JP2004517639A - リパーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
リパーゼのＣ末端アミノ酸にペプチド延長鎖を付加すると臭気形成傾向が弱まる。この知見は、比較的短鎖（たとえばＣ８以下）の脂肪アシル基を含む脂肪たとえばバター脂肪を含む乳製品又はやし油やパーム核油などの熱帯植物油で汚れた繊維製品を洗濯する際の臭気発生が少ないリパーゼ変異体の開発につながるであろう。
Description
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、臭気発生の可能性が小さいリパーゼ変異体に、また該変異体の製造方法に関連する。本発明は特に洗剤組成物への使用に適した変異体に、とりわけ乳脂肪で汚れた衣類の洗濯に際して一次洗浄効果と低い臭気発生傾向とを示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体に関連する。
【０００２】
発明の背景技術
リパーゼはたとえば、衣類などの繊維製品から油汚れを落とす洗剤用酵素として、パンなどベーカリー製品の生地への添加剤として有用である。たとえばサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（異名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、欧州特許第２５８０６８号及び３０５２１６号）に由来するリパーゼは洗剤用としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ商品）の商品名で販売されている。ＷＯ ００／６００６３は洗浄液中で特に優れた一次洗浄効果を発揮するサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を開示している。ＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２及びＷＯ ００／３２７５８もまたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を開示している。
【０００３】
用途次第では臭気を発生させる短鎖脂肪酸の形成を極力抑えることが重要である。たとえばリパーゼ入り洗濯洗剤では周知のように牛乳で汚れた衣類に付着した残留臭気が残ることもある（欧州特許第４３０３１５号）。
【０００４】
発明の要約
本発明者はリパーゼのＣ末端アミノ酸にペプチド延長鎖を付加すると臭気形成傾向が弱まることを発見した。この発見は、比較的短鎖（たとえばＣ８以下）の脂肪アシル基を含む脂肪たとえばバター脂肪を含む乳製品又はやし油やパーム核油などのような熱帯植物油で汚れた繊維製品を洗濯しても臭気があまり発生しないリパーゼ変異体の開発につながるであろう。そうした変異体は短鎖アシル基よりも長鎖アシル基に対する特異性が強い、及び／又は中性ｐＨよりもアルカリ性ｐＨでの活性比が大きいすなわち洗浄液のｐＨに近いアルカリ性ｐＨ（たとえばｐＨ ９又は１０）でのリパーゼ活性に比してすすぎ洗い時の中性ｐＨでのリパーゼ活性が相対的に低いであろう。
【０００５】
従って本発明は、親リパーゼのＣ末端へのペプチド延長鎖を付加し、そしてその結果得られるポリペプチドを上記のうちいずれかの性質の改善を伴うリパーゼについてスクリーニングすることによりリパーゼを生産する方法を提供する。
本発明はまた、リパーゼ活性を有し、かつリパーゼ活性をもつ親ポリペプチドと親ポリペプチドのＣ末端に付加されたペプチド延長鎖とを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
本発明はさらに、前記の性質を有するリパーゼを使用した洗剤組成物及び洗剤製造方法を提供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
親リパーゼ
親リパーゼは、配列番号：２に示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）の配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有する真菌リパーゼでもよい。
たとえば親リパーゼは、本明細書中のＤＮＡ配列を基礎にして設計されたプローブを使用してタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、特にタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の菌株から取り出してもよい。
【０００７】
より詳細には、親リパーゼは下記の生物から単離された、表示のアミノ酸配列を有するリパーゼでもよい。対応する遺伝子を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株はブダペスト条約に基づきＤＳＭＺに次のとおり寄託した：
【０００８】
【表１】
【０００９】
以上のソース生物は以下の菌株保存機構から商業ベースで自由に分譲が受けられる：
ＤＳＭＺ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ−ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＤＥ
ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ．
ＣＢＳ （Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ ８， ３５８４ ＣＴ Ｕｔｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．
ＵＡＭＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ ＆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｄｅｖｏｎｉａｎ Ｂｏｔａｎｉｃ Ｇａｒｄｅｎ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ， Ｔ６Ｇ ３ＧＩ．
【００１０】
あるいは、親リパーゼは以上のうち任意のリパーゼのアミノ酸配列を改変することにより得られる変異体、特にＷＯ ００／６００６３に記載の、又は本明細書で以下に記載する一次洗浄活性を有する変異体でもよい。
【００１１】
Ｃ 末端のペプチド延長鎖
本発明は親リパーゼのＣ末端アミノ酸への（たとえば配列番号：２に示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼのＬ２６９への）、ペプチド結合によるペプチド延長鎖の付加を提供する。このペプチド延長鎖は部位指定又はランダム突然変異誘発で付加してもよい。
Ｃ末端のペプチド延長鎖は２〜１５個のアミノ酸残基、特に２〜１１個又は３〜１０個たとえば２、３、４、５、７、９又は１１個の残基からなってもよい。
【００１２】
延長鎖は特に（本来のＣ末端から数えた）表示された位置に次の残基を有してもよい：
・ 第１位に負荷電アミノ酸残基（Ｅ又はＤなど）
・ 第２位及び／又は第３位に小さな非荷電アミノ酸残基（Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＬなど）、及び／又は
・ 第３〜７位、特に第４、５又は６位に、正荷電アミノ酸残基（Ｈ又はＫなど）。
ペプチド延長鎖はＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ、又はその短縮形たとえばＨＴＰＳＳＧＲＧＧ、ＨＴＰＳＳＧＲ、ＨＴＰＳＳ又はＨＴＰでもよい。他の例はＫＶ、ＥＳＴ、ＬＶＹ、ＲＨＴ、ＳＶＦ、ＳＶＴ、ＴＡＤ、ＴＰＡ、ＡＧＶＦ及びＰＧＬＰＦＫＲＶなどである。
【００１３】
ペプチド延長鎖は、親ポリペプチドをコードするベクター（プラスミド）とＣ末端からアミノ酸２〜１５個分の延長鎖に対応する終止コドンを有するオリゴヌクレオチドとを使用して突然変異誘発法によって付加してもよい。Ｃ末端と終止コドンの間のヌクレオチドはランダムでよいし、前述のアミノ酸の側に偏ってもよい。これを行う１つの方法は、所望のランダム突然変異を含むと同時に目的遺伝子の３末端とのハイブリダイゼーションに必要な配列を有するＤＮＡオリゴを設計することであろう。このＤＮＡオリゴは、（周知の）逆方向ＤＮＡ鎖とハイブリダイズしうるオリゴと共にＰＣＲに使用する。次いでＰＣＲ断片を所望の場（発現ベクター）にクローニングする。
【００１４】
長鎖 ／ 短鎖特異性の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比して長鎖／短鎖特異性が大きくても［たとえば長鎖（Ｃ１６−Ｃ２０）トリグリセリドに対する活性と短鎖（たとえばＣ４−Ｃ８）トリグリセリドに対する活性の比が大きくても］よい。これは基質としてのオリーブ油のＳＬＵと基質としてのトリブチリンのＬＵの比として測定されよう（測定方法については後述）。
【００１５】
アルカリ性 ／ 中性活性比の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比してアルカリ性／中性活性比すなわちアルカリ性ｐＨ （たとえばｐＨ ９〜１０）でのリパーゼ活性の中性ｐＨ （ｐＨ ７程度）での活性に対する比が大きくてもよい。これは後述のように基質としてのトリブチリンを使用して測定されよう。
【００１６】
正荷電アミノ酸による置換
親リパーゼは、配列番号：２のＥ１又はＱ２４９に対応する位置付近の非荷電又は負荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による１又は複数（たとえば２〜４、特に２）の置換を含んでもよい。正荷電アミノ酸はＫ、Ｒ又はＨでもよい。非荷電又は負荷電アミノ酸は他の任意のアミノ酸でよい。
【００１７】
前記置換は、配列番号：２のＥ１又はＱ２４９から１５Å以内の立体構造表面に、たとえば位置１〜１１、９０、９５、１６９、１７１〜１７５、１９２〜２１１、２１３〜２２６、２２８〜２５８又は２６０〜２６２のいずれかに対応する位置に存在する。
前記置換は、Ｅ１又はＱ２４９から１０Å以内、たとえば位置１〜７、１０、１７５、１９５、１９７〜２０２、２０４〜２０６、２０９、２１５、２１９〜２２４、２３０〜２３９又は２４２〜２５４のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
【００１８】
前記置換は、Ｅ１から１５Å以内、たとえば位置１〜１１、１６９、１７１、１９２〜１９９、２１７〜２２５、２２８〜２４０、２４３〜２４７、２４９、２６１〜２６２のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
前記置換は、最も好ましくはＥ１から１０Å以内、たとえば位置１〜７、１０、２１９〜２２４及び２３０〜２３９のいずれかに対応する位置に存在する。
たとえば、若干の特定の置換はＳ３Ｒ、Ｓ２２４Ｒ、Ｐ２２９Ｒ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ、Ｄ２３４Ｒ及びＴ２２４Ｒに対応する。
【００１９】
位置 ９０ 〜 １０１ 及び ２１０ のアミノ酸
親リパーゼは特に、位置９０〜１０１及び２１０の荷電アミノ酸に対する特定の制限条件を満たす場合もある。この電荷制限を満たすリパーゼは陰イオン分が高い洗剤に特に有効である。
たとえばアミノ酸２１０は負荷電でもよい。Ｅ２１０は不変のままでも、又は置換体Ｅ２１０Ｄ／Ｃ／Ｙ特にＥ２１０Ｄでもよい。
前記リパーゼは位置９０〜１０１ （特に９４〜１０１）のうちの任意の位置たとえばＤ９６及び／又はＥ９９に負荷電アミノ酸を含んでもよい。
【００２０】
さらに、前記リパーゼは位置Ｎ９４に非荷電又は負荷電アミノ酸すなわちＮ９４ （非荷電又は負荷電）たとえばＮ９４Ｎ／Ｄ／Ｅを含んでもよい。
また、前記リパーゼは領域９０〜１０１ （特に９４〜１０１）の正味電荷が負又は中立でもよい、すなわち「負荷電アミノ酸の数」が「正荷電アミノ酸の数」と同じか又は大きくてもよい。たとえば、前記領域はＬｉｐｏｌａｓｅのまま無変化で、２個の負荷電アミノ酸（Ｄ９６とＥ９９）と１個の正荷電アミノ酸（Ｋ９８）を有してもよく、１個の非荷電アミノ酸（Ｎ９４）を有してもよく、あるいは１又は複数の置換を含んでもよい。
【００２１】
あるいは３個のアミノ酸Ｎ９４、Ｎ９６及びＥ９９のうち２個が負の又は無変化の電荷を有してもよい。従って３アミノ酸がすべて無変化のままでもよいし、保存的置換又は負荷電置換により変化してもよい、すなわちＮ９４（非荷電又は負荷電）、Ｄ（負荷電）及びＥ９９（負荷電）となってもよい。例はＮ９４Ｄ／Ｅ及びＤ９６Ｅである。
さらに３個のアミノ酸Ｎ９４、Ｎ９６及びＥ９９のうち１個が置換により電荷を増して、Ｎ９４（正荷電）、Ｄ９６（非荷電又は正荷電）又はＥ９９（非荷電又は正荷電）となってもよい。例はＮ９４Ｋ／Ｒ、Ｄ９６Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｓ／Ｗ又はＥ９９Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｈである。
【００２２】
親リパーゼは、Ｅ９９Ｋに対応する置換と位置９９〜１０１に対応する領域内の１負荷電アミノ酸たとえばＤ９６Ｄ／Ｅとを含んでもよい。
非荷電アミノ酸の負荷電アミノ酸による置換（Ｎ９４Ｄ／ＤＥ）は陰イオン洗剤の性能を向上させよう。非荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による置換（Ｎ９４Ｋ／Ｒ）は陰イオン洗剤と陰イオン／非イオン洗剤（全界面活性剤中の陰イオン比率がたとえば４０〜７０％の洗剤）の両方で優れた性能を発揮する変異体リパーゼをもたらすであろう。
【００２３】
他位置のアミノ酸
親リパーゼは随意に他アミノ酸の置換を、特に１０個未満又は５個未満のそうした置換を含んでもよい。例は配列番号：２中のＱ２４９Ｒ／Ｋ／Ｈ、Ｒ２０９Ｐ／Ｓ及びＧ９１Ａに対応する置換である。周知の原理に従ってさらなる置換たとえばＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ ９４／２５５７７、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ９７／０７２０２に記載の置換を行ってもよい。
【００２４】
親リパーゼ変異体
親リパーゼは、配列番号：２に、Ｇ９１Ｇ／Ａ＋Ｅ９９Ｅ／Ｄ／Ｒ／Ｋ＋ Ｔ２３１Ｔ／Ｓ／Ｒ／Ｋ＋Ｎ２３３Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｋ＋Ｑ２４９Ｑ／Ｎ／Ｒ／Ｋに対応する置換を含んでもよい。若干の具体例は下記に対応する置換を含む変異体である：
【００２５】
【表２】
【００２６】
アミノ酸改変の命名法
本書で突然変異の識別に使用した命名法は基本的にＷＯ ９２／０５２４９に準拠している。たとえばＴ２３１Ｒは位置２３１におけるＴがＲにより置換されていることを表わす。
２７０ＰＧＬＰＦＫＲＶは配列番号：２のＣ末端（Ｌ２６９）に付加したペプチド延長鎖を表わす。
【００２７】
アミノ酸のグループ分け
本明細書ではアミノ酸を、洗剤で一般的なｐＨ １０での電荷をもとに負荷電、正荷電又は非荷電（電気的中性）に区分する。たとえば負荷電アミノ酸はＥ、Ｄ、Ｃ（システイン）及びＹ特にＥとＤである。正荷電アミノ酸はＲ、Ｋ及びＨ特にＲとＨである。非荷電アミノ酸はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ及びジスルフィド結合の一部としてのＣである。同じグループ（負荷電、正荷電又は非荷電）内の他アミノ酸による置換は保存的置換という。
非荷電アミノ酸は疎水性又は非極性（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ及びジスルフィド結合の一部としてのＣ）と親水性又は極性（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ）に分けてもよい。
【００２８】
アミノ酸の同一性
親リパーゼはサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号：２）とのアミノ酸同一性が５０％以上、特に５５％以上、６０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、９５％超又は９８％超である。
この同一性は周知のコンピュータープログラムたとえばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５） 中のＧＡＰを用いて、ポリペプチド配列比較のための設定をギャップ挿入ペナルティー３．０、ギャップ延長ペナルティー０．１として決定するのが適当であろう。
【００２９】
アミノ酸配列のアラインメント
本明細書では配列番号：２を基準にしてアミノ酸残基を識別する。他リパーゼ配列中の対応位置を求めるには、ＧＡＰアラインメントを用いて配列番号：２に該配列を合わせる。ＧＡＰはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５）に入っている。ポリペプチド配列比較には次の設定を用いる：ギャップ挿入ペナルティー３．０、ギャップ延長ペナルティー０．１。
【００３０】
ＤＮＡ 配列、発現ベクター、宿主細胞、リパーゼの産生
本発明は本発明のリパーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を収めた発現ベクター、及び該ＤＮＡ配列又は発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞を提供する。これらは周知の方法により得られよう。
本発明はまた、リパーゼの産生につながるような条件下で形質転換宿主細胞を培養し培養液からリパーゼを回収することによりリパーゼを生産する方法を提供する。該方法は周知の原理に従って実行されよう。
【００３１】
リパーゼ活性
中性及びアルカリ性ｐＨでのトリブチリンに対するリパーゼ活性 （単位： ＬＵ７及びＬＵ９）
アラビアゴムを乳化剤としてトリブチリン（グリセリントリブチラート）を乳化し、リパーゼの基質を調整する。ｐＨスタット滴定試験で３０℃、ｐＨ７又は９でのトリブチリンの加水分解を追跡する。１単位のリパーゼ活性（１ ＬＵ７又は１ ＬＵ９）はｐＨ７又は９で１μｍｏｌ酪酸毎分を遊離しうる酵素量に等しい。ＬＵ７は単にＬＵともいう。
中性及びアルカリ性ｐＨでの相対リパーゼ活性はＬＵ９／ＬＵ７として表示されよう。これは２．０以上であろう。
【００３２】
トリオレインに対するリパーゼ活性 （ 単位 ： ＳＬＵ）
安定化オリーブ油乳濁液（Ｓｉｇｍａカタログ番号８００−１）を基質として、４０ｍＭ ＮａＣｌと５ｍＭ塩化カルシウムとを添加した５ｍＭトリス緩衝液中でリパーゼ活性を３０℃、ｐＨ９で測定する。２．５ｍｌの基質を１２．５ｍｌの緩衝液と混合し、ｐＨを９に調整し、０．５ｍｌの希釈リパーゼ試料を添加し、オレイン酸形成量をｐＨスタット滴定試験で追跡する。
【００３３】
１ ＳＬＵはこれらの条件下で１μｍｏｌ滴定可能オレイン酸毎分を遊離するリパーゼ量である。
本発明のリパーゼは特に少なくとも４０００又は５０００ ＳＬＵ／ｍｇ−酵素タンパク質の活性を有するであろう。
アルカリ性ｐＨでのトリグリセリドの長鎖及び短鎖アシル結合に対する相対活性はＳＬＵ／ＬＵ９比として表示されよう。ＳＬＵ／ＬＵ９は２．０以上、３．０以上又は４．０以上であろう。
【００３４】
一次洗浄効果
リパーゼの一次洗浄効果は次の要領で測定する：
Ｓｔｙｌｅ ４００綿布を９５℃の脱イオン水で洗濯し、９×９ｃｍの小切れにカットする。各小切れの中心に５０μｌのラード／スーダンレッド（０．７５ｍｇ−色素／ｇ−ラード）を付着させ、この汚染小切れを７０℃で２５分間加熱処理し、一晩置く。７枚の汚染小切れを、硬度１５°ｄＨ （Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋ ４：１）の水に試験洗剤４ｇ／Ｌを溶かした１０００ｍｌの洗浄液（３０℃）によりＴｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ洗浄試験用洗濯機で２０分間洗濯し、次いで水道水で１５分間すすぎ洗いし、一晩干す。
【００３５】
洗浄液へのリパーゼ添加量は０．２５ｍｇ−酵素タンパク質／Ｌとする。コントロール洗浄液はリパーゼ無添加で調製する。
一次洗浄サイクル後に４６０ｎｍでの反射率を測定して汚れ落ちを評価し、その結果を、同じ条件で、ただしリパーゼ無添加で洗浄したブランクの反射率を差し引いてΔＲとして表示する。
【００３６】
試験洗剤
【表３】
【００３７】
洗剤添加剤
本発明のリパーゼは一般に洗剤組成物に添加剤として使用されよう。この添加剤は非飛散型顆粒、安定化液、懸濁液又は被防護酵素などとして調製すると好都合である。その調製法は周知である。
【００３８】
洗剤組成物
本発明の洗剤組成物はたとえば洗濯用添加剤組成物や汚れた布地の前処理用組成物を含めた手洗い及び機械洗い用洗濯洗剤組成物、、すすぎ洗い用柔軟剤組成物、及び家庭用硬質表面クリーニング・食器洗い用組成物などとして調製してもよい。
【００３９】
本発明の洗剤組成物は本発明のリパーゼと界面活性剤とを含む。また随意に、ビルダー、別の酵素、泡止め剤、柔軟剤、色移り防止剤、及び洗剤に通常使用される他の成分たとえば汚れ懸濁剤、汚れ遊離剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、変色防止剤、色素剤、及び／又はカプセル入り又は非カプセル入り香料などを含んでもよい。
【００４０】
本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、バー、タブレット又は顆粒タイプとすることができる。ｐＨ（使用濃度の水溶液で測定）は通常、中性又はアルカリ性たとえば７〜１１特に９〜１１であろう。本発明の顆粒状組成物は「コンパクトタイプ」でもよい、すなわち５５０〜９５０ｇ／ｌという通常の顆粒状洗剤よりも高密度にしてもよい。
【００４１】
本発明のリパーゼ又は随意に別のリパーゼ（酵素タンパク質）の洗剤組成物中の含量は通常、組成物重量の０．００００１％〜２％、好ましくは０．０００１％〜１％、なお好ましくは０．００１％〜０．５％、さらになお好ましくは０．０１％〜０．２％である。
本発明の洗剤組成物は１〜５，０００ ＬＵ／ｇ−洗剤、好ましくは２〜５００ ＬＵ／ｇたとえば１０〜１００ＬＵ／ｇに相当する量のリパーゼを含んでもよい。洗剤は水に溶かして、２．５〜１，５００ ＬＵ／リットル−洗浄液特に１０〜５００ ＬＵ／ｌたとえば３０〜２００ ＬＵ／ｌに相当する量のリパーゼを含む洗浄液としてもよい。リパーゼタンパク質の量は０．００１〜１０ ｍｇ／ｇ−洗剤又は０．００１〜１００ ｍｇ／ｌ−洗浄液としてもよい。
【００４２】
界面活性剤系は非イオン、陰イオン、陽イオン、両性、及び／又は双性イオン界面活性剤を含んでもよい。前述のように、本発明のリパーゼ変異体は陰イオン界面活性剤７０〜１００重量％と非イオン界面活性剤０〜３０重量％の、特に陰イオン界面活性剤８０〜１００重量％と非イオン界面活性剤０〜２０重量％の混合物を含む洗剤に特に好適である。さらに前述のように、本発明のある種の好ましいリパーゼは４０〜７０％の陰イオン界面活性剤と３０〜６０％の非イオン界面活性剤とを含む洗剤にも好適である。界面活性剤の含量は一般に０．１〜６０重量％、たとえば１〜４０重量％特に１０〜４０重量％、好ましくは約３〜約２０重量％である。以下、界面活性剤の若干例を挙げる。
【００４３】
陰イオン界面活性剤の例はアルキル硫酸塩、アルキルエトキシスルファート、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩などである。
非イオン界面活性剤の例は酸化ポリアルキレン（たとえば酸化ポリエチレン）、アルキルフェノール縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの酸化エチレンとの縮合生成物、アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの縮合生成物、アルキル多糖類、アルキルフェノールエトキシラート及びアルコールエトキシラートなどである。
さらに詳細には、本発明のリパーゼはＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５で開示されている洗剤組成物に使用してもよい。
【００４４】
実施例
実施例 １．Ｃ 末端ライブラリーを使用したリパーゼ変異体の調製
ライブラリーの創出
目的はＣ末端に３個の追加アミノ酸を付加することであった。Ｃ末端上の追加アミノ酸は短鎖トリグリセリドに対する活性に比して長鎖グリセリドに対する活性を増し、またｐＨ１０での活性に比してｐＨ７での活性を妨げ、もって洗剤中のリパーゼに起因する臭いを洗濯中及び洗濯後に減じる可能性がある。
【００４５】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に、置換Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋ Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒを導入したリパーゼをコードする遺伝子でプラスミドｐＥＮｉ１５７６を構築した。
ｐＥＮｉ１５７６を鋳型とし、オリゴ１９６７１及び９９１２２２ｊ１ （配列番号： １１及び１２）及びＰＷＯポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて全量１０μｌの反応液中でＰＣＲ反応を行った。オリゴ９９１２２ｊ１はＣ末端に３個の追加アミノ酸を付加する。
ＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄカラムで精製し、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩで切断した。
プラスミドｐＥＮＩ１８６１をＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩで切断した。
【００４６】
ＰＣＲ断片とプラスミドベクターを１％ゲルから精製した。
ベクターとＰＣＲ断片を一晩ライゲートし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂに電気穿孔法で導入して１２３，０００個の独立大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）形質転換体を生成した。
１０個の独立クローンを配列解析すると、満足な多様性を示すことが判明した。
すべてのクローンからＤＮＡを調製した。
【００４７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ の形質転換とスクリーニング
約５μｇのＤＮＡプラスミドを（ＷＯ ００／２４８８３に記載の）Ｊａｌ３５５に導入した。ＰＥＧを加えて２０分間インキュベートした後、プロトプラストを（ＣａＣｌ２の除去を目的に）１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５で２回洗った。
プロトプラストをアルギン酸塩溶液（１．５％アルギン酸塩、１％デキストラン、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５）に混ぜた。ポンプ（Ｏｌｅ Ｄｉｃｈ １１０ＡＣＲ．８０Ｇ３８．ＣＨ５Ａ）を使用して、このアルギン酸塩溶液を１５ｃｍの高さからＣａＣｌ２溶液（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．２Ｍ ＣａＣｌ２）中に滴下した。これによりおよそ２個に１個の割合で１個の形質転換プロトプラストを収めた径２．５ｍｍ程度のビーズが形成され、５５，０００個程度の形質転換体が生成した。
【００４８】
形成後のビーズを１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２に移し、３０℃で一晩培養した。ビーズを滅菌水で２回洗った後、１×ボーゲル培地（炭素源なし。炭素源はアルギン酸塩ビーズ中にデキストランとして既に存在）に移し、３０℃で一週間培養した。
一週間培養後ビーズを、ＴＩＤＥとオリーブ油を添加したプレート（１ｇ／Ｌアガロース、０．１ＭトリスｐＨ ９．０、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍｌ／Ｌオリーブ油、１．４ｇ／Ｌ ＴＩＤＥ、０．００４％ブリリアントグリーン）に塗った。プレートを３７℃で一晩培養した。
【００４９】
３８４個の陽性ビーズを、各ウェルに１５０μｌ １×ボーゲルと２％マルトースとを入れた９６穴マイクロタイタープレート×４に、移した。
プレートを３４℃で３日間培養した。
この培地をｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）とパルミチン酸ＰＮＰに対する活性のスクリーニング検査にかけた。長鎖基質（パルミチン酸ＰＮＰ）に対する最高活性及び短鎖基質（吉草酸ＰＮＰ）に対する低活性を有する６４個のクローンを小プレート上で単離し、そこから各ウェルに２００μｌ １×ボーゲルと２％マルトース入れた９６穴マイクロタイタープレートに移した。
【００５０】
３４℃で３日間培養後、培地を再びｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰとパルミチン酸ＰＮＰに対する活性並びにｐＨ１０でのパルミチン酸ＰＮＰに対する活性のスクリーニング検査にかけた。
１０個のクローンがｐＨ１０でのパルミチン酸ＰＮＰに対する高活性とｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰに対する低活性を示した。
１個の変異体は偶然にもＤＮＡオリゴに欠失が生じたために、Ｃ末端に３個ではなく１１個の追加アミノ酸残基が付加された。
【００５１】
１ 回目で陽性と判明した変異体
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＰＡ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
【００５２】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の形質転換及びスクリーニング手順を再び繰り返し、以下の変異体を陽性と判定した：
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＬＶＹ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＫＶ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＲＨＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＡＤ
【００５３】
実施例 ２．臭気と洗浄効果の評価
配列番号：２に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した：
Ｎ９４Ｋ＋Ｄ９６Ｌ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＰＧＬＰＦＫＲＶ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＡＧＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＬＶＹ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＲＨＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＡＤ
【００５４】
ラード／スーダンレッドとバター／スーダンレッドという異なる汚れを付着させた綿布の小切れを対象に洗浄試験を実施した。ラード汚染小切れとバター汚染小切れを２５分間７０℃に加熱し、一晩置いた。これらの汚染小切れを、硬度１５°ｄＨの水に試験洗剤４ｇ／Ｌを溶かした洗浄液（３０℃）によりＴｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ洗浄試験用洗濯機で２０分間洗濯し、次いで水道水で１５分間すすぎ洗いし、一晩干した。
洗浄液へのリパーゼ変異体添加量は０．２５又は１．０ ｍｇ−酵素タンパク質／リットルとした。リパーゼ変異体無添加でコントロール洗浄液を調製し、またペプチド延長鎖を欠く同一アミノ酸配列のリパーゼ変異体で基準実験を行った。
【００５５】
小切れの二次洗浄はリパーゼ無添加で行った。
以下の要領で洗浄効果を評価した：
・ 洗浄後のバター汚染小切れを検査時まで密閉バイアルに保存しておき、臭気発生をパネル官能検査で評価した。
・ 洗浄効果は一次又は二次洗浄後のラード汚染小切れの反射率を測定して評価した。いずれの変異体もこの１サイクル洗浄試験で有意の効果を示した。
・ 効果／弊害比を「ラード汚染小切れに関する一次又は二次洗浄効果」÷「バター汚染小切れに関する臭気」として計算した。効果／弊害比の改善は、基準より高レベルでリパーゼを使用すれば臭気を抑えながら基準と同レベルの効果があげられることを示唆する。
試験した変異体はいずれも、同じリパーゼＣ末端にペプチド延長鎖の付加がないものと比較して臭気発生の低減及び／又は効果／弊害比の改善を示した。
【００５６】
実施例 ３．一次洗浄効果、アルカリ性 ／ 中性 ｐＨ での活性、長鎖 ／ 短鎖活性
配列番号：２に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した：
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
前述の要領で一次洗浄効果を評価したが、各リパーゼ変異体の反射率の増分（ΔＲ）は３．０を上回ることが判明した。
リパーゼ活性は前述の方法によりＬＵ７、ＬＵ９及びＳＬＵとして測定した。各リパーゼ変異体はＬＵ９／ＬＵ７比が２．０を上回り、またＳＬＵ／ＬＵ９比が２．０を上回ると判明した。
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
発明の技術分野
本発明は、臭気発生の可能性が小さいリパーゼ変異体に、また該変異体の製造方法に関連する。本発明は特に洗剤組成物への使用に適した変異体に、とりわけ乳脂肪で汚れた衣類の洗濯に際して一次洗浄効果と低い臭気発生傾向とを示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体に関連する。
【０００２】
発明の背景技術
リパーゼはたとえば、衣類などの繊維製品から油汚れを落とす洗剤用酵素として、パンなどベーカリー製品の生地への添加剤として有用である。たとえばサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（異名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、欧州特許第２５８０６８号及び３０５２１６号）に由来するリパーゼは洗剤用としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ商品）の商品名で販売されている。ＷＯ ００／６００６３は洗浄液中で特に優れた一次洗浄効果を発揮するサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を開示している。ＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２及びＷＯ ００／３２７５８もまたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ変異体を開示している。
【０００３】
用途次第では臭気を発生させる短鎖脂肪酸の形成を極力抑えることが重要である。たとえばリパーゼ入り洗濯洗剤では周知のように牛乳で汚れた衣類に付着した残留臭気が残ることもある（欧州特許第４３０３１５号）。
【０００４】
発明の要約
本発明者はリパーゼのＣ末端アミノ酸にペプチド延長鎖を付加すると臭気形成傾向が弱まることを発見した。この発見は、比較的短鎖（たとえばＣ８以下）の脂肪アシル基を含む脂肪たとえばバター脂肪を含む乳製品又はやし油やパーム核油などのような熱帯植物油で汚れた繊維製品を洗濯しても臭気があまり発生しないリパーゼ変異体の開発につながるであろう。そうした変異体は短鎖アシル基よりも長鎖アシル基に対する特異性が強い、及び／又は中性ｐＨよりもアルカリ性ｐＨでの活性比が大きいすなわち洗浄液のｐＨに近いアルカリ性ｐＨ（たとえばｐＨ ９又は１０）でのリパーゼ活性に比してすすぎ洗い時の中性ｐＨでのリパーゼ活性が相対的に低いであろう。
【０００５】
従って本発明は、親リパーゼのＣ末端へのペプチド延長鎖を付加し、そしてその結果得られるポリペプチドを上記のうちいずれかの性質の改善を伴うリパーゼについてスクリーニングすることによりリパーゼを生産する方法を提供する。
本発明はまた、リパーゼ活性を有し、かつリパーゼ活性をもつ親ポリペプチドと親ポリペプチドのＣ末端に付加されたペプチド延長鎖とを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
本発明はさらに、前記の性質を有するリパーゼを使用した洗剤組成物及び洗剤製造方法を提供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
親リパーゼ
親リパーゼは、配列番号：２に示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）の配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有する真菌リパーゼでもよい。
たとえば親リパーゼは、本明細書中のＤＮＡ配列を基礎にして設計されたプローブを使用してタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はサーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、特にタラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミセス・イバダネンシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ）、タラロミセス・エメルソニル（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）の菌株から取り出してもよい。
【０００７】
より詳細には、親リパーゼは下記の生物から単離された、表示のアミノ酸配列を有するリパーゼでもよい。対応する遺伝子を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株はブダペスト条約に基づきＤＳＭＺに次のとおり寄託した：
【０００８】
【表１】
以上のソース生物は以下の菌株保存機構から商業ベースで自由に分譲が受けられる：
ＤＳＭＺ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ−ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＤＥ
ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ．
ＣＢＳ （Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ ８， ３５８４ ＣＴ Ｕｔｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．
ＵＡＭＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ ＆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｄｅｖｏｎｉａｎ Ｂｏｔａｎｉｃ Ｇａｒｄｅｎ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ， Ｔ６Ｇ ３ＧＩ．
【００１０】
あるいは、親リパーゼは以上のうち任意のリパーゼのアミノ酸配列を改変することにより得られる変異体、特にＷＯ ００／６００６３に記載の、又は本明細書で以下に記載する一次洗浄活性を有する変異体でもよい。
【００１１】
Ｃ 末端のペプチド延長鎖
本発明は親リパーゼのＣ末端アミノ酸への（たとえば配列番号：２に示すサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼのＬ２６９への）、ペプチド結合によるペプチド延長鎖の付加を提供する。このペプチド延長鎖は部位指定又はランダム突然変異誘発で付加してもよい。
Ｃ末端のペプチド延長鎖は２〜１５個のアミノ酸残基、特に２〜１１個又は３〜１０個たとえば２、３、４、５、７、９又は１１個の残基からなってもよい。
【００１２】
延長鎖は特に（本来のＣ末端から数えた）表示された位置に次の残基を有してもよい：
・ 第１位に負荷電アミノ酸残基（Ｅ又はＤなど）
・ 第２位及び／又は第３位に小さな非荷電アミノ酸残基（Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＬなど）、及び／又は
・ 第３〜７位、特に第４、５又は６位に、正荷電アミノ酸残基（Ｈ又はＫなど）。
ペプチド延長鎖はＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ、又はその短縮形たとえばＨＴＰＳＳＧＲＧＧ、ＨＴＰＳＳＧＲ、ＨＴＰＳＳ又はＨＴＰでもよい。他の例はＫＶ、ＥＳＴ、ＬＶＹ、ＲＨＴ、ＳＶＦ、ＳＶＴ、ＴＡＤ、ＴＰＡ、ＡＧＶＦ及びＰＧＬＰＦＫＲＶなどである。
【００１３】
ペプチド延長鎖は、親ポリペプチドをコードするベクター（プラスミド）とＣ末端からアミノ酸２〜１５個分の延長鎖に対応する終止コドンを有するオリゴヌクレオチドとを使用して突然変異誘発法によって付加してもよい。Ｃ末端と終止コドンの間のヌクレオチドはランダムでよいし、前述のアミノ酸の側に偏ってもよい。これを行う１つの方法は、所望のランダム突然変異を含むと同時に目的遺伝子の３末端とのハイブリダイゼーションに必要な配列を有するＤＮＡオリゴを設計することであろう。このＤＮＡオリゴは、（周知の）逆方向ＤＮＡ鎖とハイブリダイズしうるオリゴと共にＰＣＲに使用する。次いでＰＣＲ断片を所望の場（発現ベクター）にクローニングする。
【００１４】
長鎖 ／ 短鎖特異性の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比して長鎖／短鎖特異性が大きくても［たとえば長鎖（Ｃ１６−Ｃ２０）トリグリセリドに対する活性と短鎖（たとえばＣ４−Ｃ８）トリグリセリドに対する活性の比が大きくても］よい。これは基質としてのオリーブ油のＳＬＵと基質としてのトリブチリンのＬＵの比として測定されよう（測定方法については後述）。
【００１５】
アルカリ性 ／ 中性活性比の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比してアルカリ性／中性活性比すなわちアルカリ性ｐＨ （たとえばｐＨ ９〜１０）でのリパーゼ活性の中性ｐＨ （ｐＨ ７程度）での活性に対する比が大きくてもよい。これは後述のように基質としてのトリブチリンを使用して測定されよう。
【００１６】
正荷電アミノ酸による置換
親リパーゼは、配列番号：２のＥ１又はＱ２４９に対応する位置付近の非荷電又は負荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による１又は複数（たとえば２〜４、特に２）の置換を含んでもよい。正荷電アミノ酸はＫ、Ｒ又はＨでもよい。非荷電又は負荷電アミノ酸は他の任意のアミノ酸でよい。
【００１７】
前記置換は、配列番号：２のＥ１又はＱ２４９から１５Å以内の立体構造表面に、たとえば位置１〜１１、９０、９５、１６９、１７１〜１７５、１９２〜２１１、２１３〜２２６、２２８〜２５８又は２６０〜２６２のいずれかに対応する位置に存在する。
前記置換は、Ｅ１又はＱ２４９から１０Å以内、たとえば位置１〜７、１０、１７５、１９５、１９７〜２０２、２０４〜２０６、２０９、２１５、２１９〜２２４、２３０〜２３９又は２４２〜２５４のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
【００１８】
前記置換は、Ｅ１から１５Å以内、たとえば位置１〜１１、１６９、１７１、１９２〜１９９、２１７〜２２５、２２８〜２４０、２４３〜２４７、２４９、２６１〜２６２のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
前記置換は、最も好ましくはＥ１から１０Å以内、たとえば位置１〜７、１０、２１９〜２２４及び２３０〜２３９のいずれかに対応する位置に存在する。
たとえば、若干の特定の置換はＳ３Ｒ、Ｓ２２４Ｒ、Ｐ２２９Ｒ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ、Ｄ２３４Ｒ及びＴ２２４Ｒに対応する。
【００１９】
位置 ９０ 〜 １０１ 及び ２１０ のアミノ酸
親リパーゼは特に、位置９０〜１０１及び２１０の荷電アミノ酸に対する特定の制限条件を満たす場合もある。この電荷制限を満たすリパーゼは陰イオン分が高い洗剤に特に有効である。
たとえばアミノ酸２１０は負荷電でもよい。Ｅ２１０は不変のままでも、又は置換体Ｅ２１０Ｄ／Ｃ／Ｙ特にＥ２１０Ｄでもよい。
前記リパーゼは位置９０〜１０１ （特に９４〜１０１）のうちの任意の位置たとえばＤ９６及び／又はＥ９９に負荷電アミノ酸を含んでもよい。
【００２０】
さらに、前記リパーゼは位置Ｎ９４に非荷電又は負荷電アミノ酸すなわちＮ９４ （非荷電又は負荷電）たとえばＮ９４Ｎ／Ｄ／Ｅを含んでもよい。
また、前記リパーゼは領域９０〜１０１ （特に９４〜１０１）の正味電荷が負又は中立でもよい、すなわち「負荷電アミノ酸の数」が「正荷電アミノ酸の数」と同じか又は大きくてもよい。たとえば、前記領域はＬｉｐｏｌａｓｅのまま無変化で、２個の負荷電アミノ酸（Ｄ９６とＥ９９）と１個の正荷電アミノ酸（Ｋ９８）を有してもよく、１個の非荷電アミノ酸（Ｎ９４）を有してもよく、あるいは１又は複数の置換を含んでもよい。
【００２１】
あるいは３個のアミノ酸Ｎ９４、Ｎ９６及びＥ９９のうち２個が負の又は無変化の電荷を有してもよい。従って３アミノ酸がすべて無変化のままでもよいし、保存的置換又は負荷電置換により変化してもよい、すなわちＮ９４（非荷電又は負荷電）、Ｄ（負荷電）及びＥ９９（負荷電）となってもよい。例はＮ９４Ｄ／Ｅ及びＤ９６Ｅである。
さらに３個のアミノ酸Ｎ９４、Ｎ９６及びＥ９９のうち１個が置換により電荷を増して、Ｎ９４（正荷電）、Ｄ９６（非荷電又は正荷電）又はＥ９９（非荷電又は正荷電）となってもよい。例はＮ９４Ｋ／Ｒ、Ｄ９６Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｓ／Ｗ又はＥ９９Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｈである。
【００２２】
親リパーゼは、Ｅ９９Ｋに対応する置換と位置９９〜１０１に対応する領域内の１負荷電アミノ酸たとえばＤ９６Ｄ／Ｅとを含んでもよい。
非荷電アミノ酸の負荷電アミノ酸による置換（Ｎ９４Ｄ／ＤＥ）は陰イオン洗剤の性能を向上させよう。非荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による置換（Ｎ９４Ｋ／Ｒ）は陰イオン洗剤と陰イオン／非イオン洗剤（全界面活性剤中の陰イオン比率がたとえば４０〜７０％の洗剤）の両方で優れた性能を発揮する変異体リパーゼをもたらすであろう。
【００２３】
他位置のアミノ酸
親リパーゼは随意に他アミノ酸の置換を、特に１０個未満又は５個未満のそうした置換を含んでもよい。例は配列番号：２中のＱ２４９Ｒ／Ｋ／Ｈ、Ｒ２０９Ｐ／Ｓ及びＧ９１Ａに対応する置換である。周知の原理に従ってさらなる置換たとえばＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ ９４／２５５７７、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ９７／０７２０２に記載の置換を行ってもよい。
【００２４】
親リパーゼ変異体
親リパーゼは、配列番号：２に、Ｇ９１Ｇ／Ａ＋Ｅ９９Ｅ／Ｄ／Ｒ／Ｋ＋ Ｔ２３１Ｔ／Ｓ／Ｒ／Ｋ＋Ｎ２３３Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｋ＋Ｑ２４９Ｑ／Ｎ／Ｒ／Ｋに対応する置換を含んでもよい。若干の具体例は下記に対応する置換を含む変異体である：
【００２５】
【表２】
アミノ酸改変の命名法
本書で突然変異の識別に使用した命名法は基本的にＷＯ ９２／０５２４９に準拠している。たとえばＴ２３１Ｒは位置２３１におけるＴがＲにより置換されていることを表わす。
２７０ＰＧＬＰＦＫＲＶは配列番号：２のＣ末端（Ｌ２６９）に付加したペプチド延長鎖を表わす。
【００２７】
アミノ酸のグループ分け
本明細書ではアミノ酸を、洗剤で一般的なｐＨ １０での電荷をもとに負荷電、正荷電又は非荷電（電気的中性）に区分する。たとえば負荷電アミノ酸はＥ、Ｄ、Ｃ（システイン）及びＹ特にＥとＤである。正荷電アミノ酸はＲ、Ｋ及びＨ特にＲとＨである。非荷電アミノ酸はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ及びジスルフィド結合の一部としてのＣである。同じグループ（負荷電、正荷電又は非荷電）内の他アミノ酸による置換は保存的置換という。
非荷電アミノ酸は疎水性又は非極性（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ及びジスルフィド結合の一部としてのＣ）と親水性又は極性（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ）に分けてもよい。
【００２８】
アミノ酸の同一性
親リパーゼはサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（配列番号：２）とのアミノ酸同一性が５０％以上、特に５５％以上、６０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、９５％超又は９８％超である。
この同一性は周知のコンピュータープログラムたとえばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５） 中のＧＡＰを用いて、ポリペプチド配列比較のための設定をギャップ挿入ペナルティー３．０、ギャップ延長ペナルティー０．１として決定するのが適当であろう。
【００２９】
アミノ酸配列のアラインメント
本明細書では配列番号：２を基準にしてアミノ酸残基を識別する。他リパーゼ配列中の対応位置を求めるには、ＧＡＰアラインメントを用いて配列番号：２に該配列を合わせる。ＧＡＰはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ． １９７０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８， ４４３−４５）に入っている。ポリペプチド配列比較には次の設定を用いる：ギャップ挿入ペナルティー３．０、ギャップ延長ペナルティー０．１。
【００３０】
ＤＮＡ 配列、発現ベクター、宿主細胞、リパーゼの産生
本発明は本発明のリパーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を収めた発現ベクター、及び該ＤＮＡ配列又は発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞を提供する。これらは周知の方法により得られよう。
本発明はまた、リパーゼの産生につながるような条件下で形質転換宿主細胞を培養し培養液からリパーゼを回収することによりリパーゼを生産する方法を提供する。該方法は周知の原理に従って実行されよう。
【００３１】
リパーゼ活性
中性及びアルカリ性ｐＨでのトリブチリンに対するリパーゼ活性 （単位： ＬＵ７及びＬＵ９）
アラビアゴムを乳化剤としてトリブチリン（グリセリントリブチラート）を乳化し、リパーゼの基質を調整する。ｐＨスタット滴定試験で３０℃、ｐＨ７又は９でのトリブチリンの加水分解を追跡する。１単位のリパーゼ活性（１ ＬＵ７又は１ ＬＵ９）はｐＨ７又は９で１μｍｏｌ酪酸毎分を遊離しうる酵素量に等しい。ＬＵ７は単にＬＵともいう。
中性及びアルカリ性ｐＨでの相対リパーゼ活性はＬＵ９／ＬＵ７として表示されよう。これは２．０以上であろう。
【００３２】
トリオレインに対するリパーゼ活性 （ 単位 ： ＳＬＵ）
安定化オリーブ油乳濁液（Ｓｉｇｍａカタログ番号８００−１）を基質として、４０ｍＭ ＮａＣｌと５ｍＭ塩化カルシウムとを添加した５ｍＭトリス緩衝液中でリパーゼ活性を３０℃、ｐＨ９で測定する。２．５ｍｌの基質を１２．５ｍｌの緩衝液と混合し、ｐＨを９に調整し、０．５ｍｌの希釈リパーゼ試料を添加し、オレイン酸形成量をｐＨスタット滴定試験で追跡する。
【００３３】
１ ＳＬＵはこれらの条件下で１μｍｏｌ滴定可能オレイン酸毎分を遊離するリパーゼ量である。
本発明のリパーゼは特に少なくとも４０００又は５０００ ＳＬＵ／ｍｇ−酵素タンパク質の活性を有するであろう。
アルカリ性ｐＨでのトリグリセリドの長鎖及び短鎖アシル結合に対する相対活性はＳＬＵ／ＬＵ９比として表示されよう。ＳＬＵ／ＬＵ９は２．０以上、３．０以上又は４．０以上であろう。
【００３４】
一次洗浄効果
リパーゼの一次洗浄効果は次の要領で測定する：
Ｓｔｙｌｅ ４００綿布を９５℃の脱イオン水で洗濯し、９×９ｃｍの小切れにカットする。各小切れの中心に５０μｌのラード／スーダンレッド（０．７５ｍｇ−色素／ｇ−ラード）を付着させ、この汚染小切れを７０℃で２５分間加熱処理し、一晩置く。７枚の汚染小切れを、硬度１５°ｄＨ （Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋ ４：１）の水に試験洗剤４ｇ／Ｌを溶かした１０００ｍｌの洗浄液（３０℃）によりＴｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ洗浄試験用洗濯機で２０分間洗濯し、次いで水道水で１５分間すすぎ洗いし、一晩干す。
【００３５】
洗浄液へのリパーゼ添加量は０．２５ｍｇ−酵素タンパク質／Ｌとする。コントロール洗浄液はリパーゼ無添加で調製する。
一次洗浄サイクル後に４６０ｎｍでの反射率を測定して汚れ落ちを評価し、その結果を、同じ条件で、ただしリパーゼ無添加で洗浄したブランクの反射率を差し引いてΔＲとして表示する。
【００３６】
試験洗剤
【表３】
洗剤添加剤
本発明のリパーゼは一般に洗剤組成物に添加剤として使用されよう。この添加剤は非飛散型顆粒、安定化液、懸濁液又は被防護酵素などとして調製すると好都合である。その調製法は周知である。
【００３８】
洗剤組成物
本発明の洗剤組成物はたとえば洗濯用添加剤組成物や汚れた布地の前処理用組成物を含めた手洗い及び機械洗い用洗濯洗剤組成物、、すすぎ洗い用柔軟剤組成物、及び家庭用硬質表面クリーニング・食器洗い用組成物などとして調製してもよい。
【００３９】
本発明の洗剤組成物は本発明のリパーゼと界面活性剤とを含む。また随意に、ビルダー、別の酵素、泡止め剤、柔軟剤、色移り防止剤、及び洗剤に通常使用される他の成分たとえば汚れ懸濁剤、汚れ遊離剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、変色防止剤、色素剤、及び／又はカプセル入り又は非カプセル入り香料などを含んでもよい。
【００４０】
本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、バー、タブレット又は顆粒タイプとすることができる。ｐＨ（使用濃度の水溶液で測定）は通常、中性又はアルカリ性たとえば７〜１１特に９〜１１であろう。本発明の顆粒状組成物は「コンパクトタイプ」でもよい、すなわち５５０〜９５０ｇ／ｌという通常の顆粒状洗剤よりも高密度にしてもよい。
【００４１】
本発明のリパーゼ又は随意に別のリパーゼ（酵素タンパク質）の洗剤組成物中の含量は通常、組成物重量の０．００００１％〜２％、好ましくは０．０００１％〜１％、なお好ましくは０．００１％〜０．５％、さらになお好ましくは０．０１％〜０．２％である。
本発明の洗剤組成物は１〜５，０００ ＬＵ／ｇ−洗剤、好ましくは２〜５００ ＬＵ／ｇたとえば１０〜１００ＬＵ／ｇに相当する量のリパーゼを含んでもよい。洗剤は水に溶かして、２．５〜１，５００ ＬＵ／リットル−洗浄液特に１０〜５００ ＬＵ／ｌたとえば３０〜２００ ＬＵ／ｌに相当する量のリパーゼを含む洗浄液としてもよい。リパーゼタンパク質の量は０．００１〜１０ ｍｇ／ｇ−洗剤又は０．００１〜１００ ｍｇ／ｌ−洗浄液としてもよい。
【００４２】
界面活性剤系は非イオン、陰イオン、陽イオン、両性、及び／又は双性イオン界面活性剤を含んでもよい。前述のように、本発明のリパーゼ変異体は陰イオン界面活性剤７０〜１００重量％と非イオン界面活性剤０〜３０重量％の、特に陰イオン界面活性剤８０〜１００重量％と非イオン界面活性剤０〜２０重量％の混合物を含む洗剤に特に好適である。さらに前述のように、本発明のある種の好ましいリパーゼは４０〜７０％の陰イオン界面活性剤と３０〜６０％の非イオン界面活性剤とを含む洗剤にも好適である。界面活性剤の含量は一般に０．１〜６０重量％、たとえば１〜４０重量％特に１０〜４０重量％、好ましくは約３〜約２０重量％である。以下、界面活性剤の若干例を挙げる。
【００４３】
陰イオン界面活性剤の例はアルキル硫酸塩、アルキルエトキシスルファート、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩などである。
非イオン界面活性剤の例は酸化ポリアルキレン（たとえば酸化ポリエチレン）、アルキルフェノール縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの酸化エチレンとの縮合生成物、アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの縮合生成物、アルキル多糖類、アルキルフェノールエトキシラート及びアルコールエトキシラートなどである。
さらに詳細には、本発明のリパーゼはＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＷＯ ９７／４１２１２、ＷＯ ９８／０８９３９及びＷＯ ９７／４３３７５で開示されている洗剤組成物に使用してもよい。
【００４４】
実施例
実施例 １．Ｃ 末端ライブラリーを使用したリパーゼ変異体の調製
ライブラリーの創出
目的はＣ末端に３個の追加アミノ酸を付加することであった。Ｃ末端上の追加アミノ酸は短鎖トリグリセリドに対する活性に比して長鎖グリセリドに対する活性を増し、またｐＨ１０での活性に比してｐＨ７での活性を妨げ、もって洗剤中のリパーゼに起因する臭いを洗濯中及び洗濯後に減じる可能性がある。
【００４５】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に、置換Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋ Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒを導入したリパーゼをコードする遺伝子でプラスミドｐＥＮｉ１５７６を構築した。
ｐＥＮｉ１５７６を鋳型とし、オリゴ１９６７１及び９９１２２２ｊ１ （配列番号： １１及び１２）及びＰＷＯポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて全量１０μｌの反応液中でＰＣＲ反応を行った。オリゴ９９１２２ｊ１はＣ末端に３個の追加アミノ酸を付加する。
ＰＣＲ断片をＢｉｏｒａｄカラムで精製し、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩで切断した。
プラスミドｐＥＮＩ１８６１をＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩで切断した。
【００４６】
ＰＣＲ断片とプラスミドベクターを１％ゲルから精製した。
ベクターとＰＣＲ断片を一晩ライゲートし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂに電気穿孔法で導入して１２３，０００個の独立大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）形質転換体を生成した。
１０個の独立クローンを配列解析すると、満足な多様性を示すことが判明した。
すべてのクローンからＤＮＡを調製した。
【００４７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ の形質転換とスクリーニング
約５μｇのＤＮＡプラスミドを（ＷＯ ００／２４８８３に記載の）Ｊａｌ３５５に導入した。ＰＥＧを加えて２０分間インキュベートした後、プロトプラストを（ＣａＣｌ２の除去を目的に）１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５で２回洗った。
プロトプラストをアルギン酸塩溶液（１．５％アルギン酸塩、１％デキストラン、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５）に混ぜた。ポンプ（Ｏｌｅ Ｄｉｃｈ １１０ＡＣＲ．８０Ｇ３８．ＣＨ５Ａ）を使用して、このアルギン酸塩溶液を１５ｃｍの高さからＣａＣｌ２溶液（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．２Ｍ ＣａＣｌ２）中に滴下した。これによりおよそ２個に１個の割合で１個の形質転換プロトプラストを収めた径２．５ｍｍ程度のビーズが形成され、５５，０００個程度の形質転換体が生成した。
【００４８】
形成後のビーズを１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２に移し、３０℃で一晩培養した。ビーズを滅菌水で２回洗った後、１×ボーゲル培地（炭素源なし。炭素源はアルギン酸塩ビーズ中にデキストランとして既に存在）に移し、３０℃で一週間培養した。
一週間培養後ビーズを、ＴＩＤＥとオリーブ油を添加したプレート（１ｇ／Ｌアガロース、０．１ＭトリスｐＨ ９．０、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍｌ／Ｌオリーブ油、１．４ｇ／Ｌ ＴＩＤＥ、０．００４％ブリリアントグリーン）に塗った。プレートを３７℃で一晩培養した。
【００４９】
３８４個の陽性ビーズを、各ウェルに１５０μｌ １×ボーゲルと２％マルトースとを入れた９６穴マイクロタイタープレート×４に、移した。
プレートを３４℃で３日間培養した。
この培地をｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）とパルミチン酸ＰＮＰに対する活性のスクリーニング検査にかけた。長鎖基質（パルミチン酸ＰＮＰ）に対する最高活性及び短鎖基質（吉草酸ＰＮＰ）に対する低活性を有する６４個のクローンを小プレート上で単離し、そこから各ウェルに２００μｌ １×ボーゲルと２％マルトース入れた９６穴マイクロタイタープレートに移した。
【００５０】
３４℃で３日間培養後、培地を再びｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰとパルミチン酸ＰＮＰに対する活性並びにｐＨ１０でのパルミチン酸ＰＮＰに対する活性のスクリーニング検査にかけた。
１０個のクローンがｐＨ１０でのパルミチン酸ＰＮＰに対する高活性とｐＨ７．５での吉草酸ＰＮＰに対する低活性を示した。
１個の変異体は偶然にもＤＮＡオリゴに欠失が生じたために、Ｃ末端に３個ではなく１１個の追加アミノ酸残基が付加された。
【００５１】
１ 回目で陽性と判明した変異体
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＰＡ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
【００５２】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の形質転換及びスクリーニング手順を再び繰り返し、以下の変異体を陽性と判定した：
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＬＶＹ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＫＶ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＲＨＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＡＤ
【００５３】
実施例 ２．臭気と洗浄効果の評価
配列番号：２に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した：
Ｎ９４Ｋ＋Ｄ９６Ｌ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＰＧＬＰＦＫＲＶ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＡＧＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＳＶＦ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＬＶＹ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＲＨＴ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＴＡＤ
【００５４】
ラード／スーダンレッドとバター／スーダンレッドという異なる汚れを付着させた綿布の小切れを対象に洗浄試験を実施した。ラード汚染小切れとバター汚染小切れを２５分間７０℃に加熱し、一晩置いた。これらの汚染小切れを、硬度１５°ｄＨの水に試験洗剤４ｇ／Ｌを溶かした洗浄液（３０℃）によりＴｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ洗浄試験用洗濯機で２０分間洗濯し、次いで水道水で１５分間すすぎ洗いし、一晩干した。
洗浄液へのリパーゼ変異体添加量は０．２５又は１．０ ｍｇ−酵素タンパク質／リットルとした。リパーゼ変異体無添加でコントロール洗浄液を調製し、またペプチド延長鎖を欠く同一アミノ酸配列のリパーゼ変異体で基準実験を行った。
【００５５】
小切れの二次洗浄はリパーゼ無添加で行った。
以下の要領で洗浄効果を評価した：
・ 洗浄後のバター汚染小切れを検査時まで密閉バイアルに保存しておき、臭気発生をパネル官能検査で評価した。
・ 洗浄効果は一次又は二次洗浄後のラード汚染小切れの反射率を測定して評価した。いずれの変異体もこの１サイクル洗浄試験で有意の効果を示した。
・ 効果／弊害比を「ラード汚染小切れに関する一次又は二次洗浄効果」÷「バター汚染小切れに関する臭気」として計算した。効果／弊害比の改善は、基準より高レベルでリパーゼを使用すれば臭気を抑えながら基準と同レベルの効果があげられることを示唆する。
試験した変異体はいずれも、同じリパーゼＣ末端にペプチド延長鎖の付加がないものと比較して臭気発生の低減及び／又は効果／弊害比の改善を示した。
【００５６】
実施例 ３．一次洗浄効果、アルカリ性 ／ 中性 ｐＨ での活性、長鎖 ／ 短鎖活性
配列番号：２に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した：
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲＧＧ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳＧＲ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＨＴＰＳＳ
Ｇ９１Ａ＋Ｅ９９Ｋ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｑ２４９Ｒ＋２７０ＥＳＴ
前述の要領で一次洗浄効果を評価したが、各リパーゼ変異体の反射率の増分（ΔＲ）は３．０を上回ることが判明した。
リパーゼ活性は前述の方法によりＬＵ７、ＬＵ９及びＳＬＵとして測定した。各リパーゼ変異体はＬＵ９／ＬＵ７比が２．０を上回り、またＳＬＵ／ＬＵ９比が２．０を上回ると判明した。
【００５７】
【表４】
【表５】
【表６】
Claims (23)
- リパーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法であって、
ａ） ｉ）リパーゼ活性を有する親ポリペプチド及び
ｉｉ）該親ポリペプチドのＣ末端に付加したペプチド延長鎖
を含むアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチドを調製するステップ
ｂ）リパーゼ活性を有し、かつ親ポリペプチドに比して
ｉ）短鎖脂肪アシルエステル対長鎖脂肪アシルエステルに対する活性比が低く、
ｉｉ）中性ｐＨ対アルカリ性ｐＨでの活性比が低く、そして／又は
ｉｉｉ）脂肪で汚れた繊維製品小切れを該ポリペプチド入りの酵素で洗濯したときに異臭を形成する傾向が低い
ポリペプチドを選択するステップ、及び
ｃ）該選択されたポリペプチドを生産するステップ
を含む方法。 - 前記親ポリペプチドが配列番号：２との同一性５０％以上のアミノ酸配列を有する請求項１の方法。
- 前記ペプチド延長鎖が２〜１５個の、特に３〜１０個のアミノ酸残基からなる請求項１又は２の方法。
- 前記ペプチド延長鎖が位置４、５又は６に正荷電アミノ酸を含む請求項１〜３のいずれかの方法。
- 前記ポリペプチドが、親ポリペプチドをコードするプラスミドと２〜１５個のアミノ酸からなる延長鎖に対応する終止コドンをもつオリゴヌクレオチドとを使用して突然変異誘発法により調製される請求項１〜４のいずれかの方法。
- リパーゼ活性を有し、かつ
ａ）リパーゼ活性を有する親ポリペプチド、及び
ｂ）該親ポリペプチドのＣ末端に付加した正荷電、負荷電又は極性アミノ酸残基を含むペプチド延長鎖、
を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。 - 前記親ポリペプチドが、配列番号：２との同一性５０％以上のアミノ酸配列を有する請求項６のポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２に比べて、Ｅ１又はＱ２４９の１５オングストロ−ム（Å）以内の立体構造表面の非荷電又は負荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による置換を含む請求項６又は７のポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２に比べて、位置１〜１１、９０、９５、１６９、１７１〜１７５、１９２〜２１１、２１３〜２２６、２２８〜２５８又は２６０〜２６２のいずれかに対応する位置の非荷電又は負荷電アミノ酸の置換を含む、請求項６〜８のいずれかのポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２に比べて、位置９０〜１０１に対応する領域に、負荷電アミノ酸と組合わされたＥ９９Ｋに対応する置換を含む、請求項６〜９のいずれかのポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２の位置Ｅ２１０に対応する位置に負荷電アミノ酸を含む、請求項６〜１０のいずれかのポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２の位置９０〜１０１に対応する領域に負荷電アミノ酸を含む請求項６〜１１のいずれかのポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号：２のＮ９４に対応する位置に非荷電又は負荷電アミノ酸を含み、そして／又は配列番号：２の位置９０〜１０１に対応する領域に負の又は電気的に中性の正味電荷を含む、請求項６〜１２のいずれかのポリペプチド。
- 前記ペプチド延長鎖が、２〜１５個の、特に３〜１０個のアミノ酸残基からなる、請求項６〜１３のいずれかのポリペプチド。
- 前記ペプチド延長鎖が、位置４、５又は６に正荷電アミノ酸を含む、請求項６〜１４のいずれかのポリペプチド。
- 前記ペプチド延長鎖が、ＨＴＰＳＳＧＲＧＧＨＲ又はその短縮形（特にＨＴＰＳＳＧＲＧＧ、ＨＴＰＳＳＧＲ、ＨＴＰＳＳ又はＨＴＰ）、ＫＶ、ＥＳＴ、ＬＶＹ、ＲＨＴ、ＳＶＦ、ＳＶＴ、ＴＡＤ、ＴＰＡ、ＡＧＶＦ又はＰＧＬＰＦＫＲＶである、請求項６〜１５のいずれかのポリペプチド。
- 界面活性剤と請求項６〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドとを含む洗剤組成物。
- 請求項６〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
- 請求項１８のＤＮＡ配列を収めた発現ベクター。
- 請求項１８のＤＮＡ配列を又は請求項１９の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
- 請求項６〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの産生につながるような条件下で請求項２１の形質転換宿主細胞を培養するステップと培養液からポリペプチドを回収するステップとを含む方法。
- 界面活性剤と、
ａ）反射率の増分（ΔＲ）が本明細書に記載の試験洗浄条件で３以上であり、
ｂ）トリブチリンに対するｐＨ９とｐＨ７での加水分解活性の比（ＬＵ９／ＬＵ７）が２．０以上であり、かつ
ｃ）オリーブ油とトリブチリンに対する加水分解活性の比（ＳＬＵ／ＬＵ）が２．０以上である
リパーゼとを含む洗剤組成物。 - 洗剤の製造方法であって、
ａ）１以上のリパーゼについて
ｉ）洗浄液中での一次洗浄効果、
ｉｉ）中性及びアルカリ性ｐＨでの相対リパーゼ活性、及び
ｉｉｉ）トリグリセリドの長鎖及び短鎖アシル結合に対する相対活性、
を試験するステップ、
ｂ） ｉ）反射率の増分（ΔＲ）が本明細書に記載の試験洗浄条件で３以上であり、
ｉｉ）トリブチリンに対するｐＨ９とｐＨ７での加水分解活性の比（ＬＵ９／ＬＵ７）が２．０以上であり、かつ
ｉｉｉ）オリーブ油とトリブチリンに対する加水分解活性の比（ＳＬＵ／ＬＵ）が２．０以上である
リパーゼを選択するステップ、及び
ｃ）選択したリパーゼを界面活性剤及び随意に他の洗剤成分と混和するステップ、
を含む方法。
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