에서 압착되는 것을 최소화할 수 있도록 고정화 효소는 통과할 수 없는 다공성 막을 사용하여 고정상의 효소 칼럼을 제조하고 이를 반응기 내부에 삽입하여 기질의 흐름 및 온도를 용이하게 조절할 수 있도록 고안한 반응기를 사용하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 변이리파제(CalB14)의 발효생산

본 발명자들은 변이리파제 CalB14를 대량생산하기 위하여 효모 균주 사카로마이세스 세레비지애 Y2805(MATα pep4::HIS3 prb-Δ 1.6R can1 his3-20 ura3-52)(Sohn 등, J. Microbiol. Biotechnol. 1, 266, 1991) 및 Y2805gal1(MATα pep4::HIS3 prb-Δ 1.6R can1 his3-20 ura3-52 gal1::tc)(이상기, 한국생명공학연구원)을 사용하였고, 형질전환에 사용한 플라스미드 pYGA-CalB14는 도 1과 같다. 발현 프로모터는 갈락토오스에 의해 발현이 유도되는 GAL 프로모터를 사용하였으며 분비 시그널로는 아스퍼질러스 니거(Aspegillus niger) 유래의 알파-아밀라아제(α-amylase) 분비 시그널인 AMY(정준기, 한국생명공학연구원)를 사용하였다.

pYGA-CalB14를 효모 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하고 (Hill et al. Nucl. Acids. Res. 19, 5971, 1991), 최소 합성배지 (0.67% 아미노산이 결여된 효모 기질 및 2% 포도당)에서 성장하는 단일 콜로니를 선별하였다. 형질전환 후 선별된 CalB14 발현 균주를 YPDG(2% 효모추출물, 1% 펩톤, 1% 글루코오스, 1% 갈락토오스)에서 배양하여 시간별로 회수된 배양액 속의 리파제 활성을 측정하였다(도 2). 리파제의 활성은 ρ-나이트로페닐 팔미테이트(ρ-nitrophenyl palmitate; pNPP)를 기질로 사용하였는데, 10mM pNPP 10㎕, 에탄올 40㎕, 50mM pH 7.6 트리스 완충용액 950㎕가 조합된 반응액에 20㎕의 배양상층 희석액을 첨가한 후, 405㎚에서 5분간 흡광하는 정도를 측정하였다. 상기 pNPP를 기질로 사용한 리파제 활성 측정방법은 pNP기와 팔미테이트가 연결된 pNPP가 리파제에 의해 팔미테이트로부터 pNP기가 절단되어 나오면서 유리된 pNP기가 405㎚에서 흡광하는 정도를 측정하는 방법이다. 본 발명에서 리파제의 활성 1 유닛(unit)은 1분당 1μM의 pNP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다. 형질전환 효모를 배양적온인 30℃에서 배양하는 경우보다 20℃에서 저온 배양하는 것이 배지에 분비된 리파제의 활성이 약 3배 이상 높음을 알 수 있었다(도 2). 이러한 결과는 CalB를 재조합 생산할 때 일반적으로 관찰되는 현상으로 단백질의 폴딩이 저온에서 잘 일어나거나 또는 저온에서 숙주세포가 분비하는 단백질 분해효소가 적었기 때문 에 배지로 분비된 CalB가 많이 남아 있기 때문으로 추정된다.

저온배양이 CalB14의 분비생산에 효과적이기 때문에 발효조를 이용한 유가식 배양에서 초기 배양은 30℃에서 수행하고 발현유도를 위해 갈락토오스를 첨가하는 시기부터 20℃로 낮추는 방법을 이용하였다. 본 배양에 들어가기 전에 세포를 200㎖의 YPD 액체배지(1% 효모추출액, 2% 펩톤 및 2% 포도당)를 포함하는 1ℓ 플라스크에 1단계 초기배양한 후 5ℓ 발효조(jar fermenter)에 접종하였다. 배양 초기에는 생육 온도를 30℃로 하여 18시간 동안 충분히 세포를 배양한 후, 단백질 발현유도를 위한 갈락토오스를 첨가하면서 온도를 20℃로 낮추어 총 84시간 동안 배양하여 CalB14를 생산하였다(도 3A). 세포의 생육은 300 OD₆₀₀(80g Dry cell weight/ℓ)까지 성장하였으며 배지로 분비된 CalB14를 확인하기 위하여 발효 중 시간별로 배지 5㎕를 취하여 SDS-PAGE 분석하였다. 약 84시간의 발효배양 후 약 800㎎/ℓ의 CalB14가 배지로 분비 생산되었음을 표준시료와의 비교를 통해서 확인하였다(도 3B). CalB14 생산 균주를 산업적으로 이용하기 위해서는 톤(ton) 단위의 대규모 발효가 용이해야 하지만 배양 중 온도를 변화시키는 문제가 용이하지 않다. 특히 하절기 수온이 20℃를 상회할 경우 발효조의 저온 유지를 위해서 냉각수를 따로 냉각해야 하는 등 발효 단가가 증가하는 문제가 있으므로 효모의 배양적온 (30℃)에서도 효율적으로 효소를 생산할 수 있는 시스템의 개발이 요구되었다.

실시예 2: 단백질융합인자 (TFP) 도입을 통한 변이 리파제 (CalB14) 분비생산

본 발명자들은 상기한 바와 같이 CalB14는 효모의 배양적온에서 제대로 분비생산되지 못하는 문제점을 해결하기 위하여 배양적온에서도 분비가 잘 될 수 있도록 효모 유래의 다양한 TFP와의 융합을 통해 배양적온에서의 CalB14 분비효과를 분석하였다. 사용한 단백질융합인자는 인체 인터루킨-2의 분비를 유도하는 단백질융합인자 TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4(한국특허 2004-003957, PCT/KR04/032004)를 사용하였다. 4종의 단백질 융합인자가 도입된 CalB14 발현벡터를 제조하기 위해서 도 4(A)와 같이 pYIL-TFP1, 2, 3, 4 벡터(한국특허 2004-116146, PCT/KR04/032004)에서 각각 SacI/XbaI으로 처리하여 얻어진 GAL 프로모터와 연결된 4종의 단백질 융합인자 유전자 절편을 SacI/XbaI 처리된 pYGA-CalB14 벡터에 삽입하여 pYGTFP1-CalB14, pYGTFP2-CalB14, pYGTFP3-CalB14 및 pYGTFP4-CalB14를 제조하였다.

제조된 4종의 CalB14 발현벡터와 pYGA-CalB14를 효모 사카로마이세스 세레비지애 Y2805에 형질전환하였다. 획득된 균주는 1% 트리뷰티린(tributyrin)이 포함되어있는 YPDG 평판배지(1% 효모추출액, 2% 펩톤, 1% 포도당 및 갈락토오스)에 옮겨 도 4(B)와 같이 균주 주변의 환의 크기를 측정하여 형질전환체의 리파제 활성을 비교 확인하였으며, TFP2를 제외한 나머지의 경우 기존 벡터보다 활성이 우수함을 확인하였다. 또한, 세포의 배양온도에 따른 활성을 분석하기 위하여 각각의 세포를 YPDG 액체배지(1% 효모추출액, 2% 펩톤, 1% 포도당 및 1% 갈락토오스)에 접종하여 배양적온인 30℃ 및 23℃에서 저온 배양하여 pNPP 측정법으로 배양액 속의 각각 의 리파제 활성을 비교하였다(표 1). 저온배양의 효과는 여전히 관찰되었으나 아밀라아제 분비 시그널을 이용하는 경우에 비해서 대부분 완화되었음을 알 수 있었다. 특히, TFP3을 사용한 경우에는 거의 온도에 따른 차이가 없음을 알 수 있었으며 30℃ 적온 배양에서 가장 높은 활성을 보였기 때문에 TFP3을 최적융합인자로 선정하고 추가적인 최적화 연구를 수행하였다.

각 발현 벡터를 함유한 균주의 배양온도에 따른 리파제 활성

	Lipase activity (U/L)
	30℃	23℃
pYGA-CalB14 (AMY) pYGT1-CalB14 (AMY) pYGT3-CalB14 (AMY) pYGT4-CalB14 (AMY)	295.2 777.6 858.6 350.4	885.6 961.2 874.8 874.8

실시예 3: 단백질융합인자3 (TFP3)의 최적화 및 변이리파제 (CalB14)의 발효 생산능 조사

CalB를 효모 배양적온인 30℃에서도 효율적으로 분비 생산할 수 있는 단백질융합인자 TFP3은 효모 사카로마이세스 세레비지애 유래의 유전자(Yjl158c)의 일부로 전체 크기는 640 bp 이지만 이중 단백질을 코딩하는 유전자의 크기는 312 bp(104 아미노산)이며 나머지는 UTR이다(한국특허 2004-003957, PCT/KR04/032004). UTR의 존재는 GAL 프로모터로부터 시작되는 전사를 방해하거나 또는 mRNA의 안정성을 저하시켜 전체적인 단백질 발현량을 낮출 가능성이 있다. 따라서 TFP3의 UTR을 제거한 CalB14 발현 벡터를 제조하기 위해 pYGTFP3-CalB14를 주형으로 프라이머 HY14(서열번호 5: 5'-GGA TCC ATG CAA TTC AAA AAC GTC G-3')와 CalB14-150R(서열번호 6: 5'-GAG TCG AAC GAC TGT GGA CCT GTG-3')을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 하였다. 상기 중합효소 연쇄반응은 써멀 사이클러(Thermal Cycler; 제조원: Takara, Japan)를 사용하여 수행하였고, 94℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 30초간 반응을 25회 수행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 수행하여 약 500bp(base pair)의 UTR이 제거된 TFP3 및 일부의 CalB14 유전자를 포함하는 단편을 획득하였다. 얻어진 단편은 0.8% 아가로스 젤에서 추출한 다음 이를 pST-Blue1(Novagen, WI, USA)에 클로닝한 후 이를 BamHI/XbaI 처리하고 BamHI/XbaI으로 처리된 pYGTFP3-CalB14에 삽입하여 UTR이 제거된 변이리파제 발현벡터인 pYGTFP3△U-CalB14(도 15)를 제조하였다. 제조된 벡터를 효모에 형질전환하고 선별된 단일 형질전환체의 CalB14 발현 및 분비를 비교하였다. 대조구로서 기존의 아밀라아제 분비 시그널을 삽입한 변이리파제 발현 균주(AMY) 및 TFP3의 UTR을 제거하지 않은 pYGTFP3-CalB14 발현 균주(TFP3)를 사용하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 UTR을 제거한 TFP3을 갖는 형질전환체가 기존 UTR을 포함하고 있는 균주에 비해 약 2배 이상 높은 리파제 활성을 보였으며 효모의 배양적온인 30℃에서도 효율적인 분비가 일어남을 확인할 수 있었다.

pYGTFP3△U-CalB14를 함유한 균주가 발효조에서도 동일한 효과를 보이는지 확인하기 위해서 5ℓ 용기 발효조에서 상기한 배지로 효모 배양 적온(30℃)에서 유가식 배양(fed-batch culture)하고 각 시간별로 회수된 배양 상층액을 전기영동하여 CalB14의 분비 정도를 분석하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 재조합 균주는 30℃에서 아주 빠르게 성장할 수 있었으며 배양온도의 shift 없이도 고효율로 CalB14를 배지로 분비 생산할 수 있었다. 단백질 활성 및 농도 분석 결과 약 1.5g/L의 CalB14가 배지로 분비되는 것이 확인되었다.

실시예 4: 변이리파제 (CalB14)의 대량생산

본 발명자들은 상기한 변이리파제 생산균주(pYGTFP3△U-CalB14를 함유한 효모 2805gal1 균주)를 500ℓ 용량의 발효조에서 최적생산 연구를 수행하였다. 발효는 500ℓ의 스테인리스 발효조를 이용하여 유가식 배양을 하면서 단백질을 분비 생산하였다. 본 배양에 들어가기 전에 100㎖의 최소 액체배지 (0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노에시드, 2% 포도당)에 1단계 초기배양한 후 다시 2ℓ의 YPD 액체배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 생산균주를 2단계 초기배양하고 이를 50ℓ의 YPD 액체배지에서 3단계 초기 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액 (4% 효모 추출액, 1% 펩톤, 2% 포도당)에 접종하여 12시간 배양하고 이후 발현유도 배지(30% 포도당, 1% 효모추출물, 0.3% 갈락토오스)를 이용하여 72시간 동안 30℃에서 유가식 배양하였다. 발효 생산된 CalB14를 50mM의 트리스 완충용액(pH7.6)으로 0.45, 0.2㎛ 크기의 막여과와 초막여과(분자량 cutoff 10,000)를 이용하여 농축하였으며, 농축된 CalB14 발효액을 다시 냉동건조하여 최종산물을 얻었다. 표 2는 발효 후 정제단계 별로 pNPP 리파제 활성 측정법을 이용하여 회수율을 확인하였다.

발효 및 여과단계별 리파제 활성

단계	Lipase activity(U/L)
단계	활성 (U/㎖)	용량 (ℓ)	총 활성 (U/L)	회수율 (%)
72시간 배양상등액 막여과 (Membrane filtrate) 초막여과 (Ultramembrane filtrate)	11,016 9,720 24,840	120 120 60	1,321,920 1,166,400 1,490,400	100 88 113

실시예 5: 변이리파제 (CalB14)의 고정화

본 발명자들은 재조합 대량생산된 CalB14를 바이오디젤 생산을 위한 고정화촉매를 개발하기 위해서 XAD4, XAD7 및 XAD16(Rohm & Hass Co.)을 흡착담체로 선택하여 고정화하고 특성을 분석하였다. 고정화 방법으로는 담체에 효소를 흡착시키는 방법을 사용하였다. 효소를 고정화하기 전에 3종의 담체 각 10g을 메탄올 25㎖에 30분간 세척한 후 다시 100㎖의 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)에 30℃에서 1시간 동안 세척하여 전처리하였다. 효소액은 10㎖의 상기 완충용액에 동결건조된 CalB14 효소 2g을 용해하여 준비하였다. 전처리된 3종의 담체에 준비해둔 10㎖의 효소액을 첨가하여 진탕배양기에서 30℃, 200rpm의 속도로 15시간 고정화시켰다. 고정화 시간은 상등액에 존재하는 초기 효소활성과 일정시간이 경과한 후 잔여 효소활성을 비교하여 더 이상 잔여 활성이 변화가 없을 때까지 고정화반응을 진행하였다. 고정화 반응이 끝난 담체는 거름종이와 유리깔때기를 이용하여 회수하고 다시 50㎖의 상기 완충용액으로 고정화된 담체를 반복 세척하였다. 세척된 고정화 효소는 상온에서 진공펌프를 이용하여 건조시키고 4℃에 보관하였다.

실시예 6: 담체별 고정화 효소의 바이오디젤 전환 활성 조사

본 발명자들은 상기한 바와 같이 3종의 흡착 담체에 CalB14를 고정화하여 바이오디젤 전환반응 효율을 비교하였다. 9.5㎖ 식물성 유지(대두유, soybean oil)에 메탄올을 5% 첨가하고 각 고정화 효소를 3%(w/v) 첨가하여 30℃에서 강력하게 교반하면서 시간별로 생성된 바이오디젤을 가스 크로마토그라피(gas chromatography, Star 3400CX, Varian Co.)를 이용하여 분석하였다. 식물성 유지(triacylglyceride, TG)와 메탄올이 반응하여 바이오디젤(fatty acid methyl ester)로 100% 전환되기 위해서는 전체 유지량의 10%(v/v) 정도의 메탄올이 필요하다. 그러나 고농도의 메탄올은 효소를 불활성화하기 때문에 메탄올을 단계적으로 첨가하는 것이 효소를 장기간 사용하기 위해서는 유리하다. 본 반응에서는 메탄올을 초기 반응 시 5%의 메탄올을 첨가하고 추가로 메탄올을 첨가하지 않았기 때문에 최대 전환율은 약 50% 정도이다.

전환된 바이오디젤분석은 시간별로 시료를 100㎕ 회수하여 13,000×g에서 1분간 원심분리한 뒤 상층액을 저울을 이용하여 20㎎을 회수하고 이를 클로로포름 1㎖에 용해하여 이중 2㎕를 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피의 초기칼럼온도 150℃에서 180℃까지 분당 15℃로 칼럼온도를 상승시키고 최종칼럼온도를 280℃로 설정하여 분당 10℃로 칼럼온도를 상승시키면서 생성되는 반응피크의 면적을 계산하여 전환활성을 측정하였다. 표준곡선은 시판중인 각각의 지방산 메틸에스터(fatty acid methyl ester, Sigma)를 구입하여 동일한 조건에서 분석하였으며 농도와 피크면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 측정결과 도 7에서 보는 바와 같이 초기반응속도는 XAD16의 경우 가장 빠른 전환효율을 보였으나 시간경과 후 XAD7도 XAD16과 동일하게 높은 전환율을 보였다. 따라서 이후 바이오디젤 전환 최적화 연구는 초기반응속도가 빠른 XAD16에 고정화된 CalB14를 이용하여 수행하였다.

실시예 7: 수분함량 및 메탄올 첨가방법에 따른 바이오디젤 전환활성 조사

본 발명자들은 반응액 내 수분함량이 바이오디젤의 전환반응에 미치는 영향을 분석하기 위해서 수분농도를 0-10%까지 변화시켜 바이오디젤 전환 정도를 비교하였다. 식물성 유지 9-10㎖에 수분농도가 각각 0, 1, 2, 5, 7.5, 10%가 되도록 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)을 첨가하고 메탄올을 3% 되게 첨가한 후 CalB14를 고정화한 XAD16을 3%(w/v) 첨가하여 30℃에서 강력하게 교반하여 생성된 바이오디젤을 분석하였다. 반응은 회분식(batch)으로 수행하였으며 이 경우 바이오디젤로의 최대 전환율은 약 30% 정도였다. 도 8에서 보는 바와 같이 수분이 전혀 포함되지 않은 경우에는 전환반응이 느리지만 수분함량이 증가되면서 점차적으로 반응효율이 증가되어 수분함량 5%까지 전환반응 효율이 증가하였다. 그러나 그 이상에서는 증가하지 않았기 때문에 이후 바이오디젤 전환반응은 5% 수분을 포함한 반응액에서 수행하였다. 바이오디젤 전환반응에서 CalB 효소의 경우 다른 리파제와 비교하였을 때 반응액 내에 수분이 다량 존재하는 경우에도 가수분해 반응이 억제되는 특징이 있다. 이는 향후 폐식용유를 이용하여 바이오디젤을 생산하고자 할 때 폐식용유 특성상 다량의 수분을 함유하고 있는데 일반 효소의 경우 가수분해를 일으켜 전체적 바이오디젤 생산성을 저해하나 본 연구에서 개발된 고정화 효소의 경우 오히려 수분이 존재할 경우에 반응이 가속화되어 폐식용유를 원료로 사용할 경우 상당한 장점을 제공할 수 있을 것으로 판단되었다.

또한, 식물성 오일을 바이오디젤로 완전히 전환하기 위해서는 필요한 10%의 메탄올의 첨가방식을 비교하였다. 반응 초기부터 10%의 메탄올을 첨가한 경우와 3.3%를 3단계에 걸쳐서 첨가하여 바이오디젤 전환 정도를 조사하였다. 식물성 유지 9에서 9.5㎖에 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)을 5% 되도록 첨가하고 메탄올을 각각 3.3 및 10% 되게 첨가한 뒤 반응을 수행하였다. 도 9에서 보는 바와 같이 반응 초기부터 메탄올을 10% 첨가한 경우에는 전환반응이 진행되었지만 반응속도가 상당히 느린 것을 알 수 있었다. 그러나 3단계로 메탄올을 첨가한 경우에는 상대적으로 매우 빠른 속도로 전환반응이 일어남을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 개량된 변이리파제가 원래의 CalB에 비해 고농도 메탄올에서 상대적으로 높은 활성을 보였지만 메탄올 전환반응을 위해서는 1단계 메탄올 첨가 방식보다는 3단계에 걸친 메탄올 첨가방식이 더 적합함을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 효소농도 및 반응온도에 따른 바이오디젤 전환활성 조사

바이오디젤 전환반응에 사용하는 고정화 효소의 최적농도를 결정하기 위하여 반응에 사용되는 고정화 효소를 식물성 유지 양 대비 3-12%(w/v)까지 변화시켜 바이오디젤 전환율을 비교하였다. 고정화된 효소의 양을 3, 6, 9, 12%(w/v)로 설정하여 바이오디젤 전환반응을 수행하였다. 9.5㎖의 식물성 유지와 5%의 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)에 3, 6, 9, 12% (w/v)의 고정화 효소를 넣고 3단계의 메탄올 첨가방식을 통해 30℃에서 바이오디젤의 최대전환율을 비교하였다. 그 결과, 도 10(A)에서 보는 바와 같이 반응속도는 효소농도 9% 이상에서는 더 이상 증가하지 않았고 최대 75% 정도까지의 전환율을 보였으며 이후 전환반응은 지속되나 반응속도가 초기속도에 비해 상당히 저하되었다.

또한, 고정화된 CalB14의 최적 반응온도를 확인하기 하여 20, 30, 40 및 50℃까지 변화시켜 상기와 동일한 방법으로 반응을 비교하였다. 그 결과, 도 10(B)에서와 같이 반응온도의 상승은 초기반응속도를 상당히 증가시켰으며 40℃ 및 50℃에서는 유사한 결과를 보였다. CalB14 효소는 어느 정도 열 안정성이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 반응온도 40℃가 효소의 장기간 재사용을 위해서는 적합할 것으로 판단되었다.

실시예 9: 고정화 효소의 농도별 반복사용에 따른 바이오디젤 전환활성 조사

고비용의 고정화 효소 생산비를 절감하기 위해서는 효소의 반복 재사용이 필요하다. 바이오디젤 전환반응에서 고정화 CalB14를 반복적으로 재사용할 수 있는지 여부를 확인하고 또 반복 재사용을 위한 최적의 효소농도를 확인하기 위해서 효소농도를 3-12%로 변화시켜 3단계 메탄올을 첨가하는 전환반응을 비교하였다. 비교 실험한 결과, 도 11에서와 같이 효소농도 9% 이상에서는 5회 반복한 전환반응에서도 반응속도의 저하 없이 약 80% 정도의 일정한 전환율을 보였다. 저농도의 효소의 경우 동일한 속도의 메탄올 첨가로 인해 반응액 중 메탄올이 축적되었으며 따라서 효소의 불활화가 진행되어 점차적으로 효소의 활성이 감소하였다. 따라서 10% 정도의 효소농도를 사용할 경우 최적의 반응속도를 유지하며 장기간 반복적인 전환반응이 가능할 것으로 예상되었다.

실시예 10: 고정화 CalB14의 반복사용을 위한 바이오디젤 생산 반응기 제작

고정화 효소를 이용하여 경제적으로 바이오디젤을 생산하기 위하여 고정화 효소의 반복사용이 가능한 반응조를 제작하였다. 고정화 효소의 반복 재사용을 위해서는 효소담체가 기계적인 힘에 의해 불활성화되는 것을 막을 수 있어야 하는데 본 발명에서는 미세한 구멍을 가진 고정상의 효소칼럼을 제조하였고 이를 반응조에 삽입하여 외부에서 펌프를 이용하여 연속적으로 반응액을 순환시키면서 바이오디젤 전환반응을 수행하였다(도 12). 반응조 내의 효소칼럼은 온도유지가 용이하며 반응액의 순환이 원활하여 기질과의 접촉을 용이하게 하는 한 장점을 제공한다.

소규모 전환반응을 위한 초기반응액은 식물성 유지 95㎖에 수분함유량이 5%가 되도록 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)을 첨가하고 효소칼럼에는 총 식물성 유지량의 5, 10 및 15 %(w/v)에 해당하는 고정화 효소를 충진하여 반응조를 반응 중 3단계 메탄올 첨가방식으로 바이오디젤 전환반응을 수행하였다. 반응조는 온도조절이 가능한 물순환 장치를 이용하여 40℃를 유지하였다.

반응 결과 도 13(A)에서 보는 바와 같이 효소의 양을 총 식물성 유지량의 10% 이상을 사용할 경우 40시간 반응 이후 약 80% 이상의 바이오디젤 전환반응이 일어났음을 확인할 수 있었다. 또한, 반응중의 시료를 TLC(thin layer chromatography) 분석하여 반응 중 생성물질들의 변화를 확인하였다(도 13(B)). TLC 분석은 클로로포름에 용해된 시료를 TLC 플레이트(Merck)에 점적하고 클로로포름: 아세톤: 아세틱에시드가 95:4:1로 혼합된 용액을 이동상으로 사용하여 전개하고 전개가 완료된 플레이트를 건조한 후 150℃에서 10분간 처리한 후 에탄올에 녹인 50% 황산(H₂SO₄)을 스프레이하여 나타난 밴드를 확인하였다. 결과에서 보는 바와 같이 반응시간이 경과하면서 TG(triacylglyceride)의 양이 줄면서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl ester)의 양이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 반응액 중 수화된 지방산이 거의 관찰되지 않아 바이오디젤의 고순도를 유지할 수 있는 장점이 있었다. 반응이 종료된 바이오디젤 시료는 원심분리를 통해서 생성된 글리세롤과 수분을 제거하였다. 상기한 바이오디젤 생산시스템은 도 14에서 보는 바와 같이 695시간 동안 연속적으로 바이오디젤 전환반응을 실행하면서 평균 84% 정도의 바이오디젤 전환율을 보여 고정화된 효소가 장기간 사용하여도 안정성에 문제가 없음을 알 수 있고 이는 효소비용을 절대적으로 절감할 수 있었으며 따라서 생물학적 바이오디젤의 경제적 대량생산을 가능하게 하였다.

생물학적 바이오디젤의 생산방법은 다양한 미생물 유래의 리파제를 사용하여 가능하지만 효소생산가격이 높아 경제성이 없으나, 본 발명에서는 활성이 개량된 변이리파제(CalB14)의 효과적인 재조합 생산 시스템을 TFP3 단백질을 이용하여 구축하여 저가로 리파제를 확보하고 담체 고정화를 통해 재사용함으로써 바이오디젤을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 단백질융합인자3(translational fusion partner 3: TFP3) 단백질과 융합된 리파제 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제 생산방법.
제1항에 있어서, TFP3 단백질이 UTR(untranslated region)이 제거된 서열번호 2로 기재되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산분자에 의해 코딩되는 방법.
제1항에 있어서, 리파제 단백질이 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변이 리파제 CalB14인 방법.
제1항에 있어서, 발현벡터가 도 15에 도시된 pYGTFP3△U-CalB14인 방법.
제3항의 방법으로 생산된 리파제를 흡착담체에 고정화하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤(biodiesel)을 생산하는 방법.
제5항에 있어서, 유지가 천연유지, 가공유지 및 폐유지 중에서 선택되는 방법.
제5항에 있어서, 알코올이 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올 중에서 선택되는 방법.
제5항에 있어서, 유지량의 5 내지 15%(v/v)에 해당하는 알코올을 2 내지 5 단계에 걸쳐 첨가하는 방법.
제5항에 있어서, 리파제의 농도가 유지량의 3 내지 15%(w/v)인 방법.
제9항에 있어서, 리파제의 농도가 전체 유지량의 8 내지 10%(w/v)인 방법.
제5항에 있어서, 반응온도가 20 내지 50℃인 바이오디젤을 생산하는 방법.
제11항에 있어서, 반응온도가 35 내지 45℃인 방법.
제3항의 방법으로 생산된 리파제가 고정화된 흡착담체로 충전된, 바이오디젤 생산을 위한 반응기.
제13항에 있어서, 상기 리파제가 고정화된 흡착담체가 반응기 내부에 위치하는 다공성 막의 칼럼에 충전되는 반응기.