JPH06507071A

JPH06507071A - 安定化酵素

Info

Publication number: JPH06507071A
Application number: JP4509154A
Authority: JP
Inventors: スベンセン，アラン; ボン　デル　オステン，クラウス; クラウセン，イブ　グロト; パトカル，シャムカント　アナント; ボルシュ，キム
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-05-01
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 1994-08-11
Also published as: DK0585285T3; WO1992019726A1; FI934812A; EP0585285A1; DE69226636T2; FI934812A0; ES2121854T3; ATE169678T1; DE69226636D1; US5914306A; EP0585285B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】安定化酵素技術分野本発明は、新規な安定化酵素に関する。更に詳しくは、本発明ｔま新規な安定化酵素に関し、ここに於て天然に発生するアミノ酸残基（プロリン以外）が１個所またはそれ以上の位置でプロリン残基で置換されており；その位置で２面角φ（ファイ）は間隔内の値（−９０”　＜φ＜　−４０’　）を構成し；好ましくは２面角φ（ファイ）およびψ（サイ）は間隔内の値〔−９０°くφ＜−４０°〕および［−１８０＜ψ＜−１５０＠または−８０＜中〈１０または１００〈市〈１８０］を構成し；そしてその位置は酵素がα−ヘリ・ンシスまたはβ−シート構造を有することを特徴とするところの領域内には位置してし）ない。

本発明はまた、新規な安定化酵素をコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび宿主生物に関する。本発明はまた、安定化酵素を含んでなる洗剤組成物に関する。

背景技術 ■亘！箆導遺酵素は、球状蛋白質でありそして長いポリペプチド鎖の相当量の折りたたみのために全くコンパクトである。ポリペプチド鎖番よ、「主鎖」とその「側鎖基」から本質的に成っている。ペプチド結合は平面であるので、Ｃα−Ｎ軸とＣα−Ｃ ′軸の周りの回転のみ力（許される。ペプチド主鎖のＣα−Ｎ結合の周りの回転は、ねじれ角φ（ファイ）によって表示され、Ｃα−Ｃ°結合の周りの角しよψ （サイ）によって表示される〔例えば、フライグトン、Ｔ、　Ｅ、（１９８４）。

蛍白ｆ；ｗ、ｕ、フリーマン　アンド　カンパニー、ニューヨーク〕。

これらの回転角度の値の選択は、＋１８０°の最大値（これは−１８０゜に等しい）を最大限度に拡げた鎖に設定することにより行なわれる。

十分に拡げたポリペプチド鎖に於て、Ｎ、ＣαおよびＣ′原子は全て互いに「トランス」である、「シスＪ立体配置に於て、角度φおよびψは０°の値に設定される。

回転される結合の背後に見られる原子が「反時計回りに」移動するような、結合の周りの位置からの回転は定義により負の値と定められ、これらの「時計回り」は正の値と定められる。従って、ねじれ角度の値は、−１８０°〜＋１８０°の範囲内にある。

Ｃα一原子は、鎖に対して回り継ぎ手の点であるからＣα一原子と結合した側基（Ｒ基）は、分子の立体配座に関して極めて重要である。

語句「コンホメーション」は、蛋白質の全体構造を造形することに於けるポリペプチド鎖の二次および三次の構造の関与を明らかにする。蛋白質の正しいコンホメーションは、蛋白質の特異的構造に対し、第一に重要でありそして酵素の独得の触媒作用（すなわち、活性および特異性）およびそれらの安定化に大きく寄与する。

ポリペプチドのアミノ酸は、４つの総括的群：非極性、電荷のない極性、および負もしくは正に荷電した極性アミノ酸に分けることができる。蛋白質分子は、それが通常生しるところのその水性環境内に浸漬された場合、最大数のその極性側鎖基を周囲環境にさらす傾向にあり、一方大多数のその非極性側鎖基は内側に配向する。このような方法での側鎖基の配向は、蛋白質のコンホメーションの安定性に至る。

従って、蛋白質は折りたたまれかつ規制された状態および折りたたまれずかつ規制されない状態間で動的平衡状態で存在する。この平衡は、ポリペプチド鎖の異なるセグメント間で短い連なりの相互作用を反映しており、これは蛋白質の全体の構造を安定化させる傾向にある。熱力学的力が折りたたまれていない分子の無作為化を同時に促進する傾向にある。

安定化蛋白質を工学的に作り出すための方法は、ポリペプチド主鎖の柔軟性を減少させることにより、そして同時に未折りたたみ鎖のエントロピーを減少させることにより未折りたたみの程度を減少させることである。これまで掻くわずかの試みが、新規な安定化酵素の開発に於てこの原理的説明を遂行するためなされてきた。

蛋白質の熱安定性を増加させる一般的原理が提供された〔鈴木。

Ｙ、（１９８９）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、Ｈ６５Ｓｅｒ、　Ｂ　）　、この文献中、鈴木は次のように述べている二球状の蛋白質の熱安定性は、二次および三次構造に於て並びに酵素の触媒的機能に於て、著るしい変更がなく、β−ターン（ｔｕｒｎｓ）の第二の部位でプロリンの発生頻度を増加させることにより大程度まで累積的に増加できる。原理は、種々の事実と発見に基づいており、これらの内でプロリン残基がβ−ターンの第二の部位で優先的に発生する強い傾向を示す事実に基づいている〔レビッティ、　Ｍ　（１９７８）　；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　；　１７４２７７−４２８５　；およびチョウ、　ｐ、　ｙ、アンド　ファスマン、　Ｇ、　Ｄ　（１９７７）　；　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、；　１１５１３５−１７５）　、原理は、蛋白質に於けるβ−ターンの第二の部位への蛋白質の挿入に制限され、他の部位は言及されていない。

国際公開−０８９１０１５２０（シータス社、米国）は、蛋白質の未折りたたみの立体配置のエントロピーを減少させることにより蛋白質の安定性を増加するための方法を提供する。この方法はストレプトマイセス　ルビキノサス　キシロースイソメラーゼに適用され、そしてそれは予見した置換部位でプロリンによるアミノ酸の置換、またはアラニンによるグリシンの置換を含む。

本発明の目的は、改良された安定性を有する酵素を提供することにある。

発明の要約本発明は新規な安定化酵素を提供し、ここに於て天然に発生するアミノ酸残基（プロリン以外）が１個所またはそれ以上の位置でプロリン残基で１換されており；その位置で２面角φ（ファイ）は間隔内の値〔−９０°〈φ＜−４０°〕を構成し；好ましくは２面角φ（ファイ）およびψ（サイ）は間隔内の値（−９０” 　＜φ＜　−４０”　）および（−１８０＜ｔＰ＜−１５０”または−８０＜ψ ＜１０または１ｏＯ〈ψ＜１８０　）を構成し；そしてその位置は酵素がα−ヘリックスまたはβ−シート構成を有することを特徴とするところの領域内には位置していない。

他の面に於て、本発明は新規安定化酵素をコードするヌクレオチド配列、これらのヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターおよびこれらの発現ベクターを含有する宿主生物に関する。

Ｍ−粟本発明に於て、プロテアーゼは別にしていかなる酵素であってよく、例えばリパーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、キシラナーゼ又はアミラーゼの如き酵素である。

ヱ亙ス匁アミノ酸に対する略記号として次の記号が用いられる：Ａ　−Ａｌａ　＝　アラリンＣ＝　Ｃｙｓ　＝　システィンＤ　−Ａｓｐ　−アスパラギン酸Ｅ　＝　Ｇｌｕ　＝　グルタミン酸Ｆ　＝　Ｐｈｅ　−フェニルアラニンＧ　＝　ｃｒｙ　−グリシンＨ＝　旧Ｓ　＝　ヒスチジン１　干　ｌｉｅ　−イソロイシンＫ　コ　Ｌｙｓ　−リシンＬ　＝　Ｌｅｕ　−ロイシンＭ　＝　Ｍｅｔ　−メチオニンＮ　＝　Ａｓａ　ｍ　アスパラギンＰ　＝　Ｐｒｏ　−プロリンＱ　＝　Ｇｉｎ　准　グルタミンＲ＝　Ａｒｇ　＝　アルギニンＳ　＝　Ｓｅｔ　冨　セリンＴ　−Ｔｈｒ　＝　トレオニンＶ　＝　Ｖａｌ　−バリンＷ　−Ｔｒｐ　＝　）リプトファンＹ　寓　Ｔｙｒ　寓　チロシン１３　＝　Ａｓｘ　−Ａｓｐ（Ｄ）またはＡｓｎ　（Ｎ）Ｚ　＝　Ｇｌｘ　−Ｇｌｕ（Ｅ）またはＧｉｎ　（Ｑ）Ｘ　−任意のアミノ酸９−　アミノ酸の欠失または不存在鼠墓変ｌ生本発明の安定化酵素は、酵素変異体または突然変異酵素である。

酵素変異体又は突然変異酵素は、新遺伝子またはその誘導体のＤＮＡヌクレオチド配列の改変によって得ることのできる酵素を意味する。

酵素変異体又は突然変異酵素は、酵素をコードするＤＮＡヌクレオチド配列を適当な宿主生物内の適当なベクターに挿入する時発現されそして生産され得る。宿主生物は、親遺伝子が由来する生物と番よ必ずしも同一でない。

アミノ酸の番号付本発明に関連して、アミノ酸残基の位置の特異的番号付が用ｐｚられる。

本発明に従って生産されるか又は意図される種々の酵素の記載において、参照を容易にするため次の命名が用いられた：〔元のアミノ酸；位置；置換アミノ酸〕これによれば、位置２２５でのグリシンのプロリンによる置換番よＧ２２５Ｐとして示される。

もしも置換、例えばＧ２２５Ｐが、例えばフミコラ　ラヌギノサリノく一ゼ内の変異によってなされる場合、生成物は「フミコラ　ラヌギノサ／Ｇ２２５Ｐ　リパーゼ」と称される。

■墓造血本発明に関連して、リパーゼの酵素活性はリパーゼ単位で表わされる。リパーゼ単位（ＬＵ’）は、標準条件下、すなわち３０．０°Ｃ；ｐ）！７．０；トリブチリン基質のもと毎分１μｓ＋ｏｌの滴定し得る酪酸を遊離する酵素の量である。

この分析方法を記載する折りたたんだ印刷物ＡＦ　９５／　５はノボノルディスク（テンマーク）に要求することにより入手可能であり、この印刷物は参考のため本明細書に導入される。

本発明に関連して、セルラーゼの酵素活性はノボセルラーゼ単位（ＮＣ１ｌ）で表わされる。１単位は、標準条件下（すなわち、ｐＨ４，８０で；０、ＩＭのアセテート緩衝液；基質として１０ｇ／ｌの）＼−キュレフ！、Ｃ？ＩＣタイプ７ＬＦ［ｌ　；　４０．０°Ｃのインキュベーション温度；２０分のインキュベージラン時間；および約０．０４１　ＮＣＵ／＋１の酵素濃度）、毎分ｌμｌ１ｏｌのグルコースに相当する還元炭水化物の量を形成する酵素の量として定義される。この分析方法を記載する折りたたんだ印刷物は、ノボノルディスクＡ／Ｓ　（テンマーク）に要求することにより入手可能であり、この印刷物は参考のため本明細書に含まれる。

図面の簡単な説明本発明を更に添付の図面により説明する：図１（シー）　１　／１７〜９／１７）は、フミコラ　ラヌギノサリバーゼの発現カセットのヌクレオチド配列を示す；図２は、プラスミドｐＡｌｌＬの制限地図を示す；図３−４は、フミコラリパーゼ変異体を生産するためのＰＣＲ技術を示す；図５（シート１３／１７〜１４／１７）は、ヨーロッパ特許出１１３０５．２１６に従って得られる、フミコラ　ラヌギノサリバーゼのアミノ酸配列（および対応するＤＮＡヌクレオチド配列）を示す；図６　（シート１５／１７〜１６／１７）は、国際公開−０９１／１７２４３に従って得られるフミコラ　インソレンス　セルラーゼのアミノ酸配列を示す；そして図７は、野生型酵素（ロ）と比較して本発明のフミコラ　ラヌギノサ／Ｇ２２５Ｐリパーゼ（◆）の７０°ＣおよびｐＨ７での安定性を示す。

発明の詳細な開示本発明は新規な安定化酵素を提供し、ここに於て天然に発生するアミノ酸残基（プロリン以外）が１個所またはそれ以上の位置でプロリン残基で置換されており；その位置で２面角φ（ファイ）は間隔内の値〔−９０°くφ〈−４０°］を構成し；好ましくは２面角φ（ファイ）およびψ（サイ）は間隔内の値〔−９０＠＜φ〈−４０°〕および（−１８０＜ψ＜−１５０”または−８０〈重く１０または１００〈ψ＜１８０　）を構成し；そしてその位置は酵素がα−ヘリ・ンシスまたはβ−シート構成を有することを特徴とするところの領域内には位置していない。

本発明に関連して、本発明の安定化酵素は酵素変異体又は改変酵素であり、天然に生ずる酵素と機能的に等価であるか又はそれに類似の構造上の特徴を有しており、そしてこの酵素において、天然に発生するアミノ酸残基（プロリン以外）が１個所またはそれ以上の位置でプロリン残基で置換されており；その位置で２面角φ（ファイ）は間隔内の値（−９０”　＜φ＜−４０°］を構成し；好ましくは２面角φ（ファイ）および重（サイ）は間隔内の値〔−９０°くφ〈−４０° 〕および（−Ｈ３ｏ　＜ψ＜−１５０’または−８０〈申＜１０または１００＜ ψ＜１８０　）を構成し；そしてその位置は酵素がα−へリノシスまたはβ−ソート構成を有することを特徴とするところの領域内には位置していない。

更に、本発明に関連して、安定化酵素は例えば粗酵素と比較した場合熱安定性、貯蔵安定性に関して改善された安定性を有する酵素である。

蛋白質の二次構造の規定本発明の安定化酵素は、対象の酵素を二次構造のための分析に委ね、間隔〔−９０°くφ〈−４０°〕に限定された２面角φ（ファイ）を有する酵素、好ましくは間隔〔−９０°〈φ〈−４０°〕およびＣ−１８０°くψ＜−１５０°又は− ８０〈ψ＜１０又は１００〈ψ＜ｔ８０　）に限定された２面角φ（ファイ）およびψ（サイ）を有する酵素内の残基を同定し、酵素がα−ヘリックス又はβ− シート構造を有することを特徴とする領域に位置する残基を除外し、もしもプロリン残基が既に同定された位置にない場合、天然発生アミノ酸残基を好ましくは対象の酵素をコードする遺伝子に適用される部位特異的変異誘発により、同定された位置でプロリン残基で置換し、次いで適当な宿主生物中で安定化酵素をコードする遺伝子を挿入することにより遺伝子発現させ、引続き適当な栄養培地中で該宿主生物の培養を行い次いで目的の酵素を回収することにより得ることができる。

安定化酵素を得る方法は、対象の酵素を二次構造用の分析に委ねることを含む。

このような分析を行うための一つの方法において、酵素の原子構造が明らかにされねばならない、原子構造はＸ線回線技術により決定できる。Ｘ線回折技術は、例えばヘンドリックソン〔ヘンドリックソン、　Ｗ、　Ａ、（１９８７）　；　Ｘｉ回回折蛋白質工学における（編集者：オフセンデル、　Ｄ、　Ｌ　アンド　フォックス、　Ｃ，Ｆ、　）第１章；アランＲ，リス社〕およびクライクトン〔クライクトン。

Ｔ、　Ｅ、同上；第６章〕によって記載されている。

リゾムコール　マイへイリパーゼの結晶構造は推論されており〔ブラディし、、バゾゾヴイスキーＡ、？１．．デレヴエンダＺ、Ｓ、、ドードソンＥ、、ドードソンＣｔ、、）シーＳ、ｌ　ターケンベルクＪ、Ｐ、、クリスチアンセンし、、フーゲーヤンセン８．１　ノルスコブＬ、　チムＬ、　アンドメンゲ［１（１９９０）　；　ｒセリンプロテアーゼトリアドＪ　（ｔｒｉａｄ）は、トリアジルグリセロール　リパーゼの触媒中心を形成する」、ネーチアー、　Ｖｏｌ、３４３６２６０７６７−７７０参照〕、そして同等物が寄託さレテオりそしてプルツクバーヘン蛋白質データバンク〔ブックスティン等（１９７７）　；　Ｊ、門ｏ１．８ｉｏ＋、　１１２５３５−５４２　）から入手可能である。

原子構造が決定されると、原子配位から２面角をコンピュータ処理することが可能である。更に、二次構造元素を設定することが可能である。二次構造元素は、水素結合を基礎にして規制される。協調的二次構造は元素の水素結合パターン、「ターン（ｔｕｒｎ）　Ｊおよび「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）　Ｊの繰り返しとして認識される。繰り返しターンは「ヘリックス（ｈｅｌ　１ｘｅｓ）　Ｊであり、繰り返しブリッジは「ラダーズ（ｌａｄｄｅｒｓ）　Ｊであり、結ばれたラダーズは「シート（ｓｈｅｅｔｓ）　」である。

二次構造元素用の分析は、原子配位から抽出される構造割り当ておよび幾可的特徴のコンピューター処理される編集を要求する。原子配位に基礎をおいた、蛋白質の二次構造を明らかにするための通常の方法は、カブシエおよびサンプルによって記載されている〔カブシエ、胸、およびサンプル、　Ｃ，（１９８３）　：　Ｂｉｏｐｏｌｙ＋＊ｅｒｓ、　２２２５７７−２６３７）　、この文献において、パターン認識方法により原子配位から構造上の特徴を抽出するアルゴリズムが提供される。最初に、水素結合が水素結合基の対間の静電気の相互作用に基づいて同定される。

次に、水素結合パターンが、ターンズ（ｔｕｒｎｓ）　（Ｔ）　、ベンズ（ｂｅｎｄｓ）（Ｓ）、ブリッジズ（ｂｒｉｄｇｅｓ）　（Ｂ）　＋　ヘリックシス（ｈｅｌｉｃｅｓ（Ｇ、　Ｈ，Ｉ）。

β−ラダーズ（ｌａｄｄｅｒｓ）　（Ｅ）およびβ−シーツ（ｓｈｅｅｔｓ）　（Ｅ）の如き二次構造要素を規制するために用いられる。

カブシェ　アンド　サンプルのファイルのコンピューター操作を可能としかつ標準のＰＡＳＣＡＬで書かれているコンピュータープログラムＤＳＳＰ　（Ｄｅｆｉｎｅ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、プロティン　データ　バンク、化学部門、プルツクバーベン　ナシッナルラボラトリー、アブトーン、ニューヨーク州、　１１９７３から入手可能である。

二次構造の分析および２面角の計算は、他の方法により、例えばモデル　ビルディングにより〔例えば、スクリフエ、ハニーフ、カルネ−およびプルデル（１９８７）　；　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　１（５）　３７７− ３８４参照〕、行うこともできる。

アミノ酸に対する２面角φ（ファイ）およびψ（サイ）を、結晶酵素中の原子構造に基づいて計算した後、プロリン残基による置換に対して好ましい２面角ファイおよびサイを有する位置を選択することが可能である。プロリン残基の脂肪族側鎖は、ペプチド基の窒素原子に共有結合している。従って、得られた環状５員環は、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合の回りの回転に硬直な拘束を負わせておりそして主ＳＩＮ−原子に対する水素結合の形成を同時に妨げげる。これらの構造上の理由により、プロリンは一般にα−ヘリカルおよびβ−シート二次コンフォメーションと適合しない、Ｃα−Ｎ結合の回りの同じ回転拘束のため、および鎖中の隣接するアミノ酸が妨害されないという要求のため、２面角ファイおよびサイ（および特にファ伺の大きさは、ペプチド中のプロリン残基に対する制限された間隔に限定される。ポリペプチド中のプロリン残基に対する２面角は、殆ど独占的に間隔（−９０’　＜φ＜−４ｏ’）、好ましくは間隔（−９０”　＜　１　＜−４０°〕オヨび（−１８０’　＜？＜−１５０”又バー８０くψ＜１０又は１００＜ψ＜１８０　）内にある。これに関連して、シス−およびトランス−残基が考えられる。

プロリン残基は上記の手順によって指摘される１又はそれ以上の位置ですでに生じているがもじれない、そして置換は、もちろん、不適切である。もしそうでなければ、方法はプロリン残基による天然に発生するアミノ酸残基の置換を含む。

この方法を、ヨーロッパ特許用１ａｉ３０５，２１６に記載された如く得られたフミコラ　ラヌギノサリバーゼについて行うとき、表１に掲げた位置が明らかにされる。この方法を国際公開−０９１／１７２４３に記載した如く得られたりシムコール　インソレンス　セルラーゼについて行うとき、表２に掲げた位置が明らかにされる。

確かにあらゆる予知された位置でプロリンへの置換が、酵素の改良された安定性をもたらすであろうことば期待できない、方法により明らかにされた位置の幾つがで、プロリン残基への天然に発生するアミノ酸残基の置換は、予言できない因子、例えば本質的な柔軟性の損失、水素結合の可能性の損失、予言できない立体障害等のために不安定を引きおこし得る。このような「臨界的サイト」は必ずしも予言できるとは限らない。

しかし、個々の置換の安定化（又は不安定化）効果が付加されたものであることば期待できる〔例えば、ウェルス、　Ｊ、　Ａ、　（１９９０）　；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　；　２９　（３７）　８５１０−８５１７参照）。

狂１旦公鼓素好ましくは、本発明の酵素は安定化リパーゼ、安定化セルラーゼ、安定化ペルオキシダーゼ、安定化キシラナーゼ、又は安定化アミラーゼである。

一つの面に於て、本発明の酵素は安定化リパーゼであり、このリパーゼはフミコラ属、リゾムコール属、カンジダ属又はシュードモナス属の構成員から得ることができる。

本発明の特異的態様に於て、酵素は安定化リパーゼであり、このリパーゼはフミコラ　ラヌギノサ、リゾムコール　マイヘイ、カンジダ　アンタルクチ力、又はシュードモナス　セパシアの株から得ることができる。フミコラから得ることのできるリパーゼは、例えばヨーロッパ特許用＠３０５，２１６および国際公開− ０８９１０１９６９に記載されている。好ましくは、リパーゼはフミコラ　ラヌギノサリパーゼであり、このリパーゼはヨーロッパ特許用１ｍ１３０５．２１６に記載した如く得られる。

本発明の他の特異的態様に於て、酵素は安定化リパーゼであり、このリパーゼはフミコラ属の構成員から得ることができ、この安定化リパーゼは表１に掲げた位置、又はそれに対して類領の位置の１又はそれ以上でプロリン残基への置換を含む、好ましくは、酵素は安定化リパーゼであり、このリパーゼはフミコラ　ラヌギノサの株から得ることができる。

更に他の特異的態様に於て、本発明の酵素は安定化リパーゼであり、このリパーゼはフミコラ属の構成員から得ることができ、この安定化リパーゼは１又はそれ以上の次の置換：　Ａ２ＢＰ、　Ｇ６１Ｐ、　Ｎｌ０ＩＰ。

５１０５Ｐ、　ＤＩＩＩＰ、　Ｄ１６５Ｐ、　Ｒ２０９Ｐ、　Ｇ２２４Ｐ、　Ｇ２２ＳＰ、　Ｔ２２６Ｐ、　Ｒ２３２Ｐ、　Ｎ２３３Ｐ。

１２４１Ｐ、　Ｔ２４４Ｐ、（図５に示されるアミノ酸配列による）又はそれに対する１７１４ｍの位置での置換を含んでなる。好ましくは、酵素は安定化リパーゼであり、リパーゼはフミコラ　ラヌギノサの株から得ることができる。

より特異的面に於て、本発明の酵素はフミコラ　ラヌギノサ／Ｇ２２５Ｐ　リパーゼ又はフミコラ　ラヌギノサ／Ｔ２２４Ｐリパーゼである。

ｌ−上ファイおよびサイ角度に基づいたフミコラ　ラヌギノサリパーゼに於いて提案されたプロリン変異体ＭＬｖ−９０’　＜　７　ｙ　イ＜　−４０°　；αヘリックス又はβシート構造のいずれの部分でもない他の面に於て、本発明の酵素は安定化セルラーゼであり、このセルラーゼはりシムコール属の構成員から得るとかできる。特異的態様において、本発明の酵素はりシムコール　マイヘイの株から得ることのできる安定化セルラーゼである。リゾムコール　マイヘイから得ることのできるセルラーゼは、例えば国際公開−０９１／１７２４３に記載されている。

本発明の他の特異的態様に於て、酵素は安定化リゾムコール　マイーイ　セルラーゼであり、この安定化セルラーゼは表２に掲げた位置又はそれに対する類似の位置の１又はそれ以上に於てプロリン残基への置換を含んでなる。

更に他の特異的態様に於て、本発明の酵素は安定化リゾムコールマイへイ　セルラーゼであり、この安定化セルラーゼは次の位置：Ａ３３Ｐ、　Ａ７８Ｐ、　１１３１Ｐ、　Ａ１６２Ｐの１又はそれ以上で、又はそれに対する類似の位置でプロリン残基への置換を含んでなる。

盗−一亀ファイおよびサイ角度に基づくりシムコール　マイヘイ　セルラーゼ中で提案されたプロリン変異体！　−９０＠＜ファイ＜　−４０’　；αヘリックス又はβシート構造のいずれの部分でもなし）プロリン８　の′ 精製リパーゼ変異体の熱安定性を、示差走査熱量（ＤＳＣ）法により試験し、そして高温で活性の測定により試験した（実験データに対し例３参照）。この実験結果を下記の表３および図７に示す。

表３から次の内容が見られる：すなわち、構築された変異体の３種は著るしく改善された熱安定性を有し、そして変異体の２種は野生形酵素と比較した場合、著るしく減少した熱安定性を有する。これらの結果は明瞭に次の内容を実証している。すなわち、理論的解釈が本明細書中で記載されるファイ−サイ−概念により蛋白質にプロリン残基を導入することにより安定に対して存在するけれども、個々の変異体の安定化効果に関して何ら結論は断定できない。

え　工によ　れた　、過去に於て、多数のプロセスが組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド又は蛋白質の生産に対して開発された。この目的に対して主としてＥ、コリー、バシラス　サブチリス、サツカロマイセス　セレビシェおよび種々のアスペルギルス株、例えばＡ、オリゼおよびＡ、ニガーが用いられる。特に、アスベルギリーは十分特徴づけられた組換えＤＮＡベクターに対する宿主生物として魅力的候補体でありそして酵素の商業的生産に対して広く用いられる微生物である。アスベルギルスオリゼに於て、生物の形質転換および幾つかの酵素の生産に対して複数の方法が開発され、そしてこれらの内フミコラ　ラヌギノサおよびリヅムコール　マイヘイリノく一ゼ（例えＬｆ、ヨーロノノ＜特許出［２３８，０２３および３０５，２１６並びに国際特許出ＩＩ　ＷＯ８９１０１９６９参照）、およびフミコラ　インソレンスおよびフサＩＪアム　オキシスボ１功ム　セルラーゼ（例えば、国際特許出願−０９１／１７２４３参照）が東証されており、これらの公報は本明細書に参考のため導入される。

ポリペプチドΔ！立腹停主兎意図がポリペプチド又は蛋白質の生産にある生物の形質転換によって、ＤＮＡ配列が生物に導入される。配列は、転写／翻訳開始シク゛ナルおよび転写／翻訳停止シグナルにフランクされた対象の遺伝子のコード領域を含む、コドン領域は、コドンと呼番ｆれる３個の塩基対の単位を含み、これは転写される遺伝子の翻訳の瞭アミノ酸に翻訳され、これは再たび集合して対象のポリペプチドを与える。

±ユづブ士上べ上ｃ２．ｓ　ｏＪ入コドン領域に於いて１個またはそれ以上の特異的コドンを交換し次いで宿主生物をこれらの新しいコード領域で形質転換することにより、新しいポリペプチドを生産することができ、これは元のボＩＪペプチドとは１個又はそれ以上のアミン酸が異なる。このような変更は、「試験管内の部位特異的の突然変異誘発」として一般に知られている技術によって導入できる。多くの方法が発行されてＩ、ｚる。

初期の方法は、シラーアンドスミス（１９８４）　；　ＤＮＡ、　３（６）　４７９−４８８によって記載されておりそして一本鎖Ｍ１３　ノ＜クテリオファージの（吏用を含む。ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）を用（する好ましし）方法力く、ネルソンアンドロング（１９８９）によって記載されてしする；　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８０．１４７−１５１゜それは、ＲＣＲ反応に於てフ゛ライマーの一つとして化学的に合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドを用も穫ることにより所望の変異を含むＰＣＲフラグメントの３工程の生産を含む。

ＰＣＲで発生させたフラグメントから、変異を有するＤＮＡフラグメントは制限酵素で分解することにより単離できそして発現プラスミドに再挿入される。第三の突然変異誘発は、ＤＮＡコード領域において制限サイトを利用する。突然変異誘発標的をフランクするサイドで制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望の変異を合成的に含む新しいフラグメントを合成しそして制限サイト間にこの新しいフラグメントをクローン化することにより、変異コード領域が構築できる。

全ての方法が、新しい又は改変した性質を有するポリペプチドの発展を取り扱う蛋白質工学と呼ばれる分野において調査に対し一般に適用可能である。

形質転換および発現は、例えばヨーロッパ特許出願３０５．２１６　（この明細書は参考のため本明細書に加入される）に記載される如く、業界公知の方法により達成できる。

本発明の安定化酵素を生産できる微生物は、他の必須の栄養源と共に同化性炭素および窒素を含有する栄養源培地中で通常の発酵法により培養でき、培地は公知技術の原則に従って構成される。安定化酵素の精製および回収は又、自体公知の方法に従って行うことができる。

ヌクレオチド配　、ベクターおよび本発明は又、本発明の安定化酵素をコードするＤＮＡヌクレオチド配列に関する。安定化酵素は発現されることができそして本発明の酵素をコードするＤＮＡヌクレオチド配列を適当な宿主生物内で適当なベクターに挿入するとき生産される。宿主生物は、親遺伝子が起源する生物とは必ずしも同一である必要はない。突然変異遺伝子、ベクターおよび突然変異体および形質転換された微生物の構築は、業界公知の適当な組換え１）ＮＡ技術によって行うことができる。

本発明は又、本発明の安定化酵素をコードするＤＮＡヌクレオチドを含有する発現ベクターおよび宿主生物に関する。

迭月見減−隻本発明は又、洗浄および洗剤組成物における本発明の安定イヒ酵素の使用並びに１種又はそれ以上の本発明の酵素を含んでなるそのような組成物を含んでなる。

本発明の洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面゛活性剤を含むことができ、これはアニオン、非イオン、カチオン、両性Ｘ４よ双性イオンタイプ又はこれらの混合物である。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖のアルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェートルエトキシスルフエ）　（ＡＥＳ）および天然脂肪酸のアｌレカ＋を金Ｔｌ塩である．非イオン界面活性剤の例は、アルキルポリエチレンク’ＩＪコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングＩＪコールエーテＪし、スクロースおよびグルコースの脂肪酸エステＪしおよびポＩＪエトキシル化アルキルグルコシドのエステルである。

本発明の洗剤組成物は、業界公知の他の洗剤成分、例え番ヨ、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、耐蝕側、金属イオン封鎖剤、抗土壌再付着剤、香料、酵素用安定剤および漂白剤、製剤助剤、螢光増白側、起泡増進剤キレート剤、充てん荊、布帛柔軟剤等を含有することができる。本発明の洗剤組成物は、実質的にＪ．フォルべに記載される如く調合できる〔フォルへＪ．；　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ　ｉｎ　ＣｏｎｓｕｍｅｒＰｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｔｈｅｏｒｙ，　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　；スフ’ＩＪンゲＪレフエルラーク１９８７、特にｒＦｒａｍｅ　ｆｏｒ　ｍｕｌａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｌｉｑｕｉｄ／ｐｏｗｄｅｒｈｅａｖｙ−ｄｕｔｙ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　」の節を参照」〕。

現在以下のように考察されている：すなわち、本発明の洗剤組成物は、洗液１１当たり蛋白分解酵素のｏ．ｏｏｏｓ〜０．　５　ＣＰＵに相当する量のプロテアーゼ調製品を含有できる。一般に、洗剤組成物中よ、洗液１１当たり０．３〜１５ｇの洗剤の範囲内の用量で用いられる。

本発明の洗剤組成物は、粉末、液体等の如きどんな好都合の形態にでも製剤化できる。

本発明の酵素は、１種又はそれ以上の酵素を含有する個々の添加剤を添加することにより、又はこれらの酵素の全てを含んでなる混合添加剤を添加することにより洗剤組成物中に含ませることができる。

本発明の添加剤、すなわち、個々の添加剤又は混合添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として製剤化できる。好ましい洗削添加剖製剤は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素である。

無塵の粒質物は、例えば英国特許１，３６２，３６５又は米国特許４、１０６，９９１に従って製造でき、そして所望により業界公知の方法により被覆できる。

洗剤用酵素は造粒前又は後に混合され得る。

液体酵素調製品は、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、塘、又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を確立された方法に従って添加することにより安定化される。他の酵素安定化剤は業界周知である。

保護される酵素は、ヨーロッパ特許出１［２３Ｂ，２１６に開示された方法に従って調製できる。

本発明を次の実施例により更に説明するが、いかなる場合心よ種子ＩＩ要求される本発明の範囲を制限するものではない。

例１フミコー　−ヌギノサリバーゼのＧ２２５Ｐの　るブース主ヱ■１至本明細書で用いられる発現プラスミドは、ヨーロッパ特許出願３０５、２１６に記載されたｐ９６０と同一であるが、但しリパーゼをコードする領域に対し丁度３′に掻かな変形がある。

ｐ９６０はＮｒｕｌおよびＢａ■旧制限酵素で消化された。これらの２個のサイト間で、プラスミドｐＢＲ３２２からのＲａｗ　Ｈ／Ｎｈｅｌ断片（ここにおいて、Ｎｂｅｌ断片はタレノーポリメラーゼで満たされていた）は、クローン化され、それによってプラスミドｐＡＯ１をっ（す、これは独特なりａ−旧およびＮｂｅｌサイトを含んでいた。これらの独得なサイト間で、ｐ９６０からのＢａｍ　）ＩＩ／Ｘｂａｌ断片はクローン化され、ｐＡＨＬを与える。

フミコラ　ラヌギノサリパーゼの発現カセットを含んでなる５ａｉｌ／Ｅｃｏ　Ｒ１断片の配列を図１に示す。この発現カセットを含有するプラスミドｐＡＨＬの制限地図を図２に示す。プラスミドを、幾つかのフミコラリパーゼ変異体の構築に対する鋳型として用いた。用いた方法は、以下に記載されそして更に図３および図４において概説されている。これは元々Ａｎａｌｙｔｉｅａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ＋　１８０＋　１４７−１５１（１９８９）においてネルソンアンドロングにより発表されている。

ブースミドＡＨＬの環状プラスミドｐＡＨＬを次の５０μｍの反応混合物中、制限酵素５ｐｈｌを用いて線状化しｋ　：　５０ｍＭ（７）ＮａＣ１，１０＋＊Ｍノ）　’）　７．− ＨＣｌ、ｐＨ７，９、１０ａＭのＭｇＣ１ｚ、　１　ｍＭのジチオトレイトール、ｌａｇのプラスミドおよびＳｐ旧の２単位、消化は、３７°Ｃで２時間行なわれた０反応混合物をフェノール（トリス−ＨＣｌで平衡化、ｐ）１７．５）を用いて抽出し次いで水冷９６％エタノールの２容量を添加して沈殿させた。ペレットを遠心分離しそして乾燥後、線状化ＤＮＡを５０ａｌのＨ，Ｏに溶解しそして濃縮物をアガロースゲルで評価した。

３工　のＰＣＲ−悸図４にも示すように、３工程の変異誘発は４個のプライマーの使用を含んだ：変異誘発性プライマー（＝Ａ）：５　’　−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡ　−３’ ＰＣＲヘルパー１　（＝Ｂ）　：５°−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＡＡＴＣＧＧＣ−３’ｓ　ＰＣＲヘルパー２　（−Ｃ）　：５　’　−ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’ＰＣＲハンドル（＝Ｄ）二５°　−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣ−３’全ての３工程は以下のものを含む緩衝液中で行なわれた：　１０ａ＋Ｈの！−’Ｊ　ス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３、５０ｍＭ（７）ＫＣＩ、　１．５　ｓ＋Ｍ＋７）ＭＣ１，１，５ｓＭＭＭｇＣ１ｚ、０．００１％のゼラチン、０．２　ｍＭ（ＤｄＡＴＰ、０．２　ｍＭ＋７）ｄＣＴＰ、０．２　ｍＭ（７）ｄＧＴＰ、０．２−ＨのＴＴＰ、　２．５単位のＴａｇポリメラーゼ。

工程１に、ｔ；い７．２００　ｐａ＋ｏｌノア”ライ７−Ａ、　１００　ｐｍｏｆ（７）プライマーｂ、および１　ｆｍｏｌの線状化プラスミドを前記緩衝液の合計１００　ｕ　１に添加しそして９５℃で２分、３７℃で２分および７２℃で３分がら成る１５回のサイクルを行った。

ＰＣＲ生成物のｉｌ！！Ｍ物をアガロースゲルで評価した。次いで、工程２を行った。０．６ｐ■ｏｌの工程１の生成物および１　ｆｍｏｌの線状化プラスミドは前記の緩衝液の合計１００μｍ中に含まれておりそして９５℃で５分、３７° Ｃで２分および７２°Ｃで１０分がら成る１回のサイクルを行った。

工程２の反応混合物に対し、１００　ｐｍｏｌのプライマーＣおよび１００ｐｏｏｌのプライマーＤを添加しく各々１μｌ）そして９５°Ｃで２分、３７°Ｃで２分および７２°Ｃで３分がら成る２０回のサイクルを行った。この操作は、変異誘発手順において工程３を含んでいた。

１゛　れた　の工程３からの生成物をアガロースゲルから単離しそして２０ｕｌのＨｚＯに再溶解した。次いで、次の組成を有する合計容量５０ｕｌ中でそれを制限酵素Ｂｓｔ　ＸＩおよびＢｇｌｌｌで消化した：　１００　ｄのＮａＣｌ、　５０−Ｈのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，９、ＩＯＱＩＭのＭｇＣＩｚ＋　Ｉ　ＭＭのＤＴＴ、　Ｂａ１ｌｌの５単位およびＢｓｔにｌの１０単位。インキュベーションを３７° Ｃで２時間行った。

２００　ｂｐ　ＢＳＴ　ＸＩ／Ｂｇｌｌ＋断片をアガロースゲルから単離した。

見災立久ター二剣しソ以走殖発現プラスミドｐＡｔ（Ｌを、先に示した条件下Ｂｓｔ　ＸＩおよびＢｇｌｌｌで分解しそして大きな断片をアガロースゲルから単離した。このヘクターに対し、先に単離した突然変異断片を連結させそして連結混合物をＥ、コリーを形質転換するため用いた。配列分析を、サンガーにより開発されたジ−デオキシ鎖停止が手順を用い二本鎖プラスミドについて行った。プラスミドは命名されたｐＡＨＬＧ２２５Ｐでありそして改変されたコドンを除いてｐＡｔｉＬに等しい。

次いでプラスミドを宿主生物に形質転換した。好ましい宿主生物は、アスペルギルス属の生物である。形質転換および発現は、本質的にヨーロッパ特許比＠３０５，２１６（同上）中に記載される如く行う。

豆は一２４ＩＰおよびＴ２４４Ｐ゛　の　−製フミコラ　ラヌギノサ／３２２４Ｐ　、フミコラ　ラヌギノサ／１２４１Ｐ、およびフミコラ　ラヌギノサ／Ｔ２４４ＰをそれぞれコードするプラスミドｐＡＨＬＳ２２４Ｐ、　ｐＡＨＬ１１２４ＩＰおよびｐＡＨＬＴ２４４Ｐを、前記の方法を用いて構築した、但し次のプライマーを変異誘発性プライマー（［プライマーＡＪ）として用いた。

５２２４Ｐ：　５　’　−ＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡ　−３’１２４１Ｐ：　５　”　−ＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣＴＴ　−３“７２４４Ｐ：　５　’　−ＴＡＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＣ−３’例２ □ 約２００　ｍｌの上澄み液を遠心分離しそして沈殿物をデカント法により捨てた。水冷エタノールを水浴上で上澄み液にゆっくり添加した。

沈殿物を遠心分離しそして捨て更に上澄み液のｐＨをＮａＯＨで７に調節した。

７０％のエタノールの上澄み液を、５０ｍＭのトリスアセテート緩衝液（ｐ）１７）で平衡化した２６０層ＪのＤＥＡＥ高速セファロースカラムに適用し、そして流速は５ｓ＋Ｉ／分であった。ｏＤお。が０．０５未満になるまでカラムを洗浄した。結合した蛋白質を、５回のカラム溶量を用い、同緩衝液中０．５　ＭのＮａＣ１までの線状ＮａＣ１グレーヂエントで溶出した。

リパーゼ活性は、０．１〜０．１５ＭのＮａＣ１濃度間で溶出された。

リパーゼ活性を含有する分画を集めそして酢酸アンモニウムを０．８Ｍの最終濃度に添加した。集めたものを、流速５＋ｌ／分でトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）　（登録商標）−ブチルカラムに適用した、カラムを０．８Ｍの酢酸アンモニウムで平衡化し次いで０Ｄ２１０が０．０５未満になるまでを洗浄した。結合した活性をミリ−キュー　（Ｍｉｌｉ　Ｑ）水で溶出した。リパーゼ活性を有する分画を集め次いで集めたもの伝導度を５抛Ｈのトリスアセテート緩衝液（ｐＨ７）のそれよりも小さい値に調節した。

集めたものを５０１１Ｍのトリスアセテート緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した３０ｍ１のＨＰＱ　−セファロースカラムに１ｍｌ／分の流速で適用した。

結合した活性をＩ　ＭＮａＣｌまでの線状塩グレーデエントで溶出した。

本発明の精製リパーゼ変異体を、示差走査熱量（ＤＳＣ）より熱分析に委ねた。

この技術を用い、熱変性温度Ｔ４を一定の計画速度で酵素溶液を加熱することにより測定した。

ミクロカル社製の示差走査熱量測定計、ＭＣ−２Ｄを研究のために用いた。酵素溶液を５０ｍＭのトリスルアセテート（ｐＨ７，０）中で調製した、酵素濃度は、０．６〜０．９−ｇ／ｍｌの範囲にあり、そして約１．２ｍｌの合計容量を各実験に用いた。全ての試料を走査速度９０℃／時間で２５℃から９０°Ｃに加熱した。

この実験の結果を前記表３に示す。

１１立足盟本発明の精製リパーゼ変異体の熱安定性を、又７０℃で活性の測定により試験した。

試料を、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７，０）を用い１ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００μＩの酵素溶液を含有する試験管を７０℃の水浴にそれぞれ１０分、２０分および４５分分間−た。

残留活性を、本明細書中で記載した分析方法を用いて測定した。

この実験からの結果を図７に示す。

入ＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣＧＡＶａｌＬｅｕＳｅｒＰｈｅＡｒｇＧｌｙＳｅｒＡｒｇＳａｒ工１ｅＧｌｕＡｓｎＴｒｐ工１ｅＧｌｙＡｓｎＬｅｕＡｓｎＰｈｅＡｓｐ−工ＣＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＣＡ’Ｉ’ｒＴＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣ１５０１−−−−−− −−−＋−−−−−−−−→−−−−−−−−−中−−−−−−−−一中−−− −−−−−−＋−−−−−−−−一＋P５６０ＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴにＴＡＡＡＣにＡＧＧＣＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＴにＴＡＣＴＧＣＣにＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＬａｕＬｙｓＧ１ｕ工１ｅＡｓｎＡｓｐ工１ａＣｙｓＳａｒＧｌｙＣｙｓＡｒｇＧｌｙＨｉｓＡｓｐＧｌｙＰｈｅＴｈｒＳｅｒＳｅｒ−ＣＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＡＣＧＴＴＡＡＧ（、ＣＡにＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧＣＡＴＣＣ１５６１−−−−−−−−−十−−−−−−−一→−−−−−−−−→−− −−−−−画一４−−−−−−−−−〒−−−−−−−−−＋１U２０１６２１−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−”−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−→−−−−−−−−−＝−−−−−−−−−{１６８０ＧＣＴＧＡＴＡＧＣＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＭＣＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＡＣＧｃｃｃＡＳｐＴ”／ｒＡｒｑＶａｌＶａｌＰｈｅＴｈｒＧｌｙＨｉｓＳｅｒＬａｕＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｅｌｌＡｌａＴｌ’１ｒＶａｌＡｌａＧＩx− Ｂ　Ｅ　ｆ　Ａ）ＩＣＩ　ＮＢｈＮａＡ工　Ｖ　エ　エ　エエエ　エ　エ１６８１−−−−−−−−−＊−−一−−−−−−中−−−−−−−−−↑−− −−−−−−−＋　−−−−−−−−一中一−−−−−−−|＋１７４０工ａ工６Ａ工ＣＯａエエエエエエエエ　エｓＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＴＴＡＣＧＴＡＴＣＧＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＦｉｇ、　１Ｆｉｇ、　２ＰＣＲを用いる突然変異体の横築す　３工程ＰＣＲ取込み変異＋　制限酵素による分裂、断片の単層型　発現プラスミドへの再クローンＣＧＴＦｉｇ、３ＰＣＲ−変異誘発工程３ＬｅｕＬｙｓＧｌｕ工１ａＡｓｎＡｓｐ工１ｅＣｙｓＳｅｒＧｌｙＣｙｓＡｒｇＧｌｙＨｉｓＡｓｐＧ１ｙＰｈａＴｈｒＳｅｒＳｅｒＴｒｐＡｒｇＳ　ａ　ｒＶａ　ＩＡＩ　ａＡｓｐＴｈｒＬａｕＡｒｇＧ　１ｎＬｙｓＶａｌＧ　ｌ　ｕＡｓｐＡｌ　ａＶａｌＡｒｑＧｌｕＨPｓＰｒ。

ＧＡＣＴＡＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣｒＧＴｒＧＣＣＧＧＡＡｓｐＴｙｒＡｒｇＶａ　ｌＶａ　ｌ　ＰｈｅＴｈｒＧｌｙＨｉＦ、ｓ　ａｒＬｅｕＧ　１ｙＧｌ　ｙＡｌ　ａＬｅｕＡｌ　ａＴｈｒＶａ　hＡＩ　ａＧｌ　ｙＡｌａＡｓｐＬａｕＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＡｓｐ工１ａＡｓｐＶａｌＰｈａＳｅｒＴｙｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＧＧＡＴＣＣＡＡＧ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧ　ＴＣＣＧＣＣＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＣＣ４８ＴＧＧ　ＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＧＣＧＧＣＴＧＧ　ＧＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣＣＧＴＧ　１４４ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＴＣ；　ＴＡＧＡＣＧＣＡＧＧ　ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧ　ＧＧＣＣＴＴＡＣＴＧ　ＧＴＧＧＣＣＧＣＭ　９６４ＣＧＡＡＡ、ＴＧＡＣＡ　ＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡ　ＣＴＧＴＡＴＴＡＧＴ　ＴＣＴｒＧＴＡＣＡＴ　ＡＡＴＴＴＣＧＴＣＡ　１０１４ＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧ　ＧＡＴＴＧＴＣＡＣＡ　ＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴ　ＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴ　ＧＡＧＴＡＣ１０６００１０２０３０叩　５０７０度での分国際調査報告国際調査報告ＰＣＴｌｏＫ　９２１００１４２゛　１ □ フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：６６）（Ｃ１２Ｎ　１５１５５Ｃ１２Ｒ１：０１）（７２）発明者　クラウセン、イブ　グロトテンマーク国、デーコー−２９２０シャルロッテンルント、エステ−、チー、ベー、。

オルトルップヤクトバイ　１５３Ｉ（７２）発明者　パトカル、ジャムカント　アナントテンマーク国、デーニー− ２８００リングピー、クリストフェルス　アレ　９１（７２）発明者　ポルシュ、キムテンマーク国、デーニー−１３０８コペンハー、、クレルケガゼ　１２

Claims

【特許請求の範囲】

１．安定化酵素であって、この酵素において天然に発生するアミノ酸残基（プロリン以外）が１個所またはそれ以上の位置でプロリン残基で置換されており；その位置で２面角φ（ファイ）は間隔内の値〔−９０°＜ψ＜−４０°〕を構成し；好ましくは２面角ψ（ファイ）およびΨ（サイ）は間隔内の値〔−９０°＜ψ ＜−４０°〕および〔−１８０＜Ψ＜−１５０°または−８０＜Ψ＜１０または１００＜Ψ＜１８０〕を構成し；そしてその位置は酵素がα−ヘリックスまたは β−シート構造を有することを特徴とするところの領域内には位置していない、前記安定化酵素。
２．安定化リパーゼ、安定化セルラーゼ、安定化ベルオキシド、安定化キシラナーゼ、又は安定化アミラーゼである、請求の範囲第１項記載の酵素。
３．安定化リパーゼであり、リパーゼがフミコラ属、リゾムコール属、カンジダ属、又はシュードモナス属の構成員から得ることのできる、請求の範囲第１項記載の酵素。
４．リパーゼが、フミコラ　ラヌギノサ、リゾムコール　マイヘイ、カンジダ　アンタルクチカ、又はシュードモナス　セパシアの株から得ることのできる、請求の範囲第３項記載のリパーゼ。
５．安定化フミコラ　ラヌギノサリパーゼである、請求の範囲第４項記載のリパーゼ。
６．リパーゼがフミコラ属の構成員から得ることのできるものであり、その安定化リパーゼが表１に掲げた１個所又はそれ以上の位置で、又はそれに対する類似の位置でプロリン残基への置換を含んでなる、請求の範囲第５項記載のリパーゼ。
７．リパーゼがフミコラ　ラヌギノサの株から得ることができるものである、請求の範囲第６項記載のリパーゼ。
８．リパーゼがフミコラ属の構成員から得ることができるものであり、この安定化リパーゼは１個又はそれ以上の位置：Ａ２８Ｐ；Ｇ６１Ｐ；Ｎ１０１Ｐ；Ｓ１０５Ｐ；Ｄ１１１Ｐ；Ｄ１６５Ｐ；Ｒ２０９Ｐ；Ｓ２２４Ｐ；Ｇ２２５Ｐ；Ｔ２２６Ｐ；Ｒ２３２Ｐ；Ｎ２３３Ｐ；１２４１Ｐ；Ｔ２４４Ｐ又はそれに対する類似の位置でプロリン残基への置換を含んでなる、請求の範囲第６項記載のリパーゼ。
９．リパーゼがフミコラ　ラヌギノサから得ることのできるものである、請求の範囲第８項記載のリパーゼ。
１０．フミコラ　ラヌギノサ／Ｇ２２５Ｐリパーゼ。
１１．フミコラ　ラヌギノサ／Ｔ２４４Ｐリパーゼ。
１２．安定化セルラーゼであり、このセルラーゼがフミコラ属、フサリアム属、トリコデルマ属、マイセリオフトラ属、パネロカエテ属、シゾフィラム属、ベニシリウム属、アスバルギルス属、又はゲオトリカム属の構成員から得ることのできるものである、請求の範囲第１項記載の酵素。
１３．セルラーゼが、フサリアム　オキシスポラムの株から得ることのできるものである、請求の範囲第１２項記載のセルラーゼ。
１４．セルラーゼが、フミコラ　インソレンス株から得ることのできるものであり、安定化セルラーゼが表２に掲げた１個又はそれ以上の位置で又はそれに対する類似の位置でプロリン残基への置換を含んでなる、請求の範囲第１２項記載のセルラーゼ。
１５．安定化リパーゼが、１個又はそれ以上の位置：Ａ３３Ｐ，Ａ７８Ｐ，１１３１Ｐ，又はＡ１６２Ｐ，又はそれに対する類似の位置でプロリン残基への置換を含んでなる、請求の範囲第１４項記載のセルラーゼ。
１６．請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の安定化酵素をコードするヌクレオチド配列。
１７．安定化酵素をコードする請求の範囲第１６項記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
１８．請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の安定化酵素をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターを含有する宿主生物。
１９．請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の酵素を含んでなる、洗剤組成物。
２０．粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、侍に安定化液体、スラリー、又は保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の酵素を含んでなる洗剤用添加剤。