CN1491278A - 脂酶变体 - Google Patents

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CN1491278A CNA028046897A CN02804689A CN1491278A CN 1491278 A CN1491278 A CN 1491278A CN A028046897 A CNA028046897 A CN A028046897A CN 02804689 A CN02804689 A CN 02804689A CN 1491278 A CN1491278 A CN 1491278A
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西格尼·芒克
�����ĵ�
杰斯珀·文德
金·博尔奇
�޲��ء�A�������
沙姆坎特·A·帕特卡
Os
桑尼·O·S·格拉德
˹�ĵ�ɭ
阿伦·斯文德森
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Abstract

将肽的延伸物与脂酶C－末端氨基酸相连可以降低形成气味的趋势。所产生的脂酶变体在洗涤由包含相对短链脂酰基团(例如高达C8)的脂，例如包含乳脂肪或诸如椰子油和棕榈仁油的热带油的乳品污物污染的织物时，可减少气味生成。

Description

脂酶变体
技术领域
本发明涉及减少气味产生潜能的脂酶变体和制备它们的方法。本发明尤其涉及适合用于洗涤剂组合物的变体，尤其是Thermomyces lanuginosus脂酶的变体，其在清洗乳脂污染的织物时显示首洗(first-wash)效果和降低气味形成的倾向。
背景技术
脂酶可用作例如洗涤剂酶以除去衣服和其它纺织品上的脂或脂肪污物，还可用作面包和其它烘焙产品的生面团的添加剂。因此，以商品名Lipolase(Novo Nordisk A/S的产品)出售的源于Thermomyceslanuginosus(与Humicola lanuginosa同义，EP 258 068和EP 305 216)的脂酶用作洗涤剂。WO 0060063描述了T.lanuginosus脂酶的变体，其在洗涤剂溶液中具有尤其好的首洗性能。WO 9704079，WO 9707202和WO0032758还公开了T.lanuginosus脂酶的变体。
在某些应用中，最小化产生气味的短链脂肪酸的形成是非常重要的。已知具有脂酶的洗涤剂有时可以遗留下残余气味附着于乳污染的衣物(EP430315)。
发明内容
发明人已经发现将肽的延伸物连接到脂肪酶C-末端氨基酸可以减小形成气味的倾向。在洗涤包含相对短链酯酰基团(例如高达C8)的脂污染例如乳品污染(所述乳品包含乳脂或诸如椰子油和棕榈仁油的热带油)的织物时，可导致具有减少气味生成的脂酶变体。该变体对长链酰基基团的特异性比对短链酰基基团的特异性提高了，和/或升高了在碱性pH与中性pH时的活性比，即在冲洗期间的中性pH(约pH 7)时的脂酶活性低于在类似于洗涤液的pH的碱性pH(例如pH 9或10)时的脂酶活性。
因此，本发明提供一种制备脂酶的方法，是通过将肽延伸物附着在亲代脂酶的C-末端并筛选所得的肽来找到具有任何上述改进特性的脂酶。
本发明还提供一种具有脂酶活性和氨基酸序列的多肽，其包括具有脂酶活性的亲代多肽和附着在亲代多肽的C-末端的肽的延伸物。
本发明还提供一种洗涤剂组合物和使用具有上述特性的脂酶制备洗涤剂的方法。
发明详述
亲代脂酶
亲代脂酶可以是氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的T.lanuginosus脂酶的序列具有至少50％同一性的真菌脂酶。
因此，亲代脂酶可以是通过使用基于此说明书中的DNA序列所设计的探针，从踝节菌属(Talaromyces)菌株或者Thermomyces菌株，尤其是Talaromyces thermophilus，Thermomyces ibadanensis，Talaromycesemersonii或者Talaromyces byssochlamydoides得来的。
更具体的是，亲代脂酶可以是自下面所示的生物体分离出的脂酶，具有所示的氨基酸序列。根据布达佩斯条约保藏于DSMZ的含有该基因的大肠杆菌菌株如下：
    生物来源  基因和多肽序列  克隆保藏号  保藏日期
Thermomyces lanuginosus DSM 4109  SEQ ID NO：1和2
Talaromyces thermophilus ATCC 10518  SEQ ID NO：3和4  DSM 14051  2001年2月8日
Thermomyces ibadanensis CBS 281.67  SEQ ID NO：5和6  DSM 14049  2001年2月8日
Talaromyces emersonii UAMH 5005  SEQ ID NO：7和8  DSM 14048  2001年2月8日
Talaromyces byssochla mydoides CBS 413.71  SEQ ID NO：9和10  DSM 14047  2001年2月8日
根据贸易条款上述来源的生物体可以容易地得到。菌株在下面地址保藏：
DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeg 1b，D-38124Braunschweig DE。
ATCC(美国典型培养物保藏中心American Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。
CBS(荷兰真菌菌种保藏中心Centraalbureau voorSchimmelcultures)，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，The Netherlands。
UAMH(加拿大阿尔伯达大学植物霉菌培养物保藏中心University ofAlberta Mold Herbarium & Culture Collection)，Devonian BotanicGarden，Edmonton，Alberta，Canada T6G 3GI.
或者，亲代脂酶可以是通过改变上述任何脂酶的氨基酸序列获得的变体，尤其是WO 0060063中所述的或下面所述的具有首洗活性的变体。
C-末端的肽延伸物
本发明通过肽键将添加的肽附着到亲代脂酶的C-末端氨基酸(例如SEQ ID NO：2所示的T lanuginosus脂酶的L269)。肽的延伸物可以通过定点突变或随机突变实现附着。
在C-末端的肽的延伸物可以由2-15个氨基酸残基，尤其是2-11或3-10例如2，3，4，5，7，9或11个氨基酸残基组成。
延伸物尤其可以具有在所示的位置的以下残基(从C-末端起始计数)：
·在第一位置的带负电荷的氨基酸(negative amino acid)残基(例如D或E)，
·在第二和/或第三位置的小的不带电荷的氨基酸(例如S，T，V或L)，和/或
·在第3到第7尤其是第4，5或6位置的带正电荷的氨基酸(positiveamino acid)残基(例如H或K)。
肽的延伸物可以是HTPSSGRGGHR或其截短形式，例如HTPSSGRGG，HTPSSGR，HTPSS或HTP。其它的实例为KV，EST，LVY，RHT，SVF，SVT，TAD，TPA，AGVF和PGLPFKRV。
肽的延伸物可以通过使用编码亲代多肽的载体(质粒)和相应于C-末端的2-15个氨基酸延伸物的具有终止密码子的寡核苷酸得以附着。在C-末端和终止密码子之间的核苷酸可以是随机的或可以是偏好上述氨基酸的。一种实施方式是设计寡DNA(DNA oligo)，其包含所需的随机突变以及具有与目的基因3′端杂交所必需的序列。该寡DNA在PCR反应中与具有能与互补DNA链(本领域技术人员已知的)杂交的寡核苷酸(oligo)一起使用，然后将PCR片段克隆入目的物(表达载体)。
提高对长链/短链的特异性
与亲代脂酶相比，本发明的脂酶提高了对长链/短链的特异性，例如提高了对长链(例如C16-C20)甘油三酸酯的活性/对短链(例如C4-C8)甘油三酸酯的活性的比值。这可以通过以橄榄油作底物的SLU的比值和以三丁酸甘油酯为底物的LU的比值测定(方法在说明书后面描述)。
提高碱性pH活性/中性pH活性的比值
与亲代脂酶相比，本发明的脂酶提高了碱性pH活性/中性pH活性的比值，即升高了在碱性pH(例如pH 9-10)和在中性pH(约pH 7)情况下的脂酶活性的比值。这可以用后面说明书描述的以三丁酸甘油酯为底物的方法进行测定。
用带正电荷的氨基酸进行取代
亲代脂酶可以在接近相应于SEQ ID NO：2的E1或Q249的位置包括一个或多个(例如2-4个，尤其是2个)用带正电荷的氨基酸取代中性或带负电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸可以是K，R或H，尤其是R。负的和中性氨基酸可以是其它任何氨基酸。
取代可以在距离SEQ ID NO：2的E1或Q249 15内的三维结构表面进行，例如相应于1-11，90，95，169，171-175，192-211，213-226，228-258或260-262的任何一位置。
取代可以在E1或Q249的10内，例如相应于1-7，10，175，195，197-202，204-206，209，215，219-224，230-239，242-254的任何位置。
取代可以在E1的15内，例如相应于111，169，171，192-199，217-225，228-240，243-247，249，261-262的任何位置。
取代最优选的是在E1的10内，例如相应于1-7，10，219-224和230-239的任何位置。
因此，一些特殊的取代是相应于S3R，S224R，P229R，T231R，N233R，D234R和T244R的那些。
在90-101和210位置的氨基酸
亲代脂酶可特殊地满足在相应的90-101和210位置的带电荷的氨基酸的某种限定。满足电荷限制的脂酶特别是在有高浓度阴离子的洗涤剂中有效。
因此，氨基酸210可以是带负电荷的。E210可以是未改变的或其具有E210D/C/Y，尤其是E210D取代。
脂酶可以包含在90-101(尤其是94-101)任何位置的带负电荷氨基酸，例如在D96和/或E99位置。
而且，脂酶可以在N94包含中性或带负电荷的氨基酸，即N94(中性或带负荷的)例如N94N/D/E。
脂酶在90-101(尤其是94-101)区可具有负的或中性净电荷，即带负电荷的氨基酸数可以等于或大于带正电荷的氨基酸数。因此，该区可来自于Lipolase，不做改变，具有两个带负电荷的氨基酸(D96和E99)和一个带正电荷的(K98)，并且在位置94(N94)具有中性氨基酸，或该区可以通过一个或多个取代修饰。
或者，三个氨基酸N94，N96和E99中的两个可以具有负的或未改变的电荷。因此所有三个氨基酸可以不变化或通过保守或带负电荷的取代而改变，即N94(中性或负的)，D(负的)和E99(负的)。实例为N94D/E和D96E。
进一步地，三个氨基酸N94，N96和E99之一可以被取代以增加电荷即N94(正的)，D96(中性或正的)或E99(中性或正的)。实例是N94K/R，D96I/L/N/S/W或E99N/Q/K/R/H。
亲代脂酶可以包括E99K取代，并且合并有相应的90-101区的带负电荷的氨基酸，例如D96D/E。
用带负电荷的氨基酸取代中性的氨基酸(N94D/E)可以改进在阴离子洗涤剂中的性能。用带正电荷的氨基酸取代中性氨基酸(N94K/R)可以提供具有在阴离子洗涤剂和阴离子/非离子洗涤剂(含有例如占总表面活性剂40-70％的阴离子的洗涤剂)中具有好的性能的脂酶变体。
其它位置的氨基酸
亲代脂酶可以任选地包含其它氨基酸的取代，尤其是少于10个或5个所述的取代。实例是在SEQ ID NO：2中相应于Q249R/K/H，R209P/S和G91A的取代。进一步的取代例如可以根据本领域已知的原理进行，例如在WO92/05249，WO 94/25577，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所述的。
亲代脂酶变体
亲代脂酶包含相应于SEQ ID NO：2中的G91G/A+E99E/D/R/K+T231T/S/R/K+N233N/Q/R/K+Q249Q/N/R/K的取代。一些特定的实例是具有相应于下面的取代。
T231R+N233R
D96L+T231R+N233R
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
R209P+T231R+N233R
E87K+G91D+D96L+G225P+T231R+N233R+Q249R+N251D
G91A+E99K+T189G+T231R+N233R+Q249R
 D102G+T231R+N233R+Q249R
 N33Q+N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R
 N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R
 N33Q+D96S+V228I++T231R+N233R+Q249R
 D62A+S83T+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
 F99N+N101S+T231R+N233R+Q249R
 R84W+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
 V60G+D62E+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
 E99K+T231R+N233R+Q249R
 T231R+N231R+Q249R
氨基酸修饰的命名法
本文所用的定义突变的命名法实质上如WO 92/05249中所述。因此，T231R表示在位置231用R取代T。
270PGLPFKRV表示附加到SEQ ID NO：2的C-末端(L269)的延伸物。
氨基酸分组
本说明书中，根据氨基酸在pH 10情况下的电荷将它们分类为带负电荷，带正电荷，或电中性的氨基酸，这在洗涤剂中是很常用的。因此，带负电荷的氨基酸是E，D，C(半胱氨酸)和Y，尤其是E和D。带正电荷的氨基酸是R，K和H，尤其是R和K。中性氨基酸是G，A，V，L，I，P，F，W，S，T，M，N，Q和形成二硫桥部分时的C。将在同组(正，负或中性)氨基酸中用其它氨基酸的取代定义为保守取代。
中性氨基酸可以分为疏水或非极性的(G，A，V，L，I，P，F，W和作为二硫桥部分的C)和亲水或极性的(S，T，M，N，Q)。
氨基酸同一性
亲代脂酶与T lanuginosus脂酶(SEQ ID NO：2)具有至少50％的同一性，尤其是至少55％，至少60％，至少75％，至少85％，至少90％，高于95％或高于98％的同一性。
同一性的程度可以通过本领域已知的计算机程序诸如GCG程序包提供的GAP进行测定(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Jour nalof Molecular Biology，48，443-45)，利用GAP进行多肽序列比较时采用下列设定值：GAP生成罚分(creation penalty)为3.0和GAP延伸罚分(extensionpenalty)为0.1。
氨基酸序列对比
在本说明书中，氨基酸残基通过SEQ ID NO：2确定。为了在另一脂酶序列中找到相应的位置，使用GAP序列对比将该序列与SEQ ID NO：2对比。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of MolecularBiology，48，443-45)中提供。下面的设定值用于多肽序列的比较：GAP生成罚为3.0和GAP延伸罚为0.1。
DNA序列，表达载体，宿主细胞以及脂酶的制备
本发明提供了一种编码本发明脂酶的DNA序列，一种携带该DNA序列的表达载体，一种包含该DNA序列或表达载体的转化宿主细胞。这些可以通过本领域已知的方法获得。
本发明还提供一种制备脂酶的方法，是通过在有益于制备该脂酶和从培养液回收该脂酶的条件下培养转化的宿主细胞进行的。该方法可以根据本领域已知的原理进行。
脂酶活性
在中性和碱性pH条件下对三丁酸甘油酯的脂酶活性(LU7和LU9)
通过使用阿拉伯胶作为乳化剂乳化丁酸甘油酯(glycerin tributyrate)制备脂酶的底物。然后在pH-stat滴定实验中在30℃于pH 7或9进行丁酸甘油酯的水解。一单位的脂酶活性(1LU7或1LU9)等于在pH 7或9时每分钟释放1μmol丁酸的酶量。LU7也称为LU。
在中性和碱性pH条件下相对酶活性可以表示为LU9/LU7。该比值至少为2.0。
对三羧酸甘油酯的脂酶活性(SLU)
以被固定的橄榄油乳化液(Sigma catalog No.800-1)为底物，在30℃，pH 9包含40mM NaCl和5mM氯化钙的5mM Tris缓冲液中测定脂酶活性。将2.5ml底物与12.5ml缓冲液混合，调节pH到9，添加0.5ml稀释的脂酶样品。接着用pH stat滴定形成的油酸的量。
一SLU是在这些条件下每分钟释放1μmol可滴定的油酸的脂酶的量。
脂酶可以具体地具有至少4000或至少5000SLU活性/mg酶蛋白。
在碱性pH条件下，针对甘油三酯长链或短链酰基键的相对活性可以表示为SLU与LU9的比值。SLU/LU9可以至少是2.0，至少3.0或至少4.0。
首洗性能
脂酶的首洗性能如下测定：
将Style 400棉在95℃用去离子水清洗并剪成9×9cm的样品。将50μl猪油(lard)/苏丹红(0.75mg染料/g猪油)涂到样品的中心，将污染的样品在70℃加热25分钟，过夜处理。7个污染的样品在30℃Terg-O-Tometer检测洗涤机中用合有4g/L检测洗涤剂的1000ml洗涤液，在硬度为15°dH(Ca2+/Mg2+4∶1的水中洗涤20分钟，接着用水龙头的水冲洗15分钟干燥过夜。
将脂酶以每升0.25mg酶蛋白的剂量加入洗涤液中。对照没有添加脂酶变体。
污染的去除通过在首次洗涤循环之后于460nm测定消除度(remission)来进行评估，结果以减去相同条件下没有脂酶洗涤的空白的消除度所得的ΔR来表示。
检测洗涤剂
本说明书所用的检测洗涤剂具有以下组合物(重量％)：
直链烷基苯磺酸盐，C10-C13     12.6
烷基硫酸盐，C16-C18     3.2
脂肪酸，C16-C18，18∶2     0.9
脂肪醇乙氧基化物，C12-C18，6.7EO     13.2
沸石     35.2
碳酸钠     1.2
碳酸氢钠     1.3
硅酸钠     4.8
硫酸钠     1.9
四硼酸钠     2.7
膦酸酯[1-羟基乙烷-1，2-diylbis(磷酸)]     0.1
一水合过硼素钠     11.2
四乙酰乙烯二胺(TAED)     6.3
Copoly(丙烯酸/马来酸)     4.3
SRP(污物释放聚合物soil release polymer)     1.2
洗涤剂添加剂
根据发明，脂酶可以通常用作洗涤剂组合物的添加剂。该添加剂可以方便地制成为非粉状颗粒(non-dusting granulate)，稳定液，浆或防护酶(protected enzyme)。添加剂可以通过本领域已知的方法制备。
洗涤剂组合物
本发明的洗涤剂组合物可以例如制成手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适合用于污染织物的预处理的组合物，漂洗添加的织物软化剂组合物，通常家用硬表面清洁应用的以及清洗餐具所用的组合物。
本发明的洗涤剂组合物包含本发明的脂酶和表面活性剂。或者，还可任选地包含助洗剂，另外的酶，抑泡剂，软化剂，染料转移抑制剂以及洗涤剂中常规使用的其它成分诸如污物悬浮剂，污物释放剂(soil-releasingagents)，荧光增白剂，研磨剂，杀菌剂，晦暗抑制剂，着色剂和/或封装(encapsulated)或非封装香料。
本发明的洗涤剂组合物可以是液体形式的，膏状的，胶状的，棒状，片状或颗粒状形式。
pH值(在所用浓度的水溶液中测定)通常是中性的或碱性的，例如在7-11的范围，尤其是9-11范围。本发明颗粒状组合物也可以是压缩形式为550-950g/l，即它们比常规颗粒状组合物具有相对高的密度。
本发明的脂酶，或任选地掺入洗涤剂组合物中的另外的酶通常为组合物酶蛋白的0.00001％-2％(按重量算)，优选的是0.0001％-1％，更优选的是0.001％-0.5％，甚至更优选的是0.01％-0.2％。
本发明的洗涤剂组合物包含脂酶的量可以相应的是每克洗涤剂1-5,000LU，优选的是2-500LU/g，例如10-100LU/g。洗涤剂可以溶于水中以产生每升洗涤溶液包含脂酶2.5-1,500LU，尤其是10-500LU/l，例如，30-200LU/l的洗涤溶液。脂酶蛋白的量可以是每克洗涤剂0.001-10mg或每升洗涤溶液0.001-100mg。
表面活性剂系统可以包含非离子的，阴离子的，阳离子的，两性的，和/或两性离子的表面活性剂。如上所述，本发明的脂酶变体尤其适合于包含阴离子和非离子表面活性剂组合的洗涤剂，其中阴离子表面活性剂的重量百分比是70-100％而非离子表面活性剂的重量百分比为0-30％，尤其是阴离子表面活性剂为80-100％而非离子表面活性剂为0-20％。进一步地，本发明一些优选的脂酶还适合于包含40-70％阴离子和30-60％非离子表面活性剂的洗涤剂。表面活性剂按重量算通常以0.1％-60％，例如1％-40％，尤其是10-40％的水平存在。优选的是约3％-约20％。一些表面活性剂的实例在下面描述。
阴离子表面活性剂的实例是烷基硫酸盐，烷基乙氧基硫酸盐，直链烷基苯磺酸盐，烷基烷氧基化硫酸盐。
阴离子表面活性剂的实例是烷基苯酚的聚环氧烷(例如聚环氧乙烷)冷凝物，初级和次级脂肪醇和环氧乙烷的冷凝产物。烷基苯酚的聚环氧乙烷冷凝物，初级和次级脂肪醇、烷基多糖与烷基苯酚乙氧基化物和脂肪醇乙氧基化物的冷凝物。
更具体的是，本发明的脂酶可以掺入到WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，WO 98/08939和WO 97/43375中所述的洗涤剂组合物中。
实施例
实施例1：使用C-末端库(library)制备脂酶变体
制备库
目的是为了将3个额外的氨基酸加入到C-末端。将额外的氨基酸加到C末端后，与针对短链三丁酸甘油酯的活性相比，提高了针对长链三丁酸甘油酯的活性，与在pH10条件下的活性相比，抑制了pH7条件下的活性，并由此降低了洗涤期间或洗涤之后的洗涤剂中脂酶的气味。
用编码具有G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R取代的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的脂酶基因构建质粒pENi1576。
使用寡19671和991222j1(SEQ ID NO：11和12)以pENi1576为模板，总体积为100μl，利用PWO聚合酶(Boehringer Mannheim)进行PCR反应。寡991222J1在C-末端添加3个额外的氨基酸。
PCR片段在Biorad柱上纯化并且用BamHI/SacII切割。
质粒pENI1861(在PCT/DK01/00805中描述)用BamHI/SacI切割。
PCR片段和质粒载体在1％凝胶上纯化。载体和PCR片段被连接过夜，并电转化入大肠杆菌菌株DH10B，产生123,000个独立的大肠杆菌转化体。
对10个独立的克隆测序显示出满意的多样性。
自所有的克隆制备DNA-prep。
曲霉属菌株的转化和筛选
将约5μg DNA质粒转化入JaI355(在WO 00/24883中提到的)。与PEG培养20分钟后，用1.2M山梨醇，10mM Tris pH7.5洗原生质体两次(以除去CaCl2)。
将原生质体在藻酸盐溶液中混合(1.5％藻酸盐，1％葡聚糖，1.2M山梨醇，10mM Tris pH 7.5)。使用泵(Ole Dich 110ACR.80G38.CH5A)将该藻酸盐溶液从15cm高度滴入CaCl2-溶液(1.2M山梨醇，10mM Tris pH 7.5，0.2M CaCl2)。以每个次级珠(second bead)约一个转化的原生质体生成直径约2.5mm的藻酸盐珠。生成约55,000个转化体。
在珠制成之后，将它们转移到1.2M山梨醇，10mM Tris pH7.5，10mMCaCl2中30℃生长过夜。用灭菌水冲洗珠两次，之后转移到1*vogel(没有碳源，已经存在于藻酸盐珠中(葡聚糖))。将该珠于30℃培养过夜。
过夜培养后，将珠铺到含有TIDE和橄榄油的平板上(1g/L琼脂糖，0.1M Tris pH 9.0，5mM CaCl2，25ml/L橄榄油，1.4g/L TIDE，0.004％亮绿)。将平板于37℃培养过夜。
将384个阳性珠转移到四个96孔微量滴定板中，每孔包含150μl1*vogel，2％麦芽糖。
平板在34℃生长3天。
针对pnp-棕榈酸酯(pnp-valerate)和pnp-戊酸酯(pnp-palmitate)在pH7.5的活性检测培养基(如WO 00/24883所述)。对长链底物(pnp-棕榈酸酯)具有最高活性和对短链底物(pnp-戊酸酯)具有低活性的64个克隆在小平板上从培养其所用的96孔微量滴定板中分离，所述板的每个孔中包含150μl1*vogel，2％麦芽糖。
在34℃生长3天之后，再一次检测培养基针对pnp-戊酸酯和pnp-棕榈酸酯在pH7.5的活性，以及针对pnp-棕榈酸酯在pH10的活性。
有10个克隆针对pnp-棕榈酸酯在pH10显示好的活性，针对pnp-戊酸酯在pH7.5显示不好的活性。
由于在寡DNA中的缺失，一变体意外地在C-末端具有11个额外氨基酸残基而不是3个。
在第一轮中鉴定为阳性的有：
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TPA
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
再次重复曲霉属菌株筛选方法，由此鉴定出下面阳性的变体：
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LVY
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270KV
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270RHT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TAD
实施例2：评估气味和洗涤性能
对基于SEQ ID NO：2的以下脂酶变体进行评估：
N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270AGVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGG
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSS
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTP
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LVY
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270RHT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TAD
用污染有不同污物的样品进行洗涤测试：猪油(lard)/苏丹红和黄油(butter)/苏丹红。污染有猪油样品和污染有黄油的样品在70℃热处理25分钟并放置过夜。污染的样品在30℃Terg-O-Tometer检测冲洗机中用洗涤液(在硬度为15°dH的水中含有4g/L检测洗涤剂)洗涤20分钟，接着用水龙头的水冲洗15分钟干燥过夜。
以每升0.25或1.0mg酶蛋白的剂量将脂酶变体加到洗涤液中。对照没有加脂酶变体，参考试验用的是具有相同氨基酸序列而没有任何肽延伸物的脂酶。
在没有脂酶的情况下第二次洗涤样品。
如下进行性能评估：
通过感官(sensory panel)评估气味的产生，将洗涤后污染有黄油的样品保存在小瓶直到评估。
通过在首次或第二次洗涤后测定染有猪油的样品的清除度来评估洗涤性能。所有的变体在一轮洗涤测试中显示显著的性能。
用首次或二次洗涤后对染有猪油的样品的性能值除以染有黄油的样品的气味值算出利益/风险比值(benefit/risk ratio)。改善的利益/风险比值表明，洗涤性能在参考水平而气味下降时，使用脂酶剂量可以高于参考水平。
与在C-末端没有肽延伸物的相同脂酶相比，所有检测的变体都显示产生较少的气味和/或较高的利益/风险比值。
实施例3：首洗性能，在碱性/中性pH条件下的活性，对长链/短链的活性
对基于SEQ ID NO：2的下面的脂酶变体进行评估：
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGG
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSS
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
如上所述评估首洗性能，发现每个脂酶变体消除度升高(ΔR)大于3.0。
通过上述的方法测定脂酶的活性LU7，LU9和SLU。发现每个脂酶变体具有LU9/LU7的比值高于2.0并且SLU/LU9比值高于2.0。
提交原件-07.02.2002 09:30:02 AM印制
0-10-1-1 表-PCT/RO/134(EASY)关于制备使用的微生物或其他生物材料保藏的说明(PCT Rule 13bis) PCT-EASY Version 2.92(2002年01月01日修改)
0-2 国际申请号 PCT/DK02/00084
0-3 申请人或代理人文件参考 10124-WO
 11-1，1-2 以下说明涉及在说明书中提及的被保藏的微生物或其他生物材料：页行 213-19
 1-31-3-11-3-21-3-31-3-4 保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，德国2001年2月8日DSMZ 14047
 1-4 附加信息 无
 1-5 本说明所适用的国家 所有指定的国家
 1-6 另外的说明(后来提交国际局) 无
 22-1，2-2 保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 213-19
 2-32-3-12-3-22-3-32-3-4 保藏证明保藏机构名称保藏机构地址 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，德国
保藏日期保藏号 2001年2月8日(08.02.2001)DSMZ 14048
2-4 附加信息 无
2-5 本说明所适用的国家 所有指定的国家
2-6 另外的说明(这些说明以后将提交国际局) 无
33-1，3-2 保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 213-19
3-33-3-13-3-23-3-33-3-4 保藏证明保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，德国2001年2月8日(08.02.2001)DSMZ 14049
3-4 附加信息 无
3-5 本说明所适用的国家 所有指定的国家
3-6 另外的说明(这些说明以后将提交国际局) 无
44-1，4-2 保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的说明：页行 213-17
4-34-3-14-3-24-3-3 保藏证明保藏机构名称保藏机构地址 德意志微生物和细胞培养物保藏中心Mascheroder Weg lb，D-
4-3-4 保藏日期保藏号 38124 Braunschweig，德国2001年2月8日(08.02.2001)DSMZ 14051
4-4 附加信息 无
4-5 本说明所适用的国家 所有指定的国家
4-6 另外的说明(这些说明以后将提交国际局) 无
            仅用于国际局
0-5 国际局收到该表格的日期：
提交的原件-2002年2月7日09:30:02AM印制
0-5-1 被授权的官员
                          序列表
                          序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>脂酶变体
<130>10130
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>918
<212>DNA
<213>Thermomyces lanuginosus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(873)
<223>
<220>
<221>sig-peptide
<222>(1)..(66)
<223>
<220>
<221>mat-peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>1
atg agg agc tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tct gcg tgg acg gcc ttg    48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc    96
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
aat ctc ttt gca cag tat tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat    144
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
                15                  20                  25
gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc    192
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
        30                  35                  40
gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct    240
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa    288
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
ttg atc gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc    336
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc    384
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat    432
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat    480
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
cgc gtg gtg ttt acc gga cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt    528
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
gcc gga gca gac ctg cgt gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca    576
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
tat ggc gcc ccc cga gtc gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc    624
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
gta cag acc ggc gga aca ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att    672
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
gtc cct aga ctc ccg ccg cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca    720
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
gag tac tgg atc aaa tct gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat    768
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
    220                 225                 230
atc gtg aag ata gaa ggc atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct    816
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
aac att ccg gat atc cct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg    864
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
                255                 260                 265
aca tgt ctt tagtggccgg cgcggctggg tccgactcta gcgagctcga gatct      918
Thr Cys Leu
<210>2
<211>291
<212>PRT
<213>Thermomyces lanuginosus
<400>2
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
                15                  20                  25
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
         45                  50                  55
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
                255                 260                 265
Thr Cys Leu
<210>3
<211>1083
<212>DNA
<213>嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(67)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(139)..(307)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(370)..(703)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(778)..(1080)
<223>
<220>
<221>mat-peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>3
atg agg agc tcg ctc gtg ctg ttc ttc gtt tct gcg tgg acg gcc ttg    48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcc agt cct gtc cga cga g gtatgtaaat cacggggtat acttttcatg         97
Ala Ser Pro Val Arg Arg
    -5              -1
cattgcatgt cgaacctgct gtactaagat tgcgcgcaca g ag  gtc tcg cag gat  152
                                              Glu Val Ser Gln Asp
                                                              5
ctg ttt gac cag ttc aac ctc ttt gcg cag tac tcg gcg gcc gca tac    200
Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr
                10                  15                  20
tgc gcg aag aac aac gat gcc ccg gca ggt ggg aac gta acg tgc agg    248
Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Gly Asn Val Thr Cys Arg
            25                  30                  35
gga agt att tgc ccc gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac    296
Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr
        40                  45                  50
tcg ttt gag ga gtaggtgtca acaagagtac aggcacccgt agtagaaata         347
Ser Phe Glu Asp
    55
gcagactaac tgggaaatgt ag t tct gga gtt ggc gat gtc acc ggg ttc     397
                           Ser Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe
                                   60                  65
ctt gct ctc gac aac acg aac aga ctg atc gtc ctc tct ttc cgc ggc    445
Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu lle Val Leu Ser Phe Arg Gly
            70                  75                  80
tct cgt tcc ctg gaa aac tgg atc ggg aat atc aac ttg gac ttg aaa    493
Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys
        85                  90                  95
gga att gac gac atc tgc tct ggc tgc aag gga cat gac ggc ttc act    541
Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly Phe Thr
    100                 105                 110
tcc tcc tgg agg tcc gtt gcc aat acc ttg act cag caa gtg cag aat    589
Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn
115                 120                 125                 130
gct gtg agg gag cat ccc gac tac cgc gtc gtc ttc act ggg cac agc    637
Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser
                135                 140                 145
ttg ggt ggt gca ttg gca act gtg gcc ggg gca tct ctg cgt gga aat    685
Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn
            150                 155                 160
ggg tac gat ata gat gtg gtatgtagga aaaatgatcc ccgtggagcg           733
Gly Tyr Asp Ile Asp Val
        165
gtcatgtgga aatgtgcagg ggtgtctaat acacagacca acag ttc tca tat ggc   789
                                                 Phe Ser Tyr Gly
                                                     170
gct ccc cgc gtc gga aac agg gct ttt gcg gaa ttc ctg acc gca cag    837
Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln
        175                 180                 185
acc ggc ggc acc ttg tac cgc atc acc cac acc aat gat att gtc ccc      885
Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro
    190                 195                 200
aga ctc ccg cca cgc gaa ttg ggt tac agc cat tct agc cca gag tat      933
Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr
205                 210                 215                 220
tgg atc acg tct gga acc ctc gtc cca gtg acc aag aac gat atc gtc      981
Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val
                225                 230                 235
aag gtg gag ggc atc gat tcc acc gat gga aac aac cag cca aat acc      1029
Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr
            240                 245                 250
ccg gac att gct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tca atg gcg acg tgt      1077
Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Ser Met Ala Thr Cys
        255                 260                 265
ttg taa                                                              1083
Leu
<210>4
<211>291
<212>PRT
<213>嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)
<400>4
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn
                15                  20                  25
Asp Ala Pro Ala Gly Gly Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Gly Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn
            110                 115                 120
Thr Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
    140                 145                 150
Ala Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro
235                 240                 245                 250
Asn Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Ser Met Ala
                255                 260                 265
Thr Cys Leu
<210>5
<211>1070
<212>DNA
<213>Thermomvces ibadanensis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(67)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(128)..(296)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(357)..(690)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(765)..(1067)
<223>
<220>
<221>mat-peptide
<222>(67)..()
<223>
<400>5
atg cgg agc tcc ctc gtg ctg ttc ttc ctc tct gcg tgg acg gcc ttg    48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
gcg cgg cct gtt cga cga g gtatgtagca agggacacta ttacatgttg         97
Ala Arg Pro Val Arg Arg
    -5              -1
accttggtga ttctaagact gcatgcgcag cg  gtt ccg caa gat ctg ctc gac   150
                                 Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp
                                                 5
cag ttt gaa ctc ttt tca caa tat tcg gcg gcc gca tac tgt gcg gca    198
Gln Phe Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala
    10                  15                  20
aac aat cat gct cca gtg ggc tca gac gta acg tgc tcg gag aat gtc    246
Asn Asn His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val
25                  30                  35                  40
tgc cct gag gta gat gcg gcg gac gca acg ttt ctc tat tct ttt gaa    294
Cys Pro Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu
                45                  50                  55
ga  gtgggtgtcg acaaagcaca gagacagtag tagagacagc agtctaactg         346
Asp
agatgtgcag t tct gga tta ggc gat gtt acc ggc ctt ctc gct ctc gac   396
             Ser Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp
                     60                  65                  70
aac acg aat aaa ctg atc gtc ctc tct ttc cgc ggc tct cgc tca gta    444
Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val
                75                  80                  85
gag aac tgg atc gcg aac ctc gcc gcc gac ctg aca gaa ata tct gac    492
Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp
            90                  95                  100
atc tgc tcc ggc tgc gag ggg cat gtc ggc ttc gtt act tct tgg agg    540
Ile Cys Ser Gly Cys Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg
        105                 110                 115
tct gta gcc gac act ata agg gag cag gtg cag aat gcc gtg aac gag    588
Ser Val Ala Asp Thr Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu
    120                 125                 130
cat ccc gat tac cgc gtg gtc ttt acc gga cat agc ttg gga ggc gca    636
His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala
135                 140                 145                 150
ctg gca act att gcc gca gca gct ctg cga gga aat gga tac aat atc    684
Leu Ala Thr Ile Ala Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile
                155                 160                 165
gac gtg gtatgtggga agaagccacc cagacaaaca attatgtgga aacatgcaag     740
Asp Val
gatggctaat acacggtcca acag ttc tca tat ggc gcg ccc cgc gtc ggt     791
                           Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly
                               170                 175
aac agg gca ttt gca gaa ttc ctg acc gca cag acg ggc ggc acc ctg    839
Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu
        180                 185                 190
tat cgc atc acc cat acc aat gat atc gtc cct aga ctc cct cct cga    887
Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg
    195                 200                 205
gac tgg ggt tac agc cac tct agc ccg gag tac tgg gtc acg tct ggt    935
Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Val Thr Ser Gly
210                 215                 220                 225
aac gac gtc cca gtg acc gca aac gac atc acc gtc gtg gag ggc atc    983
Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp Ile Thr Val Val Glu Gly Ile
                230                 235                 240
gat tcc acc gac ggg aac aac cag ggg aat atc cca gac atc cct tcg    1031
Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ser
            245                 250                 255
cat cta tgg tat ttc ggt ccc att tca gag tgt gat tag                1070
His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Glu Cys Asp
        260                 265
<210>6
<211>291
<212>PRT
<213>Thermomyces ibadanensis
<400>6
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu
        -20                 -15                 -10
Ala Arg Pro Val Arg Arg Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp Gln Phe
    -5              -1  1               5                   10
Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Asn Asn
                15                  20                  25
His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro
            30                  35                  40
Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
        45                  50                  55
Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
    60                  65                  70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu Asn Trp Ile
75                  80                  85                  90
Ala Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp Ile Cys Ser Gly
                95                  100                 105
Cys Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
            110                 115                 120
Thr Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu His Pro Asp Tyr
        125                 130                 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Ile
    140                 145                 150
Ala Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile Asp Val Phe Ser
155                 160                 165                 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
                175                 180                 185
Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
            190                 195                 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
        205                 210                 215
Glu Tyr Trp Val Thr Ser Gly Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp
    220                 225                 230
Ile Thr Val Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly
235                 240                 245                 250
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ser His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser
                255                 260                 265
Glu Cys Asp
<210>7
<211>1064
<212>DNA
<213>Talaromyces emersonii
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(88)
<223>
<220>
<221>mat-peptide
<222>(88)..()
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(142)..(310)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(362)..(695)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(756)..(1061)
<223>
<400>7
atg ttc aaa tcg gcc gct gtg cgg gcc att gct gcc ctc gga ctg act    48
Met Phe Lys Ser Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr
                -25                 -20                 -15
gcg tca gtc ttg gct gct cct gtt gaa ctg ggc cgt cga g gtaaggaagc   98
Ala Ser Val Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Gly Arg Arg
            -10                 -5              -1
atgacggaga gaacaccctg tgcgacctgc tgacatcctt cag at gtt tct cag     152
                                                Asp Val Ser Gln
gac ctc ttc gac cag ctc aat ctt ttc gag cag tac tcg gcg gct gcg    200
Asp Leu Phe Asp Gln Leu Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala Ala
5                   10                  15                  20
tac tgt tca gct aac aat gag gcc tct gcc ggc acg gca atc tct tgc    248
Tyr Cys Ser Ala Asn Asn Glu Ala Ser Ala Gly Thr Ala Ile Ser Cys
                25                  30                  35
tcc gca ggc aat tgc ccg ttg gtc cag cag gct gga gca acc atc ctg    296
Ser Ala Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Ile Leu
            40                  45                  50
tat tca ttc aac aa gtgggtgtca cggaaaagat tgttgatacc aacatgttga     350
Tyr Ser Phe Asn Asn
        55
cgtgttgtca g c att ggc tct ggc gat gtg acg ggt ttt ctc gct ctc     398
               Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu
                        60                 65
gac tcg acg aat caa ttg atc gtc ttg tca ttc cgg gga tca gag act    446
Asp Ser Thr Asn Gln Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Glu Thr
70                  75                  80                  85
ctc gaa aac tgg atc gct gac ctg gaa gct gac ctg gtc gat gcc tct    494
Leu Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Glu Ala Asp Leu Val Asp Ala Ser
                90                  95                  100
gcc atc tgt tcc ggc tgt gaa gca cac gat ggg ttc ctt tca tcc tgg    542
Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Leu Ser Ser Trp
            105                 110                 115
aat tca gtc gcc agc act ctg aca tcc aaa atc tcg tcg gcc gtc aac    590
Asn Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Ala Val Asn
        120                 125                 130
gaa cat ccc agc tac aag ctg gtc ttc acc ggc cac agt ctc gga gcc    638
Glu His Pro Ser Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Ala
    135                 140                 145
gcc ttg gct aca ctt gga gcc gtt tct ctt aga gag agc gga tat aat    686
Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly Tyr Asn
150                 155                 160                 165
att gac ctc gtaagtttcc ggcacgggcg tcgtcatcat cgagcggaaa            735
Ile Asp Leu
gactgaccgg ttaactgcag tac aat tat ggc tgc ccc cgg gtc ggt aac acc  788
                      Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
                          170                 175
gcg ctc gca gac ttc atc acc acg caa tcc gga ggc aca aat tac cgc    836
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
gtc acg cat tcc gat gac cct gtc ccc aag ctg cct ccc agg agt ttt    884
Val Thr His Ser Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
gga tac agc caa ccg agc cca gag tac tgg atc acc tca ggg aac aat    932
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
gta act gtt caa ccg tcc gac atc gag gtc atc gaa ggc gtc gac tcc    980
Val Thr Val Gln Pro Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
act gca ggc aac gac ggc acc cct gct ggc ctt gac att gat gct cat    1028
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Ala Gly Leu Asp Ile Asp Ala His
    245                 250                 255
cgg tgg tac ttt gga ccc att agc gca tgt tcg tga                    1064
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Ala Cys Ser
260                 265                 270
<210>8
<211>299
<212>PRT
<213>Talaromyces emersonii
<400>8
Met Phe Lys Ser Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr
                -25                 -20                 -15
Ala Ser Val Leu Ala Ala Pro Val Glu Leu Gly Arg Arg Asp Val Ser
            -10                 -5              -1  1
Gln Asp Leu Phe Asp Gln Leu Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala
    5                   10                  15
Ala Tyr Cys Ser Ala Asn Asn Glu Ala Ser Ala Gly Thr Ala Ile Ser
20                  25                  30                  35
Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Ile
                40                  45                  50
Leu Tyr Ser Phe Asn Asn Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu
            55                  60                  65
Ala Leu Asp Ser Thr Asn Gln Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser
        70                  75                  80
Glu Thr Leu Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Glu Ala Asp Leu Val Asp
    85                  90                  95
Ala Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Leu Ser
100                 105                 110                 115
Ser Trp Asn Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Ala
                120                 125                 130
Val Asn Glu His Pro Ser Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu
            135                 140                 145
Gly Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly
        150                 155                 160
Tyr Asn Ile Asp Leu Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
    165                 170                 175
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Thr Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
Val Thr His Ser Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
Val Thr Val Gln Pro Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Ala Gly Leu Asp Ile Asp Ala His
    245                 250                 255
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Ala Cys Ser
260                 265                 270
<210>9
<211>1074
<212>DNA
<213>Talaromyces byssochlamydoides
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(85)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(150)..(318)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(376)..(709)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(760)..(1071)
<223>
<220>
<221>mat-peptide
<222>(85)..()
<223>
<400>9
atg ttc aaa tca act gtc cgg gcc atc gcc gcc ctc gga ctg acc tcg    48
Met Phe Lys Ser Thr Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr Ser
            -25                 -20                 -15
tca gtc ttt gct gct cct atc gaa ctg ggc cgt cga g gtaaggggca       95
Ser Val Phe Ala Ala Pro Ile Glu Leu Gly Arg Arg
        -10                 -5              -1
tgaaaactcc ctgtatggca tctcatctgg cagcatatct actgacatcc tcag at     151
                                                            Asp
gtt tcg gag cag ctc ttc aac cag ttc aat ctc ttc gag cag tat tcc    199
Val Ser Glu Gln Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser
            5                   10                  15
gcg gct gcg tac tgt cca gcc aac ttt gag tcc gct tcc ggc gcg gca    247
Ala Ala Ala Tyr Cys Pro Ala Asn Phe Glu Ser Ala Ser Gly Ala Ala
        20                  25                  30
att tct tgt tcc aca ggc aat tgc ccg ctc gtc caa cag gct ggc gca    295
Ile Ser Cys Ser Thr Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala
    35                  40                  45
acc acc ctg tat gca ttc aac aa gtgagtgtca tggaaaggct tgttggtaca    348
Thr Thr Leu Tyr Ala Phe Asn Asn
50                  55
ccgtacgggt atgttgactg tcatcag c atc ggc tct ggc gat gtg acg ggt    400
                                Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly
                                        60                  65
ttt ctt gct gtc gat ccg acc aac cga ctc atc gtc ttg tcg ttc cgg    448
Phe Leu Ala Val Asp Pro Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg
                70                  75                  80
ggg tca gag agt ctc gag aac tgg atc act aat ctc agc gcc gac ctg    496
Gly Ser Glu Ser Leu Glu Asn Trp Ile Thr Asn Leu Ser Ala Asp Leu
            85                  90                  95
gtc gat gcc tct gca atc tgt tcc ggg tgt gaa gcc cat gac gga ttc    544
Val Asp Ala Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe
        100                 105                 110
tat tcg tct tgg caa tca gtt gcc agc act ctg acc tcc caa atc tcg    592
Tyr Ser Ser Trp Gln Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Gln Ile Ser
    115                 120                 125
tcg gcc ctc tcg gca tat cca aac tac aag ctg gtc ttc acc ggc cac    640
Ser Ala Leu Ser Ala Tyr Pro Asn Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His
130                 135                 140                 145
agt ctc gga gcc gcc tta gct aca ctt gga gct gtc tct ctc agg gag    688
Ser Leu Gly Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu
                150                 155                 160
agt gga tac aat atc gac ctc gtaagttcct ggcattgcca tcatggaaag       739
Ser Gly Tyr Asn Ile Asp Leu
            165
agactcacag ttaactgtag tac aac ttt ggc tgt ccc cgg gtc ggc aac act  792
                      Tyr Asn Phe Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr
                          170                 175
gcg ctc gca gac ttt att acc aac caa acc ggt ggc aca aat tac cgg    840
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Thr Asn Gln Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Arg
180                 185                 190                 195
gta acg cat tac gag gac cct gtc ccc aag ctg cct ccc agg agt ttt    888
Val Thr His Tyr Glu Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe
                200                 205                 210
gga tac agc caa cct agc ccg gaa tac tgg atc acg tcg gga aac aat    936
Gly Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn
            215                 220                 225
gtg act gtg act tcg tcc gac atc gat gtc gtc gtg ggt gtc gac tcg    984
Val Thr Val Thr Ser Ser Asp Ile Asp Val Val Val Gly Val Asp Ser
        230                 235                 240
act gca ggc aac gac ggg acg cct gat ggc ctt gac act gct gcc cat    1032
Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Asp Gly Leu Asp Thr Ala Ala His
    245                 250                 255
agg tgg tat ttt gga cct act acc gaa tgt tcg tcg tca tga            1074
Arg Trp Tyr Phe Gly Pro Thr Thr Glu Cys Ser Ser Ser
260                 265                 270
<210>10
<211>300
<212>PRT
<213>Talaromyces byssochlamydoides
<400>10
Met Phe Lys Ser Thr Val Arg Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu Thr Ser
            -25                 -20                 -15
Ser Val Phe Ala Ala Pro Ile Glu Leu Gly Arg Arg Asp Val Ser Glu
        -10                 -5              -1  1
Gln Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Ser Ala Ala Ala
5                   10                  15                  20
Tyr Cys Pro Ala Asn Phe Glu Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ile Ser Cys
                25                  30                  35
Ser Thr Gly Asn Cys Pro Leu Val Gln Gln Ala Gly Ala Thr Thr Leu
            40                  45                  50
Tyr Ala Phe Asn Asn Ile Gly Ser Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala
        55                  60                  65
Val Asp Pro Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Glu
    70                  75                  80
Ser Leu Glu Asn Trp Ile Thr Asn Leu Ser Ala Asp Leu Val Asp Ala
85                  90                  95                  100
Ser Ala Ile Cys Ser Gly Cys Glu Ala His Asp Gly Phe Tyr Ser Ser
                105                 110                 115
Trp Gln Ser Val Ala Ser Thr Leu Thr Ser Gln Ile Ser Ser Ala Leu
            120                 125                 130
Ser Ala Tyr Pro Asn Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly
        135                 140                 145
Ala Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Val Ser Leu Arg Glu Ser Gly Tyr
    150                 155                 160
Asn Ile Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Thr Ala
165                 170                 175                 180
Leu Ala Asp Phe Ile Thr Asn Gln Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Arg Val
                185                 190                 195
Thr His Tyr Glu Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Arg Ser Phe Gly
            200                 205                 210
Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asn Val
        215                 220                 225
Thr Val Thr Ser Ser Asp Ile Asp Val Val Val Gly Val Asp Ser Thr
    230                 235                 240
Ala Gly Asn Asp Gly Thr Pro Asp Gly Leu Asp Thr Ala Ala His Arg
245                 250                 255                 260
Trp Tyr Phe Gly Pro Thr Thr Glu Cys Ser Ser Ser
                265                 270
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Oligo 19671
<400>11
ctcccttctc tgaacaataa accc                                  24
<2l0>12
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Oligo 991222J1
<220>
<221>misc_feature
<222>(50)..(57)
<223>n是C或G或T或A
<400>12
cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctgctawn nwnnwnnaag    60
acatgtccca attaacc                                                   77

Claims (23)

1.一种制备具有脂酶活性的多肽的方法，包括：
a)制备至少一种具有氨基酸序列的多肽，包括：
i)具有脂酶活性的亲代多肽和
ii)附着在亲代多肽C-末端的多肽的延伸物
b)选择具有脂酶活性的多肽，与亲代多肽相比该多肽具有：
i)对于短链和长链脂肪酰酯的活性之比较低，
ii)中性和碱性pH情况下的脂酶活性之比较低，和/或
iii)在具有该多肽的洗涤剂中洗涤有脂污物的织物样品时形成气味的倾向降低，
c)产生所选的多肽。
2.权利要求1的方法，其中亲代多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2有至少50％的同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中肽的延伸物由2-15个尤其是3-10个氨基酸残基组成。
4.权利要求1-3中的任何之一方法，其中肽的延伸物包含在位置4，5或6的带正电荷的氨基酸残基。
5.权利要求1-4中的任何之一方法，其中多肽是通过突变制备，使用编码亲代多肽的质粒和具有终止子的对应于2-15个氨基酸延伸物的寡核苷酸。
6.具有脂酶活性和氨基酸序列的多肽，包括：
i)具有脂酶活性的亲代多肽和
ii)肽的延伸物，包括附着在亲代多肽C-末端的带正电荷的氨基酸残基，带负电荷的氨基酸残基或极性氨基酸残基。
7.权利要求6的多肽，其中亲代多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2有至少50％的同一性。
8.权利要求6或7的多肽，其中与SEQ ID NO：2相比，亲代多肽包括在E1或Q249的15之内的三维结构表面带正电荷的氨基酸对电中性或带负电荷的氨基酸的取代。
9.权利要求6-8中任意之一的多肽，其中与SEQ ID NO：2相比，亲代多肽包括在相应于1-11，90，95，169，171-175，192-211，213-226，228-258或260-252的位置电中性或带负电荷的氨基酸的取代。
10.权利要求6-9中任意之一的多肽，其中与SEQ ID NO：2相比，亲代多肽包括在90-101区域中带负电荷的氨基酸与相应于E99K的取代组合。
11.权利要求6-10中任意之一的多肽，其中亲代多肽包括在相应于SEQID NO：2的E210位置上的带负电荷的氨基酸。
12.权利要求6-11中任意之一的多肽，其中亲代多肽包括在相应于SEQID NO：2的90-101区域的带负电荷的氨基酸。
13.权利要求6-12中任意之一的多肽，其中亲代多肽包括在相应于SEQID NO：2的N94位置上的中性或带负电荷的氨基酸，和/或在相应于SEQ IDNO：2的90-101区域具有负的或中性净电荷。
14.权利要求6-13中任意之一的多肽，其中肽的延伸物由2-15个尤其是3-10个氨基酸残基组成。
15.权利要求6-14中任意之一的多肽，其中肽的延伸物包括在位置4，5或6的带正电荷的氨基酸残基。
16.权利要求6-15中任意之一的多肽，其中肽的延伸物是HTPSSGRGGHR或其截短形式(尤其是HTPSSGRGG，HTPSSGR，HTPSS或HTP)，KV，EST，LVY，RHT，SVF，SVT，TAD，TPA，AGVF或PGLPFKRV。
17.一种洗涤剂组合物，包括表面活性剂和权利要求6-16任一项的多肽。
18.编码权利要求6-16中任一项的多肽的DNA序列。
19.一种携带权利要求18的DNA序列的表达载体。
20.一种转化宿主细胞，包含权利要求18的DNA序列或权利要求19的表达载体。
21.一种制备权利要求6-16任一项的多肽的方法，该方法包括在有益于制备所述多肽的条件下培养权利要求7的转化宿主细胞和从所产生的培养液中回收该多肽。
22.一种洗涤剂组合物，包括表面活性剂和脂酶，具有：
a)在本说明书的测试洗涤条件下消除度升高(ΔR)至少3，
b)对于三丁酸甘油酯在pH9和pH7的水解活性的比值(LU9/LU7)至少为2，和
c)对于橄榄油和三丁酸甘油酯的水解活性的比值(SLU/LU)至少为2。
23.一种制备洗涤剂的方法，包括：
a)测试至少一种脂酶的如下方面：
    i)在洗涤溶液中其首洗性能，
    ii)在中性和碱性pH时其相对脂酶活性，和
    iii)对甘油三酯中长链和短链酰基键的相对活性，
b)筛选具有如下特征的脂酶：
    i)在本说明书的检测条件下消除度升高至少3，
    ii)对于三丁酸甘油酯在pH9和pH7的水解活性的比值(LU9/LU7)
至少为2，和
iii)对于橄榄油和三丁酸甘油酯的水解活性的比值(SLU/LU)至少为
2，和
c)混合所选的脂酶和表面活性剂以及任选的其它洗涤成分。
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